LEUCÉMIES AIGUËS

Place de la cytométrie en flux dans le diagnostic

et le suivi des leucémies aiguës
Marie-Christine Béné a,*, Francis Lacombeb

RÉSUMÉ
L’immunophénotypage est devenu une étape incontournable du dia-
gnostic des leucémies aiguës, complément indispensable de l’examen
morphologique des cellules au microscope. Il permet de confirmer la
lignée cellulaire engagée dans le processus leucémique, et de préciser
le stade de blocage des blastes dans leur différenciation. Ces éléments
conditionnent en partie la prise en charge des patients, subordonnée un
peu plus tard aux caractéristiques cytogénétiques et moléculaires de la
tumeur. La réalisation et l’interprétation correctes de la cytométrie en flux
appliquée aux leucémies aiguës impliquent une bonne connaissance
des marqueurs utilisables et de leur expression dans la moelle normale.
Ces données ont longtemps été fragmentaires mais sont désormais de
mieux en mieux établies, facilitant le diagnostic initial. L’impact des ano-
malies immunophénotypiques sur le pronostic a pratiquement disparu
avec les progrès thérapeutiques, même si l’identification formelle de la
lignée en cause reste indispensable. Cependant, alors que les critères de
corticosensibilité précoce (pour les leucémies aiguës lymphoblastiques)
et de chimiosensibilité initiale prennent une importance croissante dans la
littérature récente, la cytométrie en flux est en mesure d’occuper une place
majeure tant pour le suivi des traitements d’induction que pour la mesure
de la maladie résiduelle aux différentes étapes de la prise en charge des
patients. Cette revue générale aborde successivement l’ensemble de ces
problématiques.
Cytométrie en flux – leucémies aiguës – diagnostic – maladie résiduelle.
1. Introduction
SUMMARY
Flow cytometry in the diagnostic work-up and
follow-up of acute leukemia
Immunophenotyping has become a mandatory step
in the diagnosis of acute leukemias, together with
cytomorphologic microscopic examination. It allows
to definitely assess the lineage involved in the leuke-
mic process and to precise the stage of blast cells
maturation blockade. These features condition in part
patients’ management, later also influenced by data
from cytogenetics and molecular analyses. Proper
performance and interpretation of flow cytometry
applied to acute leukemias implies solid knowledge of
the markers available and their expression in normal
bone marrow. These features, long only sparse, now
tend to be better and better established, facilitating
the initial diagnosis. The prognostic impact of immu-
nophenotypic anomalies has almost disappeared
with the progress of therapies, even if definite lineage
assessment remains fundamental. However, since cri-
teria of early corticosensitivity (for acute lymphoblas-
tic leukemias) and of initial chemosensitivity appear
to be of growing importance in the recent literature,
flow cytometry is likely to gain a major place for the
follow-up of induction therapies as well as for minimal
residual disease assessment at the various treatment
checkpoints. This review addresses all these issues.

Flow cytometry – acute leukemias – diagnosis –

Le diagnostic d’une leucémie aiguë est évoqué lors de la
minimal residual disease.
mise en évidence de cellules blastiques à l’examen mor-
phologique d’un frottis de sang ou de moelle, dans un
contexte d’hyperleucocytose ou au contraire de cytopénie périphérique, avec ou sans syndrome tumoral ou autres
manifestations cliniques évocatrices. Sur le plan physiopa-
thologique, il s’agit d’une expansion tumorale de cellules
a Service d’hématologie biologique
hématopoïétiques bloquées dans leur différenciation à un
Centre hospitalier universitaire de Nantes
stade précoce de maturation [1]. Les progrès constants dans
Hôtel-Dieu
la compréhension de ces pathologies ont permis de mettre
9, quai Moncousu
44093 Nantes cedex 1
en évidence les très nombreuses anomalies moléculaires
associées à cette prolifération, dont certaines constituent
b Service d’hématologie biologique
des facteurs pronostiques importants à prendre en compte
Centre hospitalier universitaire de Bordeaux dans la prise en charge des patients [2].
Hôpital Haut-Levêque Les étapes initiales du diagnostic requièrent cependant
Avenue Magellan l’identification de la lignée cellulaire en cause, et reposent
33604 Pessac cedex sur l’examen morphologique et la caractérisation immu-
nophénotypique des cellules blastiques. Ces résultats
* Correspondance peuvent être obtenus en quelques heures et guider rapi-
mariechristine.bene@chu-nantes.fr dement les décisions thérapeutiques. La réalisation de
nombreux essais cliniques a permis d’effectuer de grands
article
ti l reçu le
l 9 janvier,
j i accepté té le
l 26 janvier
j i 2015 progrès pour l’obtention d’une rémission complète de
© 2015 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés. la maladie, confortée par des traitements d’entretien

