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Application à l’hématologie maligne

des techniques de biologie moléculaire
C. Callens, R. Ben Abdelali, E. Macintyre

Les hémopathies malignes constituent un groupe de pathologies hétérogènes dans leur pronostic et
leur oncogénèse, mais représentent un modèle d’étude privilégié des mécanismes de cancérogenèse chez
l’homme par la présence d’anomalies génétiques récurrentes impliquées dans leur processus oncogénique
et la disponibilité aisée de matériel tumoral. Les techniques de biologie moléculaire tiennent aujourd’hui
une large place dans la prise en charge de ces maladies. Elles sont indispensables au diagnostic, à
l’évaluation du pronostic, à la décision thérapeutique et au suivi des malades après traitement. D’un
point de vue plus fondamental, les techniques de biologie moléculaire ont transformé notre capacité
à caractériser les hémopathies malignes et à comprendre les processus qui les induisent. L’analyse des
anomalies moléculaires récurrentes dans les leucémies et les lymphomes a largement contribué à améliorer
notre compréhension des mécanismes oncogéniques et physiologiques. Aujourd’hui, les techniques à
haut débit telles que les puces et le séquençage nous permettent de découvrir et d’étudier de nouvelles
anomalies dont l’accumulation est nécessaire au développement d’une hémopathie maligne.
© 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Biologie moléculaire ; Hémopathie maligne ; Clonalité ; Maladie résiduelle ; PCR ; Séquençage

Plan  Introduction
■ Introduction 1 Depuis la découverte de la structure en double hélice de l’acide
■ Techniques de base de la biologie moléculaire 1 désoxyribonucléique (ADN) il y a 40 ans, la biologie molécu-
Amplification en chaîne par une ADN polymérase laire a transformé notre capacité à caractériser les hémopathies
thermostable (« polymerase chain reaction ») 2 malignes et à comprendre les processus qui les induisent. Grâce
RT-PCR (PCR après transcription inverse) 3 aux développements technologiques, la biologie moléculaire,
PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR) 3 d’abord cantonnée à la recherche, s’applique maintenant en rou-
Séquençage 5 tine à l’évaluation biologique de malades atteints d’hémopathie
Arrays : transcriptome, SNP, CGH 5 maligne. Ces techniques aident au diagnostic, à l’évaluation du
Technique de transfert d’empreintes : « blotting » 7 pronostic, au choix thérapeutique et au suivi du malade après
Électrophorèses 7 traitement. Sur un plan plus fondamental, l’analyse structurelle
■
et fonctionnelle des gènes dérégulés dans les leucémies et les
Applications à l’hématologie maligne 7
lymphomes a beaucoup amélioré notre compréhension des méca-
Détection d’une population lymphoïde clonale 7
nismes à la fois oncogéniques et physiologiques.
Détection des anomalies génétiques récurrentes 10
■ Apport de l’analyse moléculaire 11
Diagnostic
Pronostic
11
11  Techniques de base de la biologie
Détection de la maladie résiduelle 11 moléculaire
Choix thérapeutique 13
Détection de la résistance aux drogues 13 Les acides nucléiques dans la cellule sont de deux types :
Évaluation moléculaire post-allogreffe 13 • l’ADN, enchaînement de 3 milliards de nucléotides chez
■ Perspectives d’avenir 13 l’homme, répartis sur 46 chromosomes, appelé ADN géno-
mique ;

EMC - Hématologie 1
Volume 7 > n◦ 2 > mai 2012
http://dx.doi.org/10.1016/S1155-1984(12)57820-9
13-000-K-30  Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire
1 2
ADN
Dénaturation
95° C
Amorce sens
Hybridation Répétition
60° C n cycles
Amorce
antisens
Élongation
72° C
2n copies
A B
• l’acide ribonucléique (ARN), lien entre le génotype (ADN) et le
phénotype (la protéine).
Ces deux acides, même s’ils ne différent que par l’absence
d’un oxygène au niveau d’un sucre de l’ADN par rapport à
l’ARN, n’ont pas les mêmes caractéristiques physicochimiques
et ne donnent pas les mêmes informations en biologie molécu-
laire.
L’ADN et l’ARN sont extraits des cellules nucléées : un milli-
litre de sang contient en moyenne 30 à 50 ␮g d’ADN. L’ADN
est relativement résistant, à la différence de l’ARN. La qualité de
l’extraction est importante pour l’analyse de l’ADN génomique et
pour l’analyse de l’ARN.
Amplification en chaîne par une ADN
polymérase thermostable (« polymerase
chain reaction »)
Cette méthode a révolutionné la biologie moléculaire des
années 1990 et a été couronnée par l’attribution du prix Nobel
de chimie en 1993 [1] . Elle est basée sur l’amplification de frag-
ments d’ADN délimités par deux courtes séquences reconnues par
deux oligonucléotides, dites amorces, grâce à une ADN polymé-
rase résistant à une haute température (95 ◦ C).
Il existe trois phases distinctes lors de l’amplification en chaîne
par la polymérase (le sigle américain de cette méthode, PCR, pour
polymerase chain reaction, universellement connu, sera utilisé dans
le texte) (Fig. 1).
Dénaturation
L’ADN est dénaturé par chauffage à haute température (95 ◦ C),
température à laquelle l’ADN polymérase résiste à la dégradation :
les deux brins se séparent.
Hybridation
La température de la solution est de l’ordre de 50 à 60 ◦ C pour
permettre à deux petits fragments d’ADN simple brin d’une ving-
taine de bases (amorces), complémentaires de la région à amplifier
et l’encadrant, de s’apparier à l’ADN génomique dénaturé (la dis-
tance entre les deux amorces peut varier entre une centaine de
paires de bases et environ 2 kb en routine). Ces amorces se fixent
préférentiellement à la région à amplifier. Elles sont nécessaires au
fonctionnement du système, car la polymérase ne peut déclencher
d’elle-même la réplication, et apportent aussi la spécificité de la
réaction.
2 EMC - Hématologie
3 4 Figure 1. Amplification génomique
par polymérisation en chaîne (polyme-
rase chain reaction [PCR]).
A. Théorie.
B. Exemple de PCR. 1, 2. Pro-
duit d’amplification ; 3. contrôle
d’amplification sans acide désoxyri-
bonucléique (ADN) ; 4. marqueur de
poids moléculaire.
Élongation
La température est à 72 ◦ C, température optimale d’activité
de l’ADN polymérase extraite d’une bactérie thermophile iso-
lée de geysers, Thermus aquaticus, d’où est tiré le nom de
l’enzyme : Taq polymérase. Cette enzyme n’est pas dégradée
par l’étape de dénaturation de 95 ◦ C, à la différence des ADN
polymérases qui avaient été préalablement utilisées. La Taq poly-
mérase copie l’ADN simple brin à partir des deux amorces :
le fragment d’ADN compris entre les deux amorces s’est alors
dupliqué.
Puis ces trois étapes (un cycle) sont répétées.
Après n cycles, le nombre de copies de la région ampli-
fiée est théoriquement de 2n . Les cycles étant habituellement
répétés 30 fois, on obtient en théorie 230 copies du gène ini-
tial, soit une amplification de l’ordre du milliard. Le produit
de l’amplification (amplicon) est ensuite visualisé sur un gel
d’agarose ou d’acrylamide (selon la taille du fragment amplifié),
qui permet la séparation des fragments en fonction de la taille.
L’utilisation d’amorces fluorescentes permet d’améliorer la réso-
lution de l’analyse du produit de PCR [2, 3] . L’une des amorces
(généralement l’antisens) est rendue fluorescente par la fixation
à son extrémité 5 d’une molécule capable d’émettre une fluores-
cence de longueur d’onde déterminée après une excitation laser.
Par cette approche, le produit de PCR obtenu après amplification
est détectable par la fluorescence émise lors du passage devant la
fenêtre de lecture au cours de la migration capillaire électrophoré-
tique sur un analyseur de fragments (Genescan® ). Ceci permet de
lui attribuer une taille précise et améliore la sensibilité de détec-
tion du signal.
Plus généralement, la PCR apporte un énorme gain de sensibi-
lité : le minimum d’ADN nécessaire pour la méthode historique
de Southern (voir plus loin) est de 5 ␮g, soit environ 750 000
cellules, tandis qu’avec la PCR on peut aller jusqu’à l’analyse
d’une seule cellule. Elle est donc particulièrement indiquée pour la
détection de séquences très peu représentées ou quand on dispose
de peu de matériel pathologique. Cette méthode a aujourd’hui
complètement supplanté la technique de Southern en routine
en raison de sa rapidité (moins de 3 heures contre 1 semaine),
de sa sensibilité et de l’absence de produits radioactifs. Mais la
sensibilité très élevée de cette méthode a pour contrepartie un
inconvénient majeur, le risque de faux positifs par amplification
d’ADN présent comme aérosols dans le laboratoire ou contami-
nant les échantillons à analyser, d’où la nécessité de travailler
dans des conditions très rigoureuses pour rendre des résultats
fiables.
 Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire  13-000-K-30
Intron 1
Intron 2
Promoteur
ADN
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Transcription
et polyadénylation
ARN AAAAAAAA
prémessager
ARN messager AAAAAAAA
A B
Figure 2.
A. Synthèse de l’acide ribonucléique (ARN) messager. L’ARN prémessager est synthétisé à partir du promoteur par l’ARN polymérase. Il est ensuite polyadénylé
et les introns sont épissés, produisant ainsi l’ARN messager mature. ADN : acide désoxyribonucléique.
B. Synthèse de l’ADN complémentaire. En présence d’une amorce (soit oligo d(T) qui se fixe sur la région polyadénylée, soit hexamères de séquence aléatoire
qui se fixent partout sur l’ARN, soit amorce spécifique), la transcriptase inverse (ADN polymérase ARN dépendante) copie le brin d’ARN messager en brin
d’ADN complémentaire. Lors du premier cycle de polymerase chain reaction (PCR), le brin d’ARN messager est éliminé et les amorces de PCR se fixent sur le
brin d’ADN complémentaire (ADNc).
RT-PCR (PCR après transcription inverse)
L’étude des ARN est devenue très aisée avec l’apport de la PCR.
Cette méthode avait été initialement décrite pour l’ADN, mais une
simple modification permet de l’utiliser aussi pour l’ARN [4] . Elle
utilise une enzyme caractéristique des rétrovirus, la transcriptase
inverse, ADN polymérase ARN-dépendante qui permet de copier,
en présence d’une amorce, une molécule d’ARN simple brin en
une molécule d’ADN simple brin complémentaire de la séquence
de l’ARN messager (Fig. 2). Une fois cette molécule d’ADN complé-
mentaire (ADNc) obtenue, la réaction classique de PCR peut être
effectuée avec deux amorces spécifiques du gène à étudier. L’étude
des produits de transcription permet la détection des ARN messa-
gers normaux ainsi que des ARN messagers de fusion résultant de
translocations chromosomiques telle que bcr-abl, caractéristique
de la leucémie myéloïde chronique. L’étude de ces transloca-
tions est pratiquement impossible au niveau de l’ADN car leurs
points de cassure sont éparpillés sur les introns. Lors de l’épissage
des ARN messagers après transcription de l’ADN, les exons sont
raboutés les uns aux autres (Fig. 2), générant des ARN et des
protéines de fusion uniformes. La grande sensibilité de l’ARN vis-
à-vis des ribonucléases, enzymes dégradant l’ARN et non l’ADN,
présentes de manière ubiquitaire (mains, etc.) et elles-mêmes résis-
tantes à la dégradation, implique un soin particulier lors de sa
manipulation.
PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR)
Cette technique a pour objectif la mesure de la cinétique de
formation du produit d’amplification au cours de la réaction de
PCR, sans l’interrompre, et d’en déduire une quantification de
la cible dans l’échantillon analysé. Elle peut s’appliquer aussi
bien à l’analyse en RT-PCR qu’à l’analyse génomique sur matrice
d‘ADN [2, 5, 6] .
Cette approche nécessite un marqueur fluorescent dont le signal
augmente de manière spécifique avec l’amplification au cours de
la réaction de PCR et un système de mesure externe de la fluores-
cence en temps réel. Grâce à cette mesure, il est possible de tracer
une courbe représentant les différentes phases de la cinétique de
PCR et de mesurer la quantité du produit d’amplification généré
en un point de la phase exponentielle. C’est uniquement pendant
cette phase qu’il est possible d’extrapoler la quantité de la cible
initialement présente dans l’échantillon avant amplification.
EMC - Hématologie
ARN messager AAAAAAAA
+ oligo d(T)TTTTTTT
AAAAAAAA
TTTTTTTTT
+ transcriptase inverse
Élongation
+ nucléotides
AAAAAAAA
ADN complémentaire TTTTTTTTT
Hybride AAAAAAAA
ARN/ADNc TTTTTTTTT
Élimination du brin d’ARN
ADNc TTTTTTTTT
L’amplification sur le même échantillon d’un gène domestique
d’expression ubiquitaire permet la validation de la qualité de
l’échantillon analysé et la quantification relative de la cible analy-
sée par rapport au gène domestique. Le choix de ce gène est crucial
car il doit être d’expression constante quels que soient les tissus
ou les pathologies en cause. De plus, son niveau d’expression et
sa cinétique de dégradation doivent être proches de celui du gène
cible analysé. Les gènes de référence les plus utilisés sont les gènes
des sous-unités 28S et 18S des ARN ribosomiques, le gène Abelson
(ABL), le gène de la glycéraldéhyde déshydrogénase (GAPDH), le
gène de la bêta-actine ou celui de l’hypoxanthine phosphoribo-
syltransférase (HPRT) [7] .
La RQ-PCR permet également une quantification de la cible en
valeur absolue grâce à l’établissement d’une droite de calibration
avec des dilutions successives d’une lignée témoin positive ou de
plasmides. Pour chaque point de la gamme, on définit le seuil de
détection (cycle threshold – Ct) à partir duquel la fluorescence
cumulée détectée dépasse le seuil de positivité (threshold), ce qui
permet d’établir une courbe d’étalonnage. Il suffit alors de reporter
le Ct obtenu pour l’échantillon à analyser sur cette droite et d’en
déduire la quantité de la cible. L’efficacité et la spécificité de la PCR
sont reflétées par la pente de cette droite, qui doit être proche de
-3,3, ce qui correspond à une efficacité de 100 % (Fig. 3).
Plusieurs systèmes de détection fluorescents sont disponibles :
les systèmes permettant la détection des produits d’amplification
générés après chaque cycle de PCR font appel soit à un agent inter-
calant se fixant directement sur l’ADN double brin, soit à une
sonde fluorogénique allant s’hybrider de manière spécifique sur
le fragment cible amplifié.
SYBR green
Le SYBR green est un agent intercalant qui émet une fluo-
rescence uniquement lorsqu’il se fixe à l’ADN double brin. Il
présente l’avantage d’être très simple d’utilisation, très sensible,
mais sa spécificité est essentiellement conditionnée par le choix
des amorces. En effet, le SYBR green marque toutes les molé-
cules d’ADN double brin, qu’elles soient spécifiques ou non de
la séquence d’intérêt. Par conséquent, tous les produits de PCR
non spécifiques et les dimères d’amorces peuvent engendrer un
signal de fluorescence. De plus, l’intensité de fluorescence est pro-
portionnelle à la masse d’ADN double brin produite, et donc à la
taille des amplicons [8] .
3
13-000-K-30  Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire

Polymérisation

R = reporter
Amorce sens R Q Q = quencher
5' 3'
3' 5'
5' 3'
5'
Amorce antisens
Déplacement

Sonde 3'
5'
3' 5'
5' 3'
5'
Amorce antisens

Digestion

5'
3' 5'
5' 3'
5'

Polymérisation complète

5'
3' 5'
5' 3'
5'

Figure 3. Principe de la polymerase chain reaction (PCR) en temps réel (système avec sonde spécifique). La sonde est dégradée au cours de l’élongation par
l’activité exonucléasique de la polymérase, entraînant une libération de l’émission de fluorescence par le reporter (R). L’accumulation de cette fluorescence
est détectée par l’appareil sans interruption de la réaction de PCR. La cinétique de l’accumulation de la fluorescence émise est proportionnelle à la quantité
de cible présente dans l’échantillon. L’utilisation d’une gamme de calibration permet de quantifier le prélèvement.

Sondes d’hydrolyse ou sondes Taqman®
® la détection de deux cibles différentes au cours d’une même PCR.
La particularité de cette technologie (système Taqman ) est
d’ajouter entre les deux amorces une sonde fluorogénique (frag-
ment d’ADN simple brin non extensible par la Taq polymérase et
spécifique de la cible) qui possède deux fluorophores différents.
L’extrémité 5 porte le fluorophore donneur (ou reporter) dérivé
de la fluorescéine (FAM, TET, JOE HEX ou VIC). À l’extrémité
3 se trouve le fluorophore dit suppresseur, ou désactivateur, ou
extincteur (quencher), habituellement un dérivé de la rhodamine
(TAMRA). Lorsque la sonde est intacte, le fluorophore donneur et
le fluorophore extincteur sont proches, du fait de la petite taille de
la sonde (20 à 30 nucléotides). Cette proximité induit la suppres-
sion de la fluorescence du donneur par le phénomène de transfert
d’énergie appelé fluorescent resonance energy transfer (FRET). Lors
de la PCR, la Taq polymérase commence l’élongation et va dégra-
der la sonde par son activité 5 -exonucléasique et donc séparer le
site donneur du site désactivateur, lequel ne pourra plus empê-
cher l’émission fluorescente du donneur. La fluorescence émise
par le donneur, mesurée à la fin de chaque cycle d’amplification,
est ainsi proportionnelle à la quantité de sonde dégradée et donc
de produit de PCR accumulé (Fig. 3).
Le développement d’un nouveau type de sondes Taqman® , les
sondes Taqman MGB, a permis de remédier à certaines limites de
ce système [9] . En effet, l’introduction à l’extrémité 3 d’une molé-
cule ayant une affinité pour le petit sillon de l’ADN, ou noyau
MGB, augmente la Tm de la sonde et stabilise plus fortement
son interaction avec la matrice ADN. Ceci a permis de concevoir
des sondes de plus petite taille (13 à 20 nucléotides), capables de
s’hybrider avec une matrice riche en oligonucléotides GC ou AT.
De plus, dans une sonde Taqman MGB, le fluorophore donneur
est associé à un désactivateur non fluorescent, ce qui rend possible
Sondes FRET en tandem ou sondes LightCycler®
Développée par LightCycler® (Roche), cette technologie fait
appel à la fixation en tandem de deux sondes marquées chacune
par une molécule fluorescente différente [10] . Dans ce système, c’est
la proximité des deux sondes lors de l’hybridation qui constitue le
signal mesuré. La technologie LightCycler® permet une certaine
flexibilité dans le choix du positionnement des sondes, mais est
limitée dans le choix du couple de fluorophores. En effet, le trans-
fert d’énergie n’est efficace que lorsque la fluorescéine est associée
à l’un des fluorophores rouges LightCycler® , le LC red 640 et le
LC red 705. De fait, le système ne peut quantifier simultanément
que deux cibles au maximum.
Quel que soit le système de fluorescence utilisé, le module de
détection fait appel à une excitation par laser ou diode de tungs-
tène via des fibres optiques et à la mesure de la fluorescence
réémise par une caméra CCD à des intervalles très rapprochés au
cours de la réaction de PCR. L’avantage de l’approche spécifique de
sonde par rapport aux agents intercalants est la grande spécificité
apportée par la sonde, et la possibilité de coamplifier plusieurs
séquences cibles dans la même réaction en utilisant des sondes
marquées par des fluochromes différents. Son coût est cependant
nettement plus élevé.
Plus récemment sont apparus sur le marché des automates
de RQ-PCR qui permettent le traitement en système fermé d’un
échantillon biologique brut (sang, LCR, etc.), depuis l’extraction
des acides nucléiques jusqu’à la quantification par RQ-PCR d’une
cible donnée. Ces automates, dont le plus connu actuellement

