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Chapitre 7

Lipases végétales : purification partielle de la lipase de Carica papaya

Ivanna Rivera, Juan Carlos Mateos­Diaz , et Georgina Sandoval

Abstrait
Les lipases de plantes présentent des caractéristiques très intéressantes pour une application dans différents domaines. Ce chapitre donne un aperçu
de certains des aspects les plus importants des lipases végétales, tels que les sources, les applications, les fonctions physiologiques et les
spécificités. Les lipases de laticifères et en particulier la lipase de papaye de Carica (CPL) sont apparues comme un biocatalyseur auto­immobilisé
polyvalent. Cependant, pour mieux comprendre les propriétés biocatalytiques du CPL, l'isolement et la purifi cation des enzymes lipolytiques
individuelles de C. papaye deviennent nécessaires. Dans ce chapitre, un protocole pratique pour la purification partielle de l'activité lipolytique
associée au latex de C. papaya est donné.

Mots clés : Lipase , Laticifère , Graines , Plantes oléagineuses

1. Introduction

Les lipases (triacylglycérol hydrolase EC. 3.1.1.3) sont des enzymes qui hydrolysent
les triacylglycérols en diacylglycérol, monoacylglycérol, acides gras et glycérol. Les
lipases sont produites dans plusieurs micro­organismes, plantes et animaux. Ils
catalysent également des réactions de synthèse, telles que l'aminolyse, l'alcoolyse
et l'interestérification ( 1) .
Les lipases de microorganismes sont les lipases les plus étudiées ; cependant,
d'autres sources de lipases pourraient être des plantes et des animaux ( 2) . Dans
le cas des plantes, les lipases sont majoritairement présentes dans les oléagineux et
les laticifères (cellules sécrétoires des feuilles et/ou des tiges des plantes produisant
du latex et du caoutchouc). Les lipases végétales ont deux fonctions principales :
fournir de l'énergie en hydrolysant les huiles stockées dans les graines ( 3) et les
protéger (par exemple, en tant qu'agents antifongiques (phytopathogènes)), comme
dans le cas des lipases laticifères et de certaines lipases d' Arabidopsis ( 4, 5 ).
Les lipases végétales ont des propriétés biochimiques intéressantes : le pH
varie entre 4 et 9 et reste actif à des températures comprises entre 37 et 80°C ( 3, 6) .
L'isolement et la purification des lipases végétales sont
réalisés avec des techniques relativement simples ; néanmoins, seulement

Georgina Sandoval (éd.), Lipases et Phospholipases : Méthodes et Protocoles, Méthodes en Biologie Moléculaire, vol.
861, DOI 10.1007/978­1­61779­600­5_7, © Springer Science+Business Media New York 2012

