INTRODUCTION A LA

SPECTROSCOPIE
Explication d’un nombre de phénomènes

couleur de nos habits, certains aliments,

couleur du ciel, arc en ciel, étoiles…
I - DEFINITION

Spectroscopie : Etude des interactions

entre un rayonnement électromagnétique
et la matière.

Interactions e Matière effectue une

transition d’un état quantique à un autre
état quantique.
 Objectif des méthodes spectroscopiques

L’objectif est de voir quelles sont les

informations que l’on peut tirer des spectres
obtenus avec chaque spectroscopie. Des
spectres fournissent des informations sur la
structure, d’autres sur la présence de groupes
fonctionnels etc... De plus, certaines
méthodes permettent un suivi quantitatif de
réactions.
• Domaine de la spectroscopie : Tout
le spectre électromagnétique.

• Techniques nombreuses et variées.

• Phénomènes se manifestent de
diverses manières mais tous
gouvernés par un nombre limité de
principes généraux, relativement
simples
• Les ondes électromagnétiques
• Une onde électromagnétique comporte à la fois un champ électrique et un champ
magnétique oscillant à la même fréquence. Ces deux champs, perpendiculaires l’un par
rapport à l’autre se propagent dans un milieu selon une direction orthogonale (figure ci-
dessous).
La propagation de ces ondes s’effectue à une vitesse qui dépend du milieu considéré. Dans le
vide, la vitesse de propagation est égale à 3.108 m.s-1.
NATURE ET PROPAGATION D’UNE ONDE ÉLECTROMAGNÉTIQUE
 Une onde électromagnétique est caractérisée par
plusieurs grandeurs physiques :

• La longueur d’onde ( λ ) : elle exprime le caractère oscillatoire périodique

de l’onde dans l’espace.
C’est la longueur d’un cycle d’une onde, la distance séparant deux crêtes
successives.
Elle est mesurée en mètre ou en l'un de ses sous-multiples,
• le nanomètre 1 nm = 10-9 mètre
le micromètre 1 μm = 10-6 mètre
le centimètre 1 cm = 10-2 mètre.
• La période (T) : elle représente le temps
nécessaire pour que l’onde effectue un cycle.
L’unité est la seconde.
• La fréquence ( ν ) : inverse de la période, elle traduit le
nombre de cycles par unité de temps.
Elle s’exprime en Hertz (Hz) - un Hz équivaut à une oscillation
par seconde - ou en multiples du Hertz,
le kilohertz 1 kHz = 103 Hz
le mégahertz 1 MHz = 106 Hz
le gigahertz 1 GHz = 109 Hz
• Longueur d’onde et fréquence sont inversement
proportionnelles et unies par la relation suivante :
"
l= n

où
- λ : longueur d’onde de l’onde électromagnétique
- c : vitesse de la lumière (3.108 m.s-1)
- ν : la fréquence de l’onde
• Par conséquent, plus la longueur d'onde est petite,
plus la fréquence est élevée, et réciproquement.
 Le spectre électromagnétique

• Le spectre électromagnétique représente la répartition des ondes

électromagnétiques en fonction de leur longueur d'onde, de leur
fréquence ou bien encore de leur énergie (figure ci-dessous).
• Les ondes électromagnétiques
• Une onde électromagnétique comporte à la fois un
champ électrique et un champ magnétique oscillant à
la même fréquence. Ces deux champs,
perpendiculaires l’un par rapport à l’autre se
propagent dans un milieu selon une direction
orthogonale (figure ci-dessous).
La propagation de ces ondes s’effectue à une vitesse
qui dépend du milieu considéré. Dans le vide, la
vitesse de propagation est égale à 3.108 m.s-1.
 Rayonnement Electromagnétique :
Dualité onde-corpuscule
nature ondulatoire :
- Fréquence n de l'oscillation
périodique des champs

- Longueur d'onde l, distance

séparant deux maxima successifs :
l = c/n
- Rayonnement porteur d’une
énergie E dont la valeur dépend de
la fréquence
 nature corpusculaire

Rayonnement électromagnétique =
flux de particules : les photons ou quanta,
se déplaçant à la vitesse de la lumière

Energie d’un photon donnée par l’équation de

Planck :
E = hv

h = 6,624.10-34 J.s ; constante de Planck

n : fréquence classique de l’onde
La matière (Structure)

L’état d’un électron dans un atome, c’est-à-dire : son énergie,

ses mouvements autour du noyau, la forme de l’orbitale, est
défini par 4 paramètres appelés nombres quantiques.

