Résultats expérimentaux :

I.. CIÉTIQUE EZYMATIQUE D’HYDROLYSE DE L’URÉE :

1. Tracer la courbe de la gamme étalon DO = f [NH4+] et calculer sa pente "a". (Figure 1)

2. calculer la quantité du produit formé et de substrat disparu pour le tube N°2 :

[
H4+] formé = (DO x Fd) / a ; (A.) [
H4+] formé = (0,423x 50 )/2,5 = 8,46 (µ M)
Selon la réaction enzymatique (page 4), l’hydrolyse d’une molécule d’urée donne deux molécules d’ammoniaque
[Urée] disparu = ([
H4+] formé )/2 ; (A.) [Urée] disparu = 8,46 /2 = 4,23 (µ M)

3. Compléter le tableau ci-dessous (exemple d’un binôme):

Tubes T 1 2 3 4 5
D.O. à 420 nm 0 0,276 0,423 0,542 0,580 0,735
[H4+] µmole / l (µ M) 0 5,52 8,46 10,84 11,6 14,7
[ Urée] µmole / l (µ M) 0 2,76 4,23 5,42 5,8 7,35

4. Représenter graphiquement la courbe de la cinétique [NH4+](µ M) = f (temps): (Figure 2)

5. Interpréter brièvement le résultat obtenu :
Pendant 10 minutes, l’évolution de la concentration de l’ammoniaque formée est linaire et correspond à la
phase stationnaire (vitesse constante). Après les 10 minutes, l’augmentation de la concentration devient faible
et correspond ainsi à la phase post-stationnaire.
6. Exprimer la vitesse initiale :
a- en µmole de H4+ /ml /min :
Vi = d[H4+]/dt ; (A.) Vi = (10,84-0)/ (10-0) = 1,084 10-3 µmol (
H4+)/ml/min
b- en µmole d'urée hydrolysée /ml / min :
Vi = (Vi (exprimé par H4+ formé) / 2 ; (A.) Vi = (1,084 10-3) / 2 = 0,542 10-3 µmol (Urée)/ml/min

7. Calculer l’activité enzymatique de l'uréase AE (AE = Vi pour 1 ml d’extrait uréasique ) :

On a AE
1 ml , alors que Vi
0,2 ml, Donc AE = (Vi x 1) / 0,2 = 2,71 10-3 µmol(H4+)/min
8. Calculer l’activité enzymatique totale de l’uréase (AET), (Vt d’extrait enzymatique = 37 ml)
AET = AE x Vt ; (A) AET = 0,1 µmol/min
9. Calculer l’activité enzymatique spécifique de l’uréase (AES). (Les protéines représentent 50% de la graine du soja)
AES = AET/ (quantité totale des protéines) ; (A.) AES = 0,1 / 2,5 103 = 4 10-5 µmol/min/mg
II. L’IFLUECE DE LA VARIATIO DE LA COCETRATIO E SUBSTRAT SUR LA VITESSE IITIALE
1. Compléter le tableau ci-dessous:
Tubes T 1 2 3 4 5
Urée 0.1M (ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1
3
[S] (x10 ) (µ M) 0 2 4 8 16 20
D.O. à 420 nm 0 0,25 0,41 0,48 0,56 0,58
[H4+] (x10-3) µmole / ml 0 2,5 4,1 4,8 5,6 5,8
Vi (x10-3) (µmoles d’urée/ ml /min) 0 0,125 0,205 0,24 0,28 0,29

1
 2. Donner pour le tube N° 3, un exemple de calcul de la [Ureé] de départ, de la [NH4+] formé après réaction et de la
valeur Vi correspondante :
[Ureé] départ = (Ci x Vi)/Vf ; (A) [Ureé] départ = (0,1 x 0,4) / 5 = 0,008 M = 8 103 µM
[H4+] formé = (DO x Fd) / a ; (A) [H4+] formé = (0,48 x 25) / 2,5 = 4,8 10-3 µmole/ml
+
Vi(µmoles d’urée/ ml /min) = ([H4 ] formé/ 2)/ dt ; (A) Vi = (4,8 10-3 /2) / 10 = 0,24 10-3 µmoles d’urée/ ml /min
3. Représenter graphiquement Vi (µmoles d’urée/ ml /min) en fonction de [S] (Figure 3)
4. Déterminer graphiquement les paramètres cinétiques Vmax et Km .
Selon la figure 3, on a trouvé que V max = 0,3 10-3 µmol/ml/min et Km = 2,4 103 µM
5. Interpréter brièvement le résultat obtenu :
Lorsque la concentration en urée n’est pas en excès, la vitesse initiale peut toujours varier. Cependant, en excès d’urée la
vitesse initiale devient constante (Vmax). De plus la valeur faible de Km montre que l’affinité de l’uréase à l’urée est forte.
6. Que représente Vmax par rapport à l’enzyme ?
Vmax représente la vitesse initiale mesurée en concentration saturée en urée au delà de laquelle, l’uréase
ne peut pas hydrolyser l’urée plus vite.

III . L’IFLUECE DE LA VARIATIO DE LA COCETRATIO DE L'EZYME SUR LA VITESSE IITIALE

1. Compléter le tableau ci-dessous
Tubes T 1 2 3 4 5
Urée 0.5M (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Uréase (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0,5
D.O. à 420 nm 0 0,182 0,287 0,451 0,537 0,636
[H4+] (x10-3) µmole / ml 0 3,6 5,7 9 10,7 12,7
Vi (x10-3) (µmoles d’urée/ ml /min) 0 0,18 0,287 0,45 0,537 0,636

2. Donner un exemple de calcul de la Vi pour le tube N°2 :

Vi = (DO x Fd x 10-3) / (2x 10x a) ; (A) Vi = (0,287x 50x 10-3)/ (2x10x2,5) = 0,287 10-3 µmoles d’urée/ ml /min
(µmoles d’urée/ ml /min)

3. Tracer la courbe Vi (µmoles d’urée/ ml /min) = f (Volume d’uréase) (Figure 4)

4. Comparer les Vi obtenues ici à la VM obtenue lorsqu'on fait varier la [Subsrat].
En excès d’urée (0,5 M), la vitesse initiale est directement proportionnelle à la concentration d’enzyme. Quand on
double le volume d’enzyme, la vitesse initiale est doublé (tube 2 et tube 4).

5. Que représente la pente de la courbe Vi (µmoles d’urée/ ml /min) = f (Volume d’uréase)

La pente représente l’activité enzymatique de l’uréase. Sa valeur est 1,35 10-3 µmol (Urée)/min.
AE exprimée en (urée) = (AE exprimée en H4+) / 2
6. Calculer l’activité enzymatique totale ( AET) et spécifique (AES) de l’uréase .
AET = 1,35 10-3 x 37 = 49,95 10-3 µmol (Urée)/min & AES = 49,95 10-3 / 2,5 103 = 19,98 10-6 µmol (Urée)/min /mg

7. Sachant qu’une Unité d’Activité Uréasique (UAE) correspond au volume d’enzyme (Ve) qui hydrolyse 1 µmol d’urée / mn.
Déterminer Ve.
Selon l’équation de régression, Vi = AE x Ve ; (A) Ve = 1/ 1,35 = 0,74 ml
8. Conclusion générale :
En excès de substrat, la vitesse initiale de l’uréase est maximale. Ainsi pour maximiser l’hydrolyse de l’urée par
l’uréase, il faut opérer dans des concentrations saturées en enzyme.