115
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116 I. Rivera et al.
1.1. Sources de
lipases végétales
1.1.1. Plantes oléagineuses
1.1.2. Céréales
1.1.3. Laticifères
quelques lipases végétales ont été purifiées jusqu'à homogénéité en raison de la
complexité du processus de purification.
Les lipases végétales ont un grand nombre d'applications potentielles à
l'échelle du laboratoire ( 7, 8)A. titre d'exemple, les lipases végétales se sont
révélées très spécifiques des acides gras présents dans la plante ( 3) ; cette
caractéristique peut être exploitée dans des applications biotechnologiques, comme
la production de biodiesel et de lipides sur mesure ( 9, 10) .
Les lipases sont utilisées dans différentes industries, telles que la pharmacie,
l'alimentation, la production d'énergie renouvelable et les détergents ( 2) .
Cependant, l'application de lipases végétales à l'échelle industrielle est compliquée
en raison de la diffi culté d'extraire et d'obtenir une quantité suffisante de lipase à
partir de matériel végétal ( 7, 10) . Afin de pallier ce problème, les cloner et les
exprimer dans un hôte adéquat est une alternative à explorer.
Les lipases sont présentes dans les plantes oléagineuses en raison de leur forte
teneur en triacylglycérols. Quelques exemples de ce type de plantes sont le maïs,
le tournesol, le colza, le ricin ou les graines de sésame. Dans les graines
oléagineuses, les triacylglycérols fonctionnent comme source de réserve
énergétique. Ils sont stockés sous forme de corps huileux, utilisés dans la production
d'énergie, et rapidement consommés lors du processus de germination. La première
étape implique la mobilisation des acides gras, qui est contrôlée par différentes
enzymes lipolytiques. En fait, l'activité lipolytique des graines apparaît normalement
lors de la germination ( 11, 12) . Dans les graines, les
lipases peuvent également être trouvées dans des compartiments subcellulaires, dans lesquels
elles peuvent être libres ou associées à des organites ( 11) .
Les céréales font partie des familles de plantes Poaceae ou Gramineae.
Ils sont principalement cultivés pour fournir de l'énergie alimentaire, mais ils sont
également une source de lipases. Dans les céréales, les grains contiennent
jusqu'à 10% de lip ids, normalement situés dans l'embryon et l'aleuroneChez
( 12) le
. blé,
la majorité de l'activité lipolytique (75 à 80 %) est localisée dans le son et 20 à 25
% dans le germe ( 13) .
Les laticifères sont une autre source de lipases végétales. Le latex produit par les
ifers lactiques est un liquide laiteux constitué de différents composés, comme des
protéines, des alcaloïdes, de la résine, des sucres, des huiles, etc., qui se
dispersent tous dans un milieu aqueux. L'essentiel de l'activité lipolytique du latex
est liée à sa fraction insoluble (c'est le cas de nombreux laticifères, notamment
chez les Caricacées). De plus, comme les enzymes lipolytiques sont principalement
piégées dans la fraction insoluble, elles sont considérées comme des enzymes
naturellement immobilisées ( 14) . La présence d'une activité
lipolytique dans le latex de plusieurs familles de plantes, notamment Asclepcia
daceae, Moraceae, Apocynaceae, Euphorbaceae, Caricacea et Bromeliacea, a été
signalée dès 1935 (8 ) . La fonction de ces
enzymes n'a pas été totalement élucidée ; cependant, on sait qu'ils sont impliqués
dans le métabolisme des terpènes et la défense des plantes contre les agents
extérieurs.
 TG
triglycérides,
PC
phosphatidylcholina
a
Conditions
de
travail
optimales
(pH,
T)
et
sélectivité
(R
préférence
de
longueur
chaîne
CL
préférence
de
degré
saturation
régiosélectivité
en
acides
gras
SD
, ,)
Jatropha
curcas Tableau
1
Babaco
( charge Euphorbe
characias Laticifères Blé Avoine Maïs Son
de
riz) Céréales Noix
de
coco poubelle
Castor Plantes
oléagineuses Source Caractéristiques
biochimiques
et
purifi
cation
de
quelques
lipases
végétales
Télécharger
la
papaye
Pentagone)
court,
SD
insaturé
pH
8,
50°C,
aw
0,38,
R
sn­1,3,
CL
pH
9,
50°C,
R
sn­3
:: : pH
5,
60°C,
CL
court
et
moyen
: pH
5,5,
32–
37
°C CL
Long,
SD
insaturé
75°C
(isoenzyme
EII)
et
65°C
:: pH
11,
80°C,
Rnon
spécifi
que
sur
TG,
: pH
8,5,
30–
40°C,
R
sn­1,3
: et
moyen,
SD
insaturé
pH
7,5,
37°C
pH
4,5,
R
sn­1
et
sn­2,
CL
court
:: : Caractéristiques
biochimiques
a
(isoenzyme
EIII) sn­2
sur
PC
Modification
des
lipides,
asymétrique de
Alcoolyse
l'huile
tournesol, Hydrolyse
de
TG
et
synthétique Hydrolyse
et
estérification Hydrolyse
des
TG Hydrolyse
des
phospholipides Estérification
des
acides
gras
et Synthèse
de
biodiesel Applications
Études
sur
la
durée
de
conservation
l'avoine
Résolutions
de
résolution
du
naproxène monoesters glycérol
Extraction
de
détergent,
fonctionnel Pas
effectué Extraction
de
détergent
(CHAPS) Extraction
par
solvant Par
chromatographie
échangeuse
d'ions Colonne
DEAE­
cellulose Utiliser
l'octyl­
sépharose Pas
effectué Par
analyse
protéomique
et
expres Partielle
par
les
précipitations
et Purifi
cation
protéomique sion
dans
Escherichia
coli ultrafi
ltration
(23,
27,
28)
14, (38,
39)
22, ( 25) (23)
35)
( 6,
34,
36)
37) ( 33) (19–
21,
31,
32)
10, (29,
30)
10, Les
références
117 7 Lipases végétales : purification partielle de la lipase de Carica papaya
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118 I. Rivera et al.
1.1.4. Charger la lipase de papaye
1.2. Purifi cation de
Lipases de Laticifères
1.2.1. Purifi cation de Carica