• n = nb quantique principal qui caractérise les couches ou

niveaux énergétiques:
n 1 2 3 4 ......
couche K L M N

• l = nb quantique secondaire, caractérise les sous-couches ou

sous-niveaux énergétiques. 0 ≤ l ≤ n-1
l 0 1 2 3 ....n-1
sous-couche s p d f ....
La matière (Structure)
• m = nombre quantique magnétique, définit les orientations
dans l'espace des différentes trajectoires de l'électron
dans l'espace
-l ≤ m ≤ +l => 2l+1 valeurs

• s = nombre quantique de spin, introduit pour tenir compte de

la rotation de l'électron autour de son axe. -1/2 ou +1/2
La matière (Structure)
n =1, l = 0, m = 0 => électrons s
n = 2, l = 0, m = 0 => électrons s
l = 1, m = -1, 0, +1 => électrons p
n = 3, ...l = 2, m = -2, -1, 0, 1, 2 => électrons d
n, l et m définissent une orbitale ou case quantique représentée par
un carré, où les électrons sont notés par des flèches -1/2 et +1/2.

Les électrons de la dernière couche sont appelés électrons de

valence:
• ils sont impliqués dans l établissement des liaisons chimiques
• Ils sont responsables des propriétés spectrométriques
La matière (Structure)
Orbitales atomiques

• En mécanique ondulatoire un électron est à la fois une particule et une

onde.
• A cette onde est associée une équation d'onde dont la valeur dépend des
coordonnées x,y,z du point de l'espace considéré.
• Cette équation d'onde doit être normalisée et être solution de l'équation de
SCHRÖDINGER
• Les solutions de cette équation d'onde correspondent aux fonctions d'onde
y (Y) et leur représentation tridimentionnelle correspond aux orbitales
atomiques.
• Le carré de ces solutions y2(Y2) en chaque point de l'espace expriment la
probabilité de présence d'un électron en ce point
La matière (Structure)
Orbitales moléculaires s et p

En combinant mathématiquement la fonction d'onde des orbitales atomiques

d'énergie voisine, on obtient les orbitales moléculaires.

• orbitales moléculaires s
Dans le cas où les 2 orbitales atomiques s ont le même axe de symétrie, on
obtient une orbitale moléculaire s et une s *
Interaction matière-rayonnement

Echanges d’énergie entre matière

et rayonnement se font par
quantités finies et élémentaires
d’énergie appelées quanta
quanta : pluriel de quantum, quantité en latin

ΔE = hn
 Processus à la base des
phénomènes spectroscopiques
Absorption Diffusion

Emission
Deux conditions pour que la transition soit
permise:

 Fréquence de la lumière correspond

à l’écart énergétique (DE) entre les
niveaux concernés

‚ Le mouvement doit provoquer, à la

même fréquence, la variation du
moment dipolaire du système
Ordres de grandeurs des énergies
très différents Ee >> Ev >> Er
Le spectre électromagnétique
 LES DIVERSES SPECTROSCOPIES
Sauts d’énergie possibles à partir de la quantification
des énergies atomiques et moléculaires sur toute
l’étendue du spectre électromagnétique

D’où : Méthodes spectroscopiques extrêmement

diverses
 Remarque 1

Spectroscopies optiques : utilisant des radiations

RX, UV, visibles et IR
mécanisme dipôlaire électrique

Spectroscopies hertziennes : utilisant micro-

ondes et ondes radio
mécanisme dipôlaire magnétique
 Remarque 2

Ø Il existe une autre technique, qui ne

fait pas appel à des niveaux d'énergie
discrets : La spectrométrie de masse

Ø Elle connaît un champ d’application

considérable.
https://youtu.be/S0ni5gNA_-I
Spectroscopie
UV-Visible
 Spectroscopie d’absorption UV-Visible
I. Introduction.

Spectroscopie : Etude des interactions entre la matière et un rayonnement

électromagnétique.

