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KOUADIO GERARD BEDIE

MICROENCAPSULATION DE COMPOSÉS
NUTRACEUTIQUES DANS DES COMPLEXES
PROTÉINES-POLYSACCHARIDES

Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en Science et Technologie des Aliments
pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Département des Sciences des aliments et de nutrition


FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC

FÉVRIER 2008

© Gérard Kouadio Bédié, 2008


ii

RÉSUMÉ COURT

La caractérisation des complexes insolubles d'isolât de protéine de lactosérum/pectine

faiblement méthylée (IPL/PFM), formés aux ratios protéines:polysaccharide (P:Ps) de 2:1,

1:1 et 1:2, et à pH 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 par acidification avant ou après mélange des solutions

d'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement méthylée (PFM), a

démontré un rendement maximal en complexes à pH 3.5-3.0 avec le ratio 2:1. La taille des

complexes formés par acidification après mélange des solutions restait petite et constante

aux différents pH. La détermination du rendement en complexes après l'incorporation

d'ingrédients hydrosolubles à différentes concentrations suggère une saturation des

complexes par les hautes concentrations de thiamine, exprimée par une diminution du

rendement en complexes à pH 3.5. L'efficacité d'encapsulation la plus élevée a été

observée avec le ratio P:Ps de 2:1. L'effet protecteur des anthocyanes par les complexes a

été étudié dans du jus de pomme pasteurisé et entreposé pendant 14 jours à 11 000

lux/40°C. La pasteurisation a provoqué une diffusion d'une proportion importante des

anthocyanes encapsulés vers l'extérieur des complexes mais la quantité d'anthocyanes

résiduelle dans les complexes est demeurée constante tout au long de l'entreposage. Les

résultats de cette recherche démontrent que le complexe IPL/LMP constitue une approche

prometteuse pour l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides.


iii

RÉSUMÉ LONG

Des complexes insolubles d'IPL/PFM ont été formés à pH 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 par le

mélange de solutions d'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement

méthylée (PFM). L'acidification a été réalisée soit avant, ou après le mélange de solutions

avec des ratios protéines:polysaccharide (P:Ps) de 2:1, 1:1 et 1:2 (0.4% de polymères

totaux). La caractérisation des complexes a démontré, qu'au ratio 2:1, la turbidité et le

rendement en complexes étaient optimaux à un pH aux environs de 3.0. De plus, les

complexes obtenus par acidification après mélange des solutions avaient une taille plus

petite et constante. L'évaluation de Pencapsulation d'ingrédients hydrosolubles par les

complexes IPL/PFM en fonction de leur concentration a été effectuée aux pH 4.0, 3.5, 3.0

et 2.5 et au ratio P:Ps de 2:1. Les concentrations utilisées étaient de 0, 0.002, 0.01, 0.05 et

0.1% pour la thiamine et de 0.1, 0.2 et 0.3% pour les anthocyanes. L'encapsulation

d'anthocyanes en fonction du ratio P:Ps à pH 3.5 a été aussi évaluée avec l'incorporation de

0.025% p/p d'anthocyanes dans les complexes aux ratios de 2:1 et 1:1. Le contenu en

thiamine des complexes ainsi que l'efficacité d'encapsulation (4-7%) étaient optimaux à pH

3.5. Les hautes concentrations en thiamine ont entraîné une diminution du rendement en

complexes à pH 3.5 mais aussi une augmentation du contenu en thiamine dans les

complexes. L'efficacité d'encapsulation des anthocyanes était plus élevée avec le ratio P:Ps

2:1 comparativement au ratio 1:1. La protection d'ingrédients hydrosolubles par les

complexes IPL/PFM a été évaluée dans du jus de pomme (pH 3.5) contenant des

anthocyanes encapsulés. Le jus a été pasteurisé à 90°C/12 s et entreposé à 11 000 lux/40°C

pendant 14 jours. La chaleur a entraîné la diffusion d'une proportion importante des


iv

anthocyanes encapsulés vers l'extérieur des complexes mais la quantité d'anthocyanes

résiduelle dans les complexes est demeurée constante tout au long de l'entreposage.

L'étude de la stabilité des complexes IPL/PFM, contenant de la thiamine, dans un système

digestif modèle a démontré que les complexes ont libéré totalement leur contenu en

thiamine dans le compartiment stomacal. Cet effet serait du au pH très acide du

compartiment qui aurait dissocié le complexe IPL/PFM. Les résultats de cette recherche

démontrent que le complexe IPL/PFM constitue une approche prometteuse pour

l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides.


V

ABSTRACT
Insoluble WPI-LMP complexes hâve been formed at pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5 by mixing

whey protein isolate (WPI) and low methoxyl pectin (LMP) solutions. The acidification

was performed before or after the mixing of the solutions at proteimpolysaccharide (P:Ps)

ratios of 2:1, 1:1, and 1:2 (0.4% total polymer). Characterization of the complexes

demonstrated that at P:Ps ratio 2:1, the turbidity and the sedimental complex yield were

optimal around pH 3.0. In addition, complexes obtained by post-blending acidification had

small and constant particle sizes. Evaluation of water soluble ingrédients encapsulation by

WPI-LMP complexes as a function of ingrédients concentration was achieved at pH 4.0,

3.5, 3.0, and 2.5 and at P:Ps ratio 2:1. Ingrédients concentrations used were 0, 0.002, 0.01,

0.05 and 0.1% for thiamine and 0.1, 0.2 et 0.3% for anthocyanins. Anthocyanins

entrapment as a function of the ratio at pH 3.5 has also been achieved with the

incorporation of 0.025% w/w anthocyanins in the complexes at P:Ps ratios of 1:1 and 2:1.

Thiamine content of the complexes as well as the entrapment efficiency (4-7%) was

optimal at pH 3.5. High concentrations of thiamine induced a decrease of the sedimentable-

complexes yield at pH 3.5 but increased thiamine content of the complexes. P:Ps ratio 2:1

provided higher entrapment efficiency of anthocyanins than ratio 1:1. The protecting effect

of the WPI-LMP complexes was evaluated in apple juice (pH 3.5) containing encapsulated

anthocyanins. The juice was pasteurized at 90°C/12 s and stored at 11 000 lux/40°C for 14

days. Although the heat induced the diffusion of a large portion of anthocyanins out of the

complexes, the residual amount of anthocyanins in the complexes remained constant during

storage.
VI

The study of the stability of WPI-LMP complexes, containing thiamine, in a

gastrointestinal System demonstrated that complexes delivered the whole thiamine content

in the stomach compartment. This effect was probably due to the very acidic pH of the

compartment, which may hâve dissociated the complexes. The results of this project

demonstrated that WPI-LMP complexes represent a promising tool for water soluble

ingrédients encapsulation in acidic foods.


vii

AVANT-PROPOS

Les travaux de cette thèse ont été réalisés dans le cadre d'un projet de recherche financé par

le Conseil de la recherche en sciences naturelles et génie du Canada (CRSNG) et les

Industries Lassonde Inc. Cette thèse comporte 8 chapitres dont trois sont écrits sous forme

d'articles scientifiques, dont je suis l'auteur principal, et qui sont ou seront publiés dans des

revues scientifiques.

Le premier chapitre intitulé «Introduction» décrit très brièvement les connaissances

scientifiques actuelles sur les interactions protéine-polysaccharides et l'encapsulation

d'ingrédients par les complexes issus de ces interactions, pour aboutir à l'objectif principal

de cette thèse.

