LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2011, Volume 6, N°24

Article de synthèse

Diagnostic de la Leptospirose Humaine : Méthodes de Détection de la Maladie

Diagnosis of Human Leptospirosis: Methods for Detection of Disease

HARAJI Mohammed*, BELAHSEN Rekia.

Laboratoire de Biotechnologie, Biochimie et Nutrition, Faculté des sciences d’El Jadida, Maroc.
* Auteur correspondant: E-mail: m.haraji@hotmail.com

Résumé Abstract

La leptospirose est une infection causée par les
leptospires pathogènes: hélicoïdal, en forme de
spirochètes mobiles qui appartiennent à l'ordre
du Spirochaetales familiale leptospiracae, genre
Leptospira. Cette bactérie a une composition
semblable à d'autres bactéries Gram-négatives,
mais avec une activité endotoxique faible.
Les facteurs déterminants et essentiels de la
transmission sont la présence des réservoirs,
particulièrement des rongeurs sauvages, un
environnement propice à la survie des leptospires
et l'interaction entre les humains, les animaux et
l'environnement. La sérologie reste l'examen clé
du diagnostic.
Plusieurs techniques sérologiques sont
disponibles mais la technique de référence reste
le microscopic agglutination test (MAT), réservé
à des laboratoires spécialisés car nécessitant
l’entretien d’une vingtaine de souches.
Mots clés: Leptospirose, leptospira, zoonose,
diagnostic.
Leptospirosis is caused by infection with
pathogenic leptospires: helical, shaped motile
spirochetes which belong to the the order
spirochaetales family leptospiracae, genus
leptospira. Has a composition similar to other
Gram-negative bacteria, but with less endotoxic
activity. They are responsible for worldwide
zoonosis.
The core determinants of transmission are the
present of carriers, particularly wild rodents,
suitable environment for survival of leptospires
and interaction between human, animals and
environment. Serology remains the key
diagnostic.
Several serological techniques are available but
the gold standard remains the microscopic
agglutination test (MAT), reserved to specialized
laboratories because they require the
maintenance of twenty strains.
Key words: Leptospirosis, leptospira, zoonosis,
diagnosis.

Introduction
Chez l'homme, les leptospiroses sont animaux en particulier les rongeurs (rats).
principalement des zoonoses professionnelles ou L'homme est sensible à tous les sérovars de
des zoonoses de loisir. Provoquées par une Leptospira interrogans et la gravité de la
bactérie (leptospira) qui parasite de nombreux maladie dépend plus de l'inoculum, de la

