Dossier scientifique

Diagnostic biologique
du paludisme d’importation
Guillaume Desoubeaux1,2,*, Jacques Chandenier1,2
1 Service de Parasitologie-Mycologie-Médecine tropicale, CHU de Tours, Hôpital Bretonneau, 1er étage du Bâtiment B2A,
2, boulevard Tonnellé,37044Tours, Cedex 9, France.
2 Université François-Rabelais, CEPR-INSERM U1100/Équipe 3,Faculté de Médecine, Bâtiment M, 10, boulevard Tonnellé, 37032 Tours,
Cedex 1, France.
*Auteur correspondant : guillaume.desoubeaux@univ-tours.fr (G. Desoubeaux).

RÉSUMÉ
Le paludisme d’importation est une infection parasitaire due
aux protozoaires du genre Plasmodium. Son diagnostic doit être
envisagé en urgence devant une fièvre au retour d’un séjour
en zone intertropicale. Il doit être précis afin de limiter l’aggra-
vation de la maladie et de proposer rapidement un traitement
adapté, les conséquences cliniques d’un accès palustre aigu
étant potentiellement très graves. Seule la recherche directe
des formes parasitaires dans le sang par le frottis sanguin et/
ou la goutte épaisse est capable de porter un diagnostic de
certitude, alors que la recherche d’antigènes circulants ne vient
qu’en complément de cette exploration microscopique. Res-
ponsables de la lecture microscopique des différentes prépa-
rations sanguines à visée diagnostiques, le biologiste médical et
les techniciens du laboratoire tiennent donc un rôle essentiel
dans la prise en charge initiale des patients concernés. Dans un
laps de temps de deux heures, le personnel doit rechercher les
formes parasitaires sanguines et, lorsque repérées, les identifier
et les dénombrer afin de répondre de la façon la plus précise
possible au clinicien, et d’orienter au mieux ce dernier dans

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sa prise en charge thérapeutique.