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2015 - N°471// 35

 et/ou la transplantation de cellules souches hématopoïé-
tiques, conduisant dans un nombre croissant de cas à
une guérison [3, 4]. De plus en plus de travaux montrent
que le choix du traitement permettant l’élimination la plus
rapide possible des cellules leucémiques est un élément
crucial permettant de prédire la solidité de cette rémission.
La complexité du processus de tumorigenèse, le plus
souvent responsable de la génération de plusieurs clones
potentiellement leucémiques [5], nécessite cependant un
suivi attentif des patients. L’identification précoce de cel-
lules d’immunophénotype anormal, ou de l’accumulation
anormale de précurseurs hématopoïétiques bloqués dans
leur différenciation, doit permettre de prévenir le déve-
loppement de rechutes. Pour l’ensemble de ces étapes,
diagnostic, évaluation de la chimiosensibilité et suivi de
la maladie résiduelle, la cytométrie en flux, permettant de
caractériser l’immunophénotype des cellules sanguines
ou médullaires, est devenue un élément indispensable de
la prise en charge des patients [1].
2. Immunophénotype
et hématopoïèse
Le développement des anticorps monoclonaux, à la fin
du vingtième siècle, a permis de disposer de quantités
importantes de réactifs stables parfaitement spécifiques
de déterminants antigéniques (ou épitopes), présents sur
des protéines exprimées à la surface ou dans les cellules
eucaryotes dont la majorité étaient précédemment insoup-
çonnées. Ces nouveaux outils ont ainsi permis de découvrir
de nombreuses molécules associées à la physiologie cel-
lulaire dont les caractéristiques, notamment fonctionnelles,
ont ensuite été approfondies à l’aide d’autres technolo-
gies. L’étude de la génération des cellules sanguines par
le processus d’hématopoïèse, déjà bien analysée par les
modifications morphologiques associées à l’engagement
dans les lignées lymphoïde, myéloïde, érythroïde ou pla-
quettaire, a considérablement bénéficié de ces progrès.
Initialement décryptées par l’immunophénotypage des
leucémies, les étapes de maturation de l’hématopoïèse
continuent d’être disséquées par les outils puissants que
représentent les anticorps monoclonaux. Bénéficiant dès
le début des années 1980 d’une nomenclature basée sur
la similitude de la spécificité des nombreux clones générés
dans les laboratoires, les anticorps monoclonaux offrent
actuellement plus de 300 clusters de différenciation ou
CD [6] et un grand nombre d’autres molécules peuvent
être reconnues par des réactifs hors CD, parmi les milliers
(estimées à 4 à 5 000) de molécules membranaires pouvant
être codées par le génome humain [7]. Un petit nombre
de ces antigènes permet de caractériser correctement les
étapes de l’hématopoïèse dans une optique diagnostique.
La description au milieu des années 1990 de CD45 comme
antigène pan-leucocytaire différenciant ces cellules des
autres types cellulaires a été une avancée considérable [8].
CD45 est une molécule transmembranaire dont la longue
partie intracytoplasmique possède une activité tyrosine
phosphatase, ce qui lui confère une activité régulatrice lors
des phénomènes d’activation cellulaire. La partie extracellu-
laire est fortement glycosylée. De plus, l’épissage alternatif
36 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2015 - N°471
des transcrits ARNm de CD45 au niveau des trois exons
