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Techniques Microbiologiques
F. Djennane
D. Mohammedi
D. Tiouit
D. Touati
K. Rahal
Edition 2009
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
- M.N Ouar-Korichi-H.Senouci-K.Rahal
Diagnostic bactériologique et sérologique de la brucellose.
ANDS 1998, 1ere édition, 33pages
- R.Bellouni-H.tali-Maamar-K.Rahal
Etude cytobactériologique et biochimique du liquide
céphalorachidien.
ANDS 2000. 52pages
- A.Benslimani-K.Rahal.
Prélèvements génitaux.
ANDS 2001. 128 pages.
- A.S Merad-H.Tali-Maamar-K.Rahal
Diagnostic bactériologique et antibiothérapie des infections
oculaires .
ANDS 2003 . 40 pages.
- M.N Ouar-Korichi-H.Senouci-K.Rahal
Diagnostic bactériologique et sérologique de la brucellose
humaine.
ANDS 2005 2eme édition. 58 pages
- N.Ramdani-Bouguessa-K.Rahal
Diagnostic bactériologique des infections respiratoires
ANDS 2006 . 48 pages.
- M.Azouaou.M.Lazri.S.Mahrane.H.Senouci
Diagnostic de la diphtérie
ANDS 2007 . 94 Pages
2
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
SOMMAIRE
CHAPITRE I................................................................................................................ 4
INTRODUCTION .......................................................................................................... 5
GENERALITES............................................................................................................. 6
RAPPEL ANATOMOPHYSIOLOGIQUE .................................................................................. 7
Rappel anatomique ............................................................................................... 7
Portes d'entrées..................................................................................................10
Facteurs favorisants l’infection urinaires ....................................................................11
Moyens de défense de l’hôte ..................................................................................12
RAPPEL CLINIQUE ..................................................................................................... 14
Cystite .............................................................................................................14
Pyélonéphrite ....................................................................................................14
Prostatite .........................................................................................................14
LE PRELEVEMENT...................................................................................................... 16
Indications de l’E.C.B.U ........................................................................................16
Les conditions du prélèvement ................................................................................17
Le matériel....................................................................................................17
Moment du prélèvement ....................................................................................18
Toilette ........................................................................................................18
Recueil des urines ...........................................................................................18
Prélèvement d’urine pour des recherches spécifiques.................................................23
Transport ......................................................................................................24
Conservation ..................................................................................................24
CHAPITRE II ............................................................................................................. 25
Examen cytobactériologique des urines...........................................................................26
Examen macroscopique...............................................................................................26
Détermination du PH urinaire ...................................................................................... 26
Examen microscopique .............................................................................................. 27
Examen à l’état frais ............................................................................................27
Examen direct après coloration ...............................................................................33
Culture .................................................................................................................. 35
Techniques d’ensemencement ................................................................................35
1- Méthode de référence : Méthode de KASS Modifiée.................................................35
2- Méthode à l’anse calibrée ...............................................................................36
3- Lames immergées .........................................................................................37
4- Tests rapides ..............................................................................................38
5- Techniques à base de milieux chromogéniques ......................................................40
Choix des milieux de culture...................................................................................44
1- Milieux pour numération bactérienne .................................................................44
2- Milieux d’isolement ......................................................................................44
Incubation.........................................................................................................45
Aspect des colonies..............................................................................................45
Identification biochimique des colonies......................................................................48
1- Caractéres biochimiques d’orientation rapide .......................................................48
2- Identification classique ..................................................................................49
3- Identification rapide (API system)......................................................................50
4- Identification des colonies sur milieux chromogènes ...............................................51
5- Identification antigénique ...............................................................................52
6- Antibiogramme ...........................................................................................52
Chapitre III.............................................................................................................. 53
Interprétation de l’ECBU ............................................................................................ 54
Interprétation selon la bactériurie et la leucocyturie......................................................... 55
Interprétation selon les germes ................................................................................... 60
Interprétation chez le transplanté rénal......................................................................... 62
Chapitre VI ............................................................................................................. 63
Epidémiologie .......................................................................................................... 64
Annexe .................................................................................................................. 70
Références bibliographiques....................................................................................... 74
3
CHAPITRE I
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
INTRODUCTION
L’infection urinaire est une pathologie fréquente, c’est ainsi qu’elle constitue
le principal motif d’exploration microbiologique (l’examen
cytobactériologique des urines représente plus de la moitié des examens
bactériologiques), de même qu’elle est la 2ème pathologie infectieuse
rencontrée en pratique extra hospitalière et nécessite un traitement
antibiotique, d’où des conséquences sur le coût des soins et le développement
des résistances.
• Bactériologique : Bactérie :
- Espèce
- Sensibilité aux antibiotiques
• Pharmacologique : Antibiotiques
- Diffusion
- Demi–vie…
Chapitre I : Généralités 5
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
GENERALITES
Les infections des voies urinaires sont définies par la présence d’un nombre
significatif de bactéries qui se développent au niveau des voies excrétrices
urinaires hautes ou basses.