Une molécule absorbera une radiation de fréquence n s’il existe des transitions

nécessitant une énergie : ∆E = hn (h = 6,63 10-34 J.s, Cte de Planck)

Eexcité
n : fréquence
l: longueur d’onde
∆E = hn = hc/l = hcn
n : nombre d’onde

Efondamental

Absorption d’un rayonnement dans le domaine de l’UV-Visible : excitation d’électrons

de valence.
 II. Le spectre électromagnétique

Modification d’états de spin nucléaire

Résonance Magnétique Nucléaire

Excitation d’électrons de valence Modification d’états de spin électronique

190-400 nm : proche UV Résonance Paramagnétique Electronique
400-700 nm : Visible
700-1100 nm : très proche IR Transitions entre niveaux vibrationnels
L’œil humain n’est sensible qu’à une toute petite partie du spectre
électromagnétique, un domaine que l’on appelle « lumière visible », dont la
longueur d’onde va de 350-400 nm (violet) à 700-750 nm (rouge).
Lorsqu’un composé absorbe l’une des couleurs de la lumière blanche, sa
couleur correspond à la couleur complémentaire
Lorsqu'on regarde le spectre sortant d'un monochromateur éclairé par une
"lumière blanche" on observe l'étalement des couleurs présentées sur la figure
ci-dessous.
 Spectroscopie
UV-Vis
Analyse quantitative et
qualitative
La couleur est une propriété
importante d'une substance. La
couleur de la matière est liée à son
absorbance ou à sa réflexivité. L'œil
humain voit la couleur
complémentaire à celle qui est
absorbée.
Connaissant ce spectre et la "rose" des
couleurs, il est possible de prévoir le
domaine de longueur d'onde où un composé
d'une couleur donnée absorbe dans le visible
(couleur complémentaire).
• L'analyse spectrophotométrique est fondée sur l'étude du
changement d'absorption de la lumière par un milieu, en fonction de
la variation de la concentration d'un constituant.

• Elle permet de travailler sur de faibles quantités de substances et

est non destructrice vis-à-vis de l'échantillon.

•Elle s'applique à un très grand nombre de dosages. On détermine la

concentration d'une substance en mesurant l'absorption relative de la
lumière par rapport à celle d'une substance de concentration connue.
Elle est d’autant plus grande que l’intensité transmise est faible.
• L’absorption de lumière correspond à une transition
électronique, phénomène au cours duquel, de l’énergie
supplémentaire est communiquée à un électron de valence
qui passe dans une orbitale de plus haute énergie.
• le nombre de « bandes d’absorption » dans un spectre UV-
visible est généralement assez réduit si bien que la
spectrophotométrie d’absorption UV-visible est surtout
utilisée à des fins d’analyse quantitative, basée sur la loi de
Lambert-Beer et non d’analyse qualitative.
 III. Absorption moléculaire, spectre de bandes

- dans un atome :
l’absorption du rayonnement donne naissance à une seule raie spectrale
Etat d'énergie excité

Transition électronique

Etat d'énergie fondamental

- dans une molécule :
les ≠ états électroniques ont des domaines énergétiques larges, dus aux niveaux
vibrationnels et rotationnels : Etotale = Eélectronique + Evibrationnelle + Erotationnelle
E

Rapport ≈ 1000:50:1
Loi de Beer-Lambert

• Lorsqu'une substance absorbe de la lumière dans le domaine de l'ultra-violet et du

visible, l'énergie absorbée provoque des perturbations dans la structure électronique
des atomes, ions ou molécules. Un ou plusieurs électrons utilisent cette énergie pour
passer d'un niveau de basse énergie à un niveau de plus haute énergie. Ces
transitions électroniques se font dans le domaine du visible, de 400 à 800 nm et de
l'ultra-violet entre 180 et 400 nm.

•Un milieu homogène traversé par de la lumière absorbe une partie de celle-ci ; les
différentes radiations constituant le faisceau incident sont différemment absorbées
suivant leur longueur d'onde et les radiations transmises sont alors caractéristiques
du milieu.

• Soit un rayon lumineux monochromatique de longueur d'onde λ traversant un

milieu homogène d'épaisseur l. Le taux de décroissance de l'intensité lumineuse en
fonction de l'épaisseur du milieu absorbant est donné par la loi de Beer-Lambert :
l'intensité de l'onde absorbée est proportionnelle à l'épaisseur de l'échantillon, au
nombre de molécules absorbantes par unité de volume et à un coefficient propre à
l'échantillon de matière
SPECTRE D’ABSORPTION

Spectre représente : transmittance %T ou absorbance A en fonction de λ o

Remarque : Les spectres sont parfois représentés en ε ou log ε

Intérêts de la spectroscopie UV-Visible :

- large domaine d’applications (Chimie minérale, organique,

biochimie),
90% des analyses médicales
- analyses quantitatives (loi de Beer-Lambert)
- grande sensibilité : limite de détection ≈ 10-5 M
- précision : 1 - 5% erreur
- simplicité, rapidité.
Origine des absorptions :
L’absorption dans le domaine UV/visible est due au passage d’un niveau
électronique à un autre d’énergie supérieure avec changement des niveaux de
vibration et de rotation; au cours de ce processus, un électron passe d’une orbitale
moléculaire à une autre d’énergie supérieure.
Si on ne considère que les composés de la chimie organique, seules les orbitales
moléculaires construites à partir d’orbitales atomiques s et p sont à prendre en
compte