4 EMC - Hématologie
 Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire  13-000-K-30
est Genexpert® (Laboratoire Cepheid), fonctionnent avec des
trousses prêtes à l’emploi, en conditionnement unitaire, stables
dans le temps et disposant d’un contrôle interne d’inhibition pour
chaque réaction. Leur avantage est la simplicité de fonctionne-
ment et la rapidité de rendu de résultat (délai inférieur à deux
heures globalement). Ils ont encore actuellement pour inconvé-
nient d’avoir un nombre de cibles restreint en oncohématologie
(quantification du transcrit de fusion BCR-ABL uniquement) et
un coût d’utilisation assez élevé [11] .
Séquençage
Méthode de Sanger
La méthode décrite par Sanger [12] est fondée sur l’arrêt de
l’élongation lors de la réplication par une ADN polymérase. Cet
arrêt est provoqué par la présence de didésoxynucléotides (ddNTP)
qui, à la différence des désoxynucléotides (dNTP, où N signifie une
des quatre bases) constituant l’ADN, ne permettent pas l’ajout
de la base suivante lors de l’élongation car le radical hydroxyl
nécessaire a été remplacé par un simple atome d’hydrogène. En
modifiant le ddNTP incorporé (par exemple ddATP au lieu de
dATP) et en faisant migrer les quatre réactions d’élongation sur un
gel de polyacrylamide permettant la résolution à une base près,
on peut définir précisément l’enchaînement des nucléotides dans
le gène étudié.
Pyroséquençage
La méthode de pyroséquençage a largement supplanté la
méthode de Sanger, parce qu’elle est plus rapide et de moindre
coût. Il s’agit d’un séquençage par synthèse qui repose sur
l’analyse en temps réel de la synthèse de l’ADN cible par l’ADN
polymérase. Le principe de base consiste à hybrider une amorce à
l’ADN cible préalablement amplifié par PCR, puis à ajouter des
nucléotides l’un après l’autre de manière séquentielle et dans
l’ordre à partir de l’extrémité 3 de l’amorce.
A chaque incorporation d’un nucléotide complémentaire dans
de l’ADN en cours de synthèse, un pyrophosphate inorganique
(PPi) est libéré. L’ATP sulfurylase transforme le pyrophophate
libéré en ATP. La molécule d’ATP libérée catalyse alors la conver-
sion, par la luciférase, de la luciférine en oxyluciférine qui
génère un signal lumineux proportionnel à la quantité d’ATP.
L’apyrase dégrade ensuite les nucléotides et l’ATP en excès. Le
signal lumineux est capté par une caméra CCD qui va le repro-
duire sous forme d’un pic sur le pyrogramme. La hauteur de
ce pic est proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés
à chaque étape. On peut donc déduire la séquence à partir de
la taille des pics obtenus. En cas de mélange de nucléotides à
une même position (polymorphisme de séquence), la taille des
pics permet d’avoir une quantification de la proportion de brins
porteurs de l’un ou l’autre des nucléotides. Cette méthode perfor-
mante, totalement automatisée, ne permet de séquencer que de
courts fragments d’ADN (60 pb jusqu’à 200 pb). La limitation du
nombre de bases séquencées est liée à l’inhibition progressive de
l’apyrase [13, 14] .
Séquençage à haut débit
Depuis 2005, de nouvelles technologies de séquençage de
génome complet qui intègrent haut débit et rapidité avec un coût
moindre ont été développées.
Trois technologies sont actuellement les plus utilisées.
Technologie Roche® /454 FLX
Cette technique est globalement fondée sur l’amplification
de l’ADN lié spécifiquement à une bille en émulsion et sur le
pyroséquençage. La première étape consiste en la fragmentation
de l’ADN génomique par nébulisation. Ces fragments d’ADN
simple brin (ADNsb) sont par la suite reliés au niveau de leurs deux
extrémités par deux adaptateurs. Des microbilles avec en surface
des amorces complémentaires de l’un des adaptateurs permettent
de fixer une molécule d’ADNsb à la fois.
Chaque fragment d’ADN est alors amplifié par PCR en émulsion
où chaque microbille est mise en émulsion dans une microgoutte
EMC - Hématologie
lipidique en présence des réactifs de PCR pour former un micro-
réacteur. Le séquençage se fait par la suite selon le principe de
pyroséquençage (décrit plus haut).
Une caméra CCD permet de capturer les images après addition
de chaque nucléotide. Connaissant l’ordre dans lequel les quatre
nucléotides sont ajoutés, l’analyse des différentes images captu-
rées permet de déduire la séquence des différents morceaux d’ADN
(illustrée par pyrogramme). Des logiciels bio-informatiques sont
ensuite utilisés pour reconstituer la séquence initiale. Cette tech-
nique permet le séquençage de fragments de 400 pb fixés sur billes,
et de 150 Mb à 0,5 Gb en un seul run.
Technologie Solexa/Illumina Genome Analyzer
Cette technologie s’appuie sur l’amplification, l’accrochage-
liaison sur support solide (puce) et l’utilisation de terminateurs
de chaîne réversibles (cyclic reversible termination – CRT) marqués
par des fluorochromes. Dans cette approche, chaque molécule
d’ADN est séquencée par addition du nucléotide complémentaire
catalysée par une ADN polymérase. Le séquençage des fragments
amplifiés se fait donc par synthèse. La réaction est suivie en temps
réel par une caméra. Chacun des quatre nucléotides marqués pos-
sède un groupe protecteur qui arrête la synthèse de l’ADN. Le
fluorophore est ensuite éliminé ainsi que le groupe protecteur,
puis le groupement fonctionnel du nucléotide incorporé est res-
tauré, ce qui permet à l’ADN polymérase d’incorporer le prochain
nucléotide et le cycle peut redémarrer. Chaque cycle comprend
donc trois étapes : incorporation, détection et déprotection. Cette
technique permet le séquençage de fragments de 35 pb fixés sur
plaque, et de 1,5 Gb à 3 Gb en un run.
Technologie Applied Biosystems SOLiD
Elle est fondée sur l’amplification par émulsion et l’hybridation-
ligature chimique. Dans les premières étapes, elle est assez
similaire de celle de Roche® . Les ADN sont d’abord fragmen-
tés puis reliés à des adaptateurs et ensuite fixés à des billes.
L’ADN est amplifié par une PCR en émulsion. Les microbilles
porteuses de l’ADN amplifié sont alors déposées sur une plaque
vitrée où aura lieu la réaction de séquençage par ajouts succes-
sifs d’octamères. Dans ses premières versions, cette technique a
permis le séquençage de fragments de 35 pb, et de 1 Gb en un
run. Cependant, avec l’avènement de la technologie SOLiD 4.0,
on peut désormais séquencer de 80 Gb à 100 Gb en un run [15–17] .
Arrays : transcriptome, SNP, CGH
La technologie des puces ADN est une méthode d’étude à haut
débit des acides nucléiques. Elle permet l’analyse simultanée de
plusieurs dizaines de milliers de gènes dans un échantillon biolo-
gique sain ou malade, aussi bien au niveau de son génome (ADN)
que de son transcriptome (ARN). L’étude du profil d’expression
génique et du génome sur puces ADN est désormais une techno-
logie fiable qui a fait la preuve de son intérêt pour la classification
moléculaire des cancers. L’intérêt de cette technologie est aussi
lié au fait qu’elle permet par une approche de criblage à grande
échelle, de découvrir des caractéristiques génomiques non sus-
pectées a priori, ce qui conduit à générer de nouvelles hypothèses
physiopathologiques.
Analyse du transcriptome
La technologie microarray permet de mesurer simultanément
et quantitativement l’expression relative de plusieurs milliers de
gènes. Depuis la description en 1995 de la première puce à ADN
avec 45 sondes fluorescentes d’Arabidopsis thaliana [18] , celle-ci est
devenue un outil majeur, en particulier pour l’étude des tumeurs
humaines.
Jusqu’à cette époque, l’étude de l’expression des gènes reposait
sur la technique de northern blot ou la RT-PCR, mais les puces à
ADN ont permis l’analyse simultanée de tous les transcrits d’un
génome. L’application immédiate a été d’améliorer et de préciser
le diagnostic, le pronostic et l’orientation thérapeutique dans des
pathologies très diverses.
Il existe trois variantes principales de ces technologies. Histori-
quement la plus ancienne, la technique des macroarrays utilisait
5
13-000-K-30  Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire

comme support des filtres de Nylon et une méthode de détec-

tion basée sur la radioactivité. Cette technique comportait certains
inconvénients : les contraintes physiques liées à la diffusion du
signal radioactif, qui limitent l’analyse à quelques centaines de
cibles par cm2 , sa sensibilité réduite, la limite inférieure étant la
détection d’une copie de messager parmi 20 000, ce qui place de
nombreux gènes faiblement exprimés en dehors de ces limites.
L’une des avancées de ces dernières années concernant les
impressions d’ADNc à haute densité a été le développement
de l’utilisation de supports en verre, couplé avec l’emploi de
méthodes de détection fluorescentes, qui ont permis une minia-
turisation importante (les microarrays sur lames de verre sont
compatibles avec des concentrations de plusieurs milliers de cibles
par cm2 ). Les premières générations de puces à ADN utilisaient des
ADNc de quelques centaines de bases, immobilisés sur les supports
par des liaisons chimiques covalentes. Ces fragments d’ADNc issus
de banques de clonage ne correspondent pas obligatoirement à
des gènes identifiés.
Les puces dites à oligonucléotides se développent de plus en
plus. Les sondes sont des oligonucléotides de synthèse allant de
25 à 80 bases. Les séquences choisies sont optimales pour hybri-
der chaque gène cible (intensité, sensibilité et spécificité). En
revanche, ce type de sonde permet uniquement la détection de
gènes connus et séquencés, ce qui a priori ne pose plus de pro-
blème pour les génomes humain et murin, qui ont été totalement
séquencés.
Les sondes sont généralement produites par microdépo-
sition, ou in situ, aboutissant à l’élaboration de sondes
d’oligonucléotides, directement sur la surface de la puce. Deux
grands types de synthèse sont utilisés : la photolithographie ou
l’impression. La description détaillée de ces techniques dépasse la Figure 4. Analyse du transcriptome par puce. Exemple de matrice de
cadre de cet article. couleurs (heatmap) obtenue après analyse des données par regroupement
La fluorescence est le système de détection le plus répandu, car non supervisé. Chaque colonne correspond à un échantillon, chaque ligne
elle permet une bonne sensibilité de détection du signal tout en à un gène présent sur la puce. Par comparaison à un témoin, les gènes
étant facile et non contraignante à manipuler, contrairement à sous-exprimés apparaissent en vert tandis que les gènes surexprimés appa-
la radioactivité. Deux types d’approches sont envisagés en fonc- raissent en rouge.
tion de l’utilisation d’un ou deux marqueurs. Dans l’approche
à un seul marqueur, dite « simple marquage » ou encore « non
compétitive », deux échantillons sont marqués avec le même fluo- de fluorochromes différents, la détection de la fluorescence glo-
rochrome – par exemple la phycoérythrine pour la technologie bale émise lors de l’hybridation permet, s’il existe un excès de
Affymetrix – et sont hybridés sur une puce séparément. L’intensité fluorescence du fluorochrome de l’ADN à étudier, de conclure
du signal sera proportionnelle à l’expression du gène correspon- à un gain de matériel génétique (amplification) ; à l’inverse, un
dant. Ce signal est généralement normalisé par rapport au bruit excès de fluorescence de l’ADN témoin identifie une perte de
de fond estimé de la puce, ou par rapport à un étalon interne, ou matériel (délétion). Cette technique permet donc de détecter
bien encore par rapport à des gènes de référence. les variations du nombre de copies d’un gène, ou copy number
Dans l’approche à deux marqueurs, dite « double marquage », abnormalities (CNA). Actuellement, les puces à ADN contiennent
reposant sur une hybridation compétitive, les deux échan- des oligonucleotides de 20 à 100 nucléotides qui couvrent
tillons sont marqués chacun avec un fluorochrome différent l’ensemble du génome (oligo CGH array). Grâce au grand nombre
– par exemple cyanine 3-CTP (Cy3) et cyanine 5-CTP (Cy5) d’oligonucléotides différents répartis de façon homogène sur le
(Agilent Technologies et la plupart des fournisseurs). Les deux génome entier dont on dispose, il a été possible de réduire la taille
échantillons sont mélangés en proportions équivalentes. Lors de minimale de la délétion ou du gain que l’on peut détecter. La
l’hybridation sur la puce, il y a compétition pour l’appariement à résolution de ces puces est inférieure à 5 kb [19, 20] .
la sonde immobilisée sur le support solide. De cette manière, on
mesure directement un ratio entre le signal fluorescent émis par
l’échantillon marqué en Cy5 et celui de l’échantillon marqué en
Polymorphismes mononucléotidiques : SNP array
Cy3. Cette technique repose sur l’hybridation d’un génome d’intérêt
L’analyse des données se décompose en trois étapes : sur une puce à ADN. Cette puce contient des oligonucléotides
• la détection du signal et l’analyse d’images ; de 15 à 25 nucléotides qui correspondent à la séquence des
• le traitement des données brutes et le regroupement ; différents allèles des centaines de milliers de polymorphismes
• l’analyse des données sur la base, en particulier, d’algorithmes mononucléotidiques du génome humain, d’où son nom : single
de classification. nucleotide polymorphism (SNP) array. Le fragment d’ADN d’intérêt
Les résultats peuvent ainsi être représentés après classification est fragmenté par digestion enzymatique, puis lié à un adapta-
supervisée (annotations et regroupement choisis préalablement à teur sur lequel va se fixer une amorce permettant l’amplification
l’analyse par l’expérimentateur) ou non supervisée (regroupement par PCR des différents fragments d’ADN générés. Ensuite, tous ces
des échantillons réalisé par le logiciel d’analyse) en fonction de fragments d’ADN amplifiés sont marqués par un fluorochrome
l’intensité d’expression de chaque gène (code couleur) et de leur et hybridés avec les sondes oligonucélotidiques fixées sur la
ressemblance (dendrogramme). La Figure 4 représente un exemple lame. Les fragments d’ADN qui trouvent l’oligonucléotide qui
de résultats d’analyse de transcriptome sous forme de heatmap. leur est exactement complémentaire vont s’hybrider et émettre
une fluorescence. Si, pour un polymorphisme donné, un seul
des oligonucléotides émet de la fluorescence, cela signifie qu’à
Hybridation génomique comparative : CGH array cette position l’individu possède le même nucléotide sur chacun
Cette technique repose sur le principe de l’hybridation des brins des chromosomes homologues, il est alors homozygote. Cette
complémentaires entre l’ADN à étudier et un ADN témoin préa- technique permet donc de détecter la perte d’hétérozygotie (loss
lablement déposé sur une puce. Ces deux ADN étant marqués of heterozygosity – LOH) sans perte quantitative de matériel,

