Le Lait (1980), LX, 487-524

Les levains lactiques thermophiles : Proprits et comportement en technologie laitire. Une revue *
par J. P.
ACCOLAS"*, D. HEMME*",

C. BOUILLANNE*"

M. J. DESMAZEAUD"*, L. VASSAL***, et Monique VEAUX**

SOMMAIRE Pages
INTRODUCTION .. .... .. .. .. LACTIQUES THERMOPHILES .. .. .. .. .. .. ..

488 489 491 494

RLE DES LEVAINS .. TAXONOMIE COMPOSITION

DES BACTRIES DES LEVAINS

Levains artisanaux Levains

UTILISATION

slectionns
CONCENTRS

DE LEVAINS LACTIQUES THERMOPHILES

496 499

A. LE YOGHOURT INFLUENCE DE LA QUALIT DU LAIT

Le chauffage

du lait

* Ce texte constitue une version revue et complte d'une confrence prsente

par l'un des auteurs (J. P. Accolas) au Congrs International de MicrobioIogie et d'Industrie Alimentaire, organis par l'APRIA, Htel Mridien, Paris, le jeudi 11 octobre 1979. ** Laboratoire de Microbiologie Laitire et de Gnie Alimentaire et *** Laboratoire de Biochimie et de Technologie Laitires, I.N,R.A. - 78350Jouy-en-Josas.

488
PROPRITS

LE LAIT

/ SEPTEMBRE-OCTOBRE

1980 / W 598

DES BACTRIES

DU YOGHOURT

Fermentation du lactose Production d'arme Synergie des bactries du yoghourt

FERMENTATION DU YOGHOURT B. MCANISME LES FROMAGES A PATE CUITE LACTIQUE CONTINUE APPLIQUE A LA FABRICATION

509

DE L'GOUTTAGE AU COURS DE L'AFFINAGE

RLE DU LEVAIN LACTIQUE THERMOPHILE

Action protolytique des bactries lactiques thermophil es. Donnes gnrales Action protolytique du levain lactique thermophile au cours de l'affinage de l'emmental C.
BACTRIOPHAGES ....

515

INTRODUCTION Les bactries lactiques des levains thermophiles, comme celles des levains lactiques msophiles (Cogan [24]), ont t utilises pour la fabrication du fromage et des laits ferments bien avant qu'on souponnt leur existence. Cela dit, on doit remarquer d'entre qu'il existe, dans le cas des fromages pte cuite, deux secteurs de production sensiblement diffrents. Le secteur traditionnel prsente encore, mutatis mutandis, des caractristiques proches des techniques artisanales d'antan. C'est par exemple le cas des fromageries de la zone d'origine, dans les montagnes du Jura et des Alpes (Mocquot [62]). La fabrication industrielle de ce type de fromage, qui implique la transformation quotidienne d'importantes quantits de lait (plusieurs centaines de milliers de litres) dans de grandes usines faisant appel une mcanisation pousse, s'est dveloppe hors de la zone traditionnelle, par exemple aux Etats-Unis (Swiss cheese), en Finlande et, plus rcemment, dans l'Ouest de la France, en Bretagne et en Normandie. De mme, le yoghourt constitue un bon exemple de produit de grande consommation qui a connu un essor industriel sans prcdent au cours des 3 dernires dcennies, dans de nombreux pays d'Europe et d'Amrique (Auciair et Mocquot [11] ; Robinson et Tamine [77]). Cela dit, pour traiter des levains lactiques therrnophiles, il importe de se fixer au dpart certaines limites, car le champ d'investigations est vaste. En outre, il convient de choisir l'approche du sujet. Dans le cadre de cette revue de microbiologie applique, il nous a sembl

MMOIRES

ORIGINAUX

489

opportun de voir dans quelle mesure la technologie laitire est capable de matriser les levains lactiques thermophiles, pour obtenir des produits de qualit uniforme et rgulire. Cela nous conduira examiner successivement ce que sont ces levains, leurs caractristiques et leurs proprits et enfin leur comportement en nous appuyant sur deux types de produits, divers titres intressants pour le microbiologiste, le yoghourt et les fromages pte cuite (emmental et gruyre). On retiendra toutefois que des levains lactiques thermophiles sont utiliss pour fabriquer de nombreux autres types de fromages, plus ou moins goutts, par exemple des fromages italiens aussi diffrents que le gorgonzola et le grana. En outre, Streptococcus thermophilus est galement utilis pour fabriquer certains types de fromages pte molle, en remplacement des levains lactiques msophiles. Les proprits acidifiantes et protolytiques de ce streptocoque thermophile sont suffisamment diffrentes de celles des streptocoques lactiques du groupe N pour confrer aux produits obtenus des caractristiques bien particulires. ROLE DES LEVAINS LACTIQUES THERMOPHILES Schmatiquement, on peut assigner deux fonctions ces levains - la premire est d'assurer la transformation du lactose en acide lactique et, ce faisant, d'abaisser le pH du lait et du caill de fromagerie. Ce rle est dterminant dans le cas du yoghourt dont le pH final se situe une valeur < 4, car il empche le dveloppement de germes indsirables (producteurs de gaz, putrfiants) et de germes pathognes ventuellement prsents. Dans le cas des fromages pte cuite, l'acidification (plus modre en raison du pouvoir tampon du caill) va cependant favoriser la synrse, c'est--dire permettre une expulsion de l'eau du caill, en quantit dtermine et au moment opportun (c'est l'gouttage du fromage sous presse). On obtiendra ainsi un extrait sec suffisamment lev et un pH suffisamment bas pour que le fromage puisse ensuite subir, avec succs, une longue priode d'affinage (plusieurs mois) ; - la seconde est de contribuer aux qualits organoleptiques du produit obtenu. Dans le cas du yoghourt, 'Cerle est primordial puisque la consistance, le got et l'arme de ce lait ferment proviennent, pour une part essentielle, du mtabolisme du levain lactique. Dans le cas des fromages, les cellules bactriennes vont librer des systmes enzymatiques qui participeront l'affinage, conjointement avec la prsure. Ainsi, des degrs divers selon le type de produit, la protolyse va modifier les proprits rhologiques du fromage et donner naissance des composs sapides ou des prcurseurs d'arme qui, repris ventuellement par d'autres micro-organismes ou modifis par des ractions purement chimiques (c'est l'hypothse avance par Law et al. [53] dans le cas du cheddar) donneront au fromage affin ses caractristiques organoleptiques propres.

490

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TABLEAU

Principaux caractres de S. thermophilus* Caractres Observations (G + C) lev mais il n'y a pas de diffrence nette avec les autres streptocoques. Confirme le bien-fond de l'espce S. thermophilus. Pas de diffrence nette avec les streptocoques du groupe srologique N.

Contenu de l'ADN en G+ C.
lOI Cl.

Voisin de 40 p. 100.

~ o
Z
lOI

Homologie des acides nucliques. Parent d'enzymes isofonctionnelles (aldolases) de diffrentes souches.

S. thermophilus est diffrent des streptocoques voisins. Avec celles de S.lactis et celles de S. eremoris: oui.

Cl

Morphologie.

Cellules sphriques ou ovodes en paires ou en longues chanes. Polymorphisme prononc dans les cultures ges. Lait, produits uniquement. laitiers Le caractre thermophile accus le diffrencie nettement des streptocoques lactiques du groupe srologique N (cultivent 10 C mais pas 45 C), et des streptocoques du groupe srologique D (cultivent 10 C et 45 C). C'est aussi l'un des streptocoques les plus thermorsistants. Trs sensible au sel, il s'oppose nettement aux streptocoques du groupe srologique D qui cultivent en prsence de 6,5 p. 100 de sel. Absence d'antigne de groupe. Diffrence essentielle avec les streptocoques lactiques msophiles (groupe srologique N) et les streptocoques fcaux (groupe srologique D).

Ecologie. Tempratures de croissance : culture 10 C 45 C ~

1-

+ +

Thermorsistance (65 C, 30 min).

o
Z
lOI

> :::r:

Cl.

Croissance en prsence de NaCl 2 p. 100.

Groupe

srologique.

* Voir la fin du tableau 1, page suivante.

MMOIRES

ORIGINAUX

491

TABLEAU Caractres

1 (suite) Observations

Hydrolyse de l'arginine.

S. lactis et la plupart des streptocoques du groupe srologique D sont positifs.

LU Il.

> 1o
Z
lU

J:

Il.

Sucres ferments : fructose, glucose, lactose, saccharose, maltose, pentoses (xylose et arabinose) et raffinose, trhalose, inuline, glycrol, mannitol, sorbitol. Action sur le lait tournesol.

