Étude des peptides

Pr Benchikh
Introduction
• Les acides aminés sont les modules élémentaires de la biosynthèse
des protéines.
• L’union de plusieurs acides amines condensés les uns à la suite des
autres, forme un peptide ou une protéine. Cette union est réalisée par
covalence, par une liaison peptidique et l’ordre dans lequel sont
enchaînés ces acides aminés constitue la structure primaire du
peptide ou de la protéine.
Liaison peptidique
• La liaison peptidique est une liaison covalente qui se forme durant
l’étape de traduction par condensation du groupe
• α carboxyle d’un acide aminé avec le groupe
• α aminé d’un autre acide aminé
• et élimination d’eau
• Deux acides aminés connectés grâce à cette liaison: dipeptide.
• 3 acides aminés: tripeptide.
• 20 acides aminés: oligopeptide.
• Entre 20 et 50 acides aminés: polypeptide.
• Les chaînes peptidiques sont vectorisées : les liaisons peptidiques attachent
les acides aminés dans un ordre spécifique.
• Les conventions sont les suivantes :
• Les aminoacides engagés dans une chaîne peptidique sont appelés résidus.
Leur nom est celui de l'aminoacide auquel on ajoute le suffixe «yl».
• Les deux aminoacides aux extrémités de la chaîne sont appelés: N-terminal
pour celui qui a sa fonction α-aminée libre; C-terminal pour celui qui a sa
fonction α-COOH libre.
• On numérote les aminoacides en plaçant la fonction N terminale à gauche,
et la fonction C terminale à droite.
• Particularités de la liaison peptidique
• La liaison peptidique est un «hybride de résonance» entre deux
formes extrêmes.

• Cette liaison est intermédiaire entre une simple et une double liaison
(double liaison partielle) qui implique les propriétés suivantes:
• La liaison peptidique est plane et les 6 atomes: Cα-CO-NH-Cα sont
coplanaires.
• La liaison peptidique est rigide: la libre rotation autour de la liaison –
C-N- est fortement restreinte.
• Toutefois, les rotations des groupes des liaisons Cα-N et Cα-C sont
libres et seulement limitées par l'encombrement stérique.
• Conformation de la liaison peptidique
• On définit Ω, angle de torsion autour de la liaison C-N.
• Les 2 carbones Cα se placent de part et d'autre du pont C-N dans la
configuration trans la plus favorable thermodynamiquement.
• Une des exceptions, est l’enchainement X-Pro pour lequel la
configuration cis et privilégiée.
• La liberté de rotation de l’angle Φ (phi) autour de la liaison entre le Cα
et l’azote amidique; La liberté de rotation de l’angle Ψ (psi) autour de
la liaison entre le Cα et le groupe carbonyle
• Selon une convention internationale, les rotations mesurées par Ψ et
Ф ont le sens indiqué dans la Figure et leur champ est de 180°.
• En faisant varier les valeurs de Ψ et Ф. il est possible de reconnaître
les conformations qui ne sont pas possibles en raison d’un
encombrement stérique: Tableau de Ramachandran qui donne les
valeurs autorisées des angles Ψ et Ф.
• Pour la plupart des résidus, les couples de valeurs stériquement
permis sont groupés essentiellement dans deux régions, les valeurs
de Ф comprises entre – 50° et – 60° ou entre – 120° et – 140°.
Diagramme de Ramachandran
• La liaison peptidique est polaire:
• Comme l’oxygène est plus électronégatif que l’azote, la liaison
peptidique est donc polaire.
• En raison de cette polarité, la liaison peptidique est très hydrophile.
Ainsi, celle-ci possède des groupes qui peuvent former des liaisons
hydrogènes, ces derniers assurant la stabilité des structures
secondaires des polypeptides et protéines.
Détermination de la séquence en acides
aminés des chaînes polypeptidiques
• Définition
• La séquence peptidique est l’établissement de l’ordre dans lequel
sont liés les acides aminés constitutifs d’un peptide.
• La première séquence complète déterminée =celle de l’insuline
(PM=6000,51 AA).
• La stratégie de base développée par F.SANGER(1953).
• Stratégie du séquençage
La détermination de la séquence d’une protéine implique:
1 Détermination du nombre de chaine polypeptidiques differentes
2 Clivage des ponts disulfure.
3 Séparation et purification des sous unités
4 Détermination de la composition en acides aminés des sous unités
5 Fragmentation de la chaine polypeptidique en petits fragments puis
détermination de la séquence des fragments.
6 Reconstruction de la séquence globale de la protéine à partir des séquences
des fragments.
7 Localisation des ponts disulfure formés entre les résidus cystéine de la
chaine polypeptidique d’origine.
• Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques
• Chaque chaîne polypeptidique a un résidu N-terminal et un résidu C-
terminal.
• En identifiant ces groupement terminaux, il est possible de
déterminer le nombre de chaînes polypeptidiques différentes dans
une protéines.
• Identification des résidus N-terminaux
1. Méthode de sanger (FDNB)
2. Méthode de dansylation
3. Méthode récurrente d’Edman
phényl isothiocyanate
(PITC)