6 EMC - Hématologie
 Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire  13-000-K-30
communément appelée disomie uniparentale (UPD) ou copy neu-
tral LOH (CN-LOH). Les techniques de SNP array les plus récentes,
notamment celles développées par Affymetrix® , contiennent sur
la même puce 1,8 millions d’oligonuléotides différents, per-
mettant la détection simultanée des CNA et des CN-LOH. La
résolution de cette technique est inférieure à 1 kb [19, 20] .
Technique de transfert d’empreintes :
« blotting »
Méthode de Southern
Quand une solution d’ADN est exposée à un pH ou une
température élevée (90 ◦ C), les deux brins complémentaires qui
constituent l’ADN se séparent. Ce phénomène, appelé dénatu-
ration, est réversible et la réassociation peut avoir lieu entre
n’importe quel acide nucléique (ARN ou ADN) tant que les
séquences sont complémentaires. Ceci est la base de la méthode
décrite initialement par Edwin Southern en 1975 [21] . L’ADN chro-
mosomique est d’abord digéré par des enzymes de restriction
afin de diminuer la taille des fragments à analyser. Ces frag-
ments sont ensuite séparés selon leur taille par électrophorèse
en gel d’agarose. Les fragments d’ADN sont transférés sur un
support solide (Nylon ou nitrocellulose) après une étape de déna-
turation. Une fois transférées, les séquences étudiées sont mises
en évidence par hybridation d’une sonde marquée radioacti-
vement (phosphore 32) ou non (avec une perte de sensibilité
dans ce dernier cas). Après lavage, la membrane est mise au
contact d’un film radiographique pour faire apparaître le signal de
radioactivité.
La sensibilité de cette méthode est de l’ordre de 5 %. Cependant
elle ne permet pas de reconnaître les mutations ponctuelles, à
l’exception des mutations affectant le site reconnu par l’enzyme
de restriction nécessaire à la digestion de l’ADN.
Northern blot
Cette méthode initialement développée pour étudier les pro-
duits de transcription nécessite une grande quantité d’ARN. Elle
est aujourd’hui remplacée par la RT-PCR. Elle est fondée sur le
même principe que le Southern blot, et fut dénommée par jeu de
mots la méthode du Northern blot [22] . L’ARN est mis à migrer dans
un gel d’agarose dénaturant (pour maintenir sa forme simple brin
linéaire), puis transféré sur une membrane de Nylon et hybridé
avec une sonde radioactive, comme pour le Southern. Un ARN
de fusion n’aura pas la même taille que l’ARN messager sau-
vage. Cette méthode permet une quantification de l’ARN messager
d’une manière plus fiable que la RT-PCR, mais avec une sensibilité
moindre.
Dot blot
Cette méthode est une simplification du Northern blot, qui
permet la quantification des ARN messagers sans évaluer leur
taille. Elle ne distingue pas un ARN de fusion d’un ARN normal.
Une goutte d’ARN est directement déposée sur une membrane
de Nylon ou de nitrocellulose (formant un petit disque sur cette
membrane, d’où le nom anglais : dot [point]). La membrane est
ensuite mise au contact de la sonde marquée puis l’hybridation
spécifique est révélée par autoradiographie.
Électrophorèses
Électrophorèse en gel de gradient dénaturant
Une des premières méthodes développées pour rechercher des
mutations dans des régions étendues de l’ADN fut l’électrophorèse
en gel de gradient dénaturant [23] . Cette technique est basée sur
le fait que l’ADN simple brin migre beaucoup moins vite que
l’ADN double brin. Un ADN double brin contenant un défaut
d’appariement (hétéroduplex réalisé in vitro entre un ADN simple
brin muté et un ADN simple brin témoin) sera dénaturé plus rapi-
dement qu’un ADN double brin parfaitement apparié. En présence
d’un gradient d’agent dénaturant (urée, etc.), l’ADN mal apparié
va se dissocier plus rapidement, d’où un arrêt de sa migration plus
EMC - Hématologie
précoce que celui de l’ADN double brin témoin. Une différence
d’une seule base entre l’ADN muté et l’ADN témoin est suffisante
pour provoquer des profils de migration différents.
Électrophorèse en gel non dénaturant
La méthode single strand conformation polymorphism (SSCP) étu-
die le polymorphisme conformationnel des structures simple brin.
Elle met à profit les différences de réappariement des molécules
d’ADN simple brin sur elles-mêmes, aboutissant à une structure
en épingle à cheveu, qui varie en fonction de la composition
en nucléotides de l’ADN [24] . Ainsi, lors d’une électrophorèse sur
un gel de polyacrylamide non dénaturant, après dénaturation
des deux brins de l’ADN à étudier, on observe une différence de
migration non seulement selon leur taille mais aussi selon leur
séquence, ce qui permet de distinguer un fragment d’ADN simple
brin muté d’un fragment témoin, non muté.
Dans un certain nombre de cas, il est utile de distinguer les
deux allèles d’un même chromosome, par exemple pour analyser
la clonalité myéloïde, ou pour effectuer une étude de chimé-
risme post-allogreffe. La technique polymorphisme de longueur
des fragments de restriction (RFLP) met à profit la présence sur
un allèle et l’absence sur l’autre d’un site de restriction. En utili-
sant d’une part cette enzyme de restriction lors de l’analyse par
la méthode de Southern, et d’autre part une sonde spécifique de
cette région, il est possible de distinguer les deux allèles par le
polymorphisme de longueur des fragments de restriction obtenus.
Le polymorphisme étudié peut provenir également d’une
séquence répétée d’une manière différente sur chaque allèle (par
exemple, 10 répétitions sur un allèle et 15 sur l’autre) analysé soit
par la méthode de Southern, soit par PCR. Ces séquences sont plus
ou moins longues :
• de 11 à 60 nucléotides pour les minisatellites, ou variable number
of tandem repeats (VNTR), utilisée pour l’analyse du chimérisme
post-allogreffe ;
• de 1 à 4 bases pour les microsatellites, ou short tandem repeats
(STR), répétitions de 12 à 40 copies (application à la clonalité
myéloïde, par exemple avec le gène du récepteur aux andro-
gènes, dont le microsatellite est représenté par la séquence CAG
répétée de 12 à 26 fois).
L’informativité relative de ces polymorphismes est nettement
plus importante pour les microsatellites et les minisatellites que
pour les RFLP.
 Applications à l’hématologie
maligne
Détection d’une population lymphoïde
clonale
La mise en évidence d’une population clonale est un argument
important de la nature maligne d’une prolifération hématopoïé-
tique, bien que la corrélation ne soit pas parfaite (voir ci-dessous).
Les techniques les plus répandues permettant de détecter une
population cellulaire clonale sont soit l’examen cytogénétique
montrant une anomalie caryotypique, soit l’étude du réarran-
gement des gènes d’immunoglobulines (Ig) ou du récepteur des
cellules T (T Cell receptor – TCR) dans une prolifération lymphoïde.
Réarrangements des gènes des Ig et du TCR
Les Ig sont composées de deux chaînes lourdes et de deux
chaînes légères tandis que le complexe du TCR comporte soit
une chaîne ␣ et une chaîne ␤, soit une chaîne ␥ et une chaîne
␦. La structure et les mécanismes de réarrangement des gènes qui
codent les chaînes lourdes (IgH, chromosome 14q32), les chaînes
légères (Ig␬, chromosome 2p12 et Ig␭, chromosome 22q11), le
locus des TCR ␣/␦ (chromosome 14q11), le TCR ␤ (chromosome
7q35) et le TCR ␥ (chromosome 7p15) sont similaires. Dans leur
configuration non réarrangée (appelée germinale), elles consistent
en de nombreux segments discontinus dénommés : variable (V),
de jonction (J) et, pour les gènes des IgH, du TCR␤ et du TCR␦ uni-
quement, de diversité (D). Il existe aussi, en aval de ces segments,
7
13-000-K-30  Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire

Configuration germinale des gènes IgH

VH DH JH Eμ Sμ Cμ
1 2 3 4 5 n 1 2 3 4 n 1 2 3 4 5 6

Gènes IgH partiellement réarrangés Recombinaison D-J

Gènes IgH réarrangés Recombinaison V-D-J

ARN messager précurseur Transcription

AAAA

Épissage
ARN messager mature AAAA
VDJ-Cμ
Figure 5. Structure des gènes qui codent pour les récepteurs à l’antigène (immunoglobulines [Ig] ou récepteur des cellules T [TCR]). Le locus IgH est illustré
à titre d’exemple. E␮ : enhancer ␮ (élément régulateur induisant la transcription des IgH) ; S␮ : séquence de switch important pour la commutation de classe
des Ig ; C␮ : segments constants.