Il existe trois types d’infections urinaires selon l’organe de l’appareil urinaire
qu’elle touchent :
Elle est dite « compliquée » (à ne pas confondre avec une infection urinaire
grave ou sévère) lorsqu’une anomalie urologique haute ou basse entraîne une
stase urinaire ou lorsqu’un corps étranger tel un calcul même minime
constitue un gîte bactérien.
Les infections urinaires peuvent être compliquées également par une maladie
générale : insuffisance rénale, maladie de système notamment diabète ou
maladie immunosuppressive (cancer, SIDA), ou traitement immunosuppressif
au long cours.
Chapitre I : Généralités 6
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
RAPPEL ANATOMOPHYSIOLOGIQUE
Rappel anatomique
- L’appareil urinaire s’étend des reins au méat urétral
- Au niveau du rein, des papilles calicielles s’opposent au reflux intra rénal
- Des mouvements péristaltiques urétéraux favorisent l’écoulement de
l’urine du rein vers la vessie
- Un système anti reflux au niveau de la jonction urétéro-vésicale évite le
reflux des urines vers le rein lors de la miction
- La vessie s’évacue par l’urètre.
- Un double sphincter existe au niveau de la jonction urétro-vésicale et
assure la continence :
• sphincter lisse : à commande réflexe
• sphincter strié : à commande volontaire
Chapitre I : Généralités 7
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Chapitre I : Généralités 8
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Chapitre I : Généralités 9
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Portes d’entrées
Tout l’arbre urinaire est physiologiquement stérile, à l’exception des derniers
milimètres de l’urètre et ceci, bien que l’urine soit pour de nombreux germes
un bon milieu de culture, l’infection peut se faire par plusieurs voies.
Chapitre I : Généralités 10
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
• Escherichia coli
- Produit des facteurs modulant sa virulence dans le tractus urinaire
(résistance à la phagocytose et à l’action du complément) :
** Adhésine
- Sont des sites de glycoreconnaissance essentiellement
fimbriale mais aussi à la surface de la bactérie
- On distingue : - Adhésine type 1 mannose sensible.
- Adhésine type 2 mannose résistante.
** Toxines
- Toxine cytotoxique nécrosante
- Hémolysine alpha :
Cytotoxique pour les cellules rénales épithéliales
Permet aux bactéries de s’encapsuler et d’échapper à la
réaction inflammatoire
Libère le fer héminique et favorise sa biodisponibilité
** Antigène de surface
- AgO : portion externe du Lipopolysacharide de la membrane
externe de paroi.
- Agk : polysaccharide capsulaire.
• Proteus mirabilis
- Le pouvoir d’adhérence par son adhésine la Proteus mirabilis
fimbriae (PMF) est médiocre ce qui exliquerait sa rareté dans les
infections urinaires habituelles. Cependant, il possède une uréase
qui entraîne la production d’urine alcaline favorisant la production
de calculs.
- Flagelles : progression dans l’arbre urinaire
- Hémolysine et protéase
- Uréase : production d’ammoniac qui entraîne une alcalinisation de
l’urine.
Chapitre I : Généralités 11
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
• Staphylococcus saprophyticus :
- Il adhère fortement à l’urothélium par des lésions relatives à un
résidu lactosamine. Son pouvoir pathogène est amplifié par la
production du slime.
• Pseudomonas aeruginosa possède une capsule polysaccharidique
épaisse qui le protége de la phagocytose et de la fixation par les
anticorps.
b. l’inoculum bactérien : quantité des bactéries qui arrivent au niveau du
tractus urinaire
Chapitre I : Généralités 12
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
• Chez l’homme :
- Sécrétions prostatiques acides
- Longueur de l’urètre
Chapitre I : Généralités 13
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
RAPPEL CLINIQUE
Cystite
C’est l’infection de la vessie, elle se manifeste par un ou plusieurs des signes
suivants :
- Dysurie habituellement associée à une pollakiurie
- Un besoin impérieux de miction
- Des brûlures mictionnelles
- Une douleur supra-pubienne
Pyélonéphrite
Le syndrome infectieux signe l’atteinte parenchymateuse. La fièvre peut
s’accompagner de frissons évocateurs d’une bactériémie.
Prostatite
Prostatite aiguë
Chapitre I : Généralités 14
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Abcés du rein
C’est une maladie rare et de pronostic grave sans traitement. Son diagnostic
est soupçonné sur la clinique, (état général altéré, fiévre prolongée,
frisson, douleur lombaire unilatérale par la palpation) et la biologie
(hyperleucocytose, VS accélerée, ECBU négatif). Il est confirmé par l’imagerie
(Echographie, UIV, angiographie du rein). L’abcés du rein est consécutif à une
bactérièmie ou à une pyélonéphrite non ou mal traitée.
Chapitre I : Généralités 15
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
LE PRELEVEMENT
Indications de l’E.C.B.U
Situations cliniques qui conduisent à demander un ECBU.
1- Syndrome douloureux
Douleurs lombaires, douleurs pelviennes, brûlures mictionnelles (per, pré
ou post miction) sensibilité au toucher rectal de la prostate (prostatite).