FIGURE : Niveaux d’énergie électronique correspondant aux différents types

d’orbitales d’une molécule et transitions possibles
Les différents types de transitions

1. Dans les composés organiques

-transitions σ σ* : λmax < 150 nm (UV lointain)

-transitions n σ* : 150 nm < λmax < 250 nm, intensité moyenne (50 < ε < 2000 L.mol-1.cm-1)
-transitions π π* : λmax > 190 nm (> 400 nm pour systèmes très conjugués), forte intensité
(1000 < ε < 10000 L.mol-1.cm-1)
-transitions n π* : λmax > 190 nm, faible intensité (10 < ε < 100 L.mol-1.cm-1)
- Transition σ →σ*

La grande stabilité des liaisons σ des composés organiques se traduit par un écart important
entre les niveaux orbitalaires frontières correspondants. Cette transition d'un électron d'une
OM liante σ dans une OM antiliante σ * demande beaucoup d'énergie ; elle est intense et
située dans le lointain UV, vers 130 nm (λmax, éthane = 135 nm, ε= 10 000). C'est pourquoi
les hydrocarbures saturés, tels l'hexane ou le cyclohexane, qui ne présentent que des
liaisons de type σ, sont pratiquement transparents dans le proche UV.
Le cyclohexane et l'heptane constituent de bons solvants d'un point de vue optique ; à 200
nm l'absorbance est de 1, pour une épaisseur traversée de 1 cm. C'est la longueur d'onde
limite pour l'usage de ces solvants. Malheureusement, leur pouvoir de solvatation est
insuffisant pour dissoudre les composés très polaires.
 s* s*
p* p*
- Transition n→ σ *
n hv
n

p p
s s
Le transfert d'un électron d'une paire libre (doublet n) des atomes O, N, S, X
à un niveau σ* est observé pour les alcools vers 180 nm, pour les amines vers
220 nm, pour les éthers vers 190 nm ainsi que pour les dérivés halogénés.
Cette transition d'intensité moyenne, se situe à l'extrême limite du proche
UV.
Exemples
méthanol : λmax= 183 nm (ε= 500); éther λmax= 190 nm ε= 2 000)
éthylamine :λmax = 210 nm (ε= 800).
 s* s*
-Transition n→π* p* p*
n hv
n

p p
n p*
s s
Cette transition résulte du passage d'un électron d'une OM non-liante n à une
OM antiliante π*. Ce type de transition est rencontré, dans le cas des
molécules qui comportent un hétéroatome porteur de doublets
électroniques libres appartenant à un système insaturé. La plus connue est
celle qui correspond à la bande carbonyle, facilement observable, située
entre 270 et 280 nm. Le coefficient d'absorption molaire est faible : pour
l'éthanal par exemple, λmax= 293 nm et ε= 12 (éthanol). La polarité de la
liaison est modifiée après absorption du photon. Ceci permet de comprendre
pourquoi la nature du solvant peut influer sur la position de la bande
d'absorption.
- Transition π→π*

Les composés, qui possèdent une double liaison éthylénique isolée, conduisent à
une forte bande d'absorption vers 170 nm (éthylène λmax = 165 nm, ε= 16 000)
dont la position dépend de la présence de substituants hétéroatomiques.

s* s*
p* p*
hv

p p
s s
Les transitions n → π* et n → σ* : intensité relativement faible car
en partie interdites

n → π*: transitions dans des molécules comportant hétéroatome

porteur de doublets électroniques libres appartenant à un système
insaturé
n → σ*: les alcools , les éthers, les amines , les dérivés halogénés
 En résumé

L’absorption dans la région des ultraviolets met en jeu:

Ø les électrons σ des liaisons saturées

Ø les électrons π des liaisons insaturées
Ø les électrons n des doublets non liants des hétéroatomes.