un ou deux gènes constants (C). Au cours de la différenciation
lymphoïde, la diversité des gènes des Ig et du TCR est générée
par un processus de recombinaison entre ces segments V, D et J
(Fig. 5). Dans le système IgH, par exemple, un des deux allèles IgH
subit d’abord une recombinaison génique entre un des segments
DH et un des segments JH , entraînant l’excision de l’ADN les sépa-
rant. Dans un deuxième temps, un des segments VH se recombine
au réarrangement DH JH , créant ainsi une unité de transcription
VH DH JH . Ce gène réarrangé est d’abord transcrit en prémessager
puis, après épissage des introns séparant le segment JH du segment
CH , l’ARN messager (ARNm) VH DH JH CH est traduit en protéine
IgH mature. L’ordre de réarrangement des gènes d’Ig est IgH puis
Ig␬ et enfin Ig␭, tandis que celui des gènes des TCR est : TCR␦
puis TCR ␥ et TCR␤ et finalement TCR␣ avec délétion du TCR␦
situé sur le même allèle, puisque le locus du TCR␦ est à l’intérieur
du locus TCR␣, entre les segments V␣ et J␣. La production d’une
Ig ou d’un TCR fonctionnel nécessite la juxtaposition, dans une
même unité de transcription et dans le même cadre de lecture, des
segments V, D et J. Si le réarrangement V-(D)-J du premier allèle
s’avère fonctionnel, le processus dit d’exclusion allélique empêche
le réarrangement du deuxième allèle. Sinon, un deuxième réarran-
gement a lieu sur l’autre allèle, augmentant ainsi la possibilité de
produire un récepteur fonctionnel.
Le réarrangement de segments V, D et J est réalisé par
l’intermédiaire de signaux de recombinaison (recognition signal
sequences – RSS) situés en aval des segments V, en amont des
segments J et de part et d’autre des segments D. Ces RSS servent
à diriger le système de recombinaison partiellement médié par
deux gènes, recombinase activating gene (RAG)-1 et 2 [25, 26] , vers les
segments V, D et J.
Trois mécanismes concourent à la génération de la diversité des
gènes des Ig et du TCR.
Réarrangement combinatoire
La diversité des gènes des Ig et du TCR qui peut être générée
par la recombinaison V-(D)-J est déterminée par le nombre de seg-
ments V, D et J de chaque locus. Comme le montre le Tableau 1,
cette diversité combinatoire varie beaucoup selon les gènes.
Diversité jonctionnelle
Lors du réarrangement, les séquences situées à la jonction des
segments V, D ou J peuvent être modifiées soit par la délétion des
nucléotides situés en aval des segments V, en amont des segments
J, et de part et d’autre des segments D, soit par l’addition de courtes
séquences non codées à l’état germinal et ajoutées grâce à l’activité
de la terminal désoxynucléotidyl transférase (TdT), créant ainsi
les régions “N”, ou complementarity determining region (CDR3) de
séquence et de longueur hautement variables. Dans la majorité
des cas (2/3 en théorie), ces processus de recombinaison créent
une séquence dont le cadre de lecture n’est pas conservé, pouvant
être transcrite en ARN mais ne pouvant être traduite en pro-
téine (réarrangement non fonctionnel). Lors de la différenciation

Tableau 1.
Répertoire des réarrangements de gènes dans les lignées lymphoïdes.
Immunoglobulines (Ig) TCR␣␤ TCR␥␦
IgH Ig␬ Ig␭ TCR␣ TCR␤ TCR␥ TCR␦
Diversité germinale
Segments V 100-200 40-80 > 40 60 ± 70 8 8
Famille de segments V 7 4 7 29 24 4 ?
Segments D > 20 - - - 2 - 3
Segments J 6 5 >4 75 13 5 3
Diversité jonctionnelle
Additions N +++ + + + ++ ++ +++

TCR : récepteur des cellules T.