+
(-)

Petit nombre de sucres ferments. Prfrence marque pour les disaccharides, lactose et saccharose. S. thermophilus est l'un des streptocoques les moins actifs en ce qui concerne l'ventail des sucres ferments. Cette raction le diffrencie des autres streptocoques isols du lait et des produits laitiers, en particulier des streptocoques lactiques du groupe srologique N (RAC).

Acidification rapide A Coagulation C Rduction trs lente et souvent incomplte du tournesol r

* ADN : acide dsoxyribonuclique ; G : guanine ; C : cytosine ; + : raction positive pour 90p. 100 ou plus des souches ; (-) : raction ngative pour 90p.l00 ou plus des souches; -: raction toujours ngative (d'aprs ACCOLAS [1]).

TAXONOMIE DES BACTERIES DES LEVAINS LACTIQUES THERMOPHILES Les levains lactiques thermophiles contiennent gnralement un ou plusieurs lactobacilles (Lactobacillus bulgaricus, L. lactis et L. helveticus) et un streptocoque, S. thermophilus. Les principaux caractres distinctifs de ces bactries lactiques sont prsents dans les tableaux 1 et 2 tirs d'un article d'Accolas [1]. Du point de vue cologique, ces bactries sont caractristiques du lait et de certains produits laitiers et ne sont qu'occasionnellement isoles d'autres biotopes. S. thermophilus possde un ensemble de proprits qui individualisent coup sr cette espce. Retenons en particulier l'absence d'antigne de groupe, son caractre thermophile accus, sa thermorsistance, son activit fermentaire rduite et sa sensibilit au sel. Rcemment, Ottogalli et al. [68] ont confirm le bien-fond de l'espce S. thermophilus, en tudiant l'homologie des acides dsoxyribonucliques (ADN) extraits de souches reprsentatives de cette espce avec des ADN extraits de streptocoques des groupes srologiques N ou D, par la technique d'hybridation. En outre, Hemme et Nardi [45] ont obtenu,

TABLEAU

Principaux caractres de L. bulgaricus, L. lactis et de L. helveticus' Caractres

L. bulgaricus L. lactis L. helveticus

Contenu de l'ADN en G
lU Cl.

C.

Voisin de 50 p. 100. Avec ceux de : L. lactis : ;;. 80 p. 100. L. helveticus : 0 40 p. 100. Avec celles de : L. lactis : oui. L. helveticus : non.

Voisin de 50p. 100 Avec ceux de : L. bulgaricus : ;;. 80 p. 100. L. helveticus : 0 40 p. 100. Avec celles de :
L. bulgaricus : oui. L. helveticus : non.

Voisin de 39p. 100. Avec ceux de : L. lactis : 0 40 p. 100. L. bulgaricus : 0 40 p. 100. Avec celles de : L. lactis : non. L. bulgaricus : non.

>

o
Z
lU

Homologie des acides nucliques. Parent d'enzymes isofonctionnelles (lacticodshydrognases) de diffrentes souches.

Cl

Morphologie.

Variable avec l'ge, le milieu, la souche. Granules mtachroma tiques abondants dans les cellules de cultures ges colores au bleu de mthylne.
D (-) E

Comme L. bulgaricus.

Polymorphisme des cultures ges moins accus que chez L. lactis et L. bulgaricus. Pas de granulations. DL
A

Isomre de l'acide lactique. Groupe srologique. Exigences nutritionnelles - riboflavine, - vitamine B 12, - pyridoxal, - acide folique, - thymidine. :

D (-) E

+ +

Production de gaz partir du glucose. Temprature de croissance : - 15 C, - 45 C. Hydrolyse de l'arginine. Acide lactique produit le lait. Sucres ferments : - fructose, - galactose, - glucose, - lactose, - maltose, - mannose, - saccharose, - trhalose. dans

+
(-)

+
Gnralement 2 2,5p.100.

Gnralement <; 1,8p. 100.

Gnralement <; 1,8p. 100.

+ + + +

+ + + + + + + +

+ + +

ADN : acide dsoxyribonuclique; G: guanine; c: cytosine; + : raction positive pour 90p. 100 ou plus des souches : raction variable, lente ou faible; (-) certaines souches de L. lactis dsaminent ['arginine ; - : raction toujours ngative; (d'aprs ACCOLAS [1]).

494

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pour dix souches de S. thermophilus, des profils lectrophortiques similaires, la fois pour les protines solubles, les fl-galactosidases et les aldolases extraites de chacune de ces souches. Notons toutefois que Lawrence et Thomas [56] estiment que S. thermophilus et de nombreux autres streptocoques, en particulier les streptocoques lactiques msophiles du groupe srologique N, pourraient constituer un phylum quasi continu de variants en raison de la similitude de la composition en bases (GC p. 100 de leurs ADN (Knittel [50]). Le caractre thermophile de ce streptocoque suggrerait, selon Law et Sharpe [54], une origine intestinale. L. helveticus et son biotype maltose ngatif L. jugurti qui a disparu de la dernire classification en date (Rogosa [78]), constitue une espce dont le gnotype se diffrencie nettement de celui du groupe auquel appartiennent L. bulgaricus et L. lactis. Cependant, la distinction phnotypique de certaines de ces espces demeure assez dlicate et elle a t jusqu' un pass rcent, en dpit de la classification solidement tablie par Orla-Jensen au dbut du sicle, l'origine de nombreuses confusions. Cela dit, Dellaglio et al. [26], s'appuyant la fois sur l'tude du phnotype et sur celle du gnotype, ont mis en vidence quelques souches inclassables dont la position taxonomique est encore actuellement incertaine.

COMPOSITION DES LEVAINS LACTIQUES THERMOPHILES On peut distinguer schmatiquement ques thermophiles : deux types de levains lacti-

Les levains artisanaux dont la composition est variable et mal connue

Les petites fromageries du Jura et des Alpes qui fabriquent le gruyre et l'emmental utilisent encore frquemment des prsures artisanales , Ce sont des macrations de caillettes de veau pralablement sches l'air, dans du lactosrum prlev chaque jour dans la cuve de fromagerie au terme de la fabrication et utilis tel quel ou dsalbumin par chauffage et acidification. Ces macrations, incubes de prfrence temprature relativement leve (40-45C) constituent pour le fromager une source d'enzyme coagulante extraite des caillettes et un levain contenant la flore lactique thermophile indispensable la russite du fromage (Accolas et Auclair [2]), Valles et Mocquot [98]). La flore lactique de ces prparations artisanales n'est ni slectionne, ni normalise, et elle est frquemment compose de plusieurs espces de lactobacilles (L. fermentum, L. helveticus, L. lactis et, un moindre degr, L. bulgaricus et L. acidophilus) et de streptocoques (S. thermophilus et parfois des streptocoques fcaux).

MMOIRES

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495

Les cultures naturelles sur lactosrum (( colture naturale in siero ) que prparent et utilisent les fromagers italiens pour fabriquer divers types de fromages, en particulier le grana, appartiennent la mme catgorie de levain. Ces cultures naturelles sont en gnral trs acides et contiennent surtout des lactobacilles appartenant aux mmes espces que celles cites prcdemment (Bottazzi et al. [14], Carini et Lodi [22]). Notons enfin qu'en Suisse, la Station Fdrale de Recherches Laitires (S.F.R.L.) de Berne travaille en troite collaboration avec les fromageries suisses d'emmental et leur distribue des cultures mixtes contenant plusieurs souches de S. thermophilus et de lactobacilles. Ces cultures mixtes sont aussi des cultures naturelles (( Rohmischkulturen ) provenant des meilleures fromageries suisses d'emmental. Elles sont conserves la S.F.R.L. sous forme lyophilise de faon prserver la composition initiale du mlange de souches et elles sont l'objet d'un tri rigoureux, pralable toute utilisation, qui s'appuie en particulier sur des essais de fabrication raliss la fromagerie exprimentale de la Station. En outre, la S.F.R.L., par l'entremise d'un corps d'inspecteurs de fromagerie et d'un service d'analyses de routine, surveille trs rgulirement le comportement de ces levains lactiques naturels (Steffen [92]) : droulement de l'acidification, recherche ventuelle des phages, notation de la qualit des fromages. Si des difficults surviennent dans une fromagerie, le levain est aussi rapidement que possible modifi en consquence. La diversit de la flore bactrienne prsente dans ces levains empiriques et leur propagation non aseptique les rendent certainement beaucoup moins sensibles aux attaques de bactriophages que les levains slectionns prpars avec un petit nombre de cultures pures. Toutefois, la composition des levains naturels est dlicate matriser et sujette des modifications imprvisibles; l'activit acidifiante de ces levains peut, en consquence, subir des variations alatoires. En outre, une dominance trop marque des lactobacilles htroferrnentaires (L. fermentum) peut tre l'origine d'une fermentation gazeuse indsirable dans le jeune fromage et de l'apparition de dfauts d'ouverture qui dprcient gravement le fromage affin. Pour viter ces alas, Bottazzi et al. [15] ont dcrit une srie d'preuves de contrle et ont fix des normes permettant d'apprcier la composition approximative et la qualit des levains naturels italiens. Les levains slectionns de composition connue