7- L’ECB des urines peut également être réalisé avant tout geste invasif
sur l’appareil urogénitale, qu’il soit à but diagnostic (U.C.R, Cystoscopie,
résection per endoscopique) ou thérapeutique (intervention chirurgicale).
Chapitre I : Généralités 16
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Le matériel
Le matériel pour la réalisation du prélèvement doit être stérile : pour ceci on
utilise :
- Des pots stériles à usage unique ou
des tubes à col large stériles.
Chapitre I : Généralités 17
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Moment du prélèvement
Antiobiothérapie :
Le prélèvement doit être effectué sur les urines du matin. En cas d’urgence
on peut réaliser le prélèvement à n’importe quel moment de la journée à
condition que les urines aient séjourné au moins trois heures dans la vessie à
savoir trois heures entre la dernière miction et le prélèvement pour l’analyse.
La miction est un moyen de défense mécanique de la vessie et permet
d’éliminer les bactéries. Quand les mictions sont fréquentes elles peuvent
aboutir à un résultat faussement négatif.
Toilette
Après un lavage hygiénique des mains, la toilette locale doit être effectuée en
réalisant une toilette de la région uro-génitale avec un antiseptique doux
(dakin, chlorhexidine) ou un savon neutre (savon de Marseille) :
Chapitre I : Généralités 18
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Elle consiste à éliminer le premier jet urinaire (20 ml) qui peut contenir
jusqu’à 104 UFC/ml de bactéries provenant de la flore urétrale, le milieu du
jet qui correspond à l’urine vésicale est récupéré dans un pot stérile qui
n’est ouvert qu’à la fin de la toilette sans toucher le bord supérieur du
récipient, et après élimination du dernier jet, le tube est fermé
hermétiquement.
Chez la femme il faut écarter les grandes lèvres, et en cas de leucorrhées
importantes il faut placer une compresse au niveau de la région vulvaire,
afin d’éviter toute contamination par la fore vaginale.
- Sachet collecteur :
Chapitre I : Généralités 19
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Elle est réalisée au moins 4 heures aprés la dernière miction (vessie pleine)
afin de visualiser le globe vésical. Le nourrisson est allongé, les régions sous
ombilicale et sus pubienne sont nettoyées puis badigeonnées d’alcool iodée,
le médecin porte des gants stériles et ponctionne avec une seringue stérile
verticalement sur la ligne médiane en plein matité à un centimètre au
dessus de la symphyse pubienne. L’urine est aspirée, l’aiguille est
capuchonnée et le point de ponction est comprimé.
Cette technique est à éviter car elle présente des risques d’infections
iatrogènes lors de la pose de la sonde et doit être réalisée dans les
conditions d’asepsie rigoureuse.
Chapitre I : Généralités 20
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Chapitre I : Généralités 21
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
- Etui pénien :
Chapitre I : Généralités 22
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Chapitre I : Généralités 23
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Transport
Le tube est fermé hermétiquement et étiqueté correctement portant nom,
prénom et heure du prélèvement. Le tube doit contenir 10 à 20ml d’urine
accompagné d’une fiche de renseignements qui doit comporter :
• L’identité du malade.
• L’origine du malade hospitalisé ou externe.
• Pathologie existante.
• Notion d’intervention chirurgicale sur l’appareil urinaire.
• Les signes cliniques.
• La prise ou non d’antibiotiques, avec le nom de (ou des)antibiotique(s)
et la posologie ainsi que la durée de prise.
• La technique de prélèvement pratiquée.
Le transport doit être rapide et ne doit pas dépasser trente minutes après la
miction. Si le transport nécessite une à deux heures, l’urine est placée dans
de la glace afin d’éviter les faux positifs car à température ambiante on a
une pullulation bactérienne.
Conservation
L’urine peut être conservée douze à vingt quatre heures à +4°C sans effet sur
la bactériurie, néanmoins la leucocyturie en sera altérée.
Chapitre I : Généralités 24
CHAPITRE II
Examen cytobactériologique
des urines
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Examen macroscopique
Aspect des urines : l’urine normale est claire. Un aspect trouble peut être dû
à une infection urinaire mais aussi à la présence de cristaux ou de sels
amorphes.
Technique : Homogénéiser l’urine par retournement ou par agitation
mécanique et noter l’aspect limpide ou trouble et la présence d’une
éventuelle hématurie
Détermination du PH urinaire
Le but étant d’évaluer l’état d’acidité ou d’alcalinité des urines.
Principe :
Mesure de la concentration en ions H+.
Technique :
Recueil des urines fraîches à l’abri de l’air et mesure du pH grâce à
l’électrode d’un pH-mètre. Celui çi doit etre calibré avec des solutions
tampon pH = 4 ou 10 et pH = 7. Les valeurs doivent être à peu près les
mêmes.
Une seconde méthode, plus simple, fait appel à des bandelettes revêtues de
deux indicateurs colorés et dont le changement des couleurs allant de
l’orange au bleu couvre une gamme de pH de 5,0 à 8,5. La réalisation de ce
test s’effectue également sur urines fraîches.
