Table 1. Data from the calculation of the bacteria pour plate method. (Practicum Data).

Sample DIlution CFU/ml

10-5 10-6
0,1 TMTC TMTC 2,5 x 108
TMTC TMTC
0,2 TMTC 114 1,795 x 108
TMTC 245
0,3 TMTC 211 2,21 x 108
TMTC 231

Calculation Example :

OD = O,1
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑓 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑦 250 250
N (CFU/ml) = (𝑛1+0,1𝑥𝑛2)𝑥𝑑
= 0,1𝑥10∗−5= 1𝑥10∗−6 = 2,5x108 CFU/ml

OD = 0,2
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑓 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑦 114+245 359
N (CFU/ml) = (𝑛1+0,1𝑥𝑛2)𝑥𝑑
= (0+0,1𝑋2)𝑋10∗−5= = 1,795x108 CFU/ml
2𝑥10∗−6

OD = 0,3
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑓 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑦 211+231 442
N (CFU/ml) = (𝑛1+0,1𝑥𝑛2)𝑥𝑑
= (0+0,1𝑋2)𝑋10∗−5= 2𝑥10∗−6 = 2,21x108 CFU/ml

POUR PLATE
3.00E+08

2.50E+08
y = -1E+08x + 2E+08
2.00E+08
R² = 0.1675
CFU/ml

1.50E+08

1.00E+08

5.00E+07

0.00E+00
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
Optical Density
 Pour Plate
0.35

0.3
Optical Density

0.25

0.2
y = -1E-09x + 0.4504
0.15 R² = 0.1675
0.1

0.05

0
0.00E+00 5.00E+07 1.00E+08 1.50E+08 2.00E+08 2.50E+08 3.00E+08
CFU/ml

Graph 1. Relationship graph between CFU / ml with optical density based on pour plate data

Table 2. Data from the calculation of the bacteria pour plate method. (Practicum Data).

Sample Dilution CFU/ml

10-5 10-6
0,1 TMTC 64 2,76 x 107
185 83
0,2 83 57 1,54 x 107
103 97
0,3 221 34 3,34 x 107
TMTC 157

Calculation example :

OD = 0,1
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑓 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑦 185+64+83 332
N (CFU/ml) = (𝑛1+0,1𝑥𝑛2)𝑥𝑑
= (1+0,1𝑋2)𝑋10∗−5= = 276666666,7 = 2,76x107CfU/ml
1,2𝑥10∗−5

OD = 0,2
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑓 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑦 83+103+57+97 340
N (CFU/ml) = (𝑛1+0,1𝑥𝑛2)𝑥𝑑
= (2+0,1𝑋2)𝑋10∗−5= 2,2𝑥10∗−5= 15454545,45 = 1,54x107CFU/ml

OD = 0,3
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜𝑓 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑦 221+34+157 412
N (CFU/ml) = (𝑛1+0,1𝑥𝑛2)𝑥𝑑
= (1+0,1𝑋2)𝑋10∗−5= 1,2𝑥10∗−5 = 343333333,3 = 3,43x107CFU/ml
 Spread Plate
4.00E+07
3.50E+07
3.00E+07 y = 3E+07x + 2E+07
R² = 0.0996
2.50E+07
CFU/ml

2.00E+07
1.50E+07
1.00E+07
5.00E+06
0.00E+00
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
Optical Density

Spread Plate
0.35

0.3
Optical Density

0.25 y = 3E-09x + 0.1125

0.2 R² = 0.0996

0.15

0.1

0.05

0
0.00E+00 1.00E+07 2.00E+07 3.00E+07 4.00E+07
CFU/ml

Graph 2. Relationship graph between CFU / ml with optical density based on Spread plate data.