MOTS CLÉS
◗ diagnostic parasitologique
◗ frottis
◗ goutte épaisse
◗ paludisme ABSTRACT
◗ parasitémie Laboratory diagnosis of malaria in non-endemic countries
◗ Plasmodium Malaria is a parasite infection caused by protozoan of the Plasmodium genus. Its dia-
KEY WORDS gnosis should be suggested in every febrile patient who comes back from any tropical
country. It has to be thorough in order to limit disease worsening and to propose
◗ malaria
rapidly an adequate therapy. Microscopic observation of parasites within red blood
◗ parasitaemia
cells is currently the only laboratory mean to readily confirm malaria diagnosis in
◗ parasite diagnosis
routine. Thin and thick blood smears are usually implemented in such a context,
◗ Plasmodium
while antigen detection should only be considered as a complementary alternative.
◗ thin blood smear
Therefore, lab techs and doctors play a critical role in the process of malaria diagnosis.
◗ thick blood smear
They have to provide a definitive report by the first two hours following the blood
sampling. They are also expected to be able to distinguish between the Plasmodium
© 2017 – Elsevier Masson SAS species and to count the number of parasites in the blood.
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Introduction
Sévissant en zones tropicales et subtropicales, et princi-
palement sur le continent africain, le paludisme est une
infection parasitaire due aux protozoaires sanguicoles des
espèces Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale et P. mala-
riae, voire plus rarement P. knowlesi [1,2]. Globalement, le
paludisme d’importation reste une infection rarement
diagnostiquée en Europe, mais dont l’incidence en France
métropolitaine n’a toutefois cessé d’augmenter jusqu’à
la fin du XXe siècle pour se stabiliser aujourd’hui autour
d’une estimation annuelle de 4 000 nouveaux cas [3,4].
La gravité de certaines présentations cliniques engendre
la survenue de cinq à dix décès par an en France, consé-
quences directes ou indirectes d’un diagnostic mal réalisé
ou retardé [5]. Ce dernier tient donc une place essentielle
dans la prise en charge initiale des patients concernés, qu’il
soit mis en place en milieu libéral ou au sein de structures
hospitalières spécialisées. Le diagnostic de certitude est
basé sur la recherche des parasites dans le sang. Afin de
garantir la meilleure évolution clinique possible par le
choix d’une action thérapeutique en aval qui soit la plus
adaptée [6], le biologiste médical et les techniciens de labo-
ratoire doivent donc être capables de confirmer ou d’infir-
mer, de façon certaine et rapide, l’hypothèse diagnostique
[7]. D’un point de vue plus général, la qualité du diagnostic
biologique est également un élément essentiel à l’échelle
de la lutte mondiale contre le paludisme puisque, associée
à des traitements adaptés et ciblés, elle tend à diminuer le
risque de transmission autochtone.
Dans cet article, nous aborderons les grands principes
de la démarche visant au diagnostic biologique du palu-
disme d’importation, puis nous détaillerons les différentes
techniques mises en œuvre dans un tel contexte et dis-
cuterons de leurs éventuelles limites.
Considérations générales sur
la prise en charge diagnostique
du paludisme d’importation
Importance du cycle parasitaire
dans la démarche diagnostique
L’homme héberge la phase asexuée du cycle infectieux
des différentes espèces parasitaires appartenant au genre
Plasmodium [2]. Seuls les stades dits « érythrocytaires »
sont visibles dans le sang périphérique, au sein des héma-
ties, et donc sont à même de conduire au diagnostic de
paludisme d’importation. À la suite de l'inoculation, les
formes sanguines sont observables dans un intervalle de
temps allant en moyenne de quelques jours à quelques
mois (correspondant à la phase de maturation hépatique
avant le passage des parasites, génériquement appelés
plasmodies, dans le sang) ; par exemple, de sept jours à
deux mois pour l’espèce P. falciparum.
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Voyages et biologie
Les trophozoïtes constituent le premier stade asexué
sanguin, celui qui se nourrit de l’hémoglobine des héma-
ties. En se divisant par scissiparité, ils entament alors une
schizogonie érythrocytaire, ou mérogonie, pour donner
naissance en 48-72 heures à un schizonte érythrocytaire,
ou méronte, contenant plusieurs noyaux parasitaires.
À l’origine des pics de fièvre, l’éclatement des schizontes
matures libère des parasites-fils, appelés mérozoïtes, qui
parasitent ensuite des hématies saines, et le cycle schizo-
gonique érythrocytaire recommence alors. Lors de chaque
cycle, la charge parasitaire sanguine augmente donc de
huit à vingt-quatre fois selon les espèces. En conséquence
ceci signifie que l’approche diagnostique, liée au repérage
des formes parasitaires dans le sang, ne sera pas la même
en fonction de la durée depuis laquelle évolue la maladie,
les parasites ne devenant détectables que lorsqu’il y en a
environ 10-50 par microlitres (/μL) sang, soit une charge
parasitaire totale d’environ 100 millions [8]. Après plu-
sieurs cycles schizogoniques successifs, et sous l’effet des
anticorps du patient ou d’un traitement antipaludique,
certains mérozoïtes évoluent en des formes différenciées,
appelées gamétocytes, qui initient la phase sexuée. Globa-
lement dans les prélèvements sanguins, les trophozoïtes
sont plus fréquemment visibles que les schizontes et
gamétocytes. Ceci est particulièrement évident lors des
crises dues à l’espèce P. falciparum au cours desquelles
les schizontes, bloqués dans les capillaires profonds, sont
absents de la circulation générale.
L’ensemble des considérations physiopathologiques rela-
tées ci-dessus rappelle qu’il est souvent illusoire d’initier
une quelconque démarche diagnostique visant la confir-
mation parasitologique d’un accès palustre d’importation
sans la notion de fièvre, puisque celle-ci est concomitante
à la multiplication parasitaire sanguine [9].
Principe général
de la démarche diagnostique
Les recommandations officielles émanant des organismes
référents préconisent d’initier sans tarder les démarches
diagnostiques pour tout patient suspect de crise de
paludisme [1,7]. Devant la gravité potentielle d’un accès
palustre qui se compliquerait, toute fièvre après séjour
dans une zone intertropicale, tout particulièrement en
Afrique, doit d’abord être considérée comme un palu-
disme jusqu’à preuve du contraire [9,10]. En France où la
maladie n’est pas endémique, le recours à un diagnostic
de certitude fiable est indispensable afin de confirmer ou
d’infirmer cette hypothèse de paludisme car les signes