Le deuxième chapitre intitulé « Revue de littérature» fait une revue exhaustive des

méthodes de microencapsulation, les interactions protéine-polysaccharide, les facteurs

influençant la formation de complexes et le système isolât de protéines de lactosérum -

pectine faiblement méthylée.

Le troisième chapitre intitulé «Problématique d'ensemble, hypothèse, but, objectifs»

présente la problématique générale, l'hypothèse, le but et les objectifs de la thèse.

Le quatrième chapitre est intitulé «Formation of native whey protein isolate-low methoxyl

pectin complexes as a matrix for hydro-soluble food ingrédient entrapment in acidic foods»
viii

est sous presse dans le journal «Food Hydrocolloids». Il porte sur l'optimisation des

paramètres permettant la formation de complexe isolât de protéine de lactosérum/pectine

faiblement méthylée et l'encapsulation de thiamine comme ingrédient hydrosoluble

modèle. J'ai contribué à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des

manipulations au laboratoire du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la

rédaction de l'article. Dr. Sylvie Turgeon et Dr. Joseph Makhlouf ont apporté leurs soutiens

scientifiques lors des expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.

Le cinquième chapitre intitulé «Evaluation of the ability of whey protein isolate-low

methoxyl pectin complexes to entrap water-soluble ingrédients» porte sur l'évaluation de la

capacité de microencapsulation des complexes WPI-LMP formés avec les paramètres

optimisés et en fonction de la concentration des ingrédients modèles ajoutés. J'ai contribué

à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des manipulations au laboratoire

du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la rédaction de l'article. Dr.

Sylvie Turgeon et Dr. Joseph Makhlouf ont apporté leurs soutiens scientifiques lors des

expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.

Le sixième chapitre intitulé «Study of the protective effect of whey protein isolate-low

methoxyl pectin complexes on anthocyanins during storage and the release of encapsulated

thiamine in a dynamic in vitro gastrointestinal model» porte sur l'évaluation de l'effet de

protection des ingrédients hydrosolubles encapsulée dans des conditions d'entreposage

ainsi que sur la stabilité des complexes dans un système gastro-intestinal modèle. J'ai

contribué à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des manipulations au


ix

laboratoire du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la rédaction de

l'article. Dr. Sylvie Turgeon et Dr. Joseph Makhlouf ont apporté leurs soutiens

scientifiques lors des expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.

Finalement, la «Conclusion générale» présentée au chapitre 7 conclut le travail par une

discussion générale de l'ensemble des résultats présentés tout au long du document et par la

présentation des perspectives de recherche.

Le chapitre 8, intitulé «Bibliographie» à la fin de cette thèse, referme l'ensemble des

références citées dans ce document.


X

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier tout d'abord ma directrice de recherche, Dr. Sylvie Turgeon pour ses

précieux conseils et son encouragement continu qui m'ont permis de réaliser ce projet.

Je remercie aussi Dr. Joseph Makhlouf pour ses conseils pertinents et ses analyses critiques

qui m'ont souvent aidé à revenir sur le bon axe dans des situations d'écart de l'objectif

principal du projet.

Mes remerciements vont aussi au Conseil de la Recherche en Sciences Naturelles et Génie

du Canada (CRSNG) et aux Industries Lassonde Inc. Pour le financement de ce projet de

recherche.

Mes vifs remerciements vont à mes parents qui n'ont cessé de me soutenir matériellement

et spirituellement même si l'écart des continents fait que je ne peux les voir fréquemment.

Je tiens aussi à remercie ma stagiaire (Nafissatou Ndiaye) pour son aide dans les

manipulations relatives au chapitre 5.

J'aimerais remercier le personnel technique et professionnel des laboratoires du

département des sciences de l'alimentation et de nutrition de l'Université Laval pour leur

aide dans mon apprentissage de l'utilisation de l'équipement du département ainsi que


xi

toutes les personnes qui de loin ou de prêt m'ont aidé, sciemment ou inconsciemment, à

relever mon moral dans les situations difficiles.

Finalement, je remercie tous les étudiants qui m'ont tenu compagnie pendant les heures

tardives de manipulation au laboratoire, spécialement Kyung-Tae KIM.


xii

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ COURT ii

RÉSUMÉ LONG iii

ABSTRACT v

AVANT-PROPOS vii

REMERCIEMENTS x

TABLE DES MATIÈRES xii

LISTE DES TABLEAUX xvii

LISTE DES FIGURES xviii

CHAPITRE 1: Introduction 1

CHAPITRE 2: Revue de littérature 4

2.1 Les techniques de microencapsulation 4


2.1.1. Microencapsulation par séchage par atomisation 5
2.1.1.1. Avantages 6
2.1.1.2. Inconvénients 6
2.1.2. Les émulsions multiples 7
2.1.3. Microencapsulation par suspension 8
2.1.4. Microencapsulation par extrusion 9
2.1.5. Microencapsulation par refroidissement (spray-chilling or spray-cooling) 10
2.1.6. Microencapsulation par complexe d'inclusion 10
2.1.7. Microencapsulation par coacervation 11
2.1.7.1. Complexe de coacervation 12
2.1.7.2. Simple coacervation 13
2.2. Les interactions protéines-polysaccharides 14
2.2.1. Incompatibilité thermodynamique 16
2.2.2. Compatibilité thermodynamique 17
2.2.2.1. Co-solubilité 17
2.2.2.2. Séparation de phases associative 18
2.2.3. Facteurs influençant la formation de complexes 19
2.2.3.1. LepH 20
2.2.3.2. La force ionique 23
xiii

2.2.3.3. Charge des biopolymères 25


2.2.3.4. La concentration totale en biopolymères 26
2.2.3.5. Le ratio protéine/polysaccharides 27
2.2.3.6. Température 28
2.2.3.7. Pression 29
2.2.3.8. Agitation et temps d'agitation 30
2.3. Biopolymères à l'étude 31
2.3.1. Les protéines du lactosérum 31
2.3.1.1. La pMactoglobuline 31
2.3.1.1.1. Facteurs influençant la structure 33
2.3.1.1.1.1. Le pH et les sels 33

2.3.1.1.1.2. La température 34
2.3.1.2. L'a-lactalbumine 35
2.3.1.2.1. Influence du pH sur la structure 36
2.3.1.3. La Sérum Albumine Bovine 37
2.3.2. La pectine 37
2.3.2.1. Caractéristiques structurales 37
2.3.2.2. Facteurs influençant la structure 43
2.3.2.2.1. LepH '. 43
2.3.2.2.2. Les minéraux 43
2.4. Le système isolât de protéines de lactosérum - pectine faiblement méthylée 44

CHAPITRE 3: Problématique d'ensemble, hypothèse, but, objectifs 47

3.1. Problématique d'ensemble .47

3.2. Hypothèse 48

3.3. But 49

3.4. Objectifs spécifiques 49

CHAPITRE 4: Formation of native whey protein isolate-low methoxyl pectin complexes as


a matrix for hydro-soluble food ingrédient entrapment in acidic foods 50

4.1. RÉSUMÉ 51

4.2. ABSTRACT 52

4.3. INTRODUCTION 53

4.4. MATERIALS AND METHODS 56


xiv

4.4.1. Materials 56
4.4.2. Reagents 56
4.4.3. Préparation of solutions 56
4.4.4. Complex formation and thiamine entrapment 57
4.4.5. Turbidity measurement 58
4.4.6. Zêta potential measurement 59
4.4.7. Complex particle size 59
4.4.8. Sedimentable-complexes yield 59
4.4.9. Microscopic observation 60
4.4.10. Détermination of thiamine 60
4.4.11. Statistical analysis 61
4.5. RESULTS 62
4.5.1. Turbidity measurement 62
4.5.2. Small angle static light scattering 62
4.5.3. Zêta potential 63
4.5.4. Sedimentable-complexes yield 63
4.5.5. Microscopic observation 63
4.5.6. Thiamine entrapment 64
4.6. DISCUSSION 65
4.6.1. EffectofpH 65
4.6.2. Effect of protein:pectin ratio 66
4.6.3. Effect of acidification mode 67
4.6.4. Ability of the complexes to entrap thiamine 68
4.7. CONCLUSION 70
CHAPITRE 5: Evaluation of the ability of whey protein isolate-low methoxyl pectin
complexes to entrap water-soluble ingrédients 79

5.1. RÉSUMÉ 80

5.2. ABSTRACT 81

5.3. INTRODUCTION 82

5.4. MATERIALS AND METHODS 85


5.4.1. Materials ... 85
5.4.2. Reagents 85
5.4.3. Préparation of stock solutions 85
5.4.4. Thiamine entrapment 86
5.4.5. Détermination of thiamine 87
5.4.6. Anthocyanins entrapment 87
5.4.7. Détermination of total monomeric anthocyanins 88
5.4.8. Statistical analysis 89
XV

5.5. RESULTS AND DISCUSSION 90

5.5.1. Effect of thiamine concentration on the entrapment 90

5.5.1.1. Sedimentable-complexes yield 90

5.5.1.2. Thiamine entrapment 91


5.5.2. Effect of protein/polysaccharide ratio and anthocyanins concentration on the
entrapment 93
5.5.2.1. Protein:polysaccharide ratio 93
5.5.2.2. Anthocyanins entrapment 94
5.6. CONCLUSION 95

CHAPITRE 6: Study of the protective effect of whey protein isolate-low methoxyl pectin
complexes on anthocyanins during storage 103

6.1. RÉSUMÉ 104

6.2. ABSTRACT 104

6.3. INTRODUCTION 105

6.4. MATERIALS AND METHODS 108

6.4.1. Materials 108

6.4.2. Reagents 108

6.4.3. Préparation of solutions 109

6.4.4. Anthocyanins entrapment by WPI-LMP complexes 109

6.4.5. Heat treatment and storage 110

6.4.6. Extraction of monomeric anthocyanins 110

6.4.7. Détermination of monomeric anthocyanins 111


6.4.8. Kinetic of dégradation of anthocyanins 111
6.4.9. Statistical analysis 111

6.5. RESULTS AND DISCUSSION 112

6.5.1. Anthocyanins protection by WPI-LMP complexes during storage 112

6.5.1.1. Heat treatment 112


xvi

6.5.1.2. Storage 114


6.6. CONCLUSION 117
CHAPITRE 7: Conclusion générale 123
ANNEXES 163
ANNEXE A : Étude de la stabilité des complexes IPL/PFM dans un système gastro-
intestinal modèle 164
ANNEXE B : Détails de l'équation de la cinétique de dégradation des anthocyanes (relatif
au chapitre 6) 173
ANNEXE C : Résultats des analyses de variance 175
xvii

LISTE DES TABLEAUX

Table 4. 1. Least square means of the particle size of the control solutions 71

Table 6. 1. Effect of heat treatment on free and complexed anthocyanins' concentration in


clarifiedapplejuice 118
Table 6. 2. Kinetic parameters for anthocyanins dégradation during storage 118
xviii

LISTE DES FIGURES

Figure 2.1. Comportement des mélanges protéine/polysaccharide 16

Figure 2.3. Structure tridimensionnelle d'un monomère de la p-lactoglobuline A 33

Figure 2. 4. Structure tridimensionnelle de Pa-albumine humain 36

Figure 2.5. Structure de la pectine 41

Figure 2.6. La structure de l'homogalaturonane 42

Figure 4.1. Turbidity of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1, 1:1,
and 1:2 72

Figure 4.2. Size of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1, 1:1, and
1:2 73

Figure 4.3. Zêta potential of 0.13% LMP and WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer
and ratios of 2:1, 1:1, and 1:2 74

Figure 4.4. Sedimentable-complexes yieldof WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer


and ratios of 2:1,1:1, and 1:2 75

Figure 4.5. Phase contrast micrographs of WPI-LMP complexes dispersion obtained by


post-blending acidification and by pre-blending acidification, with a protein:pectin ratio of
2:1 76

Figure 4.6. Thiamine content of the complexes of WPI-LMP complexes obtained at ratio
2:1 by post-blending acidification and pre-blending acidification 77

Figure 4.7. Entrapment efficiency of WPI-LMP complexes at ratio 2:1 obtained by post-
blending acidification and pre-blending acidification 78

Figure 5.1. Sedimentable-complexes yield of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels


ofadded thiamine as a functionofpH 96

Figure 5.2. Thiamine content of the complexes of WPI/LMP complexes mixtures with 4
levels ofadded thiamine as a functionofpH 97
xix

Figure 5.3. Entrapment efficiency of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added
thiamine as a function of pH 98
Figure 5.4. Entrapment efficiency of WPI/LMP complexes at P:Ps ratios of 1:1 and 2:1 and
at pH 3.5, with 0.4% total polymer 99
Figure 5.5. Entrapment efficiency of WPI/LMP complexes at ratios 2:1 and at pH 3.5, with
3 levels of incorporated anthocyanins 100
Figure 5. 6. Structure of anthocyanins 101
Figure 5. 7. Structure of thiamine hydrochloride 102

Figure 6.1. Mechanism of structural transformation of anthocyanins in aqueous


média 119
Figure 6.2. Total anthocyanins content of WPI-LMP complexes during storage at pH 3.5,
with 0.4% of total polymer, and at a P:Ps ratio of 2:1 120
Figure 6.3. Percentage of anthocyanins during storage at pH 3.5, with 0.4% of total
polymer, and at a P:Ps ratio of 2:1 121
Figure 6.4. Dégradation of anthocyanins added to clarified apple juice during
storage 122
1

CHAPITRE 1: Introduction
Plusieurs études ont démontré que les interactions électrostatiques entre des polymères de

charges opposées pouvaient conduire à la formation de complexes (Biesheuvel & Stuart,

2004; Burgess, 1990; Girard et al, 2002; Kaibara et al, 2000; Mattison et al, 1995;

Schmitt et al, 1999). Les paramètres polymériques (densité de charge, masse molaire,

concentration, nature chimique et ratio) guidant la formation de ces complexes ont été

largement décrits dans la littérature (De Vries, 2004; Weinbreck et al, 2003; Wen &

Dubin, 1997). D'autres paramètres externes (température, effets de cisaillement et pression)

ainsi que les conditions de formation des complexes (pH, force ionique, type d'ions) ont

aussi été investigués (Galazka et al, 1997; Galazka et al, 1999a; Galazka et al, 1999b;

Schmitt et al, 1998 ; Weinbreck et al, 2003; Wen & Dubin, 1997). Ainsi, des limites de pH

indiquant la formation de complexes solubles et insolubles ont été déterminées (Weinbreck

et al, 2003).

Les complexes issus des interactions protéine-polysaccharide peuvent servir de matrice

d'encapsulation dans le processus d'enrichissement des aliments pauvres en nutriments

(Abrams & Atkinson, 2003; Dunn, 2003; Sinclair, 1979). La microencapsulation constitue

un moyen efficace de protection des nutriments contre les dommages environnementaux

(lumière, présence d'oxygène, interactions entre nutriments et particules alimentaires) tout

en leur assurant une bonne stabilité et une libération contrôlée dans les systèmes ciblés

(Versic, 1988). Les méthodes chimiques de microencapsulation, représentées par la

séparation de phases associative et les émulsions (de Kruif et al, 2004; Dziezak, 1988;
2

Versic, 1988; Yuliani et al, 2004), sont indiquées pour le domaine alimentaire, vu

l'utilisation de solvant comestible (eau). La plupart des méthodes de microencapsulation

par séparation de phases associative reposent sur la formation de complexes protéine-

polysaccharide (Chilvers et al, 1988; Tirkkonen et al, 1994; Tiyaboonchai et al, 2001).

L'utilisation des complexes protéine-polysaccharide serait très importante pour la

protection des ingrédients encapsulés notamment dans les aliments où les conditions de

préparation et d'entreposage (pH, traitements thermiques, exposition à la lumière etc..)

peuvent altérer rapidement les nutriments. La stabilité des nutriments dans les aliments (à

l'état non encapsulé) exposés à diverses conditions de transformation et d'entreposage a été

largement étudiée dans la littérature (Kirca, et al, 2003, 2006, 2007; Morais et al, 2002;

Turker et al. 2004). De plus, les études effectuées sur l'encapsulation ces dernières années

ont porté surtout sur les ingrédients liposolubles (Djordjevic, et al, 2004a & 2004b,

Jimenez et al, 2004, Jouzel et al, 2003, Kondo et al, 1996, Lamprecht et al, 2001, Liu et

al, 2001, Soottitantawat et al, 2005a & 2005b.); peu d'études se sont intéressées à la

protection des nutriments alimentaires hydrosolubles par l'encapsulation et à la stabilité des

systèmes d'encapsulation et la libération d'ingrédients encapsulés dans le système digestif

(Picot & Lacroix, 2004; Rao et al, 1995; Kim et al, 2006; Verwei et al, 2003). Malgré les

connaissances actuelles sur les paramètres de formation de complexes protéine-

polysaccharide, l'utilisation de la microencapsulation comme moyen d'enrichissement des

aliments et l'évaluation de la stabilité des systèmes matrice et des ingrédients encapsulés

ont été peu étudiées.

L'objectif général de cette recherche était de développer une matrice de complexes d'isolat

de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement méthylée (PFM) pour la


3

microencapsulation d'ingrédients nutraceutiques hydrosolubles dans un système

alimentaire de type acide et d'évaluer la protection de ces ingrédients encapsulés suite à un

traitement thermique et durant l'entreposage. La recherche visait aussi à étudier la stabilité

des complexes, contenant des ingrédients hydrosolubles, dans un système gastro-intestinal

modèle.
4

CHAPITRE 2: Revue de littérature

2.1 Les techniques de microencapsulation

L'encapsulation peut être définie comme le processus de formation de couche continue (i.e.

polymères, protéine-polysaccharide complexes) autour d'ingrédients à encapsuler qui

peuvent être des particules solides, des gouttelettes de liquide, du gaz ou des cellules

microbiennes (King, 1995). La taille des particules encapsulées peut être classée macro (>

5000u), micro (0.2 à 5000u) et nano (< 0.2u) (Jackson and Lee, 1991; King, 1995;

Ribeiro et ai, 1997).

Les techniques d'encapsulation sont des procédés qui existent depuis des décennies. En

effet, la microencapsulation a été utilisée pour la première fois en 1954 dans l'industrie du

papier sans carbone qui atteignait des productions de plus de 500 000 tonnes par année

(Dziezak, 1988). L'auteur rapporte aussi l'utilisation de cette méthode dans divers

domaines tels que la pharmacie et le domaine agro-alimentataire. Dans le domaine

alimentaire, les méthodes d'encapsulation sont diverses. Elles peuvent être divisées en

méthodes physiques incluant le séchage par atomisation (spray-drying), le séchage par

suspension (air suspension), l'extrusion, l'encapsulation par jet refroidissant (spray-chilling

ou spray-cooling), l'encapsulation par inclusion, et les méthodes chimiques qui incluent la

formation de complexes par séparation de phases associative (Viersic, 1988; Dziezak,

1988; Todd, 1970). Les émulsions peuvent être utilisées en combinaison avec certaines de

ces méthodes d'encapsulation (Liu et al, 2001). Selon Balassa & Fanger, (1971), les
5

avantages de l'utilisation de la microencapsulation pour l'industrie agroalimentaire sont

multiples : 1) un moyen efficace de confiner les ingrédients alimentaires sensibles à

l'intérieur d'un aliment à titre de protection contre les autres composants de l'aliment

pendant l'entreposage, 2) un moyen d'enrichir les aliments en nutriments perdus au cours

de la fabrication, 3) une méthode d'utilisation de nouveaux ingrédients ou d'ingrédients

sensibles pour la préparation d'aliments riches en ces composés, 4) un mécanisme de

libération inhabituelle et/ou rapide d'ingrédients dans les aliments, 5) une valeur ajoutée

ayant un effet attractif et favorable à la commercialisation des aliments. Bien que plusieurs

techniques soient utilisées en microencapsulation, nous ne passerons en revue que quelques

unes qui nous paraissent de plus grande importance.

2.1.1. Microencapsulation par séchage par atomisation (Spray-drying)

La technique d'encapsulation par atomisation est la technique la plus utilisée dans

l'industrie alimentaire (Dziezak, 1988; Risch, 1995) grâce à ses nombreux avantages. Cette

technique a été utilisée pour l'encapsulation des flaveurs pour la première fois dans les

années trente avec de la gomme d'acacia comme matrice protectrice (Dziezak, 1988). Cette

technique comporte d'abord une étape de préparation de la dispersion d'ingrédients actifs

dans une solution de biopolymères protecteurs qui peuvent être de la maltodextrine, de

l'amidon modifié, une gomme, ou une combinaison de biopolymères (Risch, 1995). Ensuite

la dispersion est homogénéisée pour réduire la taille des particules, puis séchée par

atomisation dans une chambre à air chaud soufflé (Gibbs et al, 1999). La

microencapsulation de flaveurs par séchage par atomisation (Liu et al, 2001) a été
6

effectuée avec du d-limonène et du butyrate d'éthyle comme ingrédients actifs et de la

cyclodextnne comme substance encapsulante dans une émulsion stabilisée avec de la

gomme arabique ou des polysaccharides de soja. Les résultats ont démontré une

encapsulation de près de 100% de d-limonène quelque soit la concentration d'encapsulant

alors que le pourcentage d'encapsulation d'éthyl butyrate variait selon la concentration

d'encapsulant et du type d'encapsulant.

2.1.1.1. Avantages

Les avantages de la microencapsulation par atomisation peuvent être regroupés ainsi:

- Une plus grande accessibilité de l'équipement incluant le matériel encapsulant (amidon et

amidon modifié, dextrine, protéines, polysaccharides, sucres, esters de cellulose);

- Un faible coût d'utilisation;

- Une production de capsules de haut rendement avec des ingrédients actifs moins volatils

et thermorésistants;

- Une facilité de solubilisation des capsules formées grâce à leur faible taille (<100u) et

large surface de contact;

-Une stabilité des substances encapsulantes pendant le séchage.

2.1.1.2. Inconvénients

Quant aux inconvénients, ils peuvent inclure :

- Une limitation du choix de substances encapsulantes caractérisées par une viscosité basse

à concentration relativement élevée;


7

- La pulvérisation de la substance encapsulante pourrait entraîner une non-couverture de la

totalité des ingrédients actifs;

- La dégradation et l'oxydation des ingrédients actifs par la chaleur, pendant et juste après

séchage;

- La formation de capsules creuses avec une couche protectrice mince, qui augmente la

surface et favorise l'oxydation par rapport à une capsule pleine.

2.1.2. Les émulsions multiples

Une émulsion, dans le domaine alimentaire, consiste en des gouttelettes de gras ou d'huile

de diamètre variant de 0.5-2.5um suspendues dans un milieu aqueux (Dalgleish, 1997).

Cependant, l'interface entre les gouttelettes d'huile et le milieu aqueux doit être occupé par

des molécules de surfactant pour prévenir une coalescence ou une agrégation immédiate.

Les surfactants sont constitués de petites molécules amphiphiles (polysorbates,

monoglycérols, diacylglycérols et lécithines) et de grosses molécules tensioactives

(protéines).

Les émulsions multiples sont un système complexe d'émulsion dans une émulsion dans

lequel les gouttelettes de la phase dispersée contiennent elles-mêmes des petites gouttelettes

dispersées (Garti, 1997) qui peuvent renfermer un ingrédient à encapsuler. Les deux

principaux types d'émulsions multiples sont les doubles émulsions eau-dans-huile-dans-eau

(E-H-E) et huile-dans-eau-dans-huile (H-E-H). Une telle émulsion est un système

thermodynamique instable qui nécessite un mélange de surfactants hydrophobe et

hydrophile et un jeu d'homogénéisation pour le rendre stable. L'acétaminophène, un


8

ingrédient hydrosoluble a été encapsulé avec succès par double émulsion E-H-E (Lai &

Tsiang, 2005). Dans une double émulsion H-E-H, un composé hydrophobe, la fluméthrine,

a été encapsulée avec une efficacité d'encapsulation de plus de 95% en utilisant un mélange

de protéines de lactosérum et de gommes (xanthane, fenugrec) comme agent stabilisateur

(Benichou et al, 2007). La glycine, les immunoglobulines IgG du lait et des protéines du

colostrum ont aussi été encapsulées avec succès dans une émulsion double E-H-E avec un

pourcentage d'encapsulation allant jusqu'à 59, 21 et 50%, respectivement (Chen et al,

1999).

2.1.3. Microencapsulation par suspension (air suspension coating or fluidized bed)

C'est une technique qui peut être utilisée pour encapsuler des particules de tailles très

variées (50 à 5000 um). Les particules suspendues dans un courant d'air ascendant chaud

ou froid dans une enceinte, sont pulvérisées avec une solution contenant des agents

encapsulants (des dextrines, des dérivés de cellulose, de protéine ou d'amidon, et des

lipides). L'enrobage des particules se solidifie au contact de l'air froid ou il sèche par

évaporation au contact de l'air chaud. Le mouvement aléatoire des particules assure un

recouvrement satisfaisant des particules (Dziezak, 1988). C'est une méthode qui permet de

contrôler la température et l'humidité durant l'encapsulation. Cependant, un mauvais

contrôle de ces paramètres peut entraîner l'enrobage partiel des particules (DeZarn, 1995).

Parmi les inconvénients de cette méthode on peut citer l'agglomération des particules

encapsulées et le temps mis pour l'encapsulation pouvant atteindre plusieurs heures (Jono

et al, 2000). Ce type d'encapsulation trouve son application dans plusieurs domaines dont
9

l'industrie des suppléments nutritionnels (vitamine C et B, sulfate ferreux, ascorbate de

sodium) où l'usage de gras comme agent enrobant empêche les réactions entre l'acide

ascorbique par exemple et les composés environnants pouvant contenir du fer. La

microencapsulation par suspension est aussi utilisée en boulangerie pour la substitution de

certains additifs impopulaires tel que le borate de potassium par de la vitamine C

encapsulée. Un autre domaine d'utilisation de cette méthode est l'industrie de la viande où

des acides organiques encapsulés, tels l'acide lactique, permettent le développement de

saveur et de couleur spécifiques aux produits carnés tels que le pepperoni, le salami et les

saucisses (DeZarn, 1995).

2.1.4. Microencapsulation par extrusion

Cette méthode consiste en la dispersion du matériel actif dans une matrice liquide

pulvérisée, par l'intermédiaire d'une enceinte pressurisée, dans un système de collecte des

microcapsules (Dziezak, 1988 ; Schlameus, 1995). Ce système peut être de différents types

dépendamment du corps protecteur utilisé. Par exemple, l'utilisation d'alginate de sodium

seul ou en combinaison avec d'autres polymères va entraîner une collecte des capsules dans

un bain froid de sel de calcium. Cette solution insolubilise et durcit le corps protecteur de la

matrice en encapsulant les ingrédients actifs à l'intérieur des gouttelettes. Les filaments

formés (grâce à la pression) sont brisés et séchés. C'est une méthode qui produit des

particules de grandes tailles qui peuvent servir dans les produits secs tels que les mélanges

pour boisson, les mélanges pour gâteaux, les mélanges pour dessert à base de gélatine et les

mélanges pour cocktail (Dziezak, 1988). L'utilisation de gel (gélatine ou carraghénane)


10

comme agents encapsulants permet de récupérer les capsules dans de la poudre d'amidon

pour éviter l'agglutination de celles-ci.

2.1.5. Microencapsulation par refroidissement (spray-chilling or spray-cooling)

Ce type d'encapsulation est similaire à l'encapsulation par séchage par atomisation à

l'exception de l'absence d'évaporation. En effet, les ingrédients à encapsuler (généralement

solides) sont mélangés dans une phase liquide qui est atomisée dans un environnement à

température contrôlée, soit inférieure ou supérieure au point de fusion du corps enveloppant

(huile végétale fractionnée ou hydrogénée). Cette technique permet de contrôler la

libération des ingrédients dans les aliments ou dans le système digestif (Dziezak, 1988 ;

Risch, 1995). Cette zone de température de fusion ou de solidification qu'offre ce type

d'encapsulation nécessite beaucoup plus de précautions dans les éventuelles manipulations

et à l'entreposage pour conserver l'intégrité des microcapsules. Cette méthode est souvent

utilisée pour l'encapsulation de particules solides telles que les vitamines, les minéraux et

les acidulants (Rish, 1995).

2.1.6. Microencapsulation par complexe d'inclusion

La technique de microencapsulation par complexe d'inclusion décrite par Dziezak (1988),

est par exception une technique moléculaire. Elle met en évidence la conformation cyclique

des P-cyclodextrines qui sont des molécules chimiquement et physiquement stables

formées par modification enzymatique d*amidon et qui comportent 7 unités glucopyranose.

L'intérieur a un caractère hydrophobe tandis que l'extérieur est hydrophile (Rish, 1995). En
11

solution, cette conformation exhibe une cavité interne qui renferme des molécules d'eau.

Les ingrédients hydrophobes (vitamines liposolubles) à encapsuler vont substituer l'eau

dans la cavité et former des liens avec l'anneau de P-cyclodextrine. Les complexes

ingrédients-P-cyclodextrine forment un précipité récupérable par filtration et séchage. La

formation et les applications des complexes de cyclodextnne ont été largement décrites par

Hedges et al. (1995). Ainsi, les liaisons engagées dans la formation de ce précipité incluent

les forces de van Der Vaals, les interactions hydrophobes et les interactions dipôle-dipôle.

La microencapsulation par complexe d'inclusion avec la cyclodextrine améliore la stabilité

à la chaleur, à la lumière et aux conditions d'oxydation des complexes ingrédients

hydrophobes-cyclodextrine, et réduit la volatilité des composés complexés (Wong, 1998;

Bhandari & D'arcy, 1996).

2.1.7. Microencapsulation par coacervation

Le terme coacervation a été emprunté au domaine de la chimie des colloïdes et il réfère au

processus de formation de la paroi d'une capsule (Versic, 1988). L'avènement du papier à

écrire sans carbone en 1942 par Banett Green marque un grand pas dans l'évolution du

concept de coacervation (Dziezak , 1988). Versic divise le principe de coacervation en trois

étapes qui sont la formation de particules ou de gouttelettes, la formation de la paroi

capsulaire et l'isolement des capsules.


12

2.1.7.1. Complexe de coacervation

La formation de complexes est possible dans un système aqueux ayant deux polymères

hydrophiliques de charges opposées. Le procédé de formation de complexes peut être

résumé en ces lignes (Soper, 1995) : 1) un premier biopolymère (généralement une

protéine) est dissout dans l'eau ; 2) l'ingrédient actif est mélangé à la solution de

biopolymère ; 3) l'ajout d'un deuxième biopolymère de charge opposé entraîne la

neutralisation des charges du premier biopolymère et les complexes se forment. La

formation de complexes diminue la solubilité des biopolymères dans l'eau, entraînant une

séparation de phases avec une phase riche en complexes de biopolymères contenant

l'ingrédient actif et une autre phase presque dépourvue de biopolymère mais riche en

solvant (Versic, 1988). Ce sont ces complexes qui forment la paroi des microcapsules après

isolement. Il faut rappeler que cette formation de coacervat est influencée par plusieurs

conditions dont le pH, la force ionique, la concentration de polymères totaux, la

composition de polymères, ainsi que le ratio des deux polymères. King (1995), décrit une

méthode d'encapsulation par coacervation qui utilise la gélatine et la gomme gellane. Dans

ce procédé, le caractère amphotère de la gélatine lui permet de former un complexe de

coacervation avec un polysaccharide anionique, la gomme gellane. À pH > 6, ces deux

polymères sont miscibles (chargés négativement tous les deux, ils se repoussent

communément). Lorsque le pH est en dessous du point isoélectrique de la gélatine (elle

devient chargée positivement), les polymères interagissent et forment un complexe de

coacervation. Le système gélatine-gomme arabique est le système le plus utilisé. Versic

(1988), décrit la formation de microcapsule à partir de ces deux polymères. Il soutient qu'il
13

est possible de former un complexe de coacervation seulement lorsque le pH est en dessous

du point isoélectrique de la gélatine car à ce pH, la gélatine est chargée positivement tandis

que la gomme arabique demeure chargée négativement. Par conséquent, des interactions

électrostatiques peuvent se produire et entraîner la formation de coacervats.

L'encapsulation de gouttelettes d'huile de tournesol et de paraffine, ainsi que des particules

de poudre d'aluminium ont fait l'objet d'encapsulation dans des complexes de coacervation

utilisant la gélatine et le XM6, un polymère sécrété par Enterobater NCIB 11870 (Chilvers

étal, 1988).

2.1.7.2. Simple coacervation

Une simple coacervation peut se former avec un seul type de biopolymère dans un solvant

où le polymère n'est pas soluble ou par addition d'un composé (sels et alcools) ayant une

affinité plus élevée pour l'eau (Soper, 1995). De cette manière ce composé entre en

compétition avec le polymère en question. Lorsque les polymères perdent la couche d'eau

associée à leurs chaînes, il y a formation de coacervat entre les différentes chaînes

(Patwardhan & Das, 1983). Vandegaer (1973), a effectué l'encapsulation de gouttelettes

d'huile par simple coacervation avec de la gélatine. Dans sa technique, il renforce la

coquille capsulaire avec une solution de formaldéhyde à 37% avant séchage. Il mentionne

aussi que plus rapidement la gélatine gélifie, plus petits sont les pores des microcapsules et

par conséquent les gouttelettes ont moins de chance de s'échapper à travers la paroi

capsulaire. Une simple coacervation avec de la gliadine ayant un paramètre de solubilité

semblable à celui du solvant a permis de produire des particules de l'ordre du nanomètre


14

quelque soit les conditions d'extraction et de purification de la protéine (Duclairoir et al,

1998).

Jusqu'à présent, la plupart des techniques de microencapsulation citées dans cette revue ne

comportent pas d'étude d'encapsulation de composés hydrosolubles tel que la thiamine ou

les anthocyanes par la méthode de séparation de phases à l'exception de quelques travaux

portant sur l'encapsulation de L-tryptophan, de monoglycerate d'acide octanoique, de

propionate d'éthyle et de limonène par les émulsion multiples (Weiss et al, 2005; Shima et

a/.,2005;Cho et al, 2005).

2.2. Les interactions protéines-polysaccharides

Lorsque les protéines et les polysaccharides sont mélangés en solution, ils interagissent de

différentes façons selon les conditions du milieu. D'un point de vue thermodynamique,

deux types d'interaction (Fig. 2.1) peuvent se produire (Ledward, 1993, 1994; Samant et

al, 1993 ; Weinbreck et al, 2004). Il s'agit de l'incompatibilité thermodynamique ou

séparation de phases ségrégative et de la compatibilité thermodynamique qui se subdivise

en deux états : 1) l'état de co-solubilité qui consiste en un système où les deux polymères

forment un mélange homogène stable ; 2) l'état de séparation de phases associative où les

deux polymères interagissent de façon attractive pour former un système diphasique dans

lequel les deux polymères se retrouvent associés et concentrés dans une même phase tandis

que la deuxième phase est pauvre en polymère. Il en résulte dans le dernier cas la formation
15

de complexes électrostatiques entre les polymères. Selon le polysaccharide utilisé, il est

possible d'obtenir des gouttelettes de coacervats. Cette phase très visqueuse est obtenue

avec certains polysaccharides (par exemple, la gomme arabique comportant un segment

protéique).
16

Polysaccharides Proteins

*> W •

Ségrégation Association

Incompatibility / Co-solubiiity / Complexation /


Depletion No phase séparation Complex coacervation

Figure 2. 1. Comportement des mélanges protéine/polysaccharide (Weinbreck, 2004)

2.2.1. Incompatibilité thermodynamique

Dans l'état d'incompatibilité thermodynamique, il y a formation d'un système biphasique

liquide - liquide dans lequel la protéine et le polysaccharide se trouvent séparés, chacun

dans l'une des deux phases (Tolstoguzov, 1986). L'incompatibilité a lieu lorsque les

polymères en solution sont de même nature, i.e. les molécules des charges sont de même

signe. L'incompatibilité dépend aussi d'autres facteurs tels que, le pH du milieu, la

flexibilité des chaînes du polysaccharide, le poids moléculaire des polymères, la


17

concentration en sels ainsi que la concentration en solides totaux. Par exemple, pour des

systèmes protéine/polysaccharide anionique, l'incompatibilité peut survenir à des hautes

forces ioniques (supérieures à 0.25 M), à un pH supérieur ou égal au point isoélectrique de

la molécule de protéine et à des concentrations en solides totaux supérieures à 4%

(Tolstoguzov, 1986)

2.2.2. Compatibilité thermodynamique

Dans le cas d'une compatibilité thermodynamique, deux situations peuvent se présenter: 1)

la formation d'un mélange homogène et stable de polymères représentant l'état de co-

solubilité ; 2) un système biphasique où les deux polymères se retrouvent principalement

dans une des deux phases par séparation de phases associative (Ledward, 1994; Samant et

al, 1993; Tolstoguzov, 1997, 1991).

2.2.2.1. Co-solubilité

Dans le cas de la co-solubilité, le mélange spontané de protéines et de polysaccharides est

homogène et stable, permettant aux deux polymères de coexister en équilibre dans la même

solution. Cet état de co-solubilité peut en tout temps basculer en incompatibilité si la

différence de poids moléculaire entre les deux polymères augmente. Ceci pourrait

déséquilibrer le rapport des forces attractives et répulsives qui stabilisaient le système. La

formation de ce type de système est favorisée à de faibles ratios protéine - polysaccharide.

De plus le maintien des deux polymères en état de co-solubilité est assuré par des
18

interactions électrostatiques mais aussi par des liaisons hydrogène. Cet état de co-solubilité

est rarement observé vu la nature différente des polymères ainsi que la grande diversité de

leurs groupements fonctionnels qui pourraient conduire à des attractions ou des répulsions.

Cependant, un cas de co-solubilité entre la pectine et la sérum albumine bovine a été

rapporté dans la littérature (Semenova et al, 1991).

2.2.2.2. Séparation de phases associative

Dans le cas d'une séparation de phases associative, un système diphasique liquide-solide se

forme et les deux polymères se trouvent essentiellement dans une même phase. Ce système

est caractérisé par la formation d'un complexe protéine-polysaccharide, dans certains cas

appelé coacervation complexe, par le biais d'interactions électrostatiques entre des

polymères de charges opposées. Lors d'une séparation de phases associative, les

interactions électrostatiques favorisant l'association des polymères, sont représentées par

des forces attractives électrostatiques entre les groupements carboxyliques du

polysaccharide et les résidus chargés positivement de la protéine (Mattison et al. 1995;

Samant et al, 1993; Sanchez & Paquin, 1997). Il en résulte une formation de précipité qui

permet de distinguer une phase riche en complexes de polymères et une phase de solvant

presque complètement dépourvue de polymères (Tolstoguzov, 1991). Ces complexes sont

stabilisés par des liaisons hydrogène, des forces de van der Waals et des interactions

hydrophobes (Dickinson, 1998; Ganz, 1974; Imeson étal, 1977; Ledward, 1994; Samant et

al, 1993). La zone de pH favorable à la formation de ces complexes se retrouve

généralement entre le point isoélectrique de la protéine et le pKa des groupements


19

carboxyliques du polysaccharide. Cette formation de complexes est aussi favorisée par la

présence de faibles forces ioniques (Burgess, 1990). Les complexes formés peuvent

présenter différents aspects dépendamment du type de polymères utilisés. Des coacervats

complexes ont été obtenus par des mélanges gomme arabique/gélatine (Burgess & Carless,

1984, 1985; Peters et al, 1992), gomme arabique/albumine (Burgess et al, 1991, Burgess

& Singh 1993), gomme xanthane/protéine du lactosérum (Laneuville et al, 2000) et P-

lactoglobuline/gomme arabique (Schmitt et al, 2000). Des complexes impliquant la sérum

albumine bovine et un polyélectrolyte, poly(chlorure de diméthyldiallylammonium)

(PDMAAC) ont été largement rapportés dans la littérature (Mattison et al, 1995,

1998; Wang et al, 1996; Xia et Dubin, 1993).

2.2.3. Facteurs influençant la formation de complexes

La formation de complexes et la séparation de phases dépendent entre autres de la vitesse

d'agitation, du ratio ingrédients/polymères, de la vitesse du refroidissement et de l'ordre

d'addition des différents composés (Versic, 1988). Quant à la stabilité du complexe, elle

dépend d'un certain nombre de facteurs dont les groupements ionisables à la surface des

protéines et polysaccharides, la structure des protéines (dénaturée ou native), la flexibilité

des polysaccharides (Ledward, 1994), la concentration des polymères, l'environnement

ionique, le contenu en sucre, la température, le poids moléculaire et le pH du milieu

(Dickinson, 1998, Syrbe et al, 1998).


20

2.2.3.1. Le pH

Le pH joue un rôle très important dans le processus de formation de complexes entre les

protéines et les polysaccharides. En effet, le pH est responsable de l'ionisation des

macromolécules afin que des interactions électrostatiques puissent s'effectuer. Plus

précisément, le pH contrôle l'ionisation des groupements des chaînes latérales, des

groupements aminés et carboxyliques des protéines et des groupements carboxyliques des

polysaccharides (Schmitt, 2000). Les complexes formés peuvent être solubles ou insolubles

dépendamment du degré de neutralisation des charges opposées (Ledward, 1994;

Tolstoguzov, 1991). Des polymères fortement chargés, résultant de la variation du pH,

auront une conformation modifiée qui les amènera à former des agrégats insolubles au

détriment de la formation de complexes solubles (Burgess, 1990; Singh et Burgess, 1989).

En fait, pendant la formation de complexes entre protéine et polysaccharide anionique, la

charge nette (négative) des molécules de polysaccharides diminue progressivement, avec la

baisse du pH, pendant qu'elles s'attachent aux molécules de protéine chargées positivement

(Benichou et al, 2002). La conséquence directe qui en découle est la diminution de la

solubilité et de l'hygroscopicité de ces polymères et finalement la formation de complexes.

Le maximum d'interactions apparaît à un point appelé point d'équivalence électrique (PEE)

où la protéine et le polysaccharide possèdent des charges également opposées (Singh and

Burgess, 1989). Des études sur la formation de complexes entre la (i-lactoglobuline et la

gomme arabique (Weinbreck et al, 2003), ont montré que la formation de complexes se

faisait dans une zone de pH bien précise (Fig. 2.2). Selon ces auteurs, lors de 1' acidification

du mélange protéine/polysaccharide, un début de formation de complexes solubles apparaît


21

d'abord à un certain pH baptisé pHc qui serait dépendant de la force ionique, du point

isoélectrique de la protéine et de la densité de charges des polymères (Mattison et al,

1995). La valeur de ce pH pourrait aussi être influencée par la vitesse d'agitation, le ratio

ingrédients/polymères, les caractéristiques des polymères, les caractéristiques des

ingrédients (mouillabilité, solubilité), la vitesse du refroidissement et l'ordre d'addition des

différents composés (Versic, 1988). Avec la baisse du pH, les interactions deviennent de

plus en plus fortes, les complexes solubles s'agrègent et la séparation de phases apparaît à

un pH désigné pH«(,i. Si la baisse de pH continue, les complexes se dissocient à un autre pH

désigné pH,^ (non indiqué). Ces résultats sont confirmés par les recherches de Versic

(1988). Par ailleurs, le degré d'implication de la charge électrique nette d'un polymère dans

les interactions coulombiennes dépend de l'écart de pH entre le point isoélectrique (pi) du

polymère et le pH de la solution dans laquelle il se trouve. Ainsi, la plupart des protéines

alimentaires (pi autour de 5) peuvent former des complexes avec les polysaccharides

anioniques puisque les 2 polymères porteraient des charges opposées (Dickinson, 1998).

Cependant la tendance vers une formation de coacervation complexe insoluble est favorisée

par de faibles concentrations de sel et par des valeurs de pH en dessous du pi de la protéine

(Dickinson, 1998). Des travaux de compatibilité de l'albumine de l'œuf et de différents

amidons ont montré qu'un optimum de complexes insolubles était obtenu en variant la

quantité d'acide ajoutée (Schmitt, 2000). Dans une étude de purification de protéines du

lactosérum, Hansen et al. (1971), utilisèrent un nouveau procédé de complexation des

protéines avec la carboxyméthycellulose avec lequel 90% des protéines précipitaient à pH

3.2 et 10% pouvaient être complexés par ajustement du pH entre 7.5 et 8.0. Ceci indique
22

que la purification des protéines peut être spécifique par simple ajustement du pH (Strege et

al, 1990), comme c'est le cas en purification sur colonne échangeuses d'ions. Une autre

étude a conduit à 90% de complexation par ajustement du pH à 6.0 d'un mélange de

protéines de lactosérum et de polysaccharide cationique, le chitosane (Bough & Landes,

1976). L'utilisation de différents types d'acides (HC1, HNO3, AcOH, H2SO4) pour abaisser

le pH pendant la formation de complexes entre la gélatine et la gomme arabique (Daniels &

Mittermaier, 1995) a révélé qu'en général, il n'y avait pas de différence au niveau du

pourcentage de complexes formés (sur une base sèche). Cependant, avec l'acide sulfurique,

le pH d'équivalence électrique est décalé à des valeurs inférieures par rapport aux autres

types d'acide.
23

100 2.5
A B
Soluble Soluble Association of
3
80 polymers complexes complexes H 2.0
(0
ity

60 1.5 É
8 '■B
1c 1
O) 40 1.0
c
■c
atte

20 0.5
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citçrt?ft-M) V j
0 0.0
6.5 4.0 3.5

Figure 2.2. Représentation des zones de formation de complexes protéines du lactosérum-gomme

arabique. Diffusion de la lumière A et turbidité O des complexes ; diffusion de la lumière des

protéines du lactosérum □ et de la gomme arabique # en fonction du pH (Weinbreck et al., 2003).

2.2.3.2. La force ionique


Parmi les trois types d'équilibre qu'on trouve dans une solution binaire

protéine/polysaccharide, la miscibilité apparaît généralement à des forces ioniques plus

faibles que l'incompatibilité et la séparation de phases associative (Dickinson, 2003).


24

Cependant, des concentrations ioniques relativement faibles favorisent la formation de

complexes de biopolymères car le nombre de charges sur ces molécules est suffisant pour

effectuer des liens électrostatiques entre elles sans être significativement influencés par les

ions. Par contre à de fortes concentrations en ions, il y a un effet inverse, celui de la

suppression des complexes, qui se justifierait par l'entrée en compétition des ions, avec les

macromolécules. Cela veut dire en réalité qu'à forte concentration en ions dans la solution,

les charges portées par les biopolymères sont réduites par les interactions avec ces ions en

présence (en créant un effet d'écran électrostatique), ce qui empêcherait les interactions

électrostatiques entre les molécules de protéines et de polysaccharides (Mattison et al,

1995; Schmitt et al, 1998). Ces auteurs ont montré que les ions divalents supprimaient la

coacervation complexe à des concentrations ioniques plus faibles que les ions monovalents,

mais que cette suppression pouvait être levée si la solution des ions divalents était diluée.

Ceci démontrerait que l'effet ionique des ions divalents est plus fort que celui des ions

monovalents. Dans un système albumine/gomme arabique (Schmitt et al, 1998),

l'optimum de coacervation a lieu à lOmM de sel alors qu'à des valeurs plus hautes il se

produit une chute drastique de la coacervation. Ceci serait dû à l'adoption d'une

conformation linéaire des polysaccharides qui formeraient des agrégats au lieu de

complexes avec les protéines. L'effet de la concentration en sel sur les interactions du

système inhibiteur de trypsine de soja/polyampholytes (Nath et al, 1995) a montré qu'en

variant la concentration de 0 à 0,75M (c'est-à-dire : 0; 0,1; 0,35 et 0,75M), la turbidité

décroissait jusqu'à la suppression, ce qui indique que cet accroissement de la concentration

en sel est défavorable à la formation de complexes. Cependant il faut noter que cette

croissance en concentration de sel s'est produite à des valeurs assez éloignées qui auraient
25

pu ne pas mettre en évidence la concentration minimale de sel favorisant la formation de

complexes par le couple protéine-polymère.

2.2.3.3. Charge des biopolymères

Le processus de formation de complexes est principalement influencé par la nature et la

densité des charges présentes sur les macromolécules. La densité de charges des

biopolymères peut être définie comme le nombre de charges par unité de longueur. Ce

facteur est très important d'autant plus que si la densité de charges est trop faible,

l'interaction électrostatique n'intervient pas et la formation de complexes est inhibée. De

plus, la charge nette des complexes influence la solubilité de ceux-ci dans leur milieu. Par

exemple, si un polymère possède un excès de charge par rapport à un deuxième polymère,

les complexes formés auront tendance à interagir avec le solvant. Cependant si les charges

des deux polymères se neutralisent complètement pendant la formation de complexes,

ceux-ci seront insolubles. Ces complexes peuvent être à nouveau solubles par titration acide

ou par ajout de sels (Mattison étal, 1995; Tolstoguzov, 1997; Xia et Dubin, 1993).

Un autre facteur important relié à la densité de charges est la conformation des polymères.

Une molécule de protéine globulaire sera plus limitée dans son interaction avec la molécule

de polysaccharide par rapport à une molécule de structure plus désordonnée (gélatine,

caséine) qui offre plus de sites chargés, facilitant ainsi les interactions avec la molécule de

polysaccharide.
26

L'hétérogénéité de la distribution de charges à la surface des molécules globulaires de

protéine peut avoir comme conséquence la formation de complexes dans une zone

défavorable à la formation de complexes par rapport au point isoélectrique de la protéine

(De Vries et al, 2003, De Vries, 2004). Par exemple, les complexes peuvent être formés à

des pH supérieurs au point isoélectrique de la protéine comme rapporté dans une étude

mettant en interaction la sérum albumine bovine et un polyélectrolyte anionique, le sulfate

d'alcool polyvinylique (Park et al, 1992). Ce phénomène est attribué à la présence de

zones de densité de charges positives appelées «patches» sur la protéine qui a une charge

nette négative, et qui interagissent avec le polyélectrolyte chargé négativement (Bowman et

al, 1997).

La majorité des polysaccharides utilisés dans le domaine de l'alimentation sont de nature

anionique; par exemple, la pectine et la gomme arabique portent des groupements

carboxyles tandis que la carraghénine porte des groupements sulfates. D'autres

polysaccharides sécrétés par les bactéries lactiques possèdent des groupements phosphates.