8 EMC - Hématologie
 Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire  13-000-K-30
1 2 3 4 5 TCRγ polyclonal
Figure 6. Détection d’une population lymphoïde clonale par amplifi-
cation de la région N du récepteur des cellules T gamma (TCR␥) à partir
de l’ADN par polymerase chain reaction (PCR) classique et migration des
produits de PCR sur gel d’acrylamide. 1. Marqueur de poids moléculaire ;
2, 3, 5. prélèvement polyclonal ; 4. prélèvement clonal.
lymphoïde, seuls les lymphocytes capables d’exprimer un récep-
teur à l’antigène fonctionnel sont sélectionnés. Il en découle que
les réarrangements retrouvés dans une cellule ou dans un clone
lymphoïde immature peuvent être non fonctionnels, mais qu’au
moins un des deux réarrangements des populations lymphoïdes
matures est fonctionnel.
Détection d’un réarrangement d’Ig ou du TCR
La technique de Southern, malgré l’amélioration qu’elle a
apportée dans notre compréhension des proliférations lym-
phoïdes, est aujourd’hui délaissée au profit de la PCR, technique
plus rapide, non radioactive, au moins aussi sensible que le Sou-
thern blot, et qui en outre nécessite beaucoup moins d’ADN.
L’amplification à partir de l’ADN, avec des amorces spécifiques
des segments V et J, permet l’amplification de la région hyper-
variable V-(D)-J, dite région N ou CDR3 (voir ci-dessus). Dans
une population lymphoïde clonale, la jonction V-(D)-J est iden-
tique dans toutes les cellules, tandis que dans une prolifération
polyclonale la taille des jonctions est variable. L’analyse des pro-
duits d’amplification après électrophorèse sur gel d’acrylamide,
de meilleure résolution que celle sur gel d’agarose, permet la
distinction entre population clonale (bande unique) et poly-
clonale (traînée d’ADN) (Fig. 6). L’utilisation de ces techniques
pour la détection de la clonalité a été appliquée à l’analyse
des réarrangements des gènes du TCR␥ et des IgH [27] . Le réper-
toire restreint (Tableau 1) du locus du TCR␥ permet l’utilisation
d’un mélange d’oligonucléotides spécifiques de chaque segment
V et J tandis que la complexité du locus des IgH nécessite
l’utilisation d’oligonucléotides « consensus » qui reconnaissent
des séquences conservées entre les différents segments V et
J, soit de toutes les familles VH , soit spécifiques de chaque
famille [28] . L’inconvénient majeur de l’utilisation du TCR␥ pour
l’analyse par PCR est la présence dans le sang de jonctions V-J
« canoniques » ayant peu de diversité jonctionnelle et pouvant
EMC - Hématologie
IgH polyclonal
TCRγ oligoclonal IgH oligoclonal
TCRγ clonal IgH clonal
Figure 7. Détection d’une population lymphoïde clonale par amplifi-
cation de la région N des V-(D)-J des IgH ou du récepteur des cellules
T gamma (TCR␥) à partir de l’ADN par polymerase chain reaction (PCR)
fluorescente et analyse de fragment.
donner des résultats faussement positifs par PCR avec certains
segments (V␥9 et JP par exemple) si leur présence n’est pas sus-
pectée [29] .
L’utilisation d’amorces fluorescentes et la détection des pro-
duits de PCR par un analyseur de fragments permet l’analyse
globale de la clonalité lymphoïde (Fig. 7) et de connaître de
manière précise la taille du réarrangement amplifié, ce qui peut
être d’une aide précieuse lors de l’analyse de prélèvements de suivi
ou pour définir un envahissement a minima (bilan d’extension) de
prélèvements périphériques. Par ailleurs, l’utilisation d’amorces
marquées par des fluochromes différents permet, dans une PCR
multiplex, d’identifier les différents segments V ou J impliqués
dans le réarrangement. Ceci apporte une meilleure compréhen-
sion des répertoires utilisés dans différentes pathologies et peut
également s’avérer utile pour l’analyse de prélèvements de suivi.
On peut par ailleurs identifier les réarrangements dits canoniques
(cf. supra) et éliminer ainsi le risque de faux positifs lié à leur
présence au sein d’un répertoire très restreint. Cette approche
présente par ailleurs l’avantage d’être très reproductible [30] .
Il faut cependant signaler le risque de détection de faux posi-
tifs par la PCR fluorescente, notamment lorsque le répertoire
étudié est restreint ou peu utilisé, comme dans l’analyse des réar-
rangements du TCR ␥ ou ␦. En conclusion, si cette méthode
comporte d’indiscutables avantages, son utilisation suppose une
bonne expérience et une interprétation en fonction de la patho-
logie sous-jacente.
Apport de l’analyse des réarrangements des gènes
des Ig et du TCR
La mise en évidence d’un réarrangement clonal des gènes des
Ig et du TCR représente un argument décisif de la nature clo-
nale d’une prolifération lymphoïde [31] . Ceci est particulièrement
important lorsque l’aspect morphologique ou histologique est
polymorphe, ce qui est parfois le cas dans certains lymphomes.
Il faut cependant signaler que, bien que dans la plupart des
cas la présence d’une population clonale signifie une population
maligne, ceci n’est pas toujours vrai. D’une part, il existe certaines
proliférations lymphoïdes clonales dont l’évolution clinique ne
correspond pas à celle d’un processus malin, telles les popula-
tions lymphoïdes B associées à une gammapathie monoclonale
bénigne, la papulose lymphomatoïde et certaines proliférations
à grands lymphocytes à grains (large granular lymphocytes – LGL).
D’autre part, le développement de techniques de plus en plus sen-
sibles permet de mettre en évidence la présence de populations
réactionnelles qui représentent en fait l’expansion d’une popula-
tion clonale lymphoïde stimulée par l’antigène. Ces populations
réactionnelles clonales sont détectées surtout si le répertoire de
réarrangements des TCR est restreint, comme dans les lympho-
cytes T␥␦ du sang et les lymphocytes T␣␤ de l’intestin [32] . Malgré
ces limites, la mise en évidence d’une population lymphoïde
clonale a beaucoup amélioré notre capacité à distinguer les proli-
férations bénignes des proliférations malignes.
L’analyse des réarrangements des gènes d’Ig et du TCR dans une
population lymphoïde dont la nature T ou B n’est pas clairement
établie par l’immunophénotypage permet parfois de déterminer la
lignée lymphoïde impliquée (T ou B). Il existe cependant une inci-
dence non négligeable de réarrangements dits illégitimes dans les
proliférations lymphoïdes immatures, surtout dans les leucémie
9
13-000-K-30  Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire
aiguë lymphoblastique (LAL). Le TCR␥, par exemple, est réar-
rangé dans 40 % à 70 % des LAL de la lignée B [33] . L’utilisation
des réarrangements des gènes du TCR ou des Ig pour faire la dis-
tinction entre prolifération T ou B est plus fiable pour l’analyse
des populations matures, au cours desquelles ces réarrangements
illégitimes sont bien plus rares. Mais, dans tous les cas, les résul-
tats doivent être interprétés en fonction des données cliniques,
morphologiques et immunologiques.
Détection des anomalies génétiques
récurrentes
L’étude cytogénétique consistant en une analyse globale du
génome a une place primordiale dans la prise en charge des
hémopathies malignes, de par l’identification d’anomalies chro-
mosomiques de valeur pronostique avérée. Il existe cependant
certaines situations où la cytogénétique classique ne permet pas
de mettre en évidence ces anomalies. Ainsi il est parfois diffi-
cile d’obtenir des métaphases de qualité acceptable, par exemple
lorsqu’un prélèvement est effectué après traitement par chi-
miothérapie, ou dans les proliférations matures dont l’index
mitotique est moins important, ou encore quand la population
maligne est minoritaire. De plus, l’analyse des métaphases n’est
pas possible sur du matériel congelé ou fixé en paraffine. Cer-
taines anomalies chromosomiques sont difficiles à détecter par
une analyse classique, comme l’inversion du chromosome 16 des
leucémies aiguës myéloïdes (LAM) M4 avec éosinophiles anor-
maux [34, 35] . Il existe aussi des anomalies chromosomiques qui
ne sont pas visibles sur le caryotype classique et qu’on appelle
anomalies cryptiques. Comme exemple de ce type d’anomalies,
la t (12; 21) dans les LAL-B pédiatriques, qui correspond à
un échange de segments chromosomiques de même « couleur »
sur le caryotype (sombre en bandes R) et ne peut de ce fait
être mise en évidence que par des techniques d’hybridation in
situ fluorescente (FISH), ou par PCR en identifiant le transcrit
de fusion TEL-AML1 qu’elle génère [36, 37] . De plus, la résolution
maximale possible de l’analyse des chromosomes marqués en
bandes R ou G est de l’ordre de 1 à 10 Mb. Ainsi les délétions
submicroscopiques, intra- ou intergéniques, ne sont détectables
que par des techniques de cytogénétique moléculaire (FISH ou
CGH array) ou par PCR. La délétion tald , par exemple, (envi-
ron 25 % des cas de LAL-T), qui aboutit à la fusion des gènes
SIL-TAL1, consiste en une délétion spécifique de 90 kb d’ADN
en amont du gène tal-1. Trop courte pour être visible par caryo-
type classique, elle peut être détectée facilement par PCR [38, 39, 40] .
D’autres anomalies génétiques, comme les mutations soma-
tiques, ne sont détectables que par des techniques de biologie
moléculaire.
Anomalies qualitatives
Les translocations conduisent à l’expression d’un transcrit de
fusion résultant de la juxtaposition des parties codantes de deux
gènes. Elles sont détectées par RT-PCR à partir de l’ARN. Ces ano-
malies se retrouvent dans les tumeurs lymphoïdes et myéloïdes.
Les transcrits de fusion et donc les produits de PCR sont identiques
chez tous les malades atteints du même type de translocation,
impliquant les mêmes introns. Cette uniformité rend possible
la détection de la quasi-totalité des translocations avec une ou
deux paires d’amorces d’amplification, mais cette analyse est très
sensible aux contaminations de la PCR, du fait même de cette
uniformité.
À titre d’exemple, les translocations t (9; 22) (q34; q11) des leu-
cémie myéloïde chronique (LMC) et des LAL sont identiques sur le
plan caryotypique mais diffèrent sur le plan moléculaire, bien que
toutes les deux impliquent les gènes bcr et abl [41–43] . Dans les deux
cas, le point de cassure du chromosome 9 se produit au sein de
l’intron 1 du gène abl, qui s’étend sur environ 200 kb. En revanche,
les points de cassure sont plus éparpillés sur le chromosome 22.
Dans la grande majorité des LMC, le point de cassure se trouve
dans la partie centrale du gène bcr (major breakpoint cluster region
– M-BCR). Le transcrit de fusion qui en résulte est traduit en une
protéine anormale, dite p210. Dans les LAL comportant une trans-
10
location t (9; 22), la majorité des cas sont caractérisés par un point
de cassure bien plus en amont dans le gène bcr, dans l’intron 1
(minor breakpoint cluster region – m-BCR). Le produit protéique de
ce gène s’appelle p190.
Actuellement, un certain nombre de transcrits de fusion
sont recherchés par RT-PCR de manière systématique dans
le bilan diagnostique des LAM (AML1-ETO, CBFb-MYH11 et
PML-RARA [44] ), des LAL-B (BCR-ABL, E2A-PBX1, MLL-AF4 et
TEL-AML1 [36, 37, 41, 42, 45–49] ) et des LAL-T (SIL-TAL, CALM-AF10 et
NUP214-ABL [38, 39, 50] ).
Il existe aussi des anomalies impliquant d’un côté un chro-
mosome et un gène constants, mais de l’autre un partenaire
chromosomique variable. Les anomalies en 11q23 sont présentes
dans environ 5 % à 10 % des leucémies aiguës en général, et d’une
manière préférentielle dans les leucémies aiguës des enfants âgés
de moins d’un an (70 %) et dans certaines leucémies secondaires.
Du côté du chromosome 11, toutes ces translocations impliquent
le même gène, MLL, alors que l’on dénombre pas moins d’une
soixantaine de gènes partenaires différents [47, 48, 51] . La transloca-
tion est détectable et quantifiable par PCR, mais du fait de la
grande variabilité des partenaires, elle est d’abord détectée par
FISH avec une sonde MLL sur métaphase ou même sur noyau
interphasique. Le partenaire est ensuite identifié par séquençage
du produit de la LDI-PCR (long distance inverse – LDI). La LDI-PCR
est une technique qui permet d’amplifier un gène de fusion en
ne connaissant que la séquence de l’un des deux gènes impliqués.
Cette technique trouve tout son intérêt dans la détection des ano-
malies génétiques impliquant des gènes à partenaires multiples,
tels que NUP98 ou MLL. Son principe repose sur la double diges-
tion par une enzyme de restriction du fragment d’ADN d’intérêt
(exemple MLL-gène partenaire inconnu) d’une taille de 2 à 5 kb,
puis ligation entre eux des deux bouts de l’ADN à étudier for-
mant ainsi un cercle, puis amplification par un couple d’amorces
de sens opposé mais toutes deux complémentaires de la séquence
génique connue. Ainsi le séquençage du produit d’amplification
permet l’identification de la séquence et donc du gène
partenaire.
Anomalies quantitatives
Il s’agit essentiellement de translocations conduisant à
l’expression aberrante d’un proto-oncogène qualitativement
normal, suite à sa juxtaposition à une séquence régulatrice inha-
bituelle, souvent celle d’un gène des Ig ou du TCR. Les points de
cassure du côté du proto-oncogène se trouvent en dehors de la
partie codante du gène, parfois à une distance considérable (une
centaine de kb pour les t (11; 14) (q13; q32) des lymphomes du
manteau par exemple) [52, 53] et la protéine reste donc intacte. Le
résultat final de ces anomalies est une dérégulation de l’expression
du proto-oncogène, soit à un stade inhabituel de la différencia-
tion ou du cycle cellulaire, soit dans un tissu n’exprimant pas ce
produit physiologiquement.
Ces anomalies chromosomiques résultent souvent d’erreurs de
la recombinase lors des réarrangements des gènes des Ig ou du TCR
(voir ci-dessus) et se retrouvent, par conséquent, dans les tumeurs
lymphoïdes. Les points de cassure sont situés dans une séquence
signal de recombinaison réelle du côté des Ig ou du TCR, et dans
une séquence qui lui ressemble du côté du proto-oncogène. La
jonction nucléotidique entre les deux chromosomes est soumise
aux mêmes modifications que les réarrangements physiologiques
des Ig ou du TCR, créant ainsi une région N spécifique de chaque
malade. L’amplification de ce type de translocation par PCR se
fait à partir de l’ADN et génère des produits de PCR de taille
variable, ce qui rend plus facile l’identification de la transloca-
tion spécifique de chaque malade et la séparation d’éventuels
produits contaminants. Par contre, seuls les points de cassure
regroupés dans la région avoisinant les amorces d’amplification
seront détectés. L’amplification par PCR de la région principale de
cassure (major breakpoint region – MBR) de la translocation t (14;
18) des lymphomes folliculaires, par exemple, ne détecte que les
cas comportant une translocation t (14; 18) caryotypique dont le
point de cassure est situé dans MBR (environ 70 %). En amplifiant
mcr (minor cluster region), il est possible de détecter les cas dont
le point de cassure se situe dans cette région (environ 5 %) [54] .
EMC - Hématologie
 Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire  13-000-K-30
De même, la détection par PCR de la translocation t (11; 14) des
lymphomes du manteau est positive seulement dans la moitié
des cas, quand le point de cassure implique la région préféren-
tielle de translocation (major cluster region – MCR) en amont du
gène dérégulé, CCND1 ou PRAD-1 [53] . Vu la faible informativité de
cette méthode, l’alternative est de mesurer par PCR quantitative
l’expression de la CCND1, qui est augmentée dans toutes les trans-
locations t (11; 14) des lymphomes du manteau. L’identification
des t (11; 14) ou t (14; 18) par biologie moléculaire est moins
informative que par cytogénétique ; en revanche, en cas de posi-
tivité, l’identification par PCR fluorescente de la taille exacte de
ces remaniements permet de suivre leur évolution en réponse au
traitement.
Dans les LAL-T, les translocations t (7; 10) et t (10; 14)
impliquent les gènes du TCR et le gène HOX11 situé sur le chromo-
some 10, entraînant sa surexpression. En routine, l’identification
par biologie moléculaire de ces deux translocations se fait grâce
à la mesure par PCR quantitative du niveau d’expression du gène
HOX11. Un autre gène de la même famille que HOX11, HOX11L2
(HOX11 like 2), est impliqué dans une translocation cryptique t
(5; 14) qui entraîne son hyperexpression, probablement en rai-
son de la proximité des régions promotrices du gène CTIP2 situé
en 14q32. En routine, l’identification de cette translocation peut
se faire par hybridation in situ fluorescente ou en quantifiant
l’expression de HOX11L2 par RQ-PCR [38, 55, 56] .
D’autres gènes sont surexprimés dans les hémopathies
malignes, mais sans remaniements chromosomiques sous-jacents.
La découverte de la surexpression de ces gènes, notamment ceux
qui ont une valeur pronostique, a été rendue possible par des
études de transcriptome, en comparant au sein d’une même
hémopathie le profil d’expression des patients de bon pronostic
à celui des patients de pronostic péjoratif. Par exemple, chez les
adultes atteints de LAM à caryotype normal, plus de la moitié
des patients surexpriment au moins l’un des gènes MN1, BAALC,
ERG-1 ou AF1q et cette surexpression est associée à un mauvais
pronostic.
Mutations somatiques
Au cours des dernières années, un grand nombre de mutations
somatiques a été découvert dans les hémopathies malignes, parti-
culièrement dans les LAM (FLT3, NPM1, CEBPA, RAS, WT1, C-KIT,
TET2, CBL, ASXL1, IDH1, IDH2, etc.), où le séquençage à haut
débit pourrait devenir un outil indispensable [57–65] .
Les mutations affectant FLT3 et NPM1 sont des duplications
et insertions de petite taille (< 400 pb) qui peuvent aussi être
détectées par PCR fluorescente puis passage au GeneScan. La
modification de la taille par rapport au témoin négatif signale
la présence d’une duplication/insertion si la taille du produit de
PCR de l’échantillon à étudier est supérieure à celle du témoin.
Des délétions de plus grande taille, qui peuvent impliquer
quelques exons du gène ou sa totalité, par exemple la délétion
intragénique ou totale d’Ikaros dans les LAL-B [66] , sont accessibles
à la PCR, mais en routine elles sont de plus en plus souvent recher-
chées par des techniques pangénomiques (CGH array, SNP array).
Certaines mutations sont associées à un sous-type
d’hémopathie, telle la mutation V617F du gène JAK2, pré-
sente dans plus de 95 % des polyglobulies de Vaquez. La mutation
étant unique, sa détection peut se faire soit par séquençage direct,
soit par PCR spécifique d’allèle (AS-PCR). Cette technique consiste
à utiliser une des deux amorces ou une sonde fluorescente qui
s’hybride spécifiquement à la séquence mutée, de sorte qu’en
absence de mutation on n’observe pas de produit d’amplification
par PCR [67] .
 Apport de l’analyse moléculaire
À la différence des réarrangements des Ig ou du TCR, qui repré-
sentent des marqueurs indirects de malignité dans les tumeurs
lymphoïdes, les anomalies génétiques sont directement impli-
quées dans le processus malin. Leur détection aide au diagnostic,
à l’évaluation du pronostic et peut conditionner le choix théra-
peutique et permet de suivre la réponse au traitement.
EMC - Hématologie
Diagnostic
Certaines anomalies sont pathognomoniques d’une maladie et
leur mise en évidence est nécessaire pour établir le diagnostic,
notamment dans tous les cas ayant une présentation clinique aty-
pique. C’est le cas par exemple de la LMC et de la détection d’un
réarrangement impliquant les gènes BCR et ABL.
De la même manière, le diagnostic de LAM3 en l’absence d’une
translocation t (15; 17) (q22; q11) et/ou d’un transcrit de fusion
PML-RARA nécessite la mise en évidence d’une forme molécu-
laire variante telle que la translocation t (11; 17) (q23; q21) ou
son transcrit de fusion, PLZF-RARA [44, 68] . Du côté lymphoïde, la
mise en évidence par caryotype classique ou par analyse molécu-
laire de la translocation t (14; 18) (q32; q21) [IgH ; bcl-2] ou de
la t (11; 14) (q13; q32) [bcl-1/CCND-1 ; IgH] contribue au diag-
nostic du lymphome folliculaire et du lymphome du manteau,
respectivement.
Pronostic
Depuis le début des années 2000, le nombre d’anomalies molé-
culaires ayant un impact pronostique ne cesse d’augmenter et leur
recherche systématique au sein de grandes cohortes de patients
protocolaires devrait permettre de pondérer la valeur de chacune
d’entre elles ou d’identifier les associations de plus grande valeur
pronostique.
Nous rapportons dans le Tableau 2 les anomalies génétiques
d’incidence supérieure à 5 % dans les leucémies, et qui ont une
valeur pronostique avérée.
Détection de la maladie résiduelle
La maladie résiduelle est définie par la persistance de cellules
tumorales qui ont survécu à la chimiothérapie, présentes en
nombre inférieur au seuil de détection des méthodes morpholo-
giques classiques, par exemple, pour les leucémies aiguës (moins
de 5 % de blastes). Il a été estimé que la masse tumorale totale au
moment du diagnostic d’une leucémie est de l’ordre de 1012 cel-
lules et que l’induction la réduit d’au moins deux log décimaux. Il
est donc évident que la rémission complète peut représenter entre
0 et 1010 cellules tumorales. La sensibilité de la détection des cel-
lules tumorales rares par PCR dépasse de plusieurs log décimaux
celle d’autres techniques (Fig. 8).
Dans les leucémies aiguës, de nombreuses données récentes
de la littérature ont démontré la pertinence d’une surveillance
séquentielle de la maladie résiduelle (minimal residual disease –
MRD) pour l’identification de groupe à haut risque de rechute
dont le pronostic pourrait être amélioré par un traitement intensif.
Les protocoles thérapeutiques des LAL, notamment, sont désor-
mais stratifiés en fonction du niveau de détection de la MRD,
après les premières cures de chimiothérapie [69–71] . Cette évalua-
tion, initialement réalisée par des méthodes semi-quantitatives
ou compétitives, est actuellement réalisée par PCR quantitative.
Les cibles utilisables sont de deux types : soit des remaniements
chromosomiques (30 % environ des LAM et des LAL), soit des réar-
rangements VDJ clonospécifiques (90 % des LAL). Les premiers
présentent l’avantage d’être stables au cours de l’évolution de la
maladie mais ne concernent qu’un tiers des patients. Les réarran-
gements VDJ sont informatifs dans plus de 90 % dans les LAL,
mais ont l’inconvénient d’être instables, notamment par évolu-
tion clonale ou émergence d’un sous-clone avec un réarrangement
différent.
Détection moléculaire des anomalies
chromosomiques
L’anomalie chromosomique la plus recherchée par PCR pour
le suivi des malades est BCR-ABL dans la LMC. La cinétique
d’évolution du taux de transcrit mesuré par PCR quantita-
tive a une incidence thérapeutique directe pour les patients :
notamment adapter la posologie du traitement par imatinib ou
déclencher la recherche par séquençage des mutations de résis-
tance.
11
13-000-K-30  Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire

Tableau 2.
Anomalies moléculaires de valeur pronostique dans les leucémies.
Gènes Type d’anomalie Hémopathie Incidence Pronostic Référence
[41, 42]
BCR-ABL Transcrit de fusion LMC 100 % Mauvais dans les LAL-B
LAL-B de l’adulte 25 %
LAL-B de l’enfant < 5%
MLL-AF4 [47–49]
Transcrit de fusion LAL-B 5% Mauvais
LAL-B < 1 an 85 %
[36, 37]
TEL-AML1 Transcrit de fusion LAL-B enfant 25 % Bon
[45, 46]
E2A-PBX1 Transcrit de fusion LAL-lignée B 5% Mauvais si traitement standard
LAL pré-B Ig Cyto. + 25 % Amélioration du pronostic avec la chimiothérapie intensive
[66]
IKZF1 Délétion LAL-B Ph1 pos 85 % Mauvais
LAL-B Ph1 nég 11 %
[38, 39]
SIL-TAL Transcrit de fusion LAL-T 10 % à 30 % Taux de rechute plus élevé
[50]
CALM-AF10 Transcrit de fusion LAL-T 7% Mauvais dans les LAL-T immatures
[38, 55]
HOX11L2 Surexpression LAL-T enfant 20 % Mauvais
LAL-T adulte 5%
[38, 56]
HOX11 Surexpression LAL-T enfant 5% Bon
LAL-T adulte 20 % à 30 %
[85]
NOTCH1 Mutation LAL-T 50 % à 60 % Bon
[85]
FBXW7 Mutation LAL-T 20 % Bon
[44]
AML1-ETO Transcrit de fusion LAM 10 % Bon
LAM-2 20 % à 40 %
PML-RARA [44]
Transcrit de fusion LAM 10 % Bon
LAM-3 > 95 %
[35]
CBFB-MYH11 Transcrit de fusion LAM 6% Bon
LAM-4 20 %
LAM-4 éosino 95 %
[57]
FLT3-ITD Mutation LAM 15 % à 30 % Mauvais
Mutation [58]
NPM1 LAM adulte 25 % à 35 % Bon
LAM enfant 2% à 6%
[59]
CEBPA Mutation LAM 6% Bon
[64]
C-KIT Mutation LAM 8% Mauvais dans les LAM à CBF

LAM : leucémies aiguës myéloïdes ; LAL : leucémie aiguë lymphoblastique ; LMC : leucémie myéloïde chronique ; CBF : core binding factor.

Détection des réarrangements des Ig et du TCR

Induction Dans près de 90 % des LAL, les réarrangements des gènes des
Consolidation Ig et/ou du TCR peuvent représenter des marqueurs moléculaires
permettant l’analyse de la maladie résiduelle. Deux stratégies sont
possibles : distinguer la population clonale résiduelle de la popula-
1012 Rémission complète Rechute 100 %
tion réactionnelle normale par la taille des fragments générés par
PCR [28, 72] ; ou détecter d’une manière spécifique la région N du
Morphologie réarrangement V-(D)-J du clone de départ. Cette deuxième stra-
Nombre de cellules malignes

1010 10-2 tégie nécessite soit le séquençage de la région N et la fabrication

Maintenance d’un oligonucléotide spécifique [73] , soit l’utilisation du produit
Maladie résiduelle d’amplification de la région N comme sonde spécifique [74] . Depuis
108 Résistance 10-4
quelques années, la place de la maladie résiduelle dans la stratifica-
tion thérapeutique des leucémies aiguës semble se préciser [75, 76] .
106 10-6 La stratégie spécifique de la région CDR3, soit par hybridation, soit
par RQ-PCR, est spécifique et sensible (de l’ordre de 10−4 à 10−5
104 soit une cellule maligne pour 10 000 à 100 000 cellules) mais a
Greffe l’inconvénient de détecter seulement le clone de départ. Elle sera
Immunothérapie mise en défaut dans le cas d’une évolution clonale.
102 La comparaison par PCR des réarrangements des gènes d’Ig ou
Consolidation
du TCR dans les tumeurs lymphoïdes lors du diagnostic et de la
tardive
rechute peut permettre de déterminer si la rechute représente la
100
0 Années 2 réapparition du même clone ou son remplacement par un autre
clone. L’apparition d’un nouveau réarrangement des gènes d’Ig ou
Figure 8. Représentation schématique des possibilités de l’évolution de
du TCR peut représenter soit une modification du réarrangement
la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës et les niveaux de sensibilité
majoritaire, soit l’émergence d’un sous-clone minoritaire pouvant
requis pour sa détection.
être sélectionné par une résistance à la chimiothérapie. La mise en