On a aussi recours des levains slectionns contenant une ou plusieurs souches de s. thermophilus et de lactobacilles (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus) surtout dans la fabrication industrielle des fromages pte cuite. Dans le cas du yoghourt, le levain est presque toujours exclusivement compos d'une ou deux souches de chacune des deux espces S. thermophilus et L. bulgaricus (Accolas [1]). Les laiteries disposent de leur propre collection de souches ou s'approvisionnent auprs de fournisseurs spcialiss. Des associations slec-

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tionnes et (ou) des rotations de souches, s'appuyant sur une connaissance des relations phagiques de ces souches, ne sont pas employes d'une manire aussi systmatique que dans le cas des levains lactiques msophiles utiliss dans les pays anglo-saxons.

UTILISATION DE LEVAINS LACTIQUES THERMOPHILES CONCENTRES Les suspensions concentres de bactries lactiques sont couramment utilises l'heure actuelle par de nombreuses usines laitires, pour ensemencer le levain proprement dit, premire tape qui simplifie dj la tche des laiteries. Ds 1968, le travail de Rousseaux et al. [79] mettait clairement en vidence les possibilits offertes par les concentrs congels de bactries lactiques therrnophiles, pour l'ensemencement direct du lait de fabrication, en fromagerie de ptes cuites. Comme le montre titre d'exemple la figure 1, il est en effet possible de conserver temprature moyennement basse (- 30 C) des concentrs de L. helveticus sans observer de diminution de la survie ni de l'activit acidifiante, pendant de longues priodes. La technique d'ensemencement direct prsente en outre un intrt tout particulier dans le cas du gruyre et de l'emmental parce que la quantit de ferments employs est dix trente fois moindre que celle qui est requise dans d'autres fabrications fromagres ou dans le cas du yoghourt. Il est loisible de penser que l'emploi de concentrs de bactries lactiques therrnophiles, comme celui des concentrs de bactries lactiques msophiles, se dveloppera de faon irrversible dans l'avenir et s'appliquera couramment l'ensemencement direct du lait. A l'appui de cette affirmation, le tableau 3 o sont rassembls titre d'exemple des rsultats obtenus l'chelle pilote par l'un de nous, montre que les concentrs congels de bactries lactiques thermophiles sont d'une qualit moyenne satisfaisante. Ajoutons que l'exprimentation en technologie laitire (fabrication de fromages pte cuite ou de yoghourts) a amplement confirm cette qualit. Il y a quelques annes, un travail de Speckman [85] et une brve communication de Porubcan et Sellers [74] suggraient que des prparations lyophilises ou sches de bactries du yoghourt pourraient rapidement se substituer aux concentrs congels. Ce type de prparations prsente en effet d'indniables avantages sur les concentrs congels, pour le transport et la conservation. Toutefois, les rsultats de ces auteurs ne sont pas pleinement convaincants et l'exprience acquise dans notre laboratoire montre que les concentrs de bactries lactiques thermophiles ne se prtent pas aussi aisment la lyophilisation qu' la conglation (cf. tab. 3). Au mieux, dans le cas de S. thermophilus, les nombres de germes vivants et les activits acidifiantes se

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fig. 1 Conservation l'tat congel de sept suspensions concentres de Lactobacillus helveticus Avant congo avant conglation. LN2 : conglation rapide et conservation dans l'azote liquide -196 C ; - 30" C ; conglation lente et conservation dans un conglateur -30 C ; dconglation rapide dans tous les cas dans un bain-marie 40" C. Milieux de conservation LN 2 ; lait crm; - 30 C ; mlange de lait et de glycrol (concentration finale en glycrol de la suspension : 25p. 100). Survie % dnombrement des lactobacilles sur glose MRS (Difco) (5 8.1010 gerrnes/g de suspension). La valeur 100, pour chacune des suspensions, est la moyenne des rsultats obtenus tout au long de la conservation. Activit acidifiante % expression des rsultats exprimentaux en units d'activit selon la mthode d'AcCOLAS AUCLAIR La valeur et [3]. 100, pour chacune des suspensions, est la moyenne des rsultats obtenus tout au long de la conservation. (Donnes indites de J. P. ACCOLAS).

maintiennent en moyenne un niveau comparable ceux des trs congels. En d'autres termes, la lyophilisation affecte les de ces streptocoques thermophiles un point tel que l'effet de tration est masqu, alors qu'il apparaissait encore nettement

concencellules concendans le

498

LELAIT! SEPTEMBRE-OCTOBREN 598 1980! TABLEAU 3

Comparaison de suspensions concentres congeles et de suspensions concentres lyophilises de bactries lactiques thermophiles* Espce et nombre de souches Rend. pondral moyen (kg p. 100 1 de culture) Nombre moyen de germes par g (x lOlO) Activit acidifiante moyenne (units par g)

Nombre de prparations

S. thermophilus (3 souches) L. helveticus (l souche) L. bulgaricus (4 souches)

15 SC 14 SL 13 SC Il SL 8 SC 5 SL

1,96 0,71 2,44 0,23 1,97 0,75

19,5 14 Il 2,9 6,9 0,02

625 UST 600 UST 166ULH 176ULH 106 ULB 10 ULB

* Donnes indites de C. BOUILLANNE: = suspension congele et SL = suspension SC lyophilise. La prparation des suspensions tait effectue comme il est indiqu dans BOUILLANNE al. [16]. Les dnombrements et taient effectus sur glose M 17 [95] dans le cas de S. thermophilus et sur glose MRS (Difco) dans le cas des lactobacilles. L'activit acidifiante tait exprime suivant un systme d'units propre chaque espce (UST, ULH ou ULB), selon la mthode d'ACCOLAS AUCLAIR[3]. et

cas des concentrs lyophiliss de streptocoques lactiques msophiles (Bouillanne et al. [16], Bouillanne et Auclair [17,]. Dans le cas de L. helveticus, les activits acidifiantes des concentrs lyophiliss sont galement du mme ordre que celles des concentrs congels, alors que la survie moyenne aprs lyophilisation chute nettement ; cela laisse penser que les dnombrements sur glose (survie) constituent un rvlateur plus svre des dommages subis par les cellules lyophilises que l'activit acidifiante. Au pire enfin, L. bulgaricus se prte trs mal la lyophilisation et les rsultats moyens obtenus avec ce germe sont particulirement dcevants et mdiocres. La fragilit )} de L. bulgaricus a t mise en vidence en diverses occasions, par exemple dans le cas de la conglation simple lorsque ce lactobacille n'est pas cultiv au pralable sur un milieu ad hoc (Smittle et al. [83]), ou encore dans le cas de la lyophilisation lorsque tout un ensemble de conditions optimales (tat physiologique des cellules, milieu protecteur, mode de lyophilisation, atmosphre de conservation, mode de rhydratation, etc.) ne sont pas runies (Morichi [64J). Les suspensions mixtes, associant S. thermophilus l'un des lactobacilles prcdents, ne modifient pas de faon notable le comportement de chacun des deux

MMOIRES

ORIGINAUX

499

germes. Ainsi les concentrs lyophiliss mixtes contenant la fois S. thermophilus et L. bulgaricus sont compltement dsquilibrs l'avantage du streptocoque. Bien entendu, les rsultats moyens rapports ci-dessus ne donnent qu'un bilan global. Cela sous-entend que, dans les meilleurs cas, pour l'un ou l'autre type de prparation, on peut obtenir des rsultats bien suprieurs aux moyennes indiques. En dfinitive, cela laisse quelque espoir de progresser encore dans cette voie, en dpit des srieuses difficults rencontres.

A.

LE YOGHOURT

Bon exemple du produit laitier frais de grande consommation dans de nombreux pays d'Europe, en plein essor dans divers pays d'Amrique et au Japon, le yoghourt est maintenant couramment fabriqu dans des ateliers industriels bien quips et de grande capacit. La principale proccupation des industriels est d'obtenir rgulirement un produit de bonne qualit. Cet objectif implique un ajustement judicieux de la qualit du lait mis en uvre, des proprits des cultures bactriennes utilises et de la technique de fabrication. Ces diffrents facteurs affectent, des degrs divers, le droulement de la fermentation.