Sebelum dilakukan enumerasi harus dilakukan pengeceran terlebih dahulu. tujuan pengeceran
adalah untuk mendapatkan koloni yang tumbuh secara terpisah. Koloni ang terpisah memudahkan
untuk dihitung dan dapat membantu sampel yang terkena cemaran yang sangat tinggi. Pengeceran
dilakukan secara bertingkat, karena sampel yang tidak dilakukan dengan pengeceran akan sangat
pekat dan kemungkinan TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). (Putri, A. M., & Kurnia, P. (2018).
IDENTIFIKASI KEBERADAAN BAKTERI COLIFORM DAN TOTAL MIKROBA DALAM ES DUNG-
DUNG DI SEKITAR KAMPUS UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA [Identification of
Coliform Bacteria and The Total Mikrobes in Dung-Dung Ice around Universitas Muhammadiyah
Surakarta Campus]. Media Gizi Indonesia, 13(1), 41-48).

Secara umum teknik enumerasi pada mikroorganisme terbagi menjadi 2 yaitu teknik
enumerasi langsung dan teknik enumerasi secarat tidak langsung. Enumerasi secara langsung
merupakan cara perhitungan total dari jumlah sel mikroba dalam suatu sampel secara mikroskopik.
Teknik enumerasi secara langsung dibagi menjadi 2 metode yaitu metode kamar hitung (Counting
Chamber) dan metode perhitungan dengan preparat olesan (Smear count). Pada metode counting
chamber digunakan instrumen hemacytometer. Keuntungan memakai metode ini adalah
pemerikasan secara cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan, tetapi kelemahannya adalah
tidak dapat membedakan antara mikroorganisme yang hidup dan mati. Hemacytometer adalah
suatu ruang kaca dengan sisi yang menjulang dan kaca penutup yang akan menahan cairan tepat 0,1
mm dari atas lantai ruang kaca. Hemaocytometer memiliki total luas permukaan 9 mm2. Hasil
perhitungan menggunakan hemocytometer cukup akurat sehingga tidak perlu diragukan lagi, begitu
juga dengan spektrofotometer yang merupakan instrumen yang lebih modern dan lebih canggih dari
pada hemocytometer. Pada metode smear count dilakukan dnegan membuat preparat dari jumlah
tertentu dari larutan sampel dan disebarkan di atas gelas objek dan dalam luas tertentu, lalu
mikrooragnisme sudah dapat dihitung menggunakan mikroskop Sardjito, T., Ramayadi, W., Srianto,
P., & Anwar, C. N. (2013). Perbandingan Penghitungan Konsentrasi Spermatozoa Domba Merino
dengan Metode Haemocytometer Thoma dan Spektrofotometer. Veterinaria Medika, 6(2), 121-126).

Enumerasi secara tidak langsung merupakan cara menghitung bakteri secara tidak langsung
yang artinya bakteri dapat dihitung berdasarkan parameter seperti kekeruhan, berat kering sel,
kadar nitogen dan aktivitas biokimia dengan bantuan instrumen seperti spektrofotomer, yang
kemudian ditentukan perhitungannya secara formula. Enumerasi secara tidak langsung melalui berat
kering sel , dilakukan dengan beberapa tahapan pertama, menyaring/sentrifugasi massa sel,
kemudian mencuci dengan aquadest/buffer, lalu dikeringkan dalam oven, bila suhu 80 derajat
celcius memerlukan waktu 24 jam atau 110 derajat cel selama 8 jam, dan ditimbang sehingga
diperoleh berat sel kering. Pada metode tubidimetri digunakan spektrofotomter sebagai instrumen
bantuan untuk membaca turbiditas. Metode turbidimetri merupakan metode keberadaan
mikroorganisme yang menggunakan prinsip kekeruhan. Semakin banyak suatu mikroorganisme yang
terdapat pada sampel, maka sampel tersebut akan semakin keruh, dimana spektrofotometer adalah
suatu alat yang dapat menunjukkan kepekatan suatu zat. Cara kerja spektrofotometer pada metode
turbidimetri adalah cahaya yang dilewatkan pada sampel, dimana terdapat media dengan bakteri
yang akan menyerap cahaya, lalu cahaya yang dilewatkan pada sampel akan ditangkap oleh detektor
(Sardjito, T., Ramayadi, W., Srianto, P., & Anwar, C. N. (2013). Perbandingan Penghitungan
Konsentrasi Spermatozoa Domba Merino dengan Metode Haemocytometer Thoma dan
Spektrofotometer. Veterinaria Medika, 6(2), 121-126).