12 EMC - Hématologie
 Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire  13-000-K-30
évidence de certaines anomalies moléculaires, telles que les muta-
tions ponctuelles de l’anti-oncogène p53 [77] lors d’une rechute,
permet de caractériser l’apparition de clones plus agressifs. Ces
anomalies moléculaires sont souvent corrélées à une aggravation
clinique ou l’acquisition de nouvelles anomalies caryotypiques.
Choix thérapeutique
Dans les leucémies aiguës, malgré l’amélioration des combinai-
sons de chimiothérapie, il persiste un certain nombre de patients
dont la maladie est d’emblée réfractaire au traitement et d’autres
qui rechutent. Cette observation est le reflet de l’hétérogénéité
des anomalies ongogéniques ayant abouti au développement de
chaque hémopathie. Les analyses moléculaires ont confirmé cette
hétérogénéité en révélant des anomalies moléculaires fréquentes,
ce qui a engendré le développement de traitements spécifiques en
vue de mieux cibler les cellules pathologiques. Aujourd’hui, un
marqueur qui détermine un traitement spécifique est qualifié de
marqueur avec impact « théranostique ». Devant l’augmentation
exponentielle des marqueurs moléculaires en oncologie, leur
détection dans un contexte hospitalier se limite progressivement
à ceux ayant un impact théranostique individuel.
L’acide tout transrétinoïque (ATRA) est le premier modèle de
traitement par différenciation de la cellule maligne possédant la
protéine de fusion PML-RARA. Il agit de façon spécifique sur les
cellules de la LAM3, provoquant leur différenciation terminale
en quelques jours in vitro. Chez les patients, il y a maturation
des cellules malignes, sans diminution de la cellularité médullaire
et donc sans aplasie thérapeutique, si ce n’est celle induite par
la chimiothérapie conventionnelle. En effet, pour le traitement
d’induction, l’ATRA et la chimiothérapie doivent absolument être
utilisés en association car le risque de syndrome rétinoïque (forte
élévation du taux de leucocytes pouvant entraîner le décès des
patients) est plus faible et les rechutes sont moins nombreuses.
D’autres études ont montré l’efficacité du trioxyde d’arsenic
(As2 O3 ) dans le traitement des LAM3, où son utilisation en mono-
thérapie permet d’obtenir une RC avec rémission moléculaire
(transcrit PML-RARA indétectable en PCR quantitative en temps
réel) chez 72 % à 91 % des patients et une survie sans maladie
relativement longue. Actuellement le traitement le plus efficace
associe ATRA, As2 O3 et chimiothérapie [78] .
Dans la LMC, la translocation t (9; 22) provoque l’activation
constitutive de la kinase abelson et des inhibiteurs de la tyrosine
kinase (ITK) ont été développés spécifiquement pour cibler cette
anomalie. Le premier à avoir été commercialisé est l’imatinib.
C’est actuellement le traitement de référence des LMC et il
est associé à la chimiothérapie pour le traitement des LA avec
chromosome Philadelphie. L’imatinib inhibe plusieurs autres
tyrosines kinases et s’est révélé efficace dans le syndrome hyper-
éosinophilique avec transcrit FIP1L1-PDFGRa. Les ITK dits de
2e génération (dasatinib, nilotinib) sont utilisés en cas de résis-
tance, d’intolérance ou de réponse suboptimale à l’imatinib.
Les mutations des oncogènes N-Ras et K-Ras surviennent dans
10-15 % et 5 % des LAM respectivement. Les mutations touchent
essentiellement les codons 12, 13 et 61 et abrogent l’activité
GTPase intrinsèque de ces petites molécules, entraînant leur acti-
vation constitutive. La valeur pronostique des mutations de Ras
dans les LAM n’est toujours pas très clairement établie. Cette
voie semble toutefois être une cible thérapeutique potentielle
car l’activité de Ras nécessite sa translocation à la membrane
plasmique via une étape de farnésylation et des inhibiteurs
de farnésyl-transférase sont actuellement testés cliniquement [79] .
L’administration de tipifarnib ou de lonafarnib chez des patients
naïfs de tout traitement et atteints de LAM, de myélodysplasie
ou de leucémie myélomonocytaire chronique a produit des résul-
tats plutôt encourageants alors qu’ils étaient décevants chez les
patients atteints de LAM réfractaire ou en rechute [80] .
Plusieurs inhibiteurs de FLT3 font l’objet d’essais cliniques, avec
pour l’instant des résultats modestes. Les composés PKC-412 et
CEP-701 ont la particularité d’inhiber d’autres récepteurs de tyro-
sine kinase (PDGF-R, kit, FMS, etc.). Ces deux molécules se sont
montrées très efficaces in vitro mais n’ont eu que très peu d’effets
lors d’essais cliniques en monothérapie [81, 82] . Ils sont désormais
EMC - Hématologie
testés en association avec une chimiothérapie standard et les résul-
tats semblent prometteurs [83] . Un nouvel inhibiteur de FLT3, le
MLN518, donne également des résultats encourageants [84] .
C-KIT est un récepteur de tyrosine kinase dont le ligand est
le stem cell factor (SCF) ; 80 % des blastes de patients expriment
le récepteur C-KIT. Le ciblage du récepteur C-KIT semble une
approche thérapeutique ciblée intéressante, surtout dans les LAM
dites à core binding factor (CBF), c’est-à-dire portant la t (8 ; 21) ou
l’inv (16), où les mutations activatrices de ce récepteur sont fré-
quentes (20 % à 30 % des cas). PKC-412 cible ce récepteur, mais
également le dasatinib. L’utilisation de cette dernière molécule
présente l’avantage d’être bien maîtrisée car elle est déjà largement
utilisée en monothérapie dans la leucémie myéloïde chronique
ou en association à la chimiothérapie dans les LA à chromosome
Philadelphie.
Dans les LAL-T, plus de 50 % des cas adultes et pédiatriques
ont une mutation activatrice du gène NOTCH1 [85] . Les muta-
tions du domaine d’hétérodimérisation (HD) entraînent le clivage
ligand-indépendant du récepteur Notch1 puis le clivage de la
partie intracytoplasmique médié par la gamma-sécrétase (GS),
ce qui aboutit à la production de la forme active de NOTCH1
(intracellular domain of NOTCH1 – ICN1). Les inhibiteurs de GS
(GSI) antagonisent les effets des mutations de NOTCH1 en blo-
quant la génération de l’ICN1. Les données préliminaires des
essais thérapeutiques sont très encourageantes quant au béné-
fice de l’utilisation des GSI dans les LAL-T NOTCH1 HD muté,
notamment en association avec les corticoïdes, qui réduisent la
toxicité intestinale des GSI [86] . Une autre molécule en cours de
développement inhibe l’interaction protéine-protéine nécessaire
à la transactivation du complexe NOTCH1 intranucléaire [87] .
Détection de la résistance aux drogues
Certains gènes responsables de l’efflux des agents cytotoxiques
des cellules hématopoïétiques, comme multi-drug resistance (mdr)-
1, ont été identifiés. L’expression de mdr-1 peut être détectée par
des techniques d’immunohistochimie au niveau protéique, par
hybridation in situ, par dot blot ou par RT-PCR au niveau de l’ARN
messager et par mesure de la vitesse d’efflux d’un fluorochrome
au niveau de l’analyse fonctionnelle. Une hyperexpression est
observée fréquemment lors de la rechute des LAM, des myélomes
et des lymphomes. Au diagnostic des LAM, l’hyperexpression de
mdr-1 représente un facteur de mauvais pronostic qui prédit une
résistance à la chimiothérapie [88] .
Dans la LMC, le séquençage a permis de détecter les mutations
du domaine kinase d’Abelson entraînant une résistance spécifique
à l’un des ITK ou à tous les ITK (mutation T315I).
Évaluation moléculaire post-allogreffe
Il est parfois important de déterminer si la reconstitution héma-
topoïétique après allogreffe est celle du receveur ou du donneur.
S’il existe une différence de sexe entre le receveur et le donneur,
cette analyse peut se faire par détection du chromosome Y, soit
par marquage à la quinacrine sur métaphase, soit par FISH sur
noyau interphasique avec une sonde Y [89] . Quand il n’y a pas
de différence de sexe, la distinction entre l’hématopoïèse de type
receveur ou de type donneur se faisait historiquement à l’aide des
minisatellites (VNTR) mais de plus en plus se fait par étude des
microsatellites (STR) [90] .
 Perspectives d’avenir
Les techniques de biologie moléculaire ne cessent d’évoluer
et il y a encore peu de temps, le séquençage entier du génome
humain était une entreprise longue et très coûteuse. Ainsi, le pre-
mier séquençage a coûté 2,7 milliards de dollars US. Aujourd’hui,
du fait de la baisse très importante du coût des technologies, le
séquençage du génome d’un individu coûte 10 000 dollars US et
pourrait rapidement tomber à 1 000 dollars US.
En 2008, des chercheurs américains ont pour la première fois
séquencé le génome entier des blastes chez une femme atteinte de
13
13-000-K-30  Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire
LAM. Pour cela, les scientifiques ont analysé la séquence génétique
des blastes de la patiente et l’ont comparée à celle d’un échan-
tillon de cellules de peau saines appartenant à la même personne.
Cette étude a notamment permis d’identifier huit nouveaux gènes
impliqués dans cette hémopathie [91] . Ainsi, cette découverte, des-
tinée à rechercher les causes génétiques du cancer, pourrait ouvrir
la voie à des approches thérapeutiques innovantes. D’autant que
les traitements ont peu évolué au cours des deux dernières décen-
nies car la plupart des événements génétiques qui déclenchent la
maladie restent inconnus à ce jour.
Même si le séquençage du génome entier paraît aujourd’hui
aisément accessible, un certain nombre de réserves peuvent être
émises. En effet, il semble difficile pour le moment d’intégrer
toutes les données émises en clinique. Si cette pratique est appelée
à se développer, il faudra mettre au point des méthodes intégrant
les données génétiques et cliniques pour aider à la décision théra-
peutique. De plus, la majeure partie des informations qui seront
obtenues n’ont pas de signification pour le moment. Comme les
connaissances évoluent rapidement, l’interprétation d’un même
génome sera différente selon le moment où elle est réalisée.
Enfin, les avancées technologiques ne doivent pas faire oublier
l’aspect éthique : toute analyse génétique nécessite le consente-
ment éclairé des patients. On peut se demander également qui
doit voir son génome séquencé et qui doit avoir accès à ces infor-
mations.
“ Point fort
• L’analyse de l’ADN et de l’ARN ne fournissent pas les
mêmes informations en biologie moléculaire.
• La PCR est une technique sensible permettant d’analyser
des anomalies moléculaires qualitatives et quantitatives.
• Les techniques de puces à ADN permettent l’analyse
simultanée de plusieurs dizaines de milliers de gènes dans
un échantillon biologique sain ou malade, aussi bien au
niveau de son génome (ADN) que de son transcriptome
(ARN).
• La détection d’une population clonale lymphoïde n’est
pas un argument de malignité.
• L’analyse des anomalies moléculaires est utilisée pour le
diagnostic, le pronostic, le suivi des hémopathies malignes
et dans certains cas le choix thérapeutique.
 Références
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via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol
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Laboratoire d’hématologie, Hôpital Necker-Enfants malades, AP-HP et Université René Descartes Paris V, Faculté de médecine, 149, rue de Sèvres, 75015
Paris, France.
CNRS UMR 8147, Université René Descartes Paris V, Faculté de médecine, Institut fédératif Necker, 149, rue de Sèvres, 75015 Paris, France.
Toute référence à cet article doit porter la mention : Callens C, Ben Abdelali R, Macintyre E. Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie
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