INFLUENCE DE LA QUALITE DU LAIT Les bactries lactiques thermophiles sont des bactries exigeantes du point de vue nutritionnel et elles ne trouvent pas toujours dans le lait, sous forme facilement assimilable, les divers composs qui leur sont ncessaires pour que leur croissance et l'acidification soient optimales. Ainsi a-t-on pu observer des variations trs importantes d'un lait un autre et suivant la saison, la meilleure acidification tant gnralement obtenue en t, alors que, dans un lait tmoin, l'acidification se droulait de faon reproductible d'un essai l'autre (fig. 2, tire de Vassal et Auclair [99]). Selon les auteurs, les variations observes pouvaient tre attribues, pour une part, aux modifications subies par le lait en raison du mtabolisme de la flore de contamination du lait cru. D'autre part, dans le cas o l'acidification devenait trs lente, les laits contenaient de la pnicilline. Il est en effet connu que les bactries lactiques thermophiles sont trs sensibles aux antibiotiques (Cogan [23]). Par exemple, une concentration de pnicilline gale 0,005 UI/ml est suffisante pour provoquer un retard notable de l'acidification.

500

LELAIT SEPTEMBRE-OCTOBRE 598 / 1980/ N"

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fig. 2 Variations de la production d'acide par les bactries du yoghourt dans les laits de grand mlange (d'aprs VASSAL AUCLAIR et [99]) a) Diffrences des valeurs de pH ( pH) mesures dans un lait tmoin, reconstitu partir d'une poudre de lait crm dilue 10p. 100 et chauff 85 C pendant 10 min. Inoculum : 1 p. 100 de chacune des deux souches utilises, S. thermophilus et L. bu/garicus. Incubation 45 C. b) Diffrences des valeurs de pH ( pH) mesures dans vingt chantillons de lait de grand mlange de deux origines diffrentes. Les signes 0 correspondent des chantillons de lait contenant de la pnicilline. Chauffage des laits, inoculum et incubation: voir a). c) Diffrences entre les valeurs de pH ( pH) mesures au dbut et aprs 3 h 30 d'incubation dans des chantillons de lait de grand mlange reus mois par mois. Chauffage des laits, etc. : voir a. Les signes 0 correspondent aux moyennes mensuelles et sont relis par un trait.

MMOIRES

ORIGINAUX

501

L'addition de sucre (saccharose) au lait, en particulier dans le cas des yoghourts aux fruits o elle peut atteindre 8 10p. 100, peut tre prjudiciable la fermentation. Selon Bills et al. [13], le dveloppement des germes et la production d'acide sont affects partir de 4 p. 100 de sucre, alors que la production d'actaldhyde (considre comme un composant majeur de l'arme du yoghourt) ne l'est qu' partir de 8 p. 100. Selon Tramer [97], l'effet inhibiteur observ dans le lait sucr rsulterait plus d'un taux de matire sche trop lev (le lait destin la fabrication du yoghourt est en effet enrichi en matire sche, soit par vaporation pralable, soit par addition de lait en poudre, pour amliorer la consistance du produit) dans les yoghourts sucrs que de l'addition de sucre elle-mme. Toutefois, il ne semble pas que toutes les cultures utilises soient galement affectes par l'addition de sucre (Gordon et Shapton [42]).

Le chauffage du lait

Le traitement thermique du lait destin la fabrication du yoghourt est effectu des tempratures relativement leves et pendant des dures relativement longues. De nombreuses combinaisons temprature-temps sont appliques en pratique (Robinson et Tamine [77]). Le chauffage pralable du lait a pour objectif d'assurer la qualit hyginique et la stabilit du produit; il permet en outre d'obtenir une bonne consistance et de limiter la synrse du caill. Mais le traitement thermique a aussi pour effet de favoriser le dveloppement des bactries du yoghourt et ce faisant, de rgulariser la fermentation. Pour une part, on peut attribuer cet effet la destruction des substances inhibitrices naturelles prsentes dans le lait cru (systme lactoperoxydase-thiocyanate ; agglutinines) auxquelles L. bulgaricus est trs sensible (Portmann et al. [73]). Cet effet rsulte surtout de l'apparition, dans le lait chauff des tempratures suprieures 90 C, de divers composs stimulants pour les bactries du yoghourt tels que les produits de dgradation de la casine dans le cas de S. thermophilus (Auc1air [10], Lorient et al. [59] ou l'acide formique form partir du lactose dans le cas L. bulgaricus (Auc1air [10]).

PROPRIETES DES BACTERIES DU YOGHOURT Les proprits fermentaires, aromatiques et paississantes des bactries lactiques du yoghourt confrent au produit final ses caractristiques organoleptiques. Du point de vue fondamental, on doit reconnatre d'emble que ces proprits sont encore assez mal connues, alors mme que le technologue sait plus ou moins empiriquement les utiliser bon escient.

502

LE LAIT / SEPTEMBRE-CTOBRE

1980 /

598

Fermentation du lactose

La fermentation du lactose par les bactries lactiques du yoghourt, S. thermophilus et L. bulgaricus, s'effectue selon la voie homofermentaire de la glycolyse. Cela dit, on ne dispose pas d'tudes suffisamment approfondies pour donner un schma cohrent et prcis de l'ensemble de la voie de fermentation. Prenons pour exemple le cas de S. thermophilus. Il est connu depuis longtemps que ce streptocoque fermente prfrentiellement des disacharides, lactose et saccharose et que de nombreuses souches sont incapables de fermenter le galactose (plus rarement le glucose) qui est excrt et, de ce fait, s'accumule dans le milieu de culture (ou dans le lait). Une tude rcente de Somkuti et Steinberg (84) a par exemple montr que 31 souches de S. thermophilus se rpartissaient en trois groupes. Le premier groupe comprenait 12 souches qui fermentaient lactose, glucose et galactose ; le second, 18 souches qui fermentaient lactose et glucose, et le troisime une souche qui ne fermentait que le lactose. En outre, ces auteurs ont observ un effet inhibiteur sur la croissance, lorsqu'ils ajoutaient du galactose des souches du second groupe cultives sur bouillon lactos. Par contre, Hernme et al. [47.] n'ont pas observ d'effet inhibiteur lorsqu'ils ajoutaient du galactose des cultures sur lait de S. thermophilus. Diffrents travaux laissaient penser qu'une hydrolyse pralable du lactose du lait en glucose et galactose, exerait une influence bnfique sur l'acidification des levains lactiques thermophiles (voir ce sujet la rfrence [44.]), encore que Tamine [94] ait obtenu des rponses variables avec des cultures mixtes de L. bulgaricus et de S. thermophilus. En outre, Hemme et al. [44] ont montr que l'hydrolyse du lactose par une 13-galactosidase purifie tait sans action et que l'effet stimulant observ prcdemment rsultait de l'action d'enzymes protolytiques prsentes dans les prparations commerciales de lactase insuffisamment purifies. Si l'on considre maintenant le tableau 4, S. thermophilus parat possder la fois une 13-galactosidase et une phospho--galactosidase. Toutefois les variations concomitantes des deux activits enzymatiques selon les conditions de culture (Hemme et al. [47.]), la similitude de la rsistance thermique et de la migration lectrophortique (Hemme et Nardi [45]), enfin l'lution identique lors de chromatographies sur gel d'exclusion ou sur rsine changeuse d'ions (Hemme, rsultats indits) conduisent penser qu'on a affaire deux isoenzymes possdant chacune les deux activits 13-galactosidase et phospho-fl-galactosidase. Si tel est bien le cas, il s'agirait l d'enzymes d'un type nouveau, caractristiques de S. thermophilus et moins spcifiques que la phospho-Bgalactosidase gnralement prsente chez les streptocoques lactiques msophiles. Revenons au tableau 4. Dans le cas de la souche 302 (assez reprsentative de l'espce en ce que son dveloppement et son pouvoir acidifiant sont rapidement affects par les bas pH) on observe une

MMOIRES ORIGINAUX TABLEAU 4

503

Variations des activits spcifiques des enzymes de la glycolyse, chez Streptococcus thermophilus, selon la souche et selon le pH de la culture* Varia tions des activits en fonction du pH de la culture (100p. 100 = activit pH 6,32) pH 5,62 pH 5,10

Activits spcifiques Enzymes de la glycolyse pH 6,32

302

385 302

385 302

385

~-galactosidase Phospho-B-galactosldase Hexokinase Aldolase Glycraldhyde-J-phosphate Pyruvate kinase L-lacticodshydrognase dshydrognase

3,3 3,9 1,4 2,9 3,1 1,3 21,3

3,8 5,7 1,1 28,4 9,8 1,4 16,9

J7l 148 103 163 173 135 95

108 338 147 452 143 60

143 167 179 108 162 136 135

102 155 130 205 129 205 98 112

* Moyennes de trois essais indpendants.