principaux induit la synthèse, selon les types cellulaires,
de huit isoformes de CD45. Les anticorps anti-CD45 les
plus utilisés reconnaissent un épitope commun à tous les
isoformes. Le niveau d’expression de CD45, identifié par
ce type d’anticorps, varie selon les sous-populations de
leucocytes, et permet de différencier rapidement les pro-
géniteurs, les granuleux (polynucléaires), les monocytes
et les lymphocytes.
Les cellules souches hématopoïétiques, totipotentes,
douées d’auto-renouvellement et à l’abri dans leur niche
ostéoblastique ou endothéliale [9] sont essentiellement
caractérisées par l’expression de la sialoglycoprotéine
CD34 qui permet de les énumérer lors de leur mobilisation
à visée de greffe autologue ou allogénique [10]. L’expres-
sion de CD34 signe le caractère immature des blastes
d’un clone leucémique. Une identification plus précise du
contingent de cellules souches associe à la recherche de
l’expression de CD34 celle de l’absence de CD38, ADP-
ribosyl cyclase membranaire exprimée à un stade plus
tardif de maturation, plus consommateur d’énergie [11].
L’engagement des progéniteurs dans la lignée lymphoïde est
la première étape précédant les réarrangements de l’ADN
particulier à ces cellules. Ces réarrangements conduisent
à la génération de récepteurs spécifiques d’antigène,
B-cell receptor (BCR) ou T-cell receptor (TCR) pour les
deux lignées principales, le BCR étant plus tard produit
sous forme d’immunoglobulines (anticorps) solubles par
les plasmocytes, étape ultime de la différenciation B. Avant
d’entamer ces réarrangements complexes, les cellules
« vérifient » leur capacité à exporter le moment venu le BCR
ou le TCR, par l’intermédiaire des complexes moléculaires
CD79 et CD3 respectivement. En pratique, l’expression
intracytoplasmique de CD79a ou de la chaîne epsilon de
CD3 signe l’engagement d’une cellule, normale ou leucé-
mique, dans l’une ou l’autre lignée lymphoïde [1].
Pour la lignée B, cette caractéristique est associée à l’ex-
pression membranaire de la molécule CD19, dont la portion
intracytoplasmique contient plusieurs motifs d’activation
ITAM (immunoreceptor tyrosin-based motif). Les autres
antigènes associés à la lignée B qui apparaissent ensuite
sont CD22, CD24 puis CD20. Pendant une phase transi-
toire, les futurs lymphocytes B expriment l’ectopeptidase
CD10. Enfin, les étapes du réarrangement des gènes des
immunoglobulines s’accompagnent dans un premier temps
de l’expression cytoplasmique de chaînes lourdes mu puis
du transfert à la membrane d’IgM et d’IgD de même spéci-
ficité, caractérisant les lymphocytes B naïfs dits « *μδ » [1].
Les cellules engagées dans la lignée T expriment en premier
lieu la molécule d’adhésion CD7, dans une phase précoce
pouvant conduire à un retour vers la lignée myéloïde. Les
antigènes CD2 et CD5 apparaissent ensuite à la surface
des précurseurs T, permettant leur exportation de la moelle
osseuse vers l’épithélium thymique. L’expression transi-
toire de CD1, molécule apparentée aux antigènes HLA de
classe I, signe la prolifération corticale des thymocytes.
Les gènes des molécules γ et δ du TCR sont les premiers
à être réarrangés, sans succès dans la majorité des cas,
permettant l’engagement du réarrangement des gènes α
et β susceptibles de conduire à un TCR fonctionnel porté
à la membrane par CD3 qui devient détectable à la surface
 LEUCÉMIES AIGUËS