λ nm
200 400
Groupements chromophores isolés
Les groupements chromophores des composés organiques sont, à la
ressemblance des fonctions, des groupements d'atomes responsables
d'absorptions caractéristiques. Par extension, le chromophore correspond
au site qui est dans la molécule, à l'origine de la transition électronique.
Les molécules appelées chromogènes sont formées d'un squelette porteur
d'un ou de plusieurs chromophores. Pour une série de composés possédant
le même chromophore, la position ainsi que l'intensité des bandes
d'absorption restent sensiblement constantes, sauf s'il y a accumulation de
plusieurs chromophores à proximité les uns des autres. Lorsque les
chromophores sont isolés, c'est-à-dire séparés par au moins deux liaisons
simples, on observe uniquement la superposition des effets individuels.
Chromophores élémentaires lmax (nm) emax (L.mol-1.cm-1)

> C = C < (alcène) 173* 10000

- C C - (alcyne) 178* 2000
> C = O (cétone) 290 16
- CH = O (aldéhyde) 279 15
- COOH (acide) 208 32
- COCl (chlorure d'acide) 220 100
- CONH2 (amide) 220 63
- COOR (ester) 211 57
- NO2 (nitro) 214 17
- N = N - (azométhane) 338 4
Chromophore Example Excitation λmax, nm ε Solvent

C=C Ethene π __> π* 171 15,000 hexane

C≡C 1-Hexyne π __> π* 180 10,000 hexane
n __> π* 290 15 hexane
C=O Ethanal
π __> π* 180 10,000 hexane
n __> π* 275 17 ethanol
N=O Nitromethane
π __> π* 200 5,000 ethanol

C-X X=Br Methyl bromide n __> σ* 205 200 hexane

X=I Methyl Iodide n __> σ* 255 360 hexane
La présence dans une même molécule de plusieurs de ces chromophores peut se traduire
soit (1) par une simple additivité si ces chromophores sont indépendants, soit (2) par des
effets bathochromes (déplacement vers les plus grandes longueurs d'onde en UV ou vers le
visible) et hyperchromes (augmentation du coefficient d'absorption moléculaire) lorsque
ces chromophores sont conjugués. C'est le cas des systèmes diéniques, polyéniques,
aromatiques (plusieurs liaisons >C=C<) ou résultant de la conjugaison de chromophores
différents. Les spectres dépendent également des interactions avec le solvant. Bien
évidemment, dans l'eau, les spectres sont très souvent sensibles au pH qui modifie
l'ionisation de certaines fonctions chimiques.

Résumé des différents effets de solvant ou de substituant en UV-Visible.

Groupe Auxochrome : groupe saturé, qui par son effet sur un groupe chomophore
modifie l'absorption de ce chromophore. Sans apporter directement eux-mêmes la
couleur, aident à son apparition car ils comportent des électrons suffisamment mobiles
pour être engagés dans des orbitales moléculaires dont les différents niveaux
énergétiques sont plus proches les uns des autres (DΕe diminue, ce qui correspond à
un effet bathochrome) et qui ont un meilleur recouvrement spatial, ce qui facilite les
transitions (le coefficient d’extinction spécifique ε est plus grand, c’est-à-dire
l’intensité de la transition ; on dit qu’on a alors un effet hyperchrome). On peut citer
par exemple, au nombre de ces groupes auxochromes, des groupements fonctionnels
tels que –NH2 ou –OH.

Exemple d'effet auxochromique : modification de l'absorption due au noyau

benzénique par substitution par un atome de Cl. Le chlore par effet inductif et
mésomère modifie l'énergie des orbitales p du cycle benzénique et donc l'absorption
UV-visible.
Effets dus aux solvants: solvatochromie
La position, l'intensité et la forme des bandes d'absorption des composés en solution, diffèrent
lorsqu'on change de solvant. C'est une des raisons qui rendent les bibliothèques de spectres UV
difficilement exploitables. Ces changements traduisent les interactions physiques
soluté/solvant qui modifient la différence d'énergie entre état fondamental et état excité.
L'étude de ces modifications permet de tirer quelques règles générales :

- Effet hypsochrome
Il existe des transitions pour lesquelles la polarité du chromophore diminue quand on passe de
l'état fondamental à l'état excité. Il en est ainsi pour la transition n®p* du carbonyle des
cétones en solution. Avant absorption, la polarisation C+-O- sera d'autant plus stabilisée que le
composé sera en présence d'un solvant polaire dont les molécules seront attirées par effet
électrostatique autour du soluté. Ceci aura pour effet de nécessiter plus d'énergie pour
provoquer la transition électronique n®p*, d'où un déplacement du maximum d'absorption
correspondant vers les courtes longueurs d'ondes (effet hypsochrome) comparativement à la
position de la bande d'absorption de ce chromophore dans un solvant non-polaire. L'état excité
étant atteint rapidement, la cage de solvant qui entoure le carbonyle n'a pas le temps de se
réorienter pour stabiliser la situation après absorption du photon. Cet effet s'observe
également pour la transition n®s*. Il est accompagné d'une variation du coefficient
d'absorption e
 .