S. thermophilus 302 et 385 taient cultivs dans du milieu M 17 42 C (concentration en lactose: 10 gj1). Lorsque les cultures atteignaient le pH dsir, elles taient rapidement refroidies o- C ; les bactries taient aussitt rcoltes et broyes. Les activits des extraits bruts taient mesures et rapportes 1 mg de protines. Les activits ~-gal et P-~-gal taient dtermines respectivement par l'hydrolyse de l'ONPG et de l'ONPG-6-P. (Activits spcifiques pH 6,32 : donnes indites de D. HEMME; variations des activits en fonction du pH : d'aprs HEMMEet
al. [47]).

augmentation notable de l'activit intracellulaire des enzymes glycolytiques lorsque le pH baisse, l'exception de l'hexokinase ; l'activit rduite de cette enzyme bas pH pourrait ralentir la poursuite de la glycolyse. Par contre, la souche 385 qui prsente un pouvoir acidifiant trs suprieur celui de la plupart des autres S. thermophilus, possde des enzymes glycolytiques apparemment moins sensibles aux bas pH. En outre, l'aldolase de cette souche prsente une activit environ dix fois plus leve que celle des autres S. thermophilus, ce qui pourrait expliquer le comportement trs particulier de cette souche (Accolas et al. [5]).

504

LE LAIT

/ SEPTEMBRE-<lCTOBRE

1980 / N" 598

Ces rsultats laissent penser qu'une tude approfondie de la voie fermentaire chez ces bactries lactiques thermophiles pourrait utilement complter les donnes (nombreuses mais encore insuffisantes) acquises dans le cas des streptocoques lactiques msophiles (Lawrence et Thomas [56]). Production d'arme

On attribue classiquement un rle de premier plan l'actaldhyde dans la formation de l'arme du yoghourt (Dumont et Adda [36]), encore qu'un certain nombre d'autres produits aromatiques figurent parmi les nombreux composs volatils que rvlent les techniques d'analyse fine (Dumont et Adda [35]) et contribuent certainement l'arme subtil d'un bon yoghourt. Un rapport actaldhyde/actone voisin de 2,8 est par exemple considr comme optimal (Mocquot et Hurel [63]). La production d'actaldhyde est avant tout le fait de L. bulgaricus. A premire vue, on pourrait penser que l'actaldhyde est forme partir du pyruvate par dcarboxylation, comme c'est le cas chez de nombreux streptocoques lactiques msophiles, en particulier chez ceux qui fermentent le citrate du lait. Il est toutefois vraisemblable que, dans le cas des bactries du yoghourt, le pyruvate form partir du lactose est affect en totalit la production d'acide lactique afin de permettre au cycle de la glycolyse de se poursuivre. Selon Lees et Jago [57.], L. bulgaricus possde une thronine aldolase qui cliverait cet acide amin en actaldhyde et en glycine. Cela est conforme l'observation de Veringa [102], qui a montr que l'addition de thronine au lait active notablement la production d'actaldhyde du yoghourt. Notons aussi que l'accumulation de l'actaldhyde dans le yoghourt indique que les bactries du yoghourt, la diffrence des streptocoques msophiles, ne disposent pas des dshydrognases ncessaires pour dgrader l'actaldhyde. Synergie des bactries du yoghourt

Pour clore cette revue des proprits des bactries du yoghourt, il convient de mentionner que L. bulgaricus et S. thermophilus cultivs en association dans du lait reprsentent, dans de nombreux cas, un bon exemple de mtabolisme intgr o chaque espce tire bnfice de la culture mixte. Comme le montre la figure 3, la production d'acide et la production d'actaldhyde de la culture mixte sont beaucoup plus actives que celles des cultures pures (Accolas et al. [5], Hamdan et al. [43]). On peut galement observer un effet synergique marqu sur la consistance et la viscosit du produit lorsqu'on emploie des cultures paississantes (Galesloot et Bassing [40, 41]). Enfin, la synergie des bactries du yoghourt expliquerait aussi, pour une bonne part, la remarquable stabilit des cultures mixtes dans le cas de la fabrication continue du yoghourt (Driessen et al. [32], Macbean et al. [60]).

MMOIRES

ORIGINAUX

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Temps (heures)

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8
Temps (heures)

Fig. 3 Productions d'actaldhyde et d'acide lactique par les bactries du yoghourt. Effets synergiques de la culture mixte a) Productions d'acide compares de cultures mixtes de S. thermophilus et de L. bulgaricus et des cultures pures correspondantes, diffrentes tempratures. Inoculum : 1 p. 100 pour les cultures pures et 0,5p. 100 de chaque souche pour les cultures mixtes ; l'acidit acquise,exprime en degrs Dornic, a t calcule en dduisant chaque fois l'acidit naturelle du lait (d'aprs ACCOLAS et al. [5]). e-e : somme moyenne des acidits produites par les cultures pures de L. bulgaricus (une souche) et de S. thermophilus (trois souches). 0-0 : acidit moyenne produite par les trois cultures mixtes correspondantes. b) Production d'actaldhyde par trois cultures mixtes dans du lait entier additionn de 3 p. 100 de poudre de lait crm et autoclav 116C pendant 10 min. Inoculum : 3 p. 100 de culture ; incubation 45 C (d'aprs HAMDAN et al. [43]). c) Production d'actaldhyde par S. thermophilus, par L. bulgaricus et par la culture mixte (mlange 1 + 1) des deux souches. Conditions de culture : voir b,'tif.aprs HAMDAN et al. [43]).

506

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1980 /

598

Il est maintenant bien tabli que divers lactobacilles thermophiles, en particulier L. bulgaricus, exercent un effet stimulant marqu sur le dveloppement et la production d'acide de S. thermophilus. Au cours des 3 dernires dcennies, les connaissances acquises dans ce domaine se sont notablement toffes grce des travaux poursuivis dans trois directions. En premier lieu, Pette et Lolkema [70] attriburent, ds 1950, l'effet stimulant observ l'action protolytique du lactobacille et le bien-fond de leur hypothse a t confirm par des travaux ultrieurs (Bautista et al. [12], Higashio et al. [48], Shankar et Davies [81, 82]). En outre, il a t montr que L. bulgaricus possde diffrentes endopeptidases et exopeptidases dont l'action globale sur les casines ou sur le lait a t tudi par Miller et Kandler [61], Tourneur [96] et El Soda [37]. De mme, Argyle et al. [9] ont mis en vidence, chez ce lactobacille, une endopeptidase lie la paroi cellulaire dont l'activit optimale se situait pH 5,8 et 47,5 C. Notons aussi qu'il n'est pas possible, en ajoutant au lait des broyats cellulaires de souches de L. bulgaricus, d'obtenir un effet stimulant sur S. thermophilus comparable celui qu'on observe dans du lait o sont cultives ces mmes souches de L. bulgaricus, c'est--dire du lait soumis l'action des cellules entires de ce lactobacille (Hemme et al. [46]).
0

En second lieu, il a t montr que l'addition au lait de certaines combinaisons minimales d'acides amins (un mlange contenant tous les acides amins engendre gnralement une action trs favorable au dveloppement de S. thermophilus) exerait un effet stimulant notable sur ce streptocoque thermophile (cf. tab. 5). La diversit des rsultats obtenus par diffrents auteurs peut provenir la fois de la composition du lait utilis, du traitement thermique appliqu ce lait et enfin des souches tudies. De plus, il n'est pas certain qu'on reproduise fidlement l'effet synergique observ dans une culture mixte lorsqu'on cherche mettre en vidence, par analogie, l'effet stimulant de certaines combinaisons d'acides amins. En troisime lieu, l'action stimulante observe sur la production d'acide de S. thermophilus peut tout aussi bien rsulter de la prsence de peptides (Bracquart et Lorient [21], Desmazeaud et Devoyod [28], Lorient et al. [59.], Shankar et Davies [81, 82]). Les travaux de Desmazeaud et al. constituent, divers titres, une contribution dterminante dans ce domaine. Il a en effet t montr que S. thermophilus est dot d'endo et d'exopeptidases intracellulaires de spcificit gnrale qui lui permettent d'utiliser les peptides exognes comme source d'azote [31]. S. thermophilus CNRZ 160, par exemple, possde une endopeptidase intracellulaire qui prsente les proprits gnrales et la spcificit d'action caractristiques des mtalloprotases neutres (EC 3.4.24.4.) [27], ainsi qu'une aminopeptidase et une dipeptidase intracellulaires ayant une large spcificit [75]. Autrement dit, S. thermophilus est quip de peptide-hydrolases intracellulaires qui lui permettent d'utiliser les peptides exognes soit comme une source

MMOIRES ORIGINAUX

507

TABLEAU
Effets stimulants

5
d'acide

de l'addition d'acides amins sur la production de S. thermophilus dans du lait

Nombre de souches tudies

Acides

amins

stimulants

Rfrences

Mlange de six amins, suivant trs active.

onze
la saison.

acides Val

PETTE et LOLKEMA,1950 [70].

fI
6j l5 [1 4j l3

His ou His His. Leu Leu

Gly,
BAUTISTA et al., 1966 [12].