de la cellule. Dans ce cas, après l’expression transitoire 3. Cytométrie en flux

d’un pré-TCR et une sélection sévère ne laissant survivre
que les lymphocytes T ne reconnaissant pas d’antigènes et cellules médullaires
du soi, les lymphocytes naïfs sont prêts à sortir du thy-
mus pour gagner les organes lymphoïdes secondaires. Ils La conjugaison des anticorps monoclonaux à des fluo-
ont au préalable quitté la corticale thymique et exprimé rochromes permet de détecter les cellules sur ou dans
concomitamment les corécepteurs CD4 et CD8 (cellules lesquelles ils se sont fixés en mesurant la lumière émise
doubles positives ou DP), reconnaissant respectivement par chaque fluorochrome après excitation par un faisceau
les cellules présentant des antigènes exogènes ou endo- lumineux de longueur d’onde appropriée. C’est sur ce prin-
gènes sur une molécule de classe II ou de classe I du cipe que repose la cytométrie en flux, qui consiste à repé-
complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). La liaison de rer chaque cellule passant dans un flux liquidien devant la
l’un de ces corécepteurs à ces molécules du CMH expri- lumière d’un faisceau laser. Les cytomètres les plus récents
mées sur l’épithélium thymique conduit à la répression de associent au moins trois lasers émettant dans des gammes
l’expression de l’autre. Il s’ensuit la génération de cellules différentes de longueur d’onde. Ils permettent ainsi la mesure
simple positives (SP) dont les deux tiers sont CD4+ et un de 8 à 10 (voire 12 ou 13 pour les plus récents) émissions
tiers CD8+ [12]. lumineuses différentes grâce à des photomultiplicateurs.
La génération de cellules myéloïdes, beaucoup plus Tous les cytomètres en flux (et les autres appareils basés sur
rapide et en beaucoup plus grand nombre que les cel- ce principe comme les automates de numération cellulaire)
lules lymphoïdes, est également moins sophistiquée. mettent à profit les propriétés intrinsèques des cellules à
Le principal marqueur d’immaturité des progéniteurs diffracter la lumière pour mesurer leur taille (diffraction dans
myéloïdes est le récepteur du stem cell factor (SCF), l’axe ou Forward Scatter) et la granularité de leur contenu
appelé c-kit ou CD117, une molécule de la superfa- (diffraction sur les côtés ou Side Scatter). Les deux photo-
mille des immunoglobulines dont la partie intracy- détecteurs recueillant ces valeurs permettent de tracer un
toplasmique a une activité tyrosine kinase. Un autre histogramme biparamétrique déjà très informatif quant à la
marqueur précoce est la myélopéroxydase (MPO), intra- composition d’un échantillon cellulaire. En cas d’envahis-
cytoplasmique et caractéristique des cellules myéloïdes. sement leucémique, la masse des blastes forme un nuage
Les molécules CD33 (homodimère de la superfamille homogène très différent de la combinatoire complexe des
des immunoglobulines) et CD13 (ectopeptidase proche nombreuses sous-populations cellulaires médullaires à
de CD10) sont les deux autres marqueurs définissant divers stades de maturation et de différenciation.
les progéniteurs myéloïdes. Ces deux antigènes de L’utilisation combinée du SSC et d’un marquage par CD45,
différenciation perdurent sur les monocytes alors que mentionné plus tôt pour ses caractéristiques d’antigène
les granuleux perdent progressivement l’expression de
panleucocytaire, permet de dresser ce qui est communé-
CD33. Les étapes ultérieures de différenciation myé-
ment appelé la « cartographie » des leucocytes médullaires
loïde, outre les modifications morphologiques permettant
(figure 1) [16]. Les progéniteurs médullaires, de faible SSC
une bonne reconnaissance des cellules au microscope,
s’accompagnent de l’expression de molécules plus ou
moins partagées par ces différentes formes cellulaires. Figure 1 – Cartographie de la moelle osseuse [16] dans la
Les marqueurs les plus caractéristiques des granuleux représentation CD45 (abscisse) side scatter (SSC, ordonnée).
sont les sucres CD15 (3-fucosyl-N-acetyl-lactosamine)
et CD65 (céramide dodecasaccharide), le récepteur
au Fc des immunoglobulines CD16 et les intégrines,
notamment la chaîne a CD11b des β2 intégrines (CD18).
Les monocytes expriment rapidement CD36 (récepteur de
la thrombospondine également présent sur les progéniteurs
érythroïdes) et CD38. Les monocytes matures expriment
le récepteur au lipopolysaccharide (LPS) CD14, ainsi que
des récepteurs au Fc des immunoglobulines, notamment
CD64 et CD32, FcgRIII, CD16, étant plus caractéristique
des monocytes inflammatoires ou non classiques [13].
À noter que les monocytes utilisent également les inté-
grines pour se déplacer, notamment CD11b.
Les érythroblastes sont caractérisés par l’absence d’expres-
sion de CD45 et la présence membranaire de CD36 et du
récepteur à la transferrine CD71 régulant leurs besoins en
fer. Deux autres antigènes sont utiles pour identifier ces
cellules, l’endogline CD105 et la glycophorine A CD235.
Les stades les plus précoces expriment CD34 et CD117,
qui disparaissent avec la perte de CD45 [14].
La lignée mégacaryocytaire est caractérisée par l’expression
des protéines plaquettaires CD41 (GP IIb), CD42 (Gp Ib) Les granuleux sont colorés en rouge, les monocytes en vert et les lymphocytes en
et CD61 (GPIIIa), associées à CD36 [15]. magenta. La région des progéniteurs, ou « bermudes » apparaît en cyan.