Papaye Latex Lipase
Les principales caractéristiques biochimiques et les applications de certains
les lipases végétales et ses méthodes de purification sont données dans le tableau 1.
En 1935, une activité lipolytique dans le latex de papaye a été signalée et est connue sous
le nom de lipase de papaye de C. (CPL). Cependant, ce n'est qu'en 1991 que l'intérêt pour
l'étude de cette enzyme a commencé. Une stéréosélectivité sn­3 du CPL a été observée
dans les réactions d'interestérification ( 15) tandis qu'une régiosélectivité sn­1,3 a été
observée dans la production de lipides structurés ressemblant à la graisse du lait humain,
où le CPL avait une activité similaire à celle des lipases commerciales testées ( 16) .
Dans la
production d'esters de cire à partir de l'estérification avec l'alcool oléique, le latex de papaye
est capable d'estérifier les acides gras à longue chaîne ( 17) . Le CPL a également été
appliqué dans l'estérification du sitostanol en utilisant de l'huile de canola et de l'acide
oléique comme groupe donneur d'acyle ( 18, 19) . Le CPL a également été utilisé pour
résoudre le naproxène et les esters 2­aryl propioniques, le fénoprofène et le kétoprofène
( 20–22) . Cela démontre la capacité du CPL à accepter une
grande variété de substrats ( 14, 23) .
L'extraction des lipases de la matrice de latex polymère n'a pas été facile. Classiquement,
la première étape pour l'enrichissement de l'activité lipasique présente dans le latex est
l'élimination des protéines solubles dans le mélange ou un mélange d'eau et d'un solvant
afin d'éliminer les lipides présents dans l'échantillon et de réaliser l'extraction ( 24– 26) .
Une autre stratégie qui a été employée est l'utilisation de certains détergents non ioniques
et zwitterioniques (CHAPS, Triton TX­100, etc.).
Dans le cas de la lipase d'Euphorbia characias , Fiorillo et al. ( 25) ont étudié différents
détergents pour l'extraction et les ont associés à divers procédés physiques et chimiques,
dont l'utilisation d'un détergent zwitterionique (CHAPS) qui améliorait le rendement
d'extraction.
La majeure partie de l'activité lipolytique est associée à la fraction insoluble dans le latex.
Jusqu'à récemment, les tentatives d'isolement des enzymes lipolytiques associées au latex
étaient couronnées de succès. En 2009, Abdelkafi et al. ( 27) ont rapporté l'extraction de
10% de l'activité lipase, correspondant à une carboxylester hydrolase à motif GDSL. Pas
plus tard que cette année (2011), la première séquence de triacylglycérol lipase du latex
de papaye de C. a été déterminée par protéomique fonctionnelle par Dhouib et al. ( 28) .
Cette enzyme montre 35% d'identité et 51% de similarité avec la lipase acide de
ricin, ce qui suggère qu'elle est responsable d'une part importante de l'activité lipolytique
présente dans le latex.
À l'heure actuelle, on ne sait pas lesquelles des enzymes lipolytiques du latex sont
responsables de l'activité catalytique observée dans les nombreuses applications du CPL.
Par conséquent, l'isolement, la purification, le clonage et l'expression des enzymes
lipolytiques individuelles présentes dans C. papaya deviennent nécessaires. Dans ce
chapitre, un protocole pratique pour la purification partielle de l'activité lipolytique associée
au latex de C. papaya est donné.
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2. Matériaux
2.1. Purifi cation partielle
du CPL
2.1.1. Collecte de CPL
Latex (voir Remarque 1)
2.1.2. Purifi cation du latex
3. Méthodes
3.1. Purifi cation partielle
du CPL
3.1.1. Collection Latex
3.1.2. Purifi cation du latex
(voir remarque 3)
7 Lipases végétales : purification partielle de la lipase de Carica papaya 119
1. Papayers aux fruits non mûrs.
2. Tubes Falcon de 50 ml ou récipients similaires.
3. Coupeur.
4. Seau à glace.
1. 2­méthyl­2­propanol (alcool terbutylique). 2.
Qualité technique n­Hexane.
3. Solution de solvant : 1:1 ( v/ v) 2­méthyl­2­propanol : n­hexane.
4. Solution d'extraction : 0,1 M Tris–HCl, 1 M NaCl, 0,5 % N­lauroyl sarcosine
(NLS), pH 8,0 (voir la note 2 ).
5. Seau à glace.
6. Eau distillée froide (4°C).
7. Vortexer.
8. Microcentrifugeuse.
9. Speed­vac ou lyophilisateur.
1. Sur les fruits non mûrs, effectuez des coupes longitudinales de 2–3 mm de profondeur
et récupérez le latex dans des récipients adaptés (voir Fig. 1). Pendant la collecte
ou pour une utilisation immédiate, conserver le contenu sur de la glace et congeler
à −20°C pour une utilisation ultérieure.
1. Ajouter 50 mL d'eau froide à 7,5 g de latex frais et agiter vigoureusement
au vortex pendant 3 min (voir Note 4 ).
2. Centrifuger l'échantillon à 5 000 ´ g (dans une microcentrifugeuse) et 4°C
pendant 20 min et jeter le surnageant (voir Remarque 5 ).
3. Répétez les étapes 1 et 2 quatre fois de plus (voir Remarques 4 et 6 ).
4. Traiter le latex égoutté ou lyophilisé avec la solution de solvant (50 ml pour
1 g de latex) et vortexer (voir note 4).
5. Centrifuger à 15 500 ´ g et 4°C pendant 10 min et jeter le surnageant (voir
Remarque 7 ).
6. Répétez les étapes 4 et 5 au moins deux fois (voir Remarque 4 ).
7. Sécher la pastille dans un speed­vac ou par lyophilisation.
8. Resuspendre le culot dans la solution d'extraction (50 mL pour 1 g
de pastille) et vortex (voir note 4 ).
9. Centrifuger à 15 500 ´ g , 4°C, pendant 10 min. Jeter le surnageant (voir
note 8).
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120 I. Rivera et al.