-Effet bathochrome

Pour les solutés peu polaires, il n'y a pas d'effet d'orientation des molécules
de solvant autour des molécules de soluté. Si le moment dipolaire du
chromophore augmente au cours de la transition, l'état final sera plus
solvaté. On rencontre cette situation pour la transition p®p* des
hydrocarbures éthyléniques dont la double liaison de départ est moins polaire
avant qu'après absorption du photon. Un solvant polaire a donc pour effet de
stabiliser la forme excitée, ce qui favorise la transition : on observe un
déplacement vers les grandes longueurs d'ondes. Cet effet bathochrome est
défini par rapport au spectre obtenu dans un solvant non polaire. En résumé,
l'étude du déplacement et des variations d'intensité des bandes d'absorption
par effet de la polarité des solvants peut aider à reconnaître la nature
électronique des transitions observées.

*
Effets de solvant :
 Effets de la conjugaison :

q Si plusieurs chromophores sont juxtaposés dans une même molécule,

l'ensemble forme un système conjugué de chromophores.

q Le spectre est fortement perturbé par rapport à la simple superposition des

effets produits par les chromophores isolés.

q Plus le nombre d'atomes sur lequel le système conjugué s'étend, plus

la délocalisation spatiale des électrons est importante et plus l'écart
entre niveau fondamental et niveau excité diminue.

q Dans les molécule polyéthylèniques, la bande d'absorption se déplace de

I'ultraviolet vers le visible à mesure que le nombre de double liaisons conjuguées
augmente. À partir de 8 double liaisons conjuguées, les corps absorbent dans le
visible.

q Ainsi la couleur orangée du β-carotène (formule ci-dessous), provient de la

réunion de onze doubles liaisons conjuguées entre elles λmax = 497 et 466 nm
dans le chloroforme.
β-carotène
 Effets de la conjugaison :
Cas des éthyléniques

Molécule Nombre Transition Bande

De (= ) p - p
*
d’absorption
1
175 nm
Ethylène

2 227 nm
Butadiène

263 nm
3

CH3-(CH=CH)6-CH3
352 nm
6

CH3-(CH=CH)9-CH3 9 413 nm
Effet de la conjugaison des chromophores:

Conjugaison : rapprochement des orbitales π et π* : λ

λ : effet bathochrome
λ : effet hypsochrome
ε : effet hyperchrome
ε : effet hypochrome

Conjugaison; mais aussi :

effets de substituants (NR2,
OH, OR, X,…),
effets de solvant (polarité),…
Appareillage
Schéma de principe d’un spectrophotomètre
Un spectrophotomètre comprend 4 parties essentielles.

Source lumineuse
Elle est constituée par :
Une lampe à décharge au deutérium utilisée dans le domaine de 190 à 400 nm avec un
maximum d'émission à 652,1nm.

lampe UV au deutérium

Une lampe à incandescence à filament de tungstène pour la région allant de 350 à 800 nm.

Lampe à incandescence à filament de tungstène (ou à halogène)

Une lampe à décharge au xénon utilisée dans le

domaine UV et visible. Ce type de lampe est très
énergétique. Elle fonctionne sous forme de flash,
juste au moment de faire une mesure.

Sensibilité spectrale des sources

Monochromateur

L'élément de base est un prisme, un réseau ou un filtre coloré. Le rôle du

monochromateur est d'isoler le rayonnement sur lequel on fait la mesure. Il est
composé principalement d'un système dispersif, d'une fente d'entrée et d'une fente
de sortie.
Cuve
• Les cuves doivent être transparentes à la lumière qui les traverse. Elles font
toutes, sauf exception, un centimètre de trajet optique.
• Suivant la nature du matériau utilisé : plastique (polystyrène ou PMMA), verre ou
quartz, le domaine de longueur d'onde utilisable est différent (le prix aussi
d'ailleurs).

- Cuves en plastique : elles sont bon marché mais elles ne résistent pas à la plupart
des solvants organiques :
- polystyrène optique : domaine : 350 - 800 nm
- PMMA : domaine : 250 - 800 nm

-Cuves en verre : résistent aux solvants, domaine : 300 - 800 nm

- Cuves en quartz : pour obtenir des spectres dans l'UV lointain, mais ce sont les
plus coûteuses, domaine : 200 - 800 nm
 Détecteur
photodiode (semi-conducteur)(transformation du signal lumineux en signal électrique)
Lorsqu'un photon rencontre un semi-conducteur, il peut transférer un électron de la bande
de valence (niveau énergétique bas) vers la bande de conduction (niveau énergétique
haut) en créant une paire électron - trou. Le nombre de paires électron - trou est fonction
de la quantité de lumière reçue par le semi-conducteur qui peut donc être utilisé en tant
que détecteur optique.
Détecteur

barrette de diodes

L'emploi d'une barrette de diodes permet une mesure simultanée sur toute
l'étendue du spectre. Une barrette CCD est un alignement de photodiodes de
petites dimensions (14µm x 14 µm) qui fonctionnent en intégrateur de lumière.
La charge qui apparaît dans une photodiode est proportionnelle à l'exposition,
c'est à dire au produit de l'éclairement par le temps de pose et elle dépend de la
longueur d'onde. A la fin de la pose, le contenu des capteurs est transféré dans
un registre analogique à décalage et une nouvelle pose commence. Ce registre
transmet les données mémorisées en mode série, c'est à dire l'une après l'autre à
un rythme fixé par l'électronique de commande de la barrette CCD. Ces données
apparaissent sous forme de tension. Dans le spectrophotomètre Mécacel, ces
tensions sont converties en un tableau de nombres par l'interface qui relie le
spectrophotomètre à l'ordinateur. Le logiciel traite ce tableau de valeurs.
Couplé à un ordinateur, le spectrophotomètre permet de tracer très rapidement
des spectres d'absorption. Le logiciel gère le temps de pose du capteur CCD.
Détecteur

photomultiplicateur
Une radiation incidente arrache un électron de la cathode par effet
photoélectrique. Cet électron est alors accéléré vers une seconde
électrode appelée dynode portée à un potentiel supérieur. L'énergie de
l'électron incident est suffisante pour arracher plusieurs autres électrons
et ainsi de suite, d'où l'effet multiplicatif. Pour un électron arraché sur la
cathode on peut récupérer jusqu'à 106 électrons sur l'anode.
Applications
Détermination d'une concentration inconnue

Cas d'une seule substance absorbante Loi de LAMBERT-BEER

Courbe d'étalonnage

Ceci permet d'établir expérimentalement la courbe A=f(c) reliant l'absorbance et la

concentration de la substance étudiée (avec l = 1cm)), en effectuant les mesures de A pour
diverses concentrations.
La valeur de e à une longueur d'onde donnée peut être précisément déterminée par un
étalonnage. On mesure pour cela l'absorbance A de solutions contenant des quantités
croissantes et connues de substance. En portant les couples de valeurs (A, C) sur un
graphique on obtient une droite, passant par l'origine, de pente e.l, on en déduit la valeur de
e.
Les mesures s'effectuent généralement à une longueur d'onde correspondant au sommet d'un
maximum du spectre d'absorption de la substance. A cette longueur d'onde, la sensibilité est
la plus grande (e maximum) et les erreurs entraînées par un calage défectueux de la longueur
d'onde se traduisent par une erreur minimum sur l'absorbance.
La loi de Beer-Lambert étant généralement vérifiée dans l'intervalle d'absorbance 0-1,3, les
concentrations des solutions étalons (au moins 5 solutions) seront choisies de façon à couvrir
tout cet intervalle.
La courbe expérimentale d'étalonnage
permet ensuite de déterminer la
concentration inconnue d'une solution de
cette substance par simple mesure de son
absorbance et report sur le graphe A =
f(c).
De façon à avoir la précision la plus
grande possible dans la détermination de
la concentration de la solution inconnue,
l'absorbance mesurée pour cette solution
(éventuellement diluée) doit être
comprise dans le tiers supérieur de la
partie linéaire de la courbe d'étalonnage.
Cas de plusieurs substances en solution
S'il n'y a pas d'interaction chimique, l'absorbance A d'une solution est la somme des
absorbances que l'on obtiendrait si chacune des substances était successivement seule en
solution.

Par exemple considérons un

mélange de 2 substances J et
R, on a pour toute longueur
d'onde l :
Al = eJ,l .l. [J] + eR,l .l. [R]

Pour connaître les concentrations des deux substances J et R dans un mélange, il est tout
d'abord nécessaire de déterminer les coefficients d'absorption de chaque composé aux
deux longueurs d'onde de travail (eJ,lJ , eJ,lR, eR,lJ et eR,lR). On effectuera pour cela quatre
étalonnages tels que décrit dans le cas d'une substance pure.
Puis, on mesure l'absorbance du mélange aux deux longueurs d'onde lJ et lR. Connaissant
eJ aux deux longueurs d'onde (eJ,lJ et eJ,lR) et e R aux deux mêmes longueurs d'onde (eR,lJ
et eR,lR) on résout le système suivant obtenu pour ces deux longueurs d'onde .
AlJ= l. (eJ,lJ . [J] + eR,lJ . [R])
AlR = l. (eJ,lR . [J] + eR,lR . [R])
C'est un système de deux équations linéaires à deux inconnues dont la résolution donne
les concentrations en J et en R cherchées.
Limites de validité de la loi de Beer-Lambert :
- solutions diluées (c < 0,01 M)
- absence d’interactions soluté-solvant
- lumière monochromatique (impossible dans l’absolu)
- influence de la lumière parasite, éviter de travailler à A > 1,5
Applications

En cinétique chimique, les points isobestiques sont utilisés comme points de

référence dans l'étude des vitesses de réaction, l'absorbance à ces longueurs
d'ondes étant constante tout au long de la réaction.
L'observation d'un point isobestique indique seulement que la stœchiométrie de
la réaction ne change pas durant la réaction chimique (ou le changement d'état
de l'échantillon), et qu'aucune réaction secondaire ne se produit pendant la
durée de l'analyse.
Les points isobestiques sont utilisés en médecine dans une technique de laboratoire
appelée oxymétrie afin de déterminer la concentration en hémoglobine, sans se
soucier de sa saturation. L'oxyhémoglobine et la désoxyhémoglobine ont des points
isobestiques à 590 et 805 nm.

Les points isobestiques sont aussi utilisés en biochimie clinique, comme méthode
d'assurance qualité, afin de vérifier la précision sur une longueur
d'onde d'un spectrophotomètre. Cela est réalisé en mesurant le spectre d'une
substance étalon pour deux conditions pH différentes (en dessus et au-dessous
du pKa du composé). Les substances utilisées comme standard comprennent
le dichromate de potassium (points isobestiques à 339 et 445 nm), le bleu de
bromothymol (325 et 498 nm) et le rouge congo (541 nm). La longueur d'onde
déterminée pour un point isobestique ne dépend pas de la concentration du
composé utilisé et, en tant que tel, il devient ainsi une référence très fiable.
 Spectroscopie UV-Vis
Applications
MARCHÉ APPLICATIONS

• Matériaux en vrac
• Composants optiques : filtres, lentilles, miroirs, séparatrices, polariseurs, verre
• Films fins, revêtements optiques et anti-réfléchissants, matériaux nanocomposites, peintures,
cellules solaires
Matériau • Lunettes de protection
• Pulpe et papier
• Matériel de camouflage
• Lunettes de soleil
• Tissus/textiles

• AQ/CQ sur les matières premières et les produits finis issus de la fabrication industrielle
• Identification chimique ou étude des processus chimiques : laboratoires de chimie synthétique, recherche en
Produits chimiques photochimie, caractérisation de nanoparticules, recherche en chimie des surfaces
• Chimie analytique
• Mesures des couleurs : Peintures et textiles (correspondance des couleurs, AQ/CQ sur les tissus, mesures SPF)

• Analyses de fixation médicamenteuse

• Réactions enzymatiques
Biotechnologie et • Analyse d'échantillons biologiques turbides, de tissus, de cellules
pharmaceutique • Mesures d'ions intracellulaires
• Acide nucléique (ARN/ADN) et détermination des protéines
• Mesures de dénaturation/renaturation de l'ADN et des protéines
 Spectroscopie UV-Vis
Capacités
La relation linéaire simple entre
l'absorbance et la concentration, et
la facilité relative de la mesure de la
lumière UV-Visible ont fait de la
spectroscopie UV-Visible la base de
milliers de méthodes analytiques
quantitatives.
Spectroscopie UV-Visible
Avantages
• Large application en matière d'analyse quantitative et
qualitative
• Peut être utilisée pour plusieurs types de molécules et
d'ions organiques et inorganiques
• Facilité d’utilisation
• Rapide
• Faible besoin de maintenance
• Mesure non destructive
Limitations
• Limites de détection supérieures (moins bonnes) que la
fluorescence
• Des bandes d'absorption superposées peuvent interférer
• Peut être difficile pour les composés sensibles à la lumière
si utilisation d'une source D2 et QI (non applicable lors de
l'utilisation d'une source de xénon)