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2015 - N°471// 37

 et exprimant CD45 avec une intensité intermédiaire, sont
présents dans une région grossièrement triangulaire, entre
les granuleux (SSC plus élevé), les monocytes (SSC inter-
médiaire et CD45 plus intense) et les lymphocytes (SSC
faible et CD45 fort), parfois appelée « bermudes ». En cas
de leucémie, cette région est hypertrophiée et s’il existe
des cytopénies associées, les autres compartiments sont
diminués ou absents.
L’informatique associée à la fluidique et aux filtres et photo-
multiplicateurs des cytomètres permet de discriminer effi-
cacement les sous-populations leucocytaires en combinant
les résultats du marquage des cellules dans une série de
fenêtres électroniques consécutives (on parle de stratégie
de fenêtrage). On peut ainsi affiner la définition du compar-
timent de progéniteurs (bermudes) en associant CD16 et
CD11b pour identifier les granuleux et leurs progéniteurs,
CD11b et CD14 pour identifier les monocytes. Les lympho-
cytes sont facilement repérables par leur forte expression
de CD45 [16]. Une équation boléenne au sein des cellules
vivantes (après exclusion des débris) permet alors de définir
les progéniteurs comme : « non granuleux et non monocytes
et non lymphocytes », excluant ainsi de la population leu-
cocytaire les formes les plus matures. L’addition à ce panel
de débrouillage de CD19 et CD10 permet de compléter
l’analyse en identifiant les progéniteurs B ou hématogones
dont l’intensité d’expression de CD45 s’accompagne de la
perte de CD10.
L’immunophénotypage d’une leucémie aiguë demande cette
première étape afin de ne s’intéresser ensuite qu’aux mar-
queurs exprimés ou non par les blastes. Cet exercice peut
être relativement simple lorsqu’il existe un envahissement
majeur et monomorphe. Il peut être plus complexe si la leu-
cémie coexiste avec une hématopoïèse normale résiduelle
ou si des sous-clones sont identifiables. Il est ainsi important
de bien connaître les caractéristiques d’une moelle normale
pour repérer ces sous-populations particulières. Cette ana-
lyse, complexe avec les panels sophistiqués utilisés actuel-
lement, bénéficie des avancées de l’informatique permettant
d’associer des fonctions statistiques telles que l’analyse en
composantes principales pour isoler des sous-populations
cellulaires présentes au sein d’un échantillon, l’harmonisation
des instruments permettant de se référer à des standards
et le développement de solutions automatisables [17-19].
4. Cytométrie des leucémies
aiguës au diagnostic
Les objectifs de l’immunophénotypage des leucémies sont i)
de confirmer la lignée hématopoïétique en cause, ii) d’iden-
tifier le stade de maturation des blastes, iii) de caractériser
des marqueurs pronostiques ou des cibles thérapeutiques
et iv) de préciser les anomalies utiles ultérieurement pour
le suivi de la maladie [1].
Comme pour toute analyse biologique, les conditions pré-
analytiques sont cruciales pour la qualité des résultats.
En cas d’envahissement périphérique, l’immunophénotype
peut parfaitement être réalisé sur un prélèvement de sang.
En revanche, lorsque l’immunophénotypage est effectué
sur un prélèvement de moelle osseuse, le premier écueil
auquel sont confrontés les cytométristes concerne la qualité
38 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2015 - N°471
des échantillons. Il existe en effet de grandes différences
de composition cellulaire entre les premières gouttes d’une
aspiration médullaire, en général réservées à la réalisation
des lames de cytologie, et le reste de la ponction. Le sang
médullaire est recueilli sur anticoaglulant pour la cytogé-
nétique (sur héparine), la cytométrie en flux et la biologie
moléculaire (sur EDTA). Le volume nécessaire est fréquem-
ment dépassé, conduisant à des prélèvements hémodilués
moins directement représentatifs de la composition médul-
laire. L’isolement électronique des blastes par les stratégies
de fenêtrage permet dans la grande majorité des cas de
fournir une identification qualitative explicite de la popu-
lation leucémique. Cependant, les grandes capacités de
la cytométrie en flux à générer des données quantitatives
précises (par l’examen de milliers de cellules au lieu des
100 ou 200 comptées au microscope) sont inapplicables.
Un nombre d’échantillons non négligeable ne souscrit même
plus dans ces conditions aux seuils de blastes (20 à 25 %
des leucocytes) permettant de définir une leucémie selon
les recommandations OMS de 2008 [20].
Pour avoir l’appréciation la moins biaisée, il est donc impor-
tant de manipuler l’échantillon le moins possible. La sophis-
tication actuelle des panels de cytométrie et des logiciels
d’analyse n’exige plus l’enrichissement préalable sur gra-
dient de densité longtemps pratiqué. Seule la recherche
des marqueurs intracytoplasmiques demande une étape de
fixation/perméabilisation qui peut désormais, avec certains
nouveaux réactifs, diminuer voire même se passer même de
l’étape de lavage [21]. Pour les marqueurs membranaires,
une simple incubation avec le cocktail d’anticorps choisi,
suivi d’une lyse des hématies, suffit pour obtenir des résul-
tats de qualité. Il existe plusieurs avantages à effectuer cette
technique de « lyse sans lavage » : i) le temps technique
est réduit, au bénéfice du temps d’analyse, ii) la présence
de tous les types cellulaires fournit des contrôles internes
permettant de se passer de contrôles isotypiques pour
déterminer les seuils d’expression positive, iii) la titration
des anticorps pour éliminer les fixations non spécifiques
permet une économie non négligeable en réactifs, iv) les
étapes de préparation peuvent être automatisées et enfin,
v) la manipulation minimale de l’échantillon permet une
représentation précise des proportions des divers types
cellulaires. En effet, chaque série de lavage et de centri-
fugation modifie la composition de l’échantillon, de façon
aléatoire d’un patient à l’autre.
Il convient cependant de respecter quelques principes
simples. L’échantillon doit être correctement anticoagulé,
étape qui revient au préleveur mais doit être vérifiée au
laboratoire, la présence d’un caillot devant ensuite être men-
tionnée si sa taille risque d’avoir modifié la composition de
l’échantillon. Les fluorochromes récents et les tandems de
fluorochromes sont des réactifs extrêmement sensibles à la
lumière qui doivent être conservés et manipulés de façon à
les exposer le moins possible aux photons. Les flacons très
opaques des fournisseurs ont été soigneusement choisis à
cet effet. La préparation en amont des panels sous forme
de cocktails utilisés sur plusieurs jours est possible mais
doit respecter ces conditions de maintien à l’obscurité. La
lecture au cytomètre doit être effectuée le plus rapidement
possible après les marquages, pour ces raisons de sensibi-
lité à la lumière mais également parce que les cellules non
 LEUCÉMIES AIGUËS