phényl
thiohydantoine (PTH)
• Identification des résidus C-terminaux
1. Hydrazinolyse
• Si l’on traite un peptide par l’hydrazine à 100⁰C pendant 20 à 100h;
toutes les liaisons peptidiques sont rompues et les résidus
transformés en hydrazides sauf le résidu C-terminal resté sous forme
libre facile à isoler et à identifier.

Aminoacyl Acide aminé

hydrazides libre
2. Méthode enzymatique
• On peut classer les peptidases en 2groupes:
• Exopeptidase: l'enzyme n'hydrolyse que la première liaison
peptidique (aminopeptidase) ou la dernière liaison peptidique
(carboxypeptidase) en libérant l'aminoacide terminal.
• Endopeptidase: l'enzyme hydrolyse des liaisons peptidiques internes
entre deux aminoacides.
• Les carboxypeptidases clivent la liaison peptidique situé juste avant le
dernier acide aminé, libérant ainsi le résidu C-terminal.
• Ex:
• Clivage des ponts disulfures
1. Clivage oxydatif des ponts disulfures par l’acide performique.
2. Clivage par réduction à l’aide de composés à fonction –SH; tel que
le 2-mercaptoéthanol.
• Séparation et purification de chaînes polypeptidiques
• L’association des protomères résulte essentiellement des forces non
covalentes qui peuvent être rompues par :
Exposition à des PH extrêmes,
L’urée 8M ou chlorure de guanidinium 6M
Des détergents: SDS
• Les chaines dissociées doivent être séparées: chromatographie par
échange d’ions ou filtration sur gel.
• Analyse de la composition en acides aminé
• L’évaluation qualitative et quantitative des résidus en acides aminés
d’un peptide impose:
La rupture de la séquence par hydrolyse des liaisons peptidiques;
L’analyse du mélange d’acides aminés obtenu.
1. Hydrolyse des liaisons peptidiques
• L’hydrolyse acide
• Par l’utilisation d’acide chlorhydrique à 6N à chaud (110⁰C).
• Inconvénients:
• Ser et Thr sont partiellement détruits;
• Trp est totalement détruit;
• Transforme en acides les fonctions amides de la glutamine en
glutamate et l’aspargine en aspartate.
• L’hydrolyse alcaline
• Utilisation d’hydroxyde de sodium (NaOH)à 4N à chaud
(110⁰C)pendant 4 à 8heures
• Inconvénients:
• Détruit la sérine; l’arginine, la thréonine; et la cystéine.
• Ceci limite son utilisation à la détermination de la teneur en
tryptophane .
• L’hydrolyse enzymatique
• Utilisée pour la détermination de l’aspargine , glutamine et du
tryptophane d’un polypeptide, détruits par les méthodes chimiques
plus sévères
• On utilise le plus souvent un mélange d’enzymes (pronase, mélange
d’enzymes non spécifique extrait de streptomyces griseus) pour
assurer une protéolyse totale.
2. Analyse qualitative et quantitative des acides aminés du mélange
obtenu
• L’hydrolysat obtenu est un mélange d’acides aminés séparés par
chromatographie d’échange d’ions ou par HPLC (en phase inverse).
• Les acides aminés sont dérivatisés avec le chlorure de dansyl, le
réactif d’Edman + 2-mercaptoéthanol qui transforment l’acide aminé
en produits fluorescent.
• Ce qui permet d’établir la composition qualitative et quantitative de
notre peptide.
• Les polypeptides de plus de 40 résidus ne peuvent être séquencés
directement.
• Les chaînes polypeptidiques doivent être hydrolysées en une série de
petits peptides ayant en moyennes 10 à 15 acides aminés.
• Méthodes enzymatiques (endopeptidases)
• Ex: la trypsine(C)
• La trypsine hydrolyse spécifiquement les liaisons peptidiques dont le
groupement CO provient d’un résidu chargé positivement arginine ou
lysine (sauf proline à droite).