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virulence de la souche et de la sensibilité
individuelle que du sérovar.
Tous les sérovars peuvent entraîner une forme
grave ou mortelle. Toutefois, les sérovars
caractérisée par le développement d’une
vascularite expliquant le caractère polymorphe et
non spécifique des différentes manifestations:
elle peut rester asymptomatique (la plupart du
temps), simuler un syndrome grippal ou évoluer
vers un choc septique avec défaillance
multiviscérale [1].
Diverses techniques de biologie moléculaire ont
été décrites pour étudier l'épidémiologie
moléculaire de Leptospira, y compris PFGE
(Pulsed-field gel electrophoresis) [2,3], ADN
polymorphe amplifié au hasard (RAPD) et
fluorescentes AFLP [4] et l’analyse (FAFLP)
[5]. Toutes ces méthodes souffrent des
inconvénients importants, y compris de faibles
pouvoirs discriminatoires, une mauvaise
reproductibilité, et le niveau élevé des
compétences techniques requises pour réaliser le
procédé.
Des examens de base, tels que la numération
globulaire, la recherche des taux de PCR et de
créatinine, peuvent donner une bonne indication
en cas de suspicion de leptospirose. Des tests
biologiques spécifiques, isolement de la bactérie,
test ADN et sérologie par test de
microagglutination (MAT), restent limités aux
laboratoires très spécialisés [6].
Toutefois, des tests sérologiques rapides,
récemment mis sur le marché, facilitent
désormais le dépistage de premier niveau de la
leptospirose, bien qu’à ce stade, ils doivent être
confirmés par une technique de référence.
Diagnostic clinique
La leptospirose humaine est typiquement une
maladie biphasique, Aucun syndrome clinique
particulier ne peut être rattaché à tel ou tel
sérovar. Dans une première phase, qualifiée de
leptospirémique, les symptômes apparaissent
brutalement (fièvre, céphalée, myalgies,
éventuellement signes digestifs ou respiratoires)
[7] et les leptospires sont isolés du sang et du
liquide céphalo-rachidien (LCR). Après une
76
Hardjo, Grippotyphosa ou Pomona et surtout les
sérovars Icterohaemorrhagiae, Copenhageni et
Bataviae sont réputés plus pathogènes. Du point
de vue physiopathologique, la leptospirose est
amélioration de l'état général, la seconde phase
ou phase immune, coïncide avec l'apparition des
anticorps et elle donne lieu à des signes cliniques
variés.
La forme ictérique sévère (maladie de Weil) est
relativement rare [8]. Elle débute par un tableau
septicémique (fièvre élevée, céphalées,
prostration, troubles de la conscience, ...) puis la
fièvre commence à diminuer vers le 5ème jour. La
deuxième phase, au cours de laquelle
apparaissent les anticorps (vers le 10ème jour), est
caractérisée par une insuffisance rénale, des
hémorragies diffuses, une atteinte hépatique
(avec parfois un ictère flamboyant), un rash
cutané, des signes méningés et myocardiques.
L'ictère disparaît progressivement entre le 15ème
et le 25ème jour et cette disparition peut être
accompagnée d'une remontée thermique [9]. Le
taux de mortalité qui varie entre 15 et 40 p.cent,
dépend des moyens de réanimation disponibles.
Les formes non ictériques sont très diverses:
syndrome grippal avec atteintes multiviscérales
[10], syndrome hémorragique, atteinte neuro-
méningée [11], insuffisances rénales, atteinte
respiratoires avec hémorragies pulmonaires [12],
simple malaise général avec fièvre et myalgies.
L'évolution peut être bénigne ou conduire à la
mort [13]. Des complications oculaires (uvéite,
irido-cyclite, kératite, rétinite hémorragique)
peuvent provoquer une cécité [14]. Dans les cas
atypiques, seul l’isolement des leptospires peut
établir le diagnostic avec certitude [15].
Diagnostic non spécifique
Le diagnostic clinique n’est pas évident, les
signes cliniques étant variés, constants et peu
spécifiques. Il peut y avoir des modifications
hématologiques (anémie normochrome,
leucopénie puis leucocytose [16], la
thrombocytopénie constitue le deuxième signe
biologique majeur en faveur d’une leptospirose
pouvant être < 30 000/mm3 classiquement au
cours d’épisodes d’insuffisance rénale, sans que
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cette association ait une valeur pronostique
défavorable [17], perturbation de l’hémostase…)
et biochimiques (l’urémie et créatinémie
augmentées, ALAT (alanine aminotransférase) et
l’ASAT (aspartate aminotransférase) augmentée,
hypoalbuminémie, perturbation de l’équilibre
électrolytique). Ces perturbations sériques se
trouvent au niveau urinaire (hémoglobinurie,
hématurie, protéinurie). La diminution du taux
de prothrombine est rare au cours de la
leptospirose, et reflète généralement une carence
en vitamine K [18]. La créatininémie et
l’azotémie s’élèvent parallèlement, tout en
demeurant en général à des taux inférieurs à 8
mg/dL et 100 mg/dl respectivement [19,20].
L’hyperbilirubinémie est à prédominance
conjuguée et peut atteindre 60 à 80 mg/L, même
si elle reste le plus souvent inférieure à 20
mg/ml.