fixées ont tendance à internaliser les marqueurs présents

à leur surface (phénomène de capping potentiellement res- Tableau I – Critères immunophénotypiques
ponsable de faux négatifs), surtout si elles sont conservées de classification selon l’EGIL [24].
à température ambiante [22].
Le choix des combinaisons d’anticorps doit tenir compte Il est nécessaire de démontrer à la fois la positivité des blastes
des coexpressions possibles et des fuites de fluorescence pour les marqueurs notés + et leur négativité pour les marqueurs
d’un fluorochrome à l’autre. Ces dernières sont minimi- notés -. L’absence de l’une ou l’autre de ces informations
sées en réalisant des compensations de fluorescence empêche l’application de la classification.
(à l’aide d’outils informatiques sur la base d’une série de
monomarquages). Il faut cependant tenir compte de ce Lignée B
phénomène, en autorisant la fuite d’une population « fille »
cCD79a, CD10 cμ sIg*
sur une population « mère » (par exemple des CD4 sur les CD19, c/
CD3) mais jamais le contraire. Le marquage par CD45 est sCD22
à cet égard le marquage mère par excellence qui ne doit
B-I
interférer avec aucune autre population. Le choix d’un fluo- + - - -
(pro-B)
rochrome excité par le laser violet ou UV est une excellente B-II
solution pour CD45. + + - -
(common)
L’identification de la lignée hématopoïétique en cause peut B-III
+ + + -
être rapidement réalisée avec un panel d’orientation B/T/ (pre-B)
myéloïde. Les meilleurs marqueurs sont les antigènes à B-IV
+ + + +
expression intracytoplasmique CD79a, CD3 et MPO respec- (mature, Burkitt)
tivement, combinés à un marquage de surface par CD45. * La recherche des immunoglobulines de surface peut être remplacée par
Le temps de perméabilisation rallonge un peu la technique celle des chaînes légères intracytoplasmiques qui signe la maturation des
blastes jusqu’au stade du réarrangement des chaînes légères.
et il peut être préféré de réaliser d’emblée un marquage plus
complet. Diverses publications, dont les recommandations
de l’European LeukemiaNet [1] permettent de guider le choix Lignée T
des panels. D’une manière générale il est recommandé cCD3 CD7 CD2, CD1a sCD3/
d’obtenir une positivité pour au moins deux marqueurs CD5, CD1a-
dans une lignée, associée à la négativité des marqueurs CD8
des autres lignées. Il existe toutefois des formes variantes, T-I
+ + - - -
(pro-T ou ETP*)
par exemple les LAL-B ou T les plus immatures expriment
souvent un ou deux antigènes plutôt myéloïdes. Une autre T-II
+ + + - -
(pre-T)
exception est celle des leucémies multi-lignées (MPAL ou
mixed phenotype acute leukemias) qui conjuguent anor- T-III
+ + + + -
(cortical-T)
malement des caractéristiques immunophénotypiques de
plusieurs lignées [20]. Ces formes rares mais graves doivent T-IV
+ + + - +
(mature T)
être identifiées afin d’engager rapidement la recherche
d’un donneur en vue d’une greffe allogénique de cellules
hématopoïétiques [23]. Il est également important, pour les avec des granuleux), associé, en présence de marqueurs
mêmes raisons de gravité, d’identifier les rares formes de myéloïdes, à l’absence d’expression de CD34, d’HLA-DR
leucémies à cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) et des intégrines de la famille CD11 [1]. Les formes de LAM
n’exprimant que CD4 et la molécule d’adhésion CD56, en à différenciation monocytaire, M4 et M5 de la classification
l’absence de marqueurs de lignée [20]. FAB associent souvent la coexpression d’antigènes mono-
Les LAL peuvent être classées selon l’EGIL [24], qui se calque cytaires comme CD4 ou CD36 [1]. Enfin, il n’est pas rare
sur les étapes de différenciation lymphoïde mentionnées d’observer l’expression atypique du marqueur pan-T CD7
plus haut, et qui est reprise dans le tableau I. sur les formes les plus immatures [1]. Ceci rend possible-
Les LAM pourraient bénéficier prochainement d’une sys- ment compte de l’existence, au cours de l’hématopoïèse
tématisation descriptive plus précise. Les cinq marqueurs normale, de formes transitoires conservant un potentiel de
les plus importants pour caractériser une LAM sont les différenciation vers la lignée T ou la lignée myéloïde. Il n’est
antigènes CD34, CD117, CD33, CD13 et MPO, sachant également pas inhabituel d’observer l’expression d’infidé-
que toutes les combinaisons possibles de coexpression de lités de lignée, certaines cellules de LAM présentant une
ces molécules peuvent être observées. Les formes de LAM positivité indiscutable pour le marqueur pan-B CD19 ou le
caractérisées par une morphologie indifférenciée, l’absence marqueur pan-T CD2 [25] qui n’est pas retrouvée dans la
de marqueurs des lignées lymphoïdes, la présence de mar- moelle normale.
queurs myéloïdes mais l’absence de MPO caractérise les Le compte rendu immunophénotypique doit conclure sur
LAM de différentiation minimale de la classification OMS la lignée et le stade de maturité des blastes. En général,
ou LAM0 [20]. Les caractéristiques cliniques et morpho- le détail des marqueurs exprimés ou non est donné sous
logiques des leucémies promyélocytaires à translocation forme de pourcentage, sachant que dans la majorité des cas
t(15;17) n’imposent pas de réaliser un immunophénotypage. 100 % des blastes expriment ou non un marqueur donné.
Néanmoins, celui-ci est caractéristique, avec un fort SSC Les expressions partielles doivent faire l’objet d’une analyse
des blastes (qui peut les faire confondre en cytométrie attentive pour vérifier ce qui se passe exactement sur les