Ala-Val-Leu-Phe-Met-Lys-Tyr-Ile-Cys-Lys-Pro-Glu-Arg-Ala-Val
• Autres endopeptidases :
• Chymotrypsine(C)
Phe ,Trp ,Tyr (sauf si pro à droite)
• Thermolysine(N)
Met, Phe, Trp, Tyr,Ile,Val (sauf si proline à gauche)
• Pepsine(N)
Phe,Trp,Tyr(sauf si proline à gauche)
• Endoprotéase V8(staphylococcus aureus)
Coté C-terminal du Glu
• b- Méthode chimique
• Bromure de cyanogène(BrCN)
• Le bromure de cyanogène (BrCN) hydrolyse la liaison peptidique du
côté C-term de la méthionine : cette dernière devient alors un résidu
C-terminal transformé en résidu homosérine lactone.
• Il y a peu de Met dans une protéine ce qui génère un nombre limité
de coupures.
• Le 2-nitro-5-thiocyanobenzoate (NTCB) hydrolyse la liaison
peptidique du côté amine de la cystéine.
• Hydoxylamine(NH2OH)
• Entraine la coupure des liaisons Asn-Gly.
• Les fragments obtenus par ce procédé sont alors séparés les uns des
autres par électrophorèse ou chromatographie.

• Chacun de ces fragments est alors soumis à une dégradation d’Edman

afin d’identifier sa séquence en acides aminés.
• Dans les séquenceurs automatiques, l’échantillon est adsorbé sur une
membrane de difluorure de polyvinylidine ou séché sur un disque en
papier de fibre de verre imprégné d’un sel d’ammonium quaternaire.
• Ceci a pour effet d’immobiliser le peptide tout en laissant pénétrer le
réactifs d’Edman (sous forme de vapeurs entrainée par un courant
d’argon).
• Les PTH-aminoacides libérés sont identifiés par HPLC.
• En utilisant au moins deux modes différents de clivage pour lequel les
points de coupure sont différents il est possible de comparer les
séquences en acides aminés des fragments obtenus.

• Il faut identifier tous les recouvrements des séquences partielles pour

établir la continuité de la séquence totale de la chaine peptidique.
• Position des ponts disulfure
• La protéine native est hydrolysée dans des conditions qui épargnent
ses ponts disulfure.
• Les fragments sont séparés par HPLC en phase inverse.
• Les résidus Cys porteurs d’un groupement thiol libre peuvent être
identifiés en les marquant par l’iodoacétate radioactif.
• Les fragments contenant des résidus Cys sont soumis à la dégradation
d’Edman et leur séquence déterminée. Ce qui permet de déduire la
position des ponts disulfure.
Conclusion
• La fonction d’une protéine ne peut être comprise que par structure.
• Le séquençage des protéines a permis de comprendre leur
signification biologique et évolutive.
• Mais surtout d’emprunter le chemin inverse pour la synthèse
chimique de peptides d’intérêt biomédical.