+ +

Ile His

+ +

Val. ACCOLAS al., 1971 [4]. et Val.

Glu, Met, Phe, His, Arg ; m- BRACQUARTet LORIENT, 1977 [19] lange Glu + His + Met trs actif. 5 6 Non prcis Glu Glu Glu

+ + +

His His His

+ + +

Met.

BRACQUARTet al., 1978 [20].

Met Met

+ +

Leu Leu

+ +

Val. HIGASHIO et al., 1978 [48]. Val SHANKAR et DAVIES, 1978 [82].

Trp.

gnrale d'acides amins [29,30], soit comme une source prfrentielle d'histidine lorsque cet acide amin se trouve en position NH2-terminale dans la chane peptidique [30]. Dans ce dernier cas, il existe un effet de taille du peptide qui fait que l'action stimulante observe diminue lorsque le nombre de rsidus d'acides amins passe de 5 12 ; en outre, les peptides de poids molculaire lev sont sans action. Enfin, des di ou des tripeptides tels que His-Ser, Lys-Tyr-Leu et AspSer-Arg dterminent un effet inhibiteur. D'autre part, Galesloot et al. [39] et Veringa et al. [lOI] ont montr que S. thermophilus exerait un effet stimulant notable sur L. bulgaricus, effet qui est li la production d'acide formique. Cet effet stimulant a t observ par d'autres auteurs (Accolas et al. [4], Shankar et Davies [82]) tandis que Higashio et al. [48] ont mis en vidence un effet cumulatif de l'acide formique et de l'acide pyruvique. On dispose donc, l'heure actuelle, de tout un ensemble de donnes solides sur les facteurs responsables de la synergie qui se mani-

508

LE LAIT / SEPTEMBRE-{)CTOBRE

1980 /

N"

598

feste lorsque S. thermophilus et L. bulgaricus sont cultivs ensemble dans du lait. Notons en outre que cette synergie est sans doute responsable de la stabilit de nombreuses cultures mixtes de yoghourt et de leur production d'acide rapide et rgulire [5], ce dont les fabricants de yoghourt tirent le plus grand profit, en pratique.

FERMENTATION LACTIQUE CONTINUE APPLIQUEE A LA FABRICATION DU YOGHOURT La fermentation continue a t utilise industriellement pour fabriquer des yoghourts. Sous sa forme la plus simple (Auclair et Mocquot [11], Lelieveld [58]) elle comporte une cuve de prfermentation o le pH du lait est maintenu constant une valeur voisine de 5,7 par addition continue de lait non ferment, tandis que le lait ferment est soutir et rparti en pots et l'incubation termine dans des chambres tuves (yoghourt ferme) ou envoy dans une seconde cuve o l'acidification est mene son terme (yoghourt brass). Le choix d'un pH de fermentation relativement lev est destin viter la coagulation prmature du lait, qui nuirait la bonne homognit de la fermentation. La coagulation acide du lait commence en effet un pH voisin de 5,5 aux tempratures d'incubation utilises dans la fabrication du yoghourt (40-45C). Le procd de fermentation continue du yoghourt pH constant a fait rcemment l'objet d'tudes thoriques et de vrifications exprimentales (Driessen et al. [32], Macbean et al. [60]), qui ont confirm la remarquable stabilit de l'association des deux bactries du yoghourt en culture continue. Macbean et al. se sont en outre livrs une analyse critique dtaille des facteurs responsables du comportement de l'association bactrienne en culture continue. D'autre part, Driessen et Stadhouders [33] ont dcrit un procd de fermentation du yoghourt entirement continu, qui a t expriment avec succs l'chelle pilote. Ce procd comporte deux tapes, la premire, comme prcdemment, est une prfermentation du lait pH 5,7. La seconde se droule dans une cuve de coagulation trs labore comportant en particulier un systme d'alimentation vitant le mlange brutal du lait prferment et du lait en cours de coagulation, et un systme d'agitation fonctionnant en va-et-vient dans le fond de la cuve, selon le principe de la mouvette, pour donner au lait acidifi la consistance requise du yoghourt brass. Les avantages de ces procds continus rsultent videmment de l'conomie ralise au niveau des investissements (place, cuves de fermentation et chambres tuves) et de la productivit d'une fermentation continue bien rgle. Les inconvnients de tels systmes l'chelle industrielle rsultent des incidents de marche, par exemple des risques que font peser les attaques de bactriophages.

MMOIRES

ORIGINAUX

509

La bonne marche d'une fermentation continue implique donc presque coup sr la mise en place d'une chane aseptique de fabrication ad hoc et exige une surveillance rigoureuse.

B.

LES FROMAGES A PATE CUITE

MECANISME DE L'EGOUTTAGE La fabrication de ce type de fromage dbute par la coagulation du lait par la prsure, c'est--dire la formation d'un rseau rassemblant la majeure partie des protines du lait (les casines). Ce coagulum est ensuite dcoup, puis brass mcaniquement et les grains de caill sont soumis un chauffage modr 53-56C. Ce travail du caill en cuve a pour effet de provoquer un gouttage relativement rapide et important des grains, de telle sorte que, lorsque la masse de caill est sortie de la cuve et mise sous presse, elle ne contient dj plus que 50 p. 100 d'eau. La concentration correspondante en lactose du caill est, dans ces conditions, suffisamment faible pour que ce sucre soit totalement ferment en acide lactique. En outre, l'acidification sous presse favorise la synrse du caill et l'gouttage se poursuit de telle faon que le fromage est, si tout se passe bien, correctement goutt (38-39p. 100 d'eau) et acidifi (pH voisin de 5,2), lorsqu'il est sorti de la presse le lendemain de la fabrication. En fait, l'acidification sous presse de ce type de fromage est une tape cl de la fabrication qui conditionne, pour une part essentielle, la russite ou l'chec ultrieur de l'affinage. C'est aussi, nous allons le voir, une tape complexe qui n'a t bien comprise que rcemment et qui constitue une bonne illustration de ce que peut tre la fermentation lactique dans la pratique quotidienne de la fromagerie. Lorsque le caill est mis sous presse, sa temprature est voisine de 50 C. La temprature ambiante de la salle de pressage tant nettement infrieure, la masse de caill (50 80 kg) va se refroidir. Comme cette masse est mauvaise conductrice de la chaleur, la temprature va chuter rapidement en priphrie alors qu'elle ne diminuera que lentement dans la zone centrale du fromage. Il va ainsi s'tablir un gradient de temprature (fig. 4 a). En consquence, la fermentation lactique va dmarrer plus rapidement dans la zone priphrique, l o la temprature va se situer dans une zone favorable au dveloppement et au mtabolisme des bactries lactiques. A l'inverse, dans la zone centrale, la temprature va demeurer trop leve pendant les premires heures de pressage pour que la fermentation y dmarre activement. Lorsqu'elle deviendra favorable, le levain ne disposera plus de lactose rsiduel pour se dvelopper. C'est ce qui explique les variations de dveloppement du levain lactique observes par Accolas et al. [6], qui conduisent des diffrences importantes et significatives (de l'ordre d'un log dcimal) entre les populations bactriennes for-

510

LE LAIT

/ SEPTEMBRE-OCTOBRE

1980/

598

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30

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Temps (heures)

fig. 4 Comportement des fromages pte cuite pendant le pressage (d'aprs ACCOLAS et al. [6]) a) Evolution des tempratures au centre et la priphrie d'un fromage de Gruyre. Temprature ambiante :24 C. b) Evolution de la flore lactique thermophile au cours des 48 h suivant la mise sous presse du gruyre. Dnombrements de L. helveticus au centre (0-0) et la priphrie (.-.) du fromage ; dnombrements correspondants (,0, - -,0,) et (A- - A) de S. thermophilus.
0

MMOIRES

ORIGINAUX

511

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10 15

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10

30

50
1

75

90

120

150

Pressage

HEURES 1 c~1 Cave 15 chaude v (20-24'C)

Cave 1 EntreRQsage JOURS froide chez le marchand (lO-13'C)

QI

g> 150

-8

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QI

50

Zones

2 3

4 5

678

fig. 5 Comportement des fromages pte cuite sous presse et au cours de l'affinage (d'aprs STEFFEN [88, 92]) a) Fermentation du lactose et formation du lactate au cours de la fabrication de l'emmental. Dgradation du lactate au cours de l'affinage. b) Variations de la teneur en acide lactique suivant la zone du fromage, dans un emmental g de 24 h. Les zones correspondant aux nombres indiqus en abscisse sont prsentes sur la section schmatique du fromage, dans la partie droite de la figure.