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2015 - N°471// 39

 cellules blastiques, en particulier s’il reste un degré signifi-
catif d’hématopoïèse résiduelle. Une technique informatique
efficace pour cette vérification est de colorer la population
identifiée et de regarder par « backgating » où elle se loca-
lise dans la cartographie CD45/SSC. Enfin, il est important
de conserver soigneusement les listmode de diagnostic
des patients qui sont très utiles pour le suivi de la maladie.
5. Cytométrie et suivi des leucémies
Un nombre croissant de publications indique que les étapes
précoces de la cortico- et de la chimio-sensibilité sont des
éléments clés du pronostic des leucémies aiguës. Les
formes les plus réfractaires doivent conduire à envisager
rapidement une allogreffe de cellules souches hématopoïé-
tiques et doivent donc être identifiées le plus tôt possible.
La mesure de la fonte des blastes au cours de la période
d’induction, dans le sang périphérique de malades atteints
de leucémie aiguë myéloblastique, est un examen rapide et
robuste qui permet une excellente approche de la chimio-
sensibilité [26]. L’examen de la moelle osseuse entre J8 et
J35 selon les protocoles est traditionnellement réalisé en
morphologie mais peut bénéficier utilement d’une analyse
en cytométrie en flux permettant l’examen d’un bien plus
grand nombre de cellules, en précisant leurs caractéris-
tiques [27]. Enfin, la sensibilité de la détection de la maladie
résiduelle en cytométrie en flux en fait un outil précieux aux
seuils décisionnels actuels thérapeutiques se situant entre
10-3 et 10-4 pour modifier la prise en charge des patients.
La recherche de la maladie résiduelle en cytométrie en flux
repose sur l’identification de cellules présentant le même
immunophénotype que les blastes du diagnostic [28, 29].
À l’inverse de la biologie moléculaire, elle ne caractérise
pas de propriétés intrinsèques à ce clone, comme le réar-
rangement des gènes des récepteurs aux antigènes ou
des translocations impliquées dans la leucémogenèse.
En revanche, elle repose sur l’existence d’un profil anor-
mal de co-expression des antigènes de différenciation ou
LAIP (leukemia associated immunophenotype) pouvant
consister en une sur- ou sous-expression de certains mar-
queurs, en asynchronie d’expression ou en infidélité de
lignage [30]. De plus, surtout dans les LAM, le blocage de
la maturation des cellules au sein du compartiment des
progéniteurs dans la région des « bermudes » est une carac-
téristique de la persistance de cette population blastique.
Il faut être prudent dans l’interprétation des variations immu-
nophénotypiques, qui peuvent être dues au traitement ou
signer la persistance ou l’émergence d’un sous-clone. Un
des grands atouts de la cytométrie en flux est toutefois
Références
[1] Béné MC, Nebe T, Bettelheim P, et al. Immunophenotyping of acute
leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the
European leukemia network package 10. Leukemia 2011;25(4):567-74.
[2] Brown CM, Larsen SR, Iland HJ, et al. Leukaemias into the 21st cen-
tury: part 1: the acute leukaemias. Intern Med J 2012;42(11):1179-86.
[3] Rowe JM1, Tallman MS. How I treat acute myeloid leukemia. Blood
2010;116(17):3147-56.
40 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2015 - N°471
la conservation des fichiers d’acquisition et d’analyse de
chaque patient. Ces données « in silico », consultables et
réinterprétables à loisir, constituent un outil précieux pour
comparer au fil du temps l’immunophénotype des cellules
résiduelles et/ou d’une rechute à celui du diagnostic.
En théorie, l’absence de détection de cellules présentant
l’immunophénotype des blastes initiaux après examen de
100 000 cellules place déjà la maladie résiduelle à une valeur
inférieure à 10-5. Il est judicieux de renforcer ce résultat en
comptant 2,5 à 3 x 105 leucocytes, ce qui est parfaitement
compatible avec un examen de routine. Si le panel est bien
caractérisé, un seul tube suffit pour cette détermination et
le temps d’acquisition est de l’ordre de 10 à 15 minutes.
Une matrice d’analyse bien systématisée permet égale-
ment de réduire le temps d’analyse, surtout si elle com-
bine le marquage du diagnostic et la comparaison avec
de la moelle normale. À l’inverse, l’apparition rapide d’un
nuage de blastes patent autorise à ne pas allonger le temps
d’acquisition. En situation intermédiaire, lorsqu’une petite
population de l’ordre de 10-4 cellules résiduelles semble se
dessiner, il est raisonnable d’acquérir un nuage de 20 à 50
éléments suspects pour conforter le résultat.
6. Conclusion
La cytométrie en flux est devenue un outil incontournable
du diagnostic des leucémies aiguës, intégré aux examens
de routine de ces maladies. La grande sophistication de
cette technique pléomorphe permettant l’identification de
multiples caractéristiques a été progressivement abandonnée
au profit de panels simplifiés au quotidien. L’assignement
de lignée est en effet le critère principal nécessaire au cli-
nicien pour guider les choix thérapeutiques. Les nombreux
facteurs pronostiques immunophénotypiques rapportés au
fil du temps sont progressivement gommés par les progrès
thérapeutiques. Il reste toutefois important d’identifier les
MPAL et les leucémies à pDC, ce qui nécessite un panel
adapté. Il est également utile de définir au diagnostic les
caractéristiques immunophénotypiques qui seront mises à
profit pour rechercher la maladie résiduelle ou caractériser
la rechute comme issue du même clone ou d’une autre
population de blastes. Enfin, les études précoces de sensi-
bilité au traitement semblent s’affirmer comme les meilleurs
marqueurs pronostiques et peuvent bénéficier de l’approche
précise apportée par la cytométrie en flux.
Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de
conflits d’intérêts en relation avec cet article.
[4] Zhao Y, Huang H, Wei G. Novel agents and biomarkers for acute
lymphoid leukemia. J Hematol Oncol 2013;6:40.
[5] Greaves M, Maley CC. Clonal evolution in cancer. Nature 2012;
481(7381):306-13.
[6] Zola H, Swart B. The human leucocyte differentiation antigens
(HLDA) workshops: the evolving role of antibodies in research, diagno-
sis and therapy. Cell Res 2005;15(9):691-4.
[7] Nicholson IC, Ayhan M, Hoogenraad NJ, et al. In silico evaluation of
two mass spectrometry-based approaches for the identification of novel
human leukocyte cell-surface proteins. J Leukoc Biol 2005;77:190-8.