Résultats :
Le pH normal des urines varie de 4,5 à 7,8 en fonction de l’alimentation et
des modifications du pH sanguin.
En cas d’infection urinaire, en particulier à germes uréasiques, il existe une
alcalinisation intempestive.
Physiologiquement, on observe une acidose de jeûne (la nuit) et une alcalose
post-prandiale.
Interprétation et intérêts
Examen microscopique
Cet examen doit être effectué dans les deux heures qui suivent le
prélèvement afin de limiter l’altération des éléments cellulaires.
Examen à l’état frais
C’est un examen qui se fait entre lame et lamelle sur cellule hématimétrique
ou sur cellule normale ; il présente de ce fait un double intérêt :
Quantitatif : Numération des éléments cellulaires
Qualitatif : Description des différents éléments cellulaires.
- Cellule de Nageotte
La cellule de Nageotte est de 10mm de largeur sur 10mm de longueur
avec une profondeur de 0.5mm et un volume total correspondant a
50mm3 ; le dénombrement des élements se fait sur 04 bandes ; le chiffre
total obtenu est divisé par 5 pour ramener le dénombrement au
millimètre cube.
1- Les leucocytes
Lorsqu’ils sont intacts, ils se présentent comme des disques
granuleux à l’intérieur desquels le noyau apparaît plus
réfringent ; lorsqu’ils sont altérés, les leucocytes ont des
contours irréguliers, fripés.
La présence de leucocytes dans les urines signe l’existence
d’une réaction inflammatoire. Cependant de véritables
réactions inflammatoires peuvent ne pas s’accompagner
d’une leucocyturie élevée (foyer inflammatoire bien circonscrit,
dilution des urines, lyses des leucocytes dans l’échantillon)
La présence de leucocytes en amas témoigne de l’ouverture d’un foyer
inflammatoire (micro-abcés).
L’altération des leucocytes peut être liée à de mauvaises conditions de
conservation du prélèvement avant son examen.
2- Les hématies :
Intactes , elles se présentent comme de petits
disques de sept mm de diamètre aux bords plus
réfringents ; altérées, elles ont un aspect en
oursin : petits disques de cinq à six mm de
diamètre, hérissées de spicules périphériques.
La présence d’hématies témoigne d’une lésion
des muqueuses de l’appareil urinaire.
Au-delà de 5 hématies par champs, le passage des globules rouges dans
les urines peut être considéré comme pathologique ; les hématies
intactes ont une forte probabilité de provenir de la vessie ou de
l’urètre. Les hématies altérées viennent du rein.
L’hématurie s’observe :
- dans les formes hémorragiques des néphrites : on pourra alors
découvrir des cylindres hématiques à l’examen du sédiment.
- dans le cas d’une atteinte glomérulaire.
- dans les cystites hémorragiques tuberculeuses, gonococciques, à
germes banaux.
- dans la tuberculose rénale.
- l’hématurie peut être associée à d’autre affections d’étiologie
non infectieuse : cancer, lithiase rénale, tumeurs de la vessie.
4- Les cylindres
Cylindres granuleux
Cylindres hyalins
PH alcalin pH acide
Phosphates amorphes Urates amorphes
Triple phosphates Acide urique
Biurate d’ammonium Oxalates de calcium
Phosphate de calcium Cystine
Carbonate de calcium
6- Les bactéries :
7- Les parasites :
- Trichomonas vaginalis : parasite protozoaire globuleux, d’un
diamètre de 15 µm en moyenne, mobile dans les urines fraîches ou
il se déplace en tourbillonnant grâce à une membrane ondulante et
4 flagelles.
- Œufs de Schistosoma haematobium.
8- Autres éléments :
Le Bleu de méthylèn(BM)
Permet la différenciation des leucocytes (aspect
morphologique), permet de visualiser la disposition des
bactéries dans les cellules (intra ou extra cellulaire) et
aussi d’apprécier le mode de groupement des bactéries.
C’est une technique semi quantitative des éléments cellulaires.
Les levures sont bien appréciées au BM.
Un frottis confectionné a partir de l’urine totale bien mélangée, est séché et
fixé puis coloré au BM ; ce frottis permet l’examen des éléments cellulaires
dans des conditions moins traumatisantes que le Gram.
Le GRAM
Permet d’apprécier l’importance de la population
bactérienne, son caractère monomorphe ou polymorphe et la
morphologie des bactéries : cocci ou bacille à Gram positif ou
à Gram négatif (aspect morpho-tinctorial) et le mode de
groupement des cocci. (Orientation pour la culture).
Une goutte (10 ou 50 ul) d’urine non centrifugée est déposée
sur une lame et séchée à l’air sans étalement, fixée puis
colorée au Gram. (Une grande concentration de bactéries va
migrer vers le sommet de la goutte).
correspondant à 104/ml
CULTURE
Techniques d’ensemencement
- Lecture :
La numération se fait selon la formule de Kass :
N=n.102 .10 bactérie / ml
Ou : n : Nombre de colonie sur la boîte.
2
10 : Inverse de la dilution.
10 : Inverse de l’inoculum.