Fig. 1. Collecte de latex de papaye Carica à partir de fruits non mûrs.

10. Séchez la pastille dans un speed­vac ou par lyophilisation et testez la

l'activité de la lipase par vos dosages d'activité habituels.

4. Remarques

1. Alternativement, le latex de papaye C. commercial pourrait être utilisé, mais l'activité

lipolytique est plus élevée dans les échantillons fraîchement prélevés.

2. Les concentrations de réactifs et le pH ont été préalablement optimisés.

3. Toute la procédure doit être effectuée sur de la glace ou dans un endroit froid
chambre afin d'éviter la dégradation de l'échantillon.

4. Plus les échantillons sont petits, meilleurs sont les résultats du lavage. Il en va de
même pour le traitement par solvant et NLS. Une bonne approche consiste à peser
20 mg de latex dans des microtubes de 1,5 ml et à ajouter 1 ml d'eau, de solvant ou
de solution d'extraction, mais pour de grandes quantités de latex, il est préférable
d'effectuer plus de lavages.

5. Le surnageant contient de la papaïne (protéase) et d'autres enzymes solubles dans

l'eau. Si vous le souhaitez, récupérez ces enzymes.

6. Cinq lavages à l'eau froide assurent l'élimination des protéases dans nos échantillons,
mais vérifient de préférence l'activité des protéases dans le surnageant.
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7 Lipases végétales : purification partielle de la lipase de Carica papaya 121

7. Le traitement au solvant extrait les lipides du latex. Il s'agit d'une étape

facultative requise pour les études biochimiques (car les lipides
pourraient interférer avec certaines analyses d'activité). Le latex traité
au solvant devient moins stable et perd une certaine activité.
8. Ce surnageant contient des estérases solubles. Pour les récupérer,
filtrer le surnageant sur membrane 0,45 μm et concentrer par ultrafi
ltration ou en lyophilisateur.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention CONACYT (Mexique)

CB­2008­104429 et la subvention ECOS (France)­ANUIES/CONACYT
(Mexique) M08­A03.

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