[8] Lacombe F, Durrieu F, Briais A, et al. Flow cytometry CD45 gating
for immunophenotyping of acute myeloid leukemia. Leukemia
1997;11(11):1878-86.
[9] Doulatov S, Notta F, Laurenti E, et al. Hematopoiesis: a human pers-
pective. Cell Stem Cell 2012;10(2):120-36.
[10] Hopman RK, DiPersio JF. Advances in stem cell mobilization. Blood
Rev 2014;28(1):31-40.
[11] van Rhenen A, Moshaver B, Kelder A, et al. Aberrant marker expres-
sion patterns on the CD34+CD38- stem cell compartment in acute
myeloid leukemia allows to distinguish the malignant from the normal
stem cell compartment both at diagnosis and in remission. Leukemia
2007;21(8):1700-7.
[12] Anderson G, Takahama Y. Thymic epithelial cells: working class
heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol
2012;33(6):256-63.
[13] Hudig D, Hunter KW, Diamond WJ, et al. Properties of human blood
monocytes. II. Monocytes from healthy adults are highly heterogeneous
within and among individuals. Cytometry B Clin Cytom 2014;86(2):121-
34.
[14] Machherndl-Spandl S, Suessner S, Danzer M, et al. Molecular
pathways of early CD105-positive erythroid cells as compared with
CD34-positive common precursor cells by flow cytometric cell-sorting
and gene expression profiling. Blood Cancer J 2013;3:e100.
[15] Lepage A, Leboeuf M, Cazenave JP, et al. The alpha(IIb)beta(3)
integrin and GPIb-V-IX complex identify distinct stages in the
maturation of CD34(+) cord blood cells to megakaryocytes. Blood
2000;96(13):4169-77.
[16] Arnoulet C, Béné MC, Durrieu F, et al. Four- and five-color flow
cytometry analysis of leukocyte differentiation pathways in normal bone
marrow: a reference document based on a systematic approach by the
GTLLF and GEIL. Cytometry B Clin Cytom 2010;78(1):4-10.
[17] Solly F, Rigollet L, Baseggio L, et al. Comparable flow cytometry
data can be obtained with two types of instruments, Canto II, and
Navios. A GEIL study. Cytometry A 2013;83(12):1066-72.
[18] Faucher JL, Lacronique-Gazaille C, Frébet E, et al. “6 markers/5
colors” extended white blood cell differential by flow cytometry.
Cytometry A 2007;71(11):934-44.
[19] Kalina T, Flores-Montero J, van der Velden VH, et al., EuroFlow
Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). EuroFlow standardi-
zation of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping
protocols. Leukemia 2012;26(9):1986-2010.
LEUCÉMIES AIGUËS
[20] Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO Classification of
tumours of haematopoietic and lymphoid tissues, Fourth Edition. Lyon,
CIRC IARC, 2008.
[21] Malergue F, van Agthoven A, Scifo C, et al. Automation of a phos-
pho-STAT5 staining procedure for flow cytometry for application in drug
discovery. J Biomol Screen 2014 [Epub ahead of print].
[22] Cuchens MA, Buttke TM. A kinetic study of membrane immunoglo-
bulin capping by flow cytometry. Cytometry 1984;5(6):601-9.
[23] Matutes E1, Pickl WF, Van’t Veer M, et al. Mixed-phenotype
acute leukemia: clinical and laboratory features and outcome in 100
patients defined according to the WHO 2008 classification. Blood
2011;117(11):3163-71.
[24] Bene MC, Castoldi G, Knapp W, et al. Proposals for the immu-
nological classification of acute leukemias. European group for
the immunological characterization of leukemias (EGIL). Leukemia
1995;9(10):1783-6.
[25] Hrusák O, Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns
reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia 2002;16(7):1233-58.
[26] Lacombe F, Arnoulet C, Maynadié M, et al. Early clearance of peri-
pheral blasts measured by flow cytometry during the first week of AML
induction therapy as a new independent prognostic factor: a GOELAMS
study. Leukemia 2009;23(2):350-7.
[27] Wood B, Winter SS, Dunsmore KP, et al. T-lymphoblastic leukemia
(T-ALL) shows excellent outcome, lack of significance of the early thy-
mic precursor (ETP) immunophenotype and validation of the prognos-
tic value of end-induction minimal residual disease (MRD) in Children’s
oncology group (COG) study AALL0434. Blood 2014;124(21):ASH
abstract.
[28] Garand R, Beldjord K, Cavé H, et al. Flow cytometry and IG/TCR
quantitative PCR for minimal residual disease quantitation in acute lym-
phoblastic leukemia: a French multicenter prospective study on behalf
of the FRALLE, EORTC and GRAALL. Leukemia 2013;27(2):370-6.
[29] Lacombe F, Allou K, Arnoulet C, et al. Assessment of minimal resi-
dual disease in acute myeloblastic leukemia in multiparameter flow
cytometry. Blood 2013:122(21):2613 (ASH abstract)
[30] Kern W, Danhauser-Riedl S, Ratei R, et al. Detection of minimal
residual disease in unselected patients with acute myeloid leukemia
using multiparameter flow cytometry for definition of leukemia-associa-
ted immunophenotypes and determination of their frequencies in nor-
mal bone marrow. Haematologica 2003;88(6):646-53.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2015 - N°471// 41