- Interprétation :
UFC=Unités formant colonie
Chaque colonie qui pousse à partir de l’urine diluée correspond à 1000
UFC dans 01 ml d’échantillon.
Une bactériurie significative est considérée devant une numération
> 100 colonies sur gélose nutritive ce qui correspond à > 10 5 UFC / ml.
- Déscription de la technique
Une anse calibrée à 10 µl est utilisée pour ensemencer les géloses
nutritives et sélectives.
On prélève verticalement avec l’anse calibrée et par capillarité une
goutte d’urine que l’on ensemence par stries sur la boîte de gélose :
une strie centrale est ensemencée puis perpendiculairement réaliser un
isolement de haut en bas de la boite en desserant légèrement les
dernières stires. (Voir annexe pour schéma).
- Avantages
Simplifie la technique de Kass en évitant les dilutions de l’urine.
Cette technique permet de bien séparer les colonies pour ensuite bien
les compter.
Diminution du coût.
- Inconvénients
Dans le cas de l’utilisation d’une anse calibrée en fil de platine, le
volume délivré par celle ci doit être régulièrement contrôlé (courbe
d’étalonnage au Bleu d’Evans). En effet après un grand nombre
d’utilisation la calibration de l’anse peut être modifiée (corrosion,
stérilisation du matériel).
- Interprétation
Chaque colonie isolée correspond à une concentration de 103 Unités
viables / ml urine. La numération bactérienne est comparée à l’abaque
de lécture correspondant aux différentes concentrations de
bactéries/ml d’urines.
3- Lames immergées
- Description de la technique
Une lame porte objet munie d’un quadrillage en relief est recouverte
de gélose CLED(Cystine – Lactose – Electrolyte – Déficient) sur une face
et de gélose Mac Conkey sur l’autre. L’intérêt de la gélose de Mac
Conkey est d’inhiber les bactéries à Gram+ et le développement en
nappe des Proteus. La lame est conservée dans un flacon cylindrique
stérile en matière plastique. Elle est fixée au couvercle du même
flacon.
- Utilisation
Saisir la lame par l’intermédiaire du couvercle auquelle elle est fixée,
immerger complètement les deux faces, retirer immédiatement, laisser
égoutter l’excès. Incubation 18 à 24 heures à 35°C.
- Lecture et Interprétation
La lecture est faite sur la gélose CLED (face verte) en comparant la
densité des colonies présentes sur chaque face avec une série de
reproductions étalons correspondant à : 103, 104, 105, 106, 107
bactéries/ml d’urine.
- Avantages et inconvénients
4- Tests rapides
Ces techniques de détection rapide de la bactériurie consistent soit à
mettre en évidence la présence d’enzymes bactériennes, soit à
détecter précocement la croissance bactérienne :
- Inconvénients :
Les bactéries â Gram positif et les Pseudomonas ne possèdent pas
de nitrate-réductase,
On ne peut pas révéler les infections à faible inoculum
(<104 bactéries/ml).
La spécificité varie de 82 à 98% (insuffisant pour de réelles
infections urinaires).
- Tests de confirmation
Indispensable pour différencier Enterococcus sp et Streptococcus
agalactiae (test pyroglutamate) et le groupe PMP (test à indole
par DMCA : diméthylaminocinnamaldéhyde) ; conseillé pour E.coli
- Limites :
- Ne permet pas la croissance d’organismes exigeants (Neisseria,
Haemophilus, Mycoplasma).
- Pas d’identification directe des autres bactéries à Gram négatif.
- Aeromonas hydrophila peut produire des colonies roses similaires à
E.coli (nécessité du test indole).
- Limites :
- Quelques souches de staphylocoques peuvent être inhibées.
- Quelques souches de levures ne se développent pas.
- Queleques souches de Citrobacter spp indologènes dépourvues de
D-galactosidase peuvent pousser comme une E.coli (colonies
roses).
- UTI 4 (OXOID)
- Principe identique avec utilisation des enzymes D-glucosidase,
D-galactosidase et tryptophane désaminase (test
complémentaire).
- CPS ID 2 (bioMérieux)
- Principe identique avec utilisation des enzymes D-glucuronidase,
D-glucuronosidase et tryptophane désaminase.
- Limites :
- Vu la couleur du milieu : gris ce qui rend l’appréciation des couleurs
produites par les colonies différente selon les techniciens
- Les IU à levure ne sont pas détectées
- Préparation du milieu nécessite une rigueur quand à l’utilisation de la
verrerie stérile, autoclavage et du stockage.
Ces milieux permettent une meilleure discrimination des colonies donc une
meilleure sensibilité de détection des urines poly-microbiennes, ceci les rend
plus faciles à utiliser pour les personnes ayant peu d’expérience.
2- Milieux d’isolement
On utilise pour l’isolement des bactéries peu exigeantes, des milieux
sélectifs tels que : gélose lactosée au bromocrésol pourpre (BCP), milieu
de Mac Conkey qui permet d’inhiber les bactéries à Gram+ et le
développement en nappe du Proteus et le milieu Hektoène (milieu
lactosé).