Pada metode Total plate count (TPC) cawan yang dipilih dan dihitung adalah cawan petri
yang mengandung antara 30-300 koloni. Jika tidak ada , maka dipilih yang mendekati 300. Prinsip
dari metode Total Plate count adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan dalam media,
maka mikroba terseut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dan kemudian dihitung tanpa mikroskop. Berdasarkan perlakuan pada mikroorganisme ada 2
metode hitung cawan yaitu metode cawan sebar dan metode cawan tuang. Rumus hitung jumlah
koloni dalam metode Total Plate Count sebagai berikut : (Irfan, M. (2014). Isolasi dan enumerasi
bakteri tanah gambut di perkebunan kelapa sawit PT. Tambang Hijau Kecamatan Tambang
Kabupaten Kampar. Jurnal Agroteknologi, 5(1), 1-8).
1 1
Jumlah koloni/ml = X x jumlah koloni dalam cawan.
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛

Metode cawan sebar adalah metode yang digunakan untuk menumbuhkn mikroorganisme
di dalam media Nutrient agar dengan cara menuangkan stock kultur bakteri yang telah memadat,
sedangkan metode cawan tuang kultur dicamourkan ketika media masih cair. Setiap metode baik
metode cawan tuang maupun metode cawan sebar memiliki kelebihan dan kekurangannya masing-
masing. Kelemahan dari metode cawan tuang adalah kontaminan sulit dibedakan karena semuanya
dituang secara homogen, sedangkan kelebihannya adalah mikroorganisme yang tumbuh tersebar
merata pada seluruh media agar baik di permukaan maupun agar, selain itu metode cawan tuang
dapat digunakan untuk membedakan mikroorganisme aerob, anaerob dan anaerob fakultatif. Pada
metode cawan sebar kelebihannya adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar secara
merata pada bagian permukaan agar dan dapat diperoleh koloni secara terpisah. Kelemahan dari
metode ini adalah mikroba yang hanya dapat dihitung hanya aerob dan anaerob fakultatif
(Putriawati, P., Inayati, N., & Agrijanti, A. (2018). Inventarisasi Bacillus Thuringiensis Dengan Metode
Cawan Sebar Pada Habitat Hidup Larva Anopheles Sp Pada Tanaman Eceng Gondok (Eichornia
Crassipes) Di Kabupaten Lombok Tengah. Jurnal Analis Medika Biosains (JAMBS), 5(2), 91-95)

Bahas data

Pada praktikum ini digunakan pengeceran bertingkat yaitu 10-5 dan 10-6 serta mikroba yang
digunakan adalah Escherichia coli (E.coli), dimana E.coli ini bersifat anaerob fakultatif yang artinya
bahwa E.Coli memanfaatkan oksigen sebagai energinya, tetapi dapat tumbuh dan berkembang tanpa
oksigen. Metode yang digunakan pada praktikum ini adalah metode cawan tuang dan metode cawan
sebar, dimana keduanya dapat mendeteksi E.coli sehingga koloni E.coli dapat dihitung. Hasil jumlah
koloni yang didapat dari percobaan pour plate pada optical density 0,1 sebanyak 2,5x10 8, sedangkan
pada spread plate sebanyak 2,76x107. Pour plate pada Optical density 0,2 mengandung koloni
sebanyak 1,795x108, sedangkan pada spread plate sebanyak 1,54x107. Pour plate pada optical
density 0,3 mengandung koloni sebanyak 2,21x108, sedangkan pada spread plate sebayak 3,34x107.
Dari data praktikum tersebut dapat diambil kesimpulan bahwa jumlah koloni bakteri pada pour plate
lebih lebih banyak daripada spread plate. Hal ini karena pour plate dapat digunakan untuk bakteri
jenis anaerob maupun aerob sehingga dapat terjadi kontaminasi apabila tidak digunakan teknik
aseptik yang tepat, sehingga apabila terkontaminasi terdapat mikroorganisme lain yang tumbuh dan
berkembang biak dalam cawan tersebut. Selain itu perlakuan untuk menumbuhkan E.Coli pada pour
plate dilakukan dengan cara menumpukkannya di dalam agar, sehingga tidak terdapat oksigen dalam
agar tersebut sehingga mikroorganisme anaerob dapat tumbu dan berkembang biak, sedangkan
pada spread plate perlakuan untuk menumbuhkan bakteri yaitu E.Coli hanya diletakkan di atas agar
pada cawan saja sehingga haya bakteri aerob saja yang dapat tumbuh. E.Coli dapat tumbuh dengan
metode pour plate maupun spread plate karena E.coli termasuk mikroorganisme bersifat anaeorb
fakultatif (Lizayana, L., Mudatsir, M., & Iswadi, I. (2016). Densitas Bakteri pada Limbah Cair Pasar
Tradisional. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pendidikan Biologi Unsyiah, 1(1)).