Les prélèvements peuvent être de différentes
natures mais leur séquence suit toujours une
chronologie précise [21]. Quel que soit le type de
prélèvement, celui-ci doit être effectué avant
toute antibiothérapie et ne doit pas être congelé
[22].
Une élévation du taux sérique de créatine
phosphokinase (CPK), prédominant sur
l’isoenzyme MM, ainsi que de la myoglobinémie
et de la myoglobinurie, témoigne du processus
de rhabdomyolyse qui accompagne la maladie
[18].
Au niveau du LCR (liquide céphalo-rachidien)
on peut déceler une pléiocytose panachée, une
hyperprotéinorachie, une glycorachie et une
chlorurachie normales [23].
La survenue d’une leptospirose chez une femme
enceinte ne constitue pas une indication
d’avortement thérapeutique, car l’infection
congénitale est rare et ne semble pas induire de
malformation. Par ailleurs, les mères allaitantes
doivent être considérées comme potentiellement
contagieuses pour leur nourrisson durant la
période septicémique de la maladie [24], au
cours de laquelle les bactéries peuvent être
excrétées dans le lait [25, 15, 26].
Diagnostic bactériologique
77
La séquence des prélèvements pour l’isolement
des leptospires suit classiquement une
chronologie précise [23, figure1],
Figure 1: Schéma récapitulatif de l’atteinte
leptospirienne et des méthodes de détection
[27].
mais il faut considérer la possibilité d’isolements
tardifs tant dans les urocultures que dans les
hémocultures [28, 29].
L’examen direct se fait au microscope à fond
noir [30]. Cette pratique est peu sensible et de
spécificité médiocre, elle n’a qu’une valeur
d’orientation et le diagnostic nécessite une
confirmation par culture [31]. Les prélèvements
doivent être effectués avant toute antibiothérapie
et ne doivent pas être congelés [22].
Lors d'infections aiguës, les leptospires peuvent
être recherchés dans le sang durant les 10
premiers jours qui suivent l’apparition de la
fièvre ; le sang veineux (1 ml minimum) est
recueilli sur acide éthylène-diamine-tétra-
acétique (EDTA) (séquestrène, 10 mg) ou
héparine (15 à 20 Ul) pour ensemencement
rapide. Si l'ensemencement du sang ne peut être
immédiat, il sera recueilli sur un tube hépariné.
L’héparine est préférable au citrate qui provoque
une acidification néfaste au développement des
leptospires [23].
Les leptospires peuvent aussi être isolés du
liquide céphalo-rachidien (LCR) au cours de la
deuxième semaine qui va suivre l’infection, Les
urocultures sont d’une rentabilité faible; elles
sont possibles à partir de la troisième semaine
[32]. Le recueil doit s’effectuer dans les
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conditions habituelles de stérilité (désinfection
locale, prélèvement au milieu de la miction) [30,
33]. Les urines doivent parvenir au laboratoire le
plus rapidement possible (en moins d'une heure)
ou être conservées à + 4 °C et à l'obscurité.
L'acidité des urines étant préjudiciable à la survie
des leptospires, il est souhaitable de réaliser une
alcalinisation préalable par une médication au
bicarbonate de sodium. L’utilisation de
substances inhibitrices (tels que le 5-
fluorouracil) permet d’éviter la contamination
des prélèvements [34].
La recherche des leptospires peut se faire par un
examen direct au microscope à fond noir ou
après coloration. L’examen au fond noir doit être
considéré comme un test d'orientation et il doit
être confirmé par une mise en culture, il ne
permet pas de différencier les leptospires
pathogènes des leptospires saprophytes ni de
différencier le genre Leptospira des genres
Leptonema et Turneriella [28].
Diagnostic sérologique
Le diagnostic des leptospiroses est assuré
essentiellement par sérologie. Comme pour la
très grande majorité des examens sérologiques,
deux prélèvements espacés de 8 à 10 jours sont
nécessaires à l'établissement du diagnostic des
formes aiguës et à la détection des anticorps de
classe IgM et IgG [35]. Le diagnostic
sérologique n'est possible que 10 à 12 jours après
l'apparition des symptômes. Une antibiothérapie
préalable retarde l'apparition des anticorps [36],
elle peut aussi diminuer les titres et même
négativer des réactions comme l'ELISA
(enzyme-liked immunosorbent assay) [37].
Un test ELISA faisant appel à un antigène extrait
d'une souche de Leptospira Patoc (saprophyte)
[15] se révèle spécifique (spécificité de genre)
mais il présente l'inconvénient d'être
fréquemment négatif lorsque l'infection est due à
certains sérovars comme Grippotyphosa ou
Australis [38]. L'utilisation de plusieurs sérovars
comme antigène améliore les résultats mais
alourdit la mise en œuvre de la réaction. Sous sa
forme actuelle, l'ELISA est considéré comme un
test de dépistage [39]. Le test de micro-
78
agglutination microscopique ou MAT (ancienne
réaction d'agglutination-lyse de Martin et Pettit)
est la technique sérologique de référence. Il
consiste à mettre en présence le sérum à tester
avec des cultures vivantes de leptospires puis à
évaluer le degré d'agglutination au microscope à
fond noir [38], Le MAT détecte les
immunoglobulines agglutinantes de type M
(IgM) et de type G (IgG), permet aussi de mettre
en évidence des anticorps et déterminer leur titre.
Chez l’homme, ce seuil est fixé à 1/100, mais
pour les animaux, les seuils varient en fonction
du contexte épidémiologique.
Cette technique de réalisation difficile (il faut
entretenir les souches de leptospires au
laboratoire) et d'interprétation délicate est
réservée aux laboratoires spécialisés. Le test de
microagglutination (MAT) présente des
inconvénients comme l’impossibilité d’identifier
la phase précoce de la maladie mais des progrès
diagnostiques sont encore envisageables [40].
Néanmoins, le MAT reste le seul test sérologique
reconnu, capable de produire des résultats
spécifiques des sérovars [41], ce qui est crucial
dans le cadre d’enquêtes épidémiologiques et
d’échanges internationaux.
Diagnostic par amplification génique
En raison des difficultés du diagnostic
bactériologique classique et du diagnostic
sérologique, des techniques d'amplification
génique par PCR ont été proposées [23]. La PCR
permet d’amplifier en quelques heures un
segment d’ADN qui sera recopié en plusieurs
millions de copies [42]. Cette amplification se
fait en trois étapes successives: l’ADN est
d’abord chauffé jusqu’à sa température de
dénaturation (95°c), puis la température est
diminuée pour permettre l’hybridation des
amorces (ou primers) spécifiques de la séquence
à amplifier. La troisième phase est la phase
d’élongation, elle consiste en l’extension des
amorces grâce à une ADN polymérase (la Taq
polymérase). A la fin de ce cycle, chaque
fragment d’ADN cible aura été copié une fois.
En répétant n fois le cycle de trois phases, on
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crée 2n copies du fragment d’ADN cible de
départ.
Elle permet un diagnostic rapide (36 heures) et
pouvant être positif dès le premier jour
d'évolution de la maladie sur des échantillons de
sang ou d'urine. Sa positivité sur l'humeur
aqueuse permet d'effectuer le diagnostic des
complications oculaires.
La technique d’amplification génique a été mise
en œuvre à partir des échantillons de reins avec
des amorces spécifiques du gène codant pour
l’Haemolysin Associated Protein (Hap 1)
discriminant l’espèce pathogène Leptospira
interrogans [43].
D'autres techniques d'amplification ont été
proposées notamment une technique amplifiant
une séquence du gène rrs mais utilisant deux
jeux d'amorces différents : un jeu spécifique des
souches pathogènes et un jeu spécifique des
souches saprophytes [44]. Cette méthode permet
de distinguer les formes pathogènes des formes
saprophytes [1].
Les prélèvements peuvent être envoyés au
laboratoire sans se soucier des délais ni de l’état
de conservation des organes avant autopsie [45].
Enfin, cette méthode peut être utilisée sur des
patients ayant déjà reçu un traitement
antibiotique [1]. Plus récemment, une méthode
fondée sur l’analyse par PCR du polymorphisme
de longueur des mini satellites ont été développé.
Cette nouvelle méthode s’avère très
performantes; en effet elle permet d’identifier,
par la combinatoire de 3 produits
d’amplification, la majorité des sérovars de L.
interrogans sensy stricto [46].
D’autres études menées sur le sérovar hardjo
bovis ont montré sensibilité plus élevée de la
PCR par rapport aux méthodes
d’immunofluorescence ou la culture [47].
79
Dans l’urine, il est possible de réaliser des PCR.
Cependant, la présence d’inhibiteurs nécessite
d’utiliser une PCR immunomagnétique ou MIPA
(magnetic immuno PCR assay).
La PCR a été aussi comparée aux méthodes
d’observation au moyen du microscope à fond
noir notamment. Ces études révèlent la
sensibilité plus élevée de la PCR aussi bien sur
sang que sur urine ou lait [48]. La PCR va aussi
permettre de différencier les souches de
leptospires des autres spirochètes telles que les
Borrelia par exemple [49]. Cette technique est
donc très sensible et extrêmement spécifique.
Cependant sa complexité nécessite qu’elle soit
réalisée et interprétée à la lueur de connaissances
de laboratoire solide.
En résumé, PCR et sérologie doivent être
considérées comme des moyens successifs de
diagnostic, la sérologie ayant l’avantage de sa
disponibilité et de sa sensibilité dès lors qu’elle
est répétée.
Des réactions d’hypersensibilité en rapport avec
la lyse massive des bactéries (réaction de
Jarisch-Herxheimer) peuvent survenir chez les
patients traités par pénicillines [50].
Diagnostic différentiel
I ‘aspect protéiforme de cette maladie rend son
identification clinique difficile et aléatoire, et
pose le problème du diagnostic différentiel avec
d'autres pathologies comme les hépatites virales,
le paludisme ou d'autres infections virales, la
grippe ou les infections à Hantavirus notamment.
Le diagnostic biologique demeure donc un outil
fondamental pour la confirmation des cas de
leptospirose [38].
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