Si on suspecte des bactéries à croissance difficile, d’autres milieux de
culture devront être utilisés. Une gélose au sang frais ou cuit peut
permettre d’isoler des Streptocoques ou des Haemophilus. Un milieu
Loweinstein Jensen pour les Mycobactéries, Une gélose Columbia au sang
pour une recherche exceptionnelle d’anaérobies strictes.
BCP :
Gélose lactosée au bromocrésol pourpre.
Milieux non inhibiteur.
Les germes fermentant le lactose sont reconnus par une coloration
jaune témoin de l’acidification du milieu.
Gélose au sang :
Incubation
L’incubation des milieux se fait à 35°C pendant 18-24 h à l’étuve.
L’atmosphère d’incubation pour les milieux enrichis se fait sous CO2 et en
anaérobiose pour la recherche de germes anaérobies strictes.
La durée d’incubation peut être prolongée pour la recherche de germes à
croissance difficile : anaérobies jusqu’à 72 h voir une semaine et
Mycobactéries une semaine jusqu’à 1 mois.
1- Milieux usuels
- Entérobactéries : Colonies de 1 à 3 mm de diamètre généralement
bombées , lisses et brillantes , opaques et blanchâtres.
2- Milieux spécifiques
- Gélose au sang frais :(GSF)
- Les Staphylocoques et les Streptocoques : peuvent faire
apparaître sur GSF une hémolyse bêta = halo clair autour de la
colonie.
- Gélose chromogène :
Les colonies apparaissent colorées (la couleur dépend du type de
milieux chromogène utilisé).
Exp colonies sur Uriselect 4 (Bio rad)
Principe :
L’oxydase cytochrome assure la fixation de l’oxygène
moléculaire sur le cytochrome réduit.
On met une colonie en présence de la NN-dimethyl-
paraphénylène-diamine réduite et incolore soit en solution, soit
en imprégnant un disque de papier buvard et en le desséchant.
Cette enzyme possède la capacité d’oxyder la NN-dimethyl-
paraphénylène-diamine réduit et incolore en dérivé semi
quinonique rose violacé.
Technique :
- Sur une lame propre et dégraissée (se trouvant à l’intérieur
d’une boîte de Petri vide), déposer dans un angle une goutte
d’eau distillée à l’aide d’une pipette Pasteur.
- A l’aide d’une pince en plastique, saisir un disque pour la
recherche d’oxydase, réhydrater avec de l’eau distillée et le
déposer au milieu de la lame, veiller à ce que le liquide ne
déborde pas du disque.
- Avec une pipette Pasteur boutonnée, prélever un peu de
culture pure de 18h sur milieu d’isolement et déposer la
colonie sur le disque, attendre quelques secondes.
Lecture :
Oxydase + : le disque devient rose foncé puis violet au niveau
du dépôt.
Oxydase - : pas de changement de couleur.
Catalase
Principe :
Cette enzyme catalyse la dégradation du peroxyde d’hydrogène
H2O2 produit toxique du métabolisme aérobie de nombreuses
bactéries, en H2O et ½ O2.
C’est l’action directe de cette enzyme qui est mise en évidence
dans la masse microbienne, cette action est caractérisée par un
dégagement gazeux résultant de la décomposition de l’eau
oxygénée.
Technique :
- A l’aide d’une pipette Pasteur déposer au milieu d’une lame
propre et dégraissée se trouvant à l’intérieur d’une boîte de
Petri vide une goutte d’eau oxygénée.
- Avec une pipette boutonnée, prélever un peu de culture pure
de 18h sur milieu d’isolement et déposer les bactéries dans
l’eau oxygénée.
Lecture :
Catalase + : Bulles de gaz dans l’eau oxygénée.
Catalase - : Pas de dégagement gazeux.
2- Identification classique
A l’aide d’une suspension bactérienne, on ensemence des milieux de
culture de compositions différentes en tubes permettant de mettre en
évidence les principaux caractères biochimiques identifiant les
entérobactéries.
L’incubation se fait à 35°C pendant 18-24h ; la lecture des caractères se
fait selon le tableau 1 (annexe 1).
Suivant l’algorythme des principaux caractères biochimiques révélés les
bactéries seront identifiées (voir annexe).
Chaque milieu utilisé doit au préalable être contrôlé pour éviter les
diagnostics éronés.
Principe :
La galerie API comporte 20 micro tubes contenant des substrats
déshydratés. Les micro tubes sont inoculés avec une suspension
bactérienne qui reconstitue les milieux déshydratés, les réactions
produites pendant la période d’incubation se traduisent par des
virages colorés spontanés lors de l’addition des réactifs .
La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture et
l’identification est obtenue à l’aide du catalogue analytique ou d’un
logiciel d’identification.
Technique :
A l’aide d’une pipette, prélever 1 à 4 colonies morphologiquement
identiques et réaliser une suspension avec le médium (2ml) "solution
saline" ou avec l’eau physiologique.