ENGLISH

Before enumeration, dilution must be done first. the purpose of retailing is to get colonies that grow
separately. Separate ang colonies make it easy to calculate and can help samples that are exposed
to very high contamination. Dilution is done in stages, because samples that are not done with dilution
will be very concentrated and likely TMTC (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). (Putri, A. M., & Kurnia,
P. (2018). IDENTIFIKASI KEBERADAAN BAKTERI COLIFORM DAN TOTAL MIKROBA DALAM
ES DUNG-DUNG DI SEKITAR KAMPUS UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
[Identification of Coliform Bacteria and The Total Mikrobes in Dung-Dung Ice around
Universitas Muhammadiyah Surakarta Campus]. Media Gizi Indonesia, 13(1), 41-48).

in general the enumeration technique in microorganisms is divided into 2 namely direct enumeration
techniques and indirectly indirect enumeration techniques. Enumeration directly is a way of
calculating the total number of microbial cells in a sample microscopically. The enumeration technique
is directly divided into 2 methods: the counting chamber method and the smear count method. In the
counting chamber method a hemacytometer instrument is used. The advantage of using this method
is that it checks quickly and does not require much equipment, but the disadvantage is that it cannot
distinguish between living and dead microorganisms. A hemacytometer is a glass chamber with a
protruding side and a glass cover that will hold liquid exactly 0.1 mm from the top of the glass room
floor. Hemaocytometer has a total surface area of 9 mm2. The results of calculations using a
hemocytometer are quite accurate so there is no doubt, as well as a spectrophotometer which is a
more modern and more sophisticated instrument than a hemocytometer. In the smear count method
is done by making preparations of a certain amount of the sample solution and spread on a glass
object and in a certain area, then microoragnism can be calculated using a microscope (Sardjito, T.,
Ramayadi, W., Srianto, P., & Anwar, C. N. (2013). Perbandingan Penghitungan Konsentrasi
Spermatozoa Domba Merino dengan Metode Haemocytometer Thoma dan
Spektrofotometer. Veterinaria Medika, 6(2), 121-126).

indirect enumeration is a way to count bacteria indirectly, which means that bacteria can be
calculated based on parameters such as turbidity, cell dry weight, nitogen content and biochemical
activity with the help of instruments such as spectrophotomers, which are then determined using
formula. Enumeration indirectly through the cell dry weight, carried out with the first few stages,
filtering / centrifuging the cell mass, then washing with aquadest / buffer, then dried in the oven, if the
temperature of 80 degrees Celsius requires 24 hours or 110 degrees cel for 8 hours, and weighed so
that dry cell weight is obtained. In the tubidimetry method spectrophotomers are used as an aid
instrument to read turbidity. Turbidimetry method is a method of the existence of microorganisms that
use the turbidity principle. The more a microorganism is in the sample, the more muddy the sample
will be, where the spectrophotometer is a device that can show the density of a substance. The
workings of the spectrophotometer in the turbidimetry method are the light passed on the sample,
where there is a medium with bacteria that will absorb light, then the light passed on the sample will
be captured by the detector (Sardjito, T., Ramayadi, W., Srianto, P., & Anwar, C. N. (2013).
Perbandingan Penghitungan Konsentrasi Spermatozoa Domba Merino dengan Metode
Haemocytometer Thoma dan Spektrofotometer. Veterinaria Medika, 6(2), 121-126).