512

LE LAIT / SEPTEMBRE-OCTOBRE 1980 / N" 598

CENTRE

Refroidissement rapide au dbut du pressage

Refroidissement lent pendant le pressage

.1 \. 4 Etablissement d'un gradient de temprature

1 Fo'lOrable paur le levain thermophile

1
Dfovoroble
Croissance

pour le levain thermophile 1

lente et fermentation

1
Croissance rapide

et fermentation \.

active 1

du lactose

peu active du lactose

1
1 1

1 1 1

Formation d'un gradient de concentration en lactose et en acide lactique Afflux de lactose

moins favorables leve en oc. lactique

1 1"
1
Tempratures Concentration

1
1 1
Tempratures favorables

Peu ou pas de lactose rsiduel

1 --

Pas de lactose rsiduel

Concentration moyenne en oc. lactique

1 1 1 oc. lactique
\

Migration lente d'acide lactique

[rtention

par les protines)

"- -

Elimination dans le lactosrum d'gouttage

fig. 6
Schma rcapitulatif du comportement des fromages pte cuite sous presse, tabli d'aprs les donnes d'AcCOLAS et al. [6], de MOCQUOT[62] et de STEFFEN [88,92]

mes au centre et en priphrie d'un mme fromage (fig. 4 b). En d'autres termes, la croissance des bactries est plus rapide, la fermentation lactique plus intense et les populations finales atteintes plus leves dans la zone priphrique que dans la zone centrale. L'tude de Steffen [88, 92] consacre l'volution sous presse des teneurs en sucres (lactose, glucose et galactose) et des isomres de l'acide lactique en diffrents points du fromage, corrobore entirement ces observations (fig. 5 a et b). Un tel phnomne est susceptible d'avoir des consquences pratiques apprciables : il est possible, par exemple, qu'une rpartition ingale des produits du mtabolisme microbien dans les parties centrale et priphrique de la meule de fromage influe sur

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l'aspect (nombre et rpartition des yeux) et sur diverses organoleptiques du fromage affin.

qualits

Cet ensemble de donnes bactriologiques et biochimiques a permis de proposer une interprtation cohrente du mcanisme de l'gouttage (Accolas et al. [6], Mocquot [62]) dont le bon droulement constitue une tape cl de la russite du fromage. On en trouvera une prsentation schmatique dans la figure 6.

ROLE DU LEVAIN LACTIQUE THERMOPHILE AU COURS DE L'AFFINAGE

Au cours de l'affinage du fromage, les bactries lactiques therrnophiles du levain qui taient prsentes en nombre lev (mais variable suivant la zone du fromage) la fin de la fabrication, vont disparatre soit rapidement (S. thermophilus) soit plus lentement (lactobacilles), alors que d'autres micro-organismes, des lactobacilles msophiles, des pdiocoques et, bien entendu, les bactries propioniques responsables de la dgradation du lactate (fig. 5 a) et de la formation de l'ouverture, vont se dvelopper dans le fromage (Veaux et al. [100], Steffen [88, 92], Steffen et al. [90]). Il a t suggr de longue date que la diminution des bactries du levain rsultait de la lyse des cellules bactriennes et tait accompagne de la libration d'enzymes protolytiques actives qui participaient, des degrs divers, l'affinage du fromage. De nombreuses donnes exprimentales concourent tayer cette faon de voir. Pour tenter d'en donner une prsentation claire et concise, nous regrouperons ces donnes en deux chapitres.

Action protolytique des bactries lactiques thermophiles. Donnes gnrales

De nombreux travaux ont t consacrs l'tude des enzymes protolytiques des bactries lactiques thermophiles en relation, parfois avec le rle ventuel de ces enzymes au cours de l'affinage du fromage. Nous ne reviendrons pas ici sur les travaux qui ont t passs en revue dans le chapitre consacr la synergie des bactries du yoghourt. Bornons-nous complter ce qui a t dit cette occasion, en mentionnant par exemple le travail de Vescovo et Bottazzi [103] consacr aux caractristiques et la localisation du systme protolytique de souches de L. helveticus. Rappelons aussi le travail de Tourneur [96], dj cit, o il apparat que des lactobacilles thermophiles isols du fromage ou du lactosrum (ceux du sous-groupe autrefois dnomm Thermobacterium) possdent une activit protasique suprieure

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celle des autres lactobacilles, activit qui serait lie, pour une grande part, la prsence d'exo et d'endopeptidases localises la surface des cellules. D'autre part, il a t montr rcemment que l'extrait brut intracellulaire de plusieurs souches de S. thermophilus dterminait in vitro une hydrolyse prfrentielle de la casine ~ (Desmazeaud et Jug [31]). La riche dotation en exopeptidases de nombreuses souches de S. thermophilus les rend potentiellement capables de dgrader certains peptides responsables de l'amertume. En particulier, leur capacit d'hydrolyser la liaison peptidique Pro-X (X tant un acide amin variable) est coup sr aussi significative, de ce point de vue, qu'elle l'est dans le cas des streptocoques lactiques msophiles (Mou et al. [65]). Cela contribue peut-tre aussi expliquer (au moins en partie) pourquoi l'amertume semble tre un dfaut de got moins frquent dans le cas des fromages pte cuite que dans le cas d'autres types de fromages (Plissier et al. [69]). Notons aussi que de nombreuses souches de S. thermophilus possdent une forte activit phosphatase acide, stable en fin de croissance (Bouillanne et Desmazeaud [18]). Cette observation prsente un certain intrt technologique si on la rapproche de celle de Dulley et Kitchen [34], qui ont montr qu'une activit phosphatase acide trop faible, au cours de la maturation du fromage, ralentissait la protolyse et ne permettait pas d'obtenir un fromage affin correct. En ce qui concerne les lactobacilles, Ohmiya et Sato [66, 67] ont nettement mis en vidence l'action protolytique des enzymes intracellulaires de L. helveticus en ajoutant des extraits cellulaires de ce germe du caill prsure aseptique. Dans le mme ordre d'ides, rappelons aussi que Petterson et Sjstrrn [72] ont obtenu des rsultats exprimentaux satisfaisants (protolyse plus prcoce et plus intense; bonne qualit organoleptique du fromage sudois pte semi-dure, une fois affin) en ajoutant au lait de fromagerie des nombres levs de lactobacilles thermophiles ayant subi un {( choc thermique pralable, destin rduire leur pouvoir acidifiant sans altrer leurs proprits protolytiques.

Action protolytique du levain lactique thermophile au cours de l'affinage de l'emmental

Une tude intensive des chercheurs suisses de la S.F.R.L. de Berne, s'appuyant en particulier sur une exprimentation fromagre rpte, a rvl sans ambigut possible le rle de premier plan que joue le levain lactique thermophile au cours de l'affinage de l'emmental et, en consquence, l'importance que revt le choix du levain pour obtenir un fromage affin sans dfauts. Le premier objectif des chercheurs suisses tait d'lucider le mcanisme de la fermentation dite secondaire ou tardive ({(Nachgrung ) de l'emmental (Steffen [89]). Ce dfaut d'ouverture caractristique (1ainure ouverte, yeux tirs, becs, etc.), qui

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dprcie frquemment le fromage, est li une production intempestive de CO2 en fin d'affinage lorsque le fromage sjourne en cave froide, c'est--dire une priode o la pte du fromage n'est plus assez lastique pour donner naissance une ouverture normale. Le levain lactique thermophileest impliqu, au premier chef, dans l'apparition de la fermentation secondaire (Steffen [91, 92]). Il existe en particulier un lien direct entre la nature du levain utilis, son activit protolytique et la formation de l'ouverture tardive. Il est par exemple remarquable que l'action protolytique engendre par des levains contenant L. helveticus est plus intense et, ce faisant, plus favorable la fermentation secondaire que celle des levains contenant L. lactis [52,90,93]. Si le levain peut produire directement le CO2 indsirable [38], il favorise surtout (et cela de faon indirecte et inopportune) une production tardive de CO2 par la flore propionique. Il est donc clair que le choix des levains lactiques thermophiles utiliss pour fabriquer l'emmental, doit prendre en compte non seulement leur aptitude produire l'acidification recherche en fabrication, mais aussi des variations possibles, d'un levain un autre, d'autres proprits mtaboliques, en particulier de l'aptitude la protolyse. A ce titre, la mesure de diverses activits enzymatiques dans le fromage peut fournir d'utiles indications sur le comportement du levain au cours de l'affinage [80,90].

C.

BACTERIOPHAGES

Il ne nous parat pas utile de revenir ici longuement sur un problme qui a fait l'objet d'une discussion dtaille dans une revue prcdente consacre aux levains lactiques msophiles (Cogan [24]). Bon nombre des problmes que posent les bactriophages et les principes de lutte exposs dans cette synthse sont certainement transposables aux levains lactiques thermophiles utiliss en technologie laitire. Rappelons que les premiers accidents de fabrication o des phages spcifiques des bactries lactiques thermophiles ont t mis en cause, ont t dcrits dans les annes 50 (Pette et Kooy [71], Deane et al. [25], Kiuru et Tybeck [49]) alors que les bactriophages des levains lactiques msophiles taient connus depuis les annes 30, grce la dcouverte des no-zlandais Whitehead et Cox. Plus rcemment, Reddy [76] a montr qu'en utilisant des techniques adquates, il tait possible de mettre en vidence, dans les usines employant des levains lactiques thermophiles, des phages spcifiques des bactries du levain, S. thermophilus et lactobacilles, et cela, beaucoup plus frquemment qu'on ne l'imaginait auparavant.

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Les phages de S. thermophilus isols jusqu' prsent, appartiennent gnralement un type morphologique (tte isomtrique, queue non contractile de longueur variable) qu'on trouve aussi frquemment chez les phages des streptocoques lactiques msophiles (Accolas et Spillmann [7]). Il est donc trs possible, comme l'a remarqu Lawrence [55], qu'il existe un lien phylognique entre les phages des streptocoques lactiques msophiles et ceux de S. thermophilus. Les phages de L. bulgaricus et de L. lactis dcrits actuellement sont, dans la majorit des cas, des phages du type morphologique prcdent, tte isomtrique et queue non contractile, tandis que ceux de L. helveticus possdent une queue pourvue d'un manchon contractile (Accolas et Spillmann [8]). Dans le cas des levains naturels des fromageries de gruyre, d'emmental, de sbrinz ou de grana, il est loisible de penser qu'on a affaire des levains dont le comportement est similaire celui des levains naturels msophiles couramment utiliss en France et dans l'Europe septentrionale (Stadhouders [86], Stadhouders et al. [87]). Propags dans les fromageries artisanales sans prcautions rigoureuses d'asepsie, ces levains contiennent gnralement, nous l'avons mentionn, une flore lactique thermophile diverse qui pourrait tre soumise une pression slective continue par les phages prsents dans la fromagerie, comme c'est le cas pour les levains lactiques msophiles naturels (Stadhouders [86]). Avec ce type de levain, on s'expose subir des irrgularits d'acidification, mais les accidents brutaux qui compromettent irrmdiablement la russite du fromage, sont plutt rares. Toutefois, l'utilisation empirique de levains naturels peut tout aussi bien entraner l'apparition de phages lytiques et provoquer une acidification insuffisante en fabrication. En effet, Kurmann [51] a rcemment montr que S. thermophilus et les lactobacilles therrnophiles sont des bactries lysognes inductibles et que les levains lactiques thermophiles eux-mmes reprsentent vraisemblablement la source des phages lytiques apparus dans les fromageries. Le problme ne diffre donc pas fondamentalement de celui que posent les levains lactiques msophiles, si ce n'est que ce dernier est maintenant mieux connu (Lawrence [55], Lawrence et Thomas [56], Cogan [24]). Cela dit, l'emploi irrflchi de cultures d'origine varie, en alternance ou en mlange, ne constitue certainement pas un remde aux difficults causes par les phages. Bien au contraire, comme l'a remarqu Lawrence [55], cette pratique peut grandement favoriser l'apparition de phages lytiques. En outre, compte tenu de la concentration de la fabrication dans de grandes usines (c'est la rgle pour le yoghourt et il existe maintenant de grandes fromageries d'emmental) on peut s'attendre ce que le problme des phages des levains lactiques thermophiles se pose avec de plus en plus d'acuit dans l'avenir en raison de l'effet amplificateur de la taille de l'usine (Lawrence et Thomas [56]), surtout si le choix et la prparation des levains ne sont pas effectus avec toute l'attention et la rflexion ncessaires.

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Remerciements
Nous remercions bien vivement les revues: Journal of Dairy Science, LebensmittelWissenschaft und Technologie, Le Lait et Le Laitier Romand, de nous avoir aimablement autoriss reproduire des figures extraites d'articles qu'elles ont publis.

Rsum Cette revue est consacre aux levains lactiques thermophiles. Une premire partie traite du rle de ces levains, des caractristiques taxonomiques des espces les plus reprsentatives (S. thermophilus et lactobacilles) de la composition des diffrents types de levains et de leur utilisation sous forme concentre et congele ou lyophilise. Deux produits laitiers, le yoghourt et les fromages pte cuite choisis titre d'exemple parce que les levains lactiques thermophiles y jouent un rle de premier plan, sont l'occasion de discuter divers problmes. Ainsi, dans le cas du yoghourt sont examins successivement l'influence de la qualit du lait, la fermentation du lactose par S. thermophilus, la production d'arme, la synergie des bactries du yoghourt et la fermentation continue du lait pH constant. Ensuite, le comportement des levains lactiques thermophiles au cours de la fabrication et de l'affinage des fromages pte cuite, est voqu la lumire des donnes exprimentales acquises et des hypothses formules rcemment dans ce domaine. Un bref chapitre consacr aux bactriophages clt cette revue. Summary
THERMOPHILIC LAcnc STARTERS: PROPERTIES AND BEHAVIOUR IN DAIRY TECHNOLOGY. A REVIEW

The first part of this review deals with the role of thermophilic lactic starters, the taxonomy of the most representative species (S. thermophilus and lactobacilli), the composition of various types of starters and the use of frozen and freeze-dried concentrates. Various problems are discussed taking as examples yoghurt and hard cooked cheeses because of the major role played by the thermophilic starters in their manufacture. In the yoghurt the influence of milk qua lity, the lactose fermentation by S. thermophilus, the flavour production, the synergy between the yoghurt bacteria and the pH-stat continuo us fermentation of milk are examined. Then the behaviour of thermophilic lactic starters during the manufacture and ripening of hard cooked cheeses is discussed in the light of recent experimental data and new hypothesis in this field. Finally data concerning thermophilic lactic phages are presented.

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Zusammenfassung
DIE THERMOPHILEN EIGENSCHAFTEN EINE MILCHSAEUREWECKER: BEI DER MILCHVERARBEITUNG. UEBERSICHT

UND VERHALTEN

Diese UEbersicht handelt von den therrnophilen Milchsureweckern. lm ersten Teil werden die Rolle der Surewecker, die taxonomischen Charakteristika der reprsentativsten Arten (S. thermophilus und Lactobazillen), die Zusammensetzung der verschiedenen Sureweckertypen und ihre Verwendung in konzentrierter und tiefgefrorener oder gefriergetrockneter Form untersucht. AIs Beispiel wurden zwei Milchprodukte, Joghurt und Hartkse ausgewhlt, da bei ihnen die thermophilen Milchsurewecker eine entscheidende Rolle spielen. Anhand dieser beiden Beispiele werden weitere Probleme diskutiert. 50 z.B. im Fall des Joghurts der Einflu der Milchqualitt, die Laktosegrung der 5: thermophilus, die Aromabildung, die Synergie der Joghurtbakterien und die kontinuierliche Grung der Milch bei konstantem pH. lm Falle der Hartkse wird auf das Verhalten der thermophilen Milchsurewecker im Laufe der Herstellung und Reifung von Hartkse anhand von gewonnenen Untersuchungsdaten und neuesten Hypothesen auf diesem Gebiet eingegangen. Den Abschluf dieser UEbersicht bildet ein kurzer Abschnitt ber Bakteriophagen.
Reu pour publication en juillet 1980.

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