Remplir les tubes (et non les cupules) des tests avec la suspension
précédente pour éviter la formation de bulles d’air au fond des
tubes. Poser la pointe de la pipette sur le coté de la cupule en
inclinant légèrement la boîte d’incubation vers l’avant.
Remplir les tubes et cupules des tests qui portent un cadre.
EX : GLU
Remplir d’huile de paraffine les cupules des tests soulignés
EX : ADH, urée
Remplir d’un peu d’eau la boîte d’incubation pour éviter la
dessication lors de l’incubation à 35°C pendant 24h.
La lecture :
- Apres incubation, la galerie sera lue et les résultats comparés au
tableau de lecture.
Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées ou
révélées par l’addition des réactifs.
La lecture automatisée :
Il existe un automate pour la lecture des Api System (Biomérieux)
en fonction des caractères révélés par la galerie biochimique, ceci
constitue un gain de temps pour l’interprétation des galeries Api .
Cependant la lecture par cet automate peut poser quelques
problèmes lors de la révélation tardive de quelques caractères
biochimiques.
Interprétation :
L’identification est obtenue à partir du profil numérique. Sur la
fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et les
valeurs 1, 2 ou 4 sont indiquées pour chacun.
En additionnant à l’intérieur de chaque groupe les valeurs
correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres, la
réaction de l’oxydase est affectée de la valeur 4 lorsque elle est
positive.
L’identification est réalisée à l’aide du catalogue analytique
(recherche le profil numérique dans la liste des profils).
EX : 4144532 => E.Coli
5- Identification antigénique
- Sérogroupage des streptocoques
Il s’agit d’un d’un sérotypage de l’antigene O, qui est réalisé grace aux
antisérums commercialisés (Diagnostic Pasteur), 16 sérogroupes sont
individualisés. La technique est celle de l’agglutination sur lame qui
demande quelques minutes pour apparaître. L’intéret du sérotypage
des P.aeruginosa est beaucoup plus épidémiologique.
6- Antibiogramme
Un antibiogramme est réalisé par méthode de diffusion en disque selon les
recommandations du CLSI pour chaque germe isolé (cf. Fasicule de
standardisation de l’antibiogramme en médecine humaine à l’echelle
nationale 5ème Edition 2008.
Interprétation de l’ECBU
KASS définit un seuil ≥ 105 UFC/ml comme étant significatif, alors que dans
plusieurs situations ce taux est revu à la baisse.
- Uropathie :
Reflux vésiculo-urétéral,
Maladie de la jonction pyélo-urétérale
- Sondé
- Paraplégique
- Prostatites aigues
Bactériurie ≥ 104 UFC/ml
Pour le diagnostic d’une prostatite aigue l’ECBU est nécessaire mais
reste insuffisant, car s’il est négatif il faut réaliser l’analyse
fractionnée des urines ainsi que l’analyse des sécertions prostatiques
recueillies au méat urétral, après massage de la glande (à éviter en
cas de prostatite fèbrile risque de bactériemie).
c) Le sondage vésical
La leucocyturie ne constitue pas un facteur prédictif d’infection urinaire
chez le malade sondé, elle n’est corrélée à la bactériurie qu’à des
concentrations microbiennes supérieures à 107 UFC/ml.
La symptomatologie est un critère important pour l’interprétation de
l’ECBU chez le porteur de sonde et permet de faire la différence entre la
colonisation et l’infection urinaire proprement dite. Selon la conférence
de consensus sur les infections urinaires nosocomiales de l’adulte entre la
sociéte francaise des pathologies infectieuses et la sociéte francaise
d’urologie qui a eu lieu à l’Institut Pasteur de Paris en 2002 : 4 situations
peuvent être observées :
Leucocyturie Bactériurie
Sonde Symptômes Interprétation
≥104 /ml UFC/ml
≥105
1 ou 2 espèces Infection débutante
+ ou - + - isolées quelque soit ou sujet
l’espèce neutropénique
bactérienne
≥103
1 ou 2 espèces Infection débutante
+ ou - + - isolées uro- ou sujet
pathogène neutropénique
reconnues (E.coli)
Seuil de détection
+ - + ou - colonisation
≥103
Chez le garçon non circoncis les Proteus retrouvés dans les urines peuvent
être une simple souillure liée à l’adhérence préputiale de la bactérie ou de
phimosis.
¾ Les entérocoques peuvent être de simples contaminants, seule la
présence de signes cliniques de cystite et d’une leucocyturie élevée
témoignent d’une infection vraie.
¾ Les lactobacilles, streptocoques α hémolytiques, Gardnerella
vaginalis, Bifidobactérium sp, bacilles diphtérimorphes sauf
Corynébactérium uréalyticum sont des contaminants qui
appartiennent à la flore urétrale ou génitale de proximité. Leur
isolement associé à la présence de cellules épithéliales urinaires à
l’examen direct des urines signe de façon quasi certaine une
contamination à l’occasion du prélèvement. Seul leur isolement à
partir d’une ponction d’urine utilisant un cathéter sus pubien pourrait
permettre d’évoquer leur rôle pathogène.