In the total plate count (TPC) method the cup chosen and counted is a petri dish containing
between 30-300 colonies. If no, then close to 300 is chosen. The principle of the Total Plate count
method is that if living microbial cells are grown in the media, the microbes will multiply and form
colonies that can be seen directly and then counted without a microscope. Based on the treatment of
microorganisms there are 2 plates count methods namely the scatter cup method and the pour cup
method. The formula for calculating the number of colonies in the Total Plate Count method is as
follows: (Irfan, M. (2014). Isolasi dan enumerasi bakteri tanah gambut di perkebunan kelapa
sawit PT. Tambang Hijau Kecamatan Tambang Kabupaten Kampar. Jurnal Agroteknologi, 5(1),
1-8).

1 1
Total of colonies/ml = x x total colonies in cup.
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑜𝑓 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟

The spread plate method is a method used to grow microorganisms in the Nutrient media so
that by pouring a stock of bacterial culture that has solidified, while the pouring method of culture
pouring when the media is still liquid. Each method, both the pour cup method and the scatter cup
method, have their advantages and disadvantages. The disadvantage of the pour cup method is that
the contaminants are difficult to distinguish because everything is poured homogeneously, while the
advantage is that microorganisms grow evenly distributed on all media so that both on the surface
and in order, besides that the pour plate method can be used to distinguish aerobic, anaerobic and
facultative anaerobes. In the method of spread plate the advantage is that microorganisms that grow
can be spread evenly on the surface of the agar and can be obtained separately. The disadvantage of
this method is that microbes that can only be calculated are only aerobic and facultative anaerobes
(Putriawati, P., Inayati, N., & Agrijanti, A. (2018). Inventarisasi Bacillus Thuringiensis Dengan
Metode Cawan Sebar Pada Habitat Hidup Larva Anopheles Sp Pada Tanaman Eceng Gondok
(Eichornia Crassipes) Di Kabupaten Lombok Tengah. Jurnal Analis Medika Biosains
(JAMBS), 5(2), 91-95)
in this practicum, multilevel dilution of 10-5 and 10-6 is used and the microbial used is Escherichia coli
(E.coli), where E.coli is a facultative anaerobic, which means that E.Coli utilizes oxygen as its energy,
but can grow and develop without oxygen. The method used in this practicum is the pour cup method
and the scatter cup method, where both can detect E. coli so that the E. coli colony can be counted.
The results of the number of colonies obtained from the pour plate experiment at optical density 0.1
were 2.5x108, while that of the spread plate was 2.76x107. Pour plate at Optical density 0.2 contains
1.795x108 colonies, while on spread plates 1.54x107. Pour plate at optical density 0.3 contains a
colony of 2.21x108, while on a spread plate as much as 3.34x107. From the practicum data it can be
concluded that the number of bacterial colonies on the pour plate is more than the spread plate. This
is because the pour plate can be used for anaerobic and aerobic bacteria so that contamination can
occur if no appropriate aseptic technique is used, so that if contaminated there are other
microorganisms that grow and multiply in the cup. Besides that, the treatment to grow E.Coli on the
pour plate is done by stacking it in agar, so there is no oxygen in the agar so that anaerobic
microorganisms can grow and multiply, whereas on the spread plate the treatment to grow bacteria,
namely E.Coli, is only placed in top so that only the cup so that only aerobic bacteria can grow. E.Coli
can be grown by pour plate or spread plate method because E.coli including microorganisms are
facultative anaeorb (Lizayana, L., Mudatsir, M., & Iswadi, I. (2016). Densitas Bakteri pada Limbah
Cair Pasar Tradisional. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pendidikan Biologi Unsyiah, 1(1)).

Menggunakan metode tirasi iodometri tujuannya untuk melihat sifat kereaktifan oksidasi dari
senyawa yang diujinya. Perlakukan penentuan kuantitatif oksidasi minyak bertujuan unntuk
melihat senyawa peroksida yang berperan sebagai oksidator yang kuat, lebih kuat daripada
ion iodida, kemudian ditentukan volume titrannya. Jika bilangan oksidasi semaki tinggi artiya
asam lemak semakin banyak yang teroksidasi.

Bilangan peroksida klo tinggi maka semakinn banyak asam lemak yg teroksidasi