cliniques, aussi évocateurs soient-ils, ne sont pas spéci-
fiques et, de fait, peuvent masquer une autre maladie [11].
Un prélèvement sanguin au pli du coude doit être
réalisé en toute urgence, quelle que soit l’importance
relative de la fièvre au moment-même de la ponction
veineuse. Le recueil dans un tube avec anticoagulant de
type EDTA (éthylène diamine tétra-acétique) ou citrate
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suffit à l’ensemble des investigations de base. Ensuite,
le choix de la ou des méthodes diagnostiques dépend
souvent des moyens à disposition, des circonstances
locales, notamment du nombre de cas recherchés chaque
année, et de la qualification du personnel de laboratoire.
Les outils de biologie médicale habituellement utilisés
pour le diagnostic de certitude de paludisme d’impor-
tation sont soit directs, c’est-à-dire basés sur la mise en
évidence directe du parasite au sein des hématies, soit
indirects, par détection d’antigènes plasmodiaux circulant
dans le sang, voire d’anticorps anti-Plasmodium dans de
rares cas très particuliers [1,7,12]. En plus de repérer les
formes parasitaires, les approches directes permettent
l’identification de l’espèce ou des espèces plasmodiales
impliquées, de leurs stades, ainsi qu’une appréciation de la
charge parasitaire sanguine. Le frottis sanguin mince et la
goutte épaisse sont les méthodes les plus anciennes, mais
toujours couramment utilisées. En plus du microscope à
lecture par immersion, elles ne nécessitent qu’un mini-
mum de matériel technique, ainsi qu’un agent fixateur et
des colorants, mais leur lecture demande une certaine
expertise. À l’inverse, bien que de réalisation plus aisée,
les limites exposées ci-dessous des méthodes indirectes
doivent toujours inciter le personnel de laboratoire à
confirmer le diagnostic présumé de paludisme obtenu
par ce biais par l’une des techniques directes susmen-
tionnées [7,13]. Qu’il soit négatif ou positif, le compte
rendu parasitologique fournissant une réponse définitive
à la prescription du clinicien doit être livré dans les deux
heures qui suivent le prélèvement sanguin [7,13].
Toutes les approches biologiques alternatives aux recher-
ches parasitologiques énumérées ci-dessus ne doivent être
considérées que comme de simples orientations diagnos-
tiques, contribuant au diagnostic, mais ne participant pas
directement à celui-ci. Par exemple, il est commun au
cours d’un accès palustre aigu d’observer une thrombo-
pénie matérialisée par un taux de plaquettes sanguines
inférieur à 150.109/L. Elle est d’intensité variable, mais
parfois sévère, passant sous 50.109/L. Cependant, sa
valeur pronostique est encore controversée [9], et elle
peut être également due à toute autre affection que
le paludisme, telle qu’une fièvre virale [14]. L’anémie
hémolytique est un bon signe d’orientation mais elle
peut manquer, surtout au début d’un accès palustre de
primo-invasion tel que celui habituellement rencontré
chez les voyageurs [15,16]. Lors des crises de paludisme
avérées, si le taux d’hémoglobine est inférieur à 50 g/L,
l’anémie devient alors un critère biologique de gravité [7].
Des cellules géantes bleutées, ou lymphocytes hyper-
basophiles activés, sont parfois visibles lors de l’analyse
hématologique de la formule sanguine, mais ne sont aucu-
nement spécifiques, puisque rencontrés dans un grand
nombre de syndromes mononucléosiques. Une hypogly-
cémie, ainsi qu'une acidose métabolique concomitante,
sont possibles [17,18], et sont même considérées comme
des signes de gravité biologiques si la concentration en
glucose est inférieure à 2,2 mmol/L, et le pH à 7,25 ou
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les bicarbonates sous 15 mmol/L, respectivement [6,7].
L’association d’une protéine C-réactive (CRP) élevée
au-delà de 8 mg/L et d’un taux d’haptoglobine effondré
sous 180 mg/L constitue un bon marqueur d’infection
palustre active [9]. Enfin, une insuffisance rénale, maté-
rialisée par des taux de créatinine ou d’urée supérieurs
à 265 μmol/L et 17 mmol/L, respectivement, est indica-
trice d’une forme grave si le diagnostic de paludisme est
ensuite confirmé par des preuves parasitologiques [6,7].
Considérations techniques
du diagnostic parasitologique
du paludisme d’importation
Approche directe
Frottis sanguin mince
Le frottis sanguin mince est rapide, facile à interpréter
pour le personnel de laboratoire habitué à la pratique
de l’hématologie. Il présente un seuil de détection d’envi-
ron 50 trophozoïtes /μL de sang. Si les parasites sont en
nombre supérieur dans le sang, le frottis permet l’identi-
fication aisée de n’importe quelle espèce parasitaire, ainsi
que de son stade, mais aussi une estimation de la charge
parasitaire sanguine, encore dénommée parasitémie.
De façon pratique, une goutte de sang de l’ordre d’un
microlitre est minutieusement étalée sur une seule
couche cellulaire à la surface d’une lame de verre stan-
dard. Le frottis sanguin mince, ainsi constitué en forme
de « langue de chat », est ensuite coloré selon la
méthode de May-Grünwald-Giemsa (MGG) à pH = 7,2
après fixation à l’alcool. La lame est attentivement lue à
l’aide d’un microscope optique, au fort grossissement
(x 1 000 sous immersion à l’huile). L’opérateur doit choi-
sir des champs microscopiques où la répartition des
hématies semble homogène, sans superposition. Il est
nécessaire de parcourir au moins 400 champs pour pro-
clamer une lame négative, ce qui correspond à environ
20 minutes de lecture pour un lecteur expérimenté. S’ils
sont présents dans l’échantillon analysé, les parasites du
genre Plasmodium sont endo-érythrocytaires : ils sont
repérables au sein de l’hématie par la couleur soutenue
rose-orangée à violette de leur noyau, et la teinte bleu-
nuage de leur cytoplasme (figure 1). Le microscopiste
doit être averti de la possibilité de confusion qui existe
avec des plaquettes superposées aux globules rouges,
ou avec les corps de Howell-Jolly et anneaux de Cabot
qui sont des reliquats de structures nucléaires éry-
throcytaires (figure 2). Le diamètre de l’hématie para-
sitée et l’allure de son cytoplasme varient en fonction
de l’espèce plasmodiale. Dans le cas d’une infection
par P. falciparum par exemple, le parasite est retrouvé
dans des hématies qui conservent une taille standard
par rapport aux hématies saines environnantes. Avec
cette espèce, plusieurs trophozoïtes peuvent par
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Figure 1. Morphologie des différents éléments parasitaires observables sur frottis sanguin
mince et concourant au diagnostic parasitologique de certitude de paludisme d’importation
(coloration MGG, grossissement x1000).

© G. Desoubeaux et collégiale ANOFEL)

A – Nombreux trophozoïtes de Plasmodium falciparum, en forme de « bague à chaton » (➱) ou d’« écouteurs » (▲), encore parfois dénommés « bracelet
arabe ». La flèche grise indique une hématie polyparasitée par quatre trophozoïtes et contenant des taches de Maurer, reliquats de la vacuole digestive
parasitaire, alors que la fine flèche noire montre une forme trophozoïte marginée, très suggestive de l’espèce P. falciparum ; B – Un trophozoïte mature
de P. vivax d’aspect amiboïde avec un noyau fragmenté, à l’intérieur d’une hématie aux contours anguleux et contenant de nombreuses fines granulations
de Schüffner intra-cytoplasmiques, reliquats excédentaires du remodelage membranaire érythrocytaire ; C – Un trophozoïte mature de P. ovale d’allure
globuleuse, associé à de nombreuses granulations de Schüffner intra-érythrocytaires ; D – Deux trophozoïtes matures de P. ovale ; E – Un trophozoïte
mature de P. malariae d’allure parallélépipédique disposé en bande équatoriale à l’intérieur d’une hématie de petite taille, et donnant l’impression d’un
« drapeau » ; F – Un trophozoïte mature de P. malariae en forme de « panier » ; G – Un schizonte, ou méronte, de P. vivax comportant 24 noyaux de
mérozoïtes-fils ; H – Un gamétocyte falciforme (fine flèche noire) et de nombreux trophozoïtes de P.falciparum ; I – Deux gamétocytes de P. ovale, de
forme arrondie et produisant du pigment malarique, aussi dénommée hémozoïne, fruit de la digestion de l’hémoglobine, dispersé dans l’hématie parasitée ;
J – Un gamétocyte de P. malariae, très producteur de pigment malarique, ou hémozoïne, sombre.

Figure 2. Exemples de différents éléments cellulaires observés sur frottis sanguin

et pouvant induire la confusion lors du diagnostic parasitologique de paludisme d’importation
(coloration MGG, grossissement x100). © G. Desoubeaux et collégiale ANOFEL)

A – Une plaquette superposée au cytoplasme d’une hématie (fine flèche grise) ; B – Un corps de Howell-Jolly (cercle rouge), reliquat
nucléaire érythrocytaire ; C – Un anneau de Cabot (pointe noire), reste de fuseau mitotique érythrocytaire.

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ailleurs être observés au sein d’une seule et unique
hématie (figure 1A). Pour P. vivax et P. ovale, l’hématie
parasitée est plus jeune, donc plus grosse, fragilisée et
se déforme de façon soit anguleuse (figure 1B), soit
oblongue en s’allongeant dans le sens du frottis (figure
1C-D), respectivement, tout en étant remplie de très
nombreuses fines granulations sombres, dites granula-
tions de Schüffner. Ces dernières correspondent à des
résidus de la membrane érythrocytaire, conséquences
des remaniements faisant suite à l’entrée du mérozoïte
dans le globule rouge. De disposition équatoriale en
« drapeau » ou d’aspect percé en forme de « panier »,
les trophozoïtes de P. malariae sont plutôt observables
au sein d’hématies âgées, dont la taille paraît diminuée
par rapport aux hématies saines (figure 1D). Exception-
nellement diagnostiquée en Europe, P. knowlesi présente
une morphologie microscopique très similaire à celle de
P. malariae, et sa distinction nécessite obligatoirement le
recours à des techniques diagnostiques additionnelles.
Les stades parasitaires autres que les trophozoïtes,
c’est-à-dire les schizontes ou mérontes (figure 1G),
ainsi que les gamétocytes (figure 1H-J), sont plus dif-
ficilement visibles, quelle que soit l’espèce plasmodiale
considérée. Les gamétocytes s’observent plus volon-
tiers après la prise de médicaments antipaludiques ou
pendant la phase de convalescence. Ainsi, ils doivent en
général être plutôt considérés comme des marqueurs
d’évolution positive, et lorsqu’ils sont repérés isolément
à distance du diagnostic initial, ne témoignent en rien
d’un échec thérapeutique.
Les principales caractéristiques morphologiques
concourant au diagnostic d’espèce sont résumées
dans le tableau I. Le lecteur doit cependant être
averti qu’il n’existe pas un seul et unique critère
universel permettant de poser le diagnostic de telle
ou telle espèce de façon certaine et définitive. Il est
plutôt encouragé à tenter de rassembler un faisceau
d’arguments au cours de l’observation de la lame afin
de garantir une identification correcte. Pour toutes
ces raisons, il apparaît déraisonnable de porter un
diagnostic de paludisme et une identification d’espèce
sur l’observation d’un seul élément parasitaire isolé.
L’opérateur doit donc s’efforcer de procéder à la lec-
ture d’un grand nombre de champs microscopiques.

Tableau 1. Critères morphologiques microscopiques pour l’identification

d’espèce plasmodiale lors du diagnostic de paludisme d’importation.
Pl. falciparum Pl. vivax Pl. ovale Pl. malariae
panaché à faible panaché à faible panaché à faible
Allure générale du frottis sanguin ™ monotone parasitémie parasitémie parasitémie
Polyparasitisme
fréquent inhabituel possible exceptionnel
(≥ 2 trophozoïtes/ hématie parasitée)
Taille des hématies parasitées standard augmentée augmentée diminuée

Forme des hématies parasitées standard trapézoïdale et anguleuse oblongue et frangée standard

Granulations de Schüffner intra-érythrocytaires š absentes nombreuses et très fines nombreuses et fines absentes

Taches de Maurer intra-érythrocytaires › occasionnelles absentes absentes absentes

Pigment malarique œ limité fin et dispersé fin et dispersé abondant et gros
fine en ‘bague’ ou
© G. Desoubeaux et collégiale ANOFEL)

Morphologie de l’anneau cytoplasmique épaisse évasée

en ‘écouteur’ ou épaisse en ‘drapeau’
des trophozoïtes matures de localisation et amoeboïde  et globuleuse ou en ‘panier’
marginée
ponctuée, parfois grosse, fragmentée et
Morphologie du noyau des trophozoïtes matures Š divisée déformée grosse et globuleuse grosse
10 – 14 μm, 12 – 24
Morphologie des schizontes Ÿ (si présents) / noyaux 10 μm, 8 – 12 noyaux 5 – 6 μm, 6 – 12

Morphologie des gamétocytes (si présents) 10 μm, falciforme 10 – 12 μm arrondie 8 – 10 μm, arrondie 5 – 6 μm, arrondie

™ un frottis monotone décrit une préparation qui ne présente qu’un
seul stade asexué, au contraire d’un frottis panaché qui permet
d’observer au moins deux stades parasitaires différents ;
š les granulations de Schüffner sont des inclusions intra-cytoplasmiques
très nombreuses et très fines, correspondant à des reliquats de
membrane érythrocytaire, conséquences du remodelage de cette
dernière au décours de l’entrée du mérozoïte dans l’hématie ;
› les taches de Maurer sont des inclusions intra-cytoplasmiques en
forme en « coup d’ongle » limitées à une quinzaine par globule rouge ;
elles correspondent possiblement à des renforcements du contour
de la vacuole digestive parasitaire ;
œ synonyme de « hémozoïne » ;
 définissant un cytoplasme parasitaire tortueux, aux contours
entrelacés ;
ž les trophozoïtes immatures sont très ressemblants les uns aux
autres, quelle que soit l’espèce plasmodiale, et miment volontiers les
trophozoïtes de P. falciparum ;
Ÿ synonyme de « mérontes ».

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Figure 3. Morphologie des différents éléments parasitaires observables sur goutte épaisse
et concourant au diagnostic parasitologique de certitude de paludisme d’importation
(coloration MGG, grossissement x1000).

© G. Desoubeaux et collégiale ANOFEL)

A – Nombreux trophozoïtes de l’espèce P. falciparum, dont la plupart sont en forme de « bague » (cercle rouge) au milieu des
hématies lysées donnant un aspect nuageux violet au champ microscopique ; B – Un gamétocyte de P. ovale, entourée de pigment
malarique abondant, ou hémozoïne. Les noyaux des leucocytes, sombres, arrondis ou polylobés, et gros, sont toujours visibles,
malgré le traitement hémolytique préalable.

De même, il n’est pas impossible que deux espèces plas-
modiales cohabitent sur un même frottis sanguin, même
si ce scénario reste relativement rare, représentant envi-
ron 0,5 % des diagnostics de paludisme d’importation en
France [4]. La charge parasitaire sanguine est estimée sur
le frottis sanguin en pourcentage, en établissant un rap-
port entre le nombre d’hématies parasitées et le nombre
d’hématies totales, saines et parasitées, décomptées sur
plusieurs champs microscopiques homogènes en nombre
et répartition de globules rouges. Seuls les trophozoïtes
et schizontes doivent être considérés par ce dénombre-
ment. Lors du diagnostic d’un accès palustre d’importa-
tion à P. falciparum, une parasitémie supérieure à 4 % est
considérée comme un élément de gravité à rapporter
expressément au clinicien en charge du patient, afin
d’adapter sa prise en charge thérapeutique [6,7].
Goutte épaisse
Même si elle a toujours été considérée comme la
méthode de référence, la goutte épaisse a longtemps
souffert d’une lenteur de réalisation qui ne lui conférait
alors qu’un rôle de confirmation à distance du frottis
sanguin mince, ainsi que d’une difficulté de lecture qui
ne la réservait qu’aux laboratoires les plus experts. Le
développement d’alternatives rapides et plus aisées à
interpréter l’a définitivement fait entrer en première
ligne du diagnostic d’urgence du paludisme d’importa-
tion, d’autant plus qu’elle présente une bien meilleure
sensibilité que le frottis, permettant en effet l’analyse
d’un volume sanguin supérieur [20]. Sa limite de détec-
tion a ainsi été estimée à 1 à 10 parasites /μL de sang, ce
qui permet, en cas de négativité et sous réserve qu’elle
ait été lue en entier, d’éliminer l’hypothèse diagnostique
de paludisme avec une très grande valeur prédictive
négative. Dans ce sens, la goutte épaisse peut être
considérée comme une technique de concentration
fiable, même si la distinction des espèces plasmodiales
est globalement plus complexe que sur un frottis.
Le principe de la réalisation technique de la goutte
épaisse repose sur l’observation complète d’une pré-
paration sanguine, déposée en un cercle réduit sur une
lame de verre standard puis hémolysée via différents
types d’agents comme la saponine ou l’eau distillée,
et ensuite colorée selon la méthode de Giemsa [20].
Contrairement au frottis sanguin mince, l’intégrité des
cellules sanguines n’est plus préservée, ce qui peut
compliquer la lecture de la lame par un opérateur non
averti. Les éléments parasitaires restent repérables
grâce à leur noyau qui apparaît bien coloré sur un
fond violet pâle, et entouré d’un anneau cytoplasmique
bleu-gris plus ou moins épais en fonction de l’espèce
plasmodiale (figure 3). Connaissant précisément le

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volume sanguin initialement déposé sur la lame, il
est possible d’estimer la parasitémie en indiquant le
nombre de formes parasitaires asexuées dénombrées
sur l’ensemble de la goutte épaisse, ou calculée grâce
à un produit en croix via les résultats de la numération
formule sanguine, en ramenant le décompte de para-
sites au nombre de noyaux de leucocytes observés sur
la préparation.
La fluorescence directe
La méthode de quantitative buffy coat Malaria (QBC
Malaria®) est une technique de concentration utilisant
l’affinité d’un agent intercalant, l’acridine orange, pour
les brins d’acides nucléiques des noyaux plasmodiaux.
Pratiquement, après incorporation de l’acridine dans le
spécimen sanguin à analyser, celui-ci est placé dans un
microtube capillaire. Par centrifugation du microtube, la
sédimentation sépare les différentes couches cellulaires
de l’échantillon en fonction de leur densité respective :
les leucocytes, puis les hématies, et enfin les plaquettes.
La surface de la couche érythrocytaire est observée
en lumière ultraviolette, à 480 nm de longueur d’onde,
afin d’y rechercher les hématies renfermant l’acridine
orange qui se serait fixée sur les noyaux parasitaires.
Les globules rouges étant normalement dépourvus de
toute structure nucléaire propre, seuls ceux héber-
geant un ou des parasites sont repérables, puisque
Plasmodium spp. est un protozoaire possédant un vrai
noyau. Cette méthode a une sensibilité équivalente à
celle de la goutte épaisse, et permet de détecter des
parasitémies très basses, de l’ordre de 1 parasite/μL
sang. En revanche, elle nécessite l’équipement par un

Figure 4. Principe de fonctionnement d’un test de diagnostic rapide dans le cadre

de la recherche d’antigènes plasmodiaux circulants dans le sang périphérique.

© G. Desoubeaux et collégiale ANOFEL)

Environ 5-10 μL d’échantillon sanguin est déposé dans le réceptacle inférieur du dispositif, au niveau de la zone dédiée de la
bandelette de nitrocellulose (1). Si le spécimen biologique contient un ou des antigènes plasmodiaux reconnus par les anticorps
marqués libres, alors des complexes immuns antigène-anticorps se forment au point de dépôt. Du tampon de lyse, jouant le
rôle d’agent d’élution, est ensuite ajouté (2), permettant, par phénomène de capillarité, le début de la migration du solvant qui
contient les complexes immuns formés au préalable. Ceux-ci sont arrêtés lorsqu’ils sont retenus par des anticorps fixés le long
de la bandelette réactive. Ces anticorps fixés ne sont pas visibles avant le début de la réaction. Une bande de coloration sombre
apparaît alors au niveau de la zone de fixation en sandwich. Une solution de rinçage est parfois utilisée pour aider à nettoyer la
bandelette et mieux visualiser les bandes réactives. À l’extrémité terminale de la bandelette, une bande contrôle témoigne de
l’élution complète, donc du bon déroulement de la réaction, en fixant les anticorps du mélange qui n’ont pas été complexés au
départ. Dans l’exemple présent, la réaction est positive au niveau de la bande contrôle et de la bande HRP2, et non au niveau de la
bande PvLDH. Ce schéma est possiblement compatible avec un accès palustre récent ou actuel à P. falciparum, sous réserve d’une
confirmation microscopique dans le sang.
Abréviations :
EDTA : Éthylène diamine tétra-acétique - HRP2 : Histidin-rich protein de Plasmodium falciparum - PvLDH : Lactate déshydrogénase de
Plasmodium vivax

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microscope à fluorescence et n’autorise pas la déter-
mination de la parasitémie, ni de l’espèce plasmodiale,
et doit donc être considérée seulement comme une
technique de dépistage.
Approche indirecte
Détection d’antigènes circulants
Basés sur le principe d’immunochromatographie sur
support solide, les tests de diagnostic rapide (TDR)
détectent des antigènes parasitaires de nature pro-
téique circulant dans le sang périphérique [13]. Cer-
tains dispositifs sont capables de fixer les antigènes
monospécifiques, c’est-à-dire ceux propres à l’espèce P.
falciparum, ou à P. vivax, d’autres détectent des antigènes
mixtes, appartenant à toutes les espèces plasmodiales.
Les TDR sont très simples d’utilisation, généralement
conditionnés en emballage unitaire, et ne nécessitent
que quelques microlitres de sang total à déposer à
l’extrémité d’une bandelette de nitrocellu-
lose. Au niveau de ce site de dépôt, le
fabricant a préalablement déposé les
anticorps monoclonaux marqués
correspondants aux différents
Les tests
antigènes recherchés. Si l’un de de
ces antigènes plasmodiaux est
présent dans le sang testé, il se
rapide
lie avec l’anticorps monoclonal antigènes parasitaires
marqué correspondant. Grâce à
de nature protéique
l’apport d’un tampon de lyse, le
sang et les monoclonaux migrent circulant
ensuite par capillarité le long
périphérique
de la bandelette. Si un complexe
immun s’était précédemment formé,
il est arrêté là encore de façon immune,
et matérialisé par le développement d’une
bande colorée à l’endroit spécifiquement indiqué par
le fabricant. Un contrôle interne est présent dans
chaque test : l’excès d’anticorps réactifs, non fixés sur
le ou les antigènes plasmodiaux recherchés, continue
à migrer le long de la bandelette, et est arrêté en aval
par un anticorps anti-anticorps non spécifique, fixé
à la membrane. Une nouvelle ligne colorée apparaît
alors et valide ainsi le bon fonctionnement du test
(figure 4). Au total, les résultats sont disponibles en
moyenne en 5 à 30 minutes, en fonction des marques.
Une dizaine de dispositifs différents de TDR est doré-
navant disponible sur le marché et bénéficie d’un mar-
quage « CE ». Tous présentent une bonne sensibilité,
surtout pour la détection de l’antigène HRP2 (histidin-
rich protein 2), propre à l’espèce P. falciparum, pour
lequel le seuil de détection est proche de celui de
la goutte épaisse. Seules les très faibles parasitémies,
ainsi que les très fortes par effet de zone, peuvent
fausser l’interprétation des TDR pour HRP2. Avec
des limites de détection proche de 100 parasites/␮L,
les résultats sont globalement moins bons pour la
détection des autres antigènes plasmodiaux, qu’ils
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N° 497 • DÉCEMBRE 2017
Dossier scientifique
Voyages et biologie
soient spécifiques d’espèce ou mixtes, telles que la
LDH (lactate déshydrogénase) ou l’aldolase, surtout
lors des infections avec l’espèce P. ovale pour lesquelles
des faux-négatifs sont très fréquents. Les TDR ne per-
mettent pas de mesurer la parasitémie, ni d’identifier
l’espèce plasmodiale en cause quand les antigènes
qu’ils détectent sont mixtes, et souffrent de réactions
croisées avec certains éléments sanguins comme le
facteur rhumatoïde. De plus, à cause du temps de clai-
rance qui est prolongé, surtout pour l’antigène HRP2
de P. falciparum, le résultat de TDR peut rester positif
plusieurs jours, voire semaines, après la résolution
d’un accès palustre.
Pour toutes les raisons évoquées ci-dessus, dans les
pays non endémiques du paludisme comme en Europe,
les TDR doivent être considérés comme de très bons
tests biologiques d’orientation, mais en aucun cas
ne doivent se substituer totalement aux techniques
microscopiques susmentionnées. De plus, même
si cet argument est de moins en moins un
obstacle à leur utilisation généralisée,
leur coût unitaire apparaît encore
relativement élevé, en tout cas en
diagnostic comparaison de celui du frottis
sanguin mince ou de la goutte
détectent des épaisse.
Détection d’anticorps
La détection d’anticorps anti-
dans le sang Plasmodium n’a en général pas
d’indication dans la démarche
diagnostique d’un accès palustre
aigu. Les anticorps ne sont en effet
produits par les plasmocytes dérivés
des lymphocytes B qu’environ 10-20 jours
après le premier contact avec le parasite dans le sang
circulant et donc le début de l’accès. La détection des
anticorps anti-Plasmodium peut être éventuellement
réalisée dans des contextes diagnostiques très spéci-
fiques de patients présentant des formes chroniques
de l’infection, tels que le paludisme viscéral évolutif
ou la splénomégalie palustre hyperactive qui sont
des entités plutôt diagnostiquées chez les sujets rési-
dant en zones d’endémie, et non chez les voyageurs
épisodiques. Étant donné que sa positivité peut per-
durer jusqu’à deux ans après l’épisode infectieux, la
sérologie est aussi parfois employée pour établir une
preuve rétrospective d’une fièvre passée, jusque-là
inexpliquée. Une autre circonstance de l’utilisation
de la sérologie, en dehors du strict cadre du dia-
gnostic, est aussi la recherche d’un contact antérieur
avec les plasmodies chez un sujet candidat à un don
de sang. Les tests d’immunofluorescence indirecte,
l’hémagglutination indirecte et l’ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay) sont classiquement utilisés. Ce
sont des antigènes de l’espèce P. falciparum qui servent
généralement à préparer les kits réactifs.
41
Dossier scientifique
Détection d’acides nucléiques
Longue à réaliser et encore relativement onéreuse en
comparaison avec les techniques directes, la recherche
d’acides nucléiques spécifiques des espèces du genre
Plasmodium par PCR (polymerase chain reaction) n’a
classiquement pas sa place dans le diagnostic d’ur-
gence d’un accès palustre d’importation [21]. Habi-
tuellement, la petite sous-unité de l’ARNr (acide ribo-
nucleique ribosomale) est ciblée. Bien que très sensible
car permettant de détecter de très faibles parasité-
mies de l’ordre de 0,3 parasites/μL de sang, l’usage de
la biologie moléculaire est pour l’instant réservé aux
centres spécialisés. Ces techniques sont par exemple
utilisées dans les cas équivoques avec de très faibles
parasitémies ou avec des formes parasitaires altérées
par la prise médicamenteuse préalable d’antipalu-
diques, et donc difficilement reconnaissables. La PCR
est également utile dans le suivi post-thérapeutique et
l’étude des gènes parasitaires impliqués dans la résis-
tance aux antipaludiques. La PCR quantitative autorise
la quantification de l’ADN plasmodial et donc une
évaluation de la charge parasitaire [4].
Importance du suivi
parasitologique dans les
suites de la prise en charge
diagnostique
Au décours du diagnostic initial de paludisme d’impor-
tation, et une fois le traitement antipaludique initié, il
est indispensable d’assurer un suivi biologique rigou-
reux, afin de garantir la bonne évolution clinique et
biologique du patient impaludé [6,7]. En plus des cri-
tères de gravité biologique, telles que par exemple la
glycémie ou l’anémie dont il est important d’évaluer
la correction rapide, le biologiste médical et les tech-
niciens de laboratoire sont principalement sollicités
pour apprécier l’involution de la charge parasitaire
qui est habituellement progressive, dans les jours qui
suivent l’instauration de la thérapeutique. La parasi-
témie est jugée 72 heures, très précisément, après la
première prise médicamenteuse. À ce stade, il n’est
pas impossible de constater la persistance de quelques
trophozoïtes sur le frottis sanguin ou la goutte épaisse.
Sous antipaludiques traditionnels, tels que ceux dérivés
de la quinine ou l’association atovaquone - proguanil,
celle-ci est habituelle et n’a rien d’inquiétant, à partir
du moment où elle a été abaissée d’au moins 75 % par
rapport à la parasitémie initiale.
Un deuxième prélèvement sanguin de contrôle est
ponctionné sept à huit jours après le début du traite-
ment. Cette fois-ci, l’absence totale de formes parasi-
taires asexuées est attendue sur l’ensemble des diffé-
rentes préparations sanguines. Seule la présence de
gamétocytes, témoins du stress induit sur le parasite
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par le traitement antipaludique, est tolérée. En revanche,
la notification de la présence de stades asexués sur le
compte rendu biologique d’un contrôle parasitologique
à une semaine de traitement doit attirer l’attention
du clinicien quant à un éventuel échec de sa prise en
charge thérapeutique.
Un dernier contrôle sanguin est préconisé un mois
après le début du traitement, afin de garantir l’absence
de rechute d’apparition retardée qui ont été parfois
décrites avec certains antipaludiques comme l’associa-
tion atovaquone–proguanil [22].
Conclusion
La recherche de paludisme d’importation doit être
réalisée, en urgence absolue, devant toute notion de
fièvre au retour de voyage en zone d’endémie palustre.
Le diagnostic de certitude est obligatoirement basé
sur l’observation microscopique de formes parasi-
taires sanguines. Des techniques anciennes, comme le
frottis sanguin mince et la goutte épaisse, constituent
toujours les méthodes de référence, même si leur
interprétation nécessite une certaine expertise. Les
tests de diagnostic rapides, qui tendent à dépister les
antigènes protéiques circulants, sont de très bons sup-
ports pour aider à orienter au mieux le diagnostic. Un
contrôle parasitologique minutieux est indispensable à
distance, afin de garantir le succès du traitement anti-
paludique qui a été prescrit au décours du diagnostic
initial. QQ
Liens d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de liens
d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs remercient le Pr Dominique Chabasse pour
la relecture attentive du manuscrit.
Points à retenir
◗tLe paludisme d’importation est responsable d’environ
150-200 accès graves par an en France.
◗tSon diagnostic passe par l’usage de techniques de
laboratoires simples, réalisées à partir de prélèvement
sanguin périphérique comme le frottis sanguin mince
et la goutte épaisse rapide.
◗tLa détection d’antigènes plasmodiaux circulants dans le
sang représente un test d’orientation diagnostique qui
a grandement contribué à améliorer la prise en charge,
même si une confirmation microscopique est toujours
impérative au décours.
◗tLe laboratoire de biologie médicale doit être capable de
rendre le résultat définitif de la recherche de paludisme
dans les deux heures qui suivent le prélèvement sanguin.

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