Champignons Virus
Candida krusei 1 (1.5%) BK Virus 1 (1.5%)
Chapitre VI : Epidémiologie 64
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
F M F M F M F M F M F M F M F M
Klebsiella spp 3 19 / 7 6 4 / 2 6 2 14 5 13 / 41 2
CHUBM
Proteus spp 2 8 5 12 2 3 6 6 11 4 8 7 10 / 15 4
Pseudomonas spp 6 2 / 4 1 1 / 3 6 / 2 1 / / / /
Staphylocoque spp / / / 2 / / 4 1 / 5 3 9 7 1 27 /
Streptocoque spp / 1 / / / / / / 4 3 2 1 1 / / /
Proteus spp 3 10 1 9 1 5 6 11 3 10 1 4 40 44 20 56
HCA
Staphylocoque spp 0 1 0 1 0 0 1 2 0 2 3 2 33 28 63 24
Streptocoque spp 1 0 2 4 2 1 1 1 2 4 3 0 48 30 49 34
E.coli 10 5 11 14 14 8 22 6 11 3 22 4 26 15 204 45
Klebsiella spp 4 10 1 6 5 5 4 1 0 11 2 2 8 16 37 17
Proteus spp 0 3 1 3 2 4 1 4 0 2 1 0 7 4 4 2
CHUM
Pseudomonas spp 0 6 0 2 / / 1 0 0 4 1 0 2 13 2 8
Staphylocoque spp 0 1 0 1 1 1 / / / / 1 1 1 2 32 3
Streptocoque spp / / 1 0 / / / / / / / / 0 1 18 5
Chapitre VI : Epidémiologie 65
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
70 E.coli (CHU-Mustapha)
66,6 N= 534
60
50
45,6
40
30
20 24,4
16,9
10 3,4
1,9
6,8
5
0
Taux de résistance %
70
60 63,8
50
55,4
40
40,9
36,6 35,8
30
25,5
20
3,9
10
0
Taux de résistance %
Amoxicilline+Ac Clavulanique Cefazoline Cefotaxime
Cotrimoxazole Gentamicine Amikacine
Ofloxacine
Chapitre VI : Epidémiologie 66
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Amikacine 100
Amoxicilline+Ac 90
Clavulanique 91,3
80
Ampicilline 86,6
70
78,5
Cefotaxime
60
Cefoxitime 50
54,1
40 44,4
Gentamicine
30
Ticarcilline
20
Cefazoline 0 4,4 2,3
10
8,5
Cotrimoxazole 0
Taux de résistance %
30
29,7
25
20
15
10 11,1
0 0 0
5
0
Taux de résistance %
Chapitre VI : Epidémiologie 67
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
S.aureus (HCA)
N= 14
14
Amikacine
13 Chloramphenicol
12
Erythromycine
Gentamicine
10 Oxacilline
Penicilline G
Pristinamycine
8
Rifamycine
Tetracycline
6 7
Cotrimoxazole
6 6 6 Vancomycine
4 Ac Fusidique
4 Fosfomycine
Lincomycine
2
2 Kanamycine
0 0 0 0 0 0 0 0
0
Taux de résistance en Nombre
Urine (N=65)
45
40 43,1
35
30
25 27,3
23,8
20
15
14,1
10 12,1
5 4,6 0
3,2
0
Taux de résistance %
Penicilline G Oxacilline Gentamicine Kanamycine
Erythromycine Lincomycine Tetracycline Vancomycine
Chapitre VI : Epidémiologie 68
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
5
5
4,5
3,5
2,5
2
2
1,5
1
0 0 0 0 0 0 0
0,5
0
Taux de résistance en Nombre
Chapitre VI : Epidémiologie 69
ANNEXE
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Anse
0 .1 m l 0 .1 m l
H K ,B C P ,M c C o n k e y 9 .9 m l GN
GSF U rin e E a u p h y s io lo g iq u e
Anse calibrée à 10 ul
Annexe 71
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
CGP
Catalase
r s
Staphylocoques Streptocoques
Culture sur GN
Coagulase
r s r s
S.aureus SCN
Enterococcus sp Sérogroupage
Annexe 72
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Tests Résultats
Négatif Positif
Urée
Orange Rose
Kovacs / immédiat
Indole Pas d’anneau Anneau rouge / rose
TDA / immédiat
TDA Marron Brun rouge
Vp1+vp2 / 10minute
VP Incolore Rose / rouge
RM / IMMEDIAT
RM Incolore Rouge
Annexe 73
Références
Bibliographiques
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
11- GOLDSTEIN FW. Place actuelle des tests rapides de détection de l’infection
urinaire. Médecine Maladie infectieuse, 1991 ; 21 : 83-88.
12- GRAF J-D et Coll. Infections urinaires de l’adulte : Quels examens préscrire et
comment les interpréter. Médecine et hygiène,1999 ; 57 : 423-425.
14- HERVE J et Coll. Infections urinaires du sujet âgé. La presse médicale, 2000 ;
29 ; N°39 : 2137-2141.
Références Bibliographiques 75
IPA – Techniques Microbiologiques Examen Cytobactériologique des Urines Ed. 2009
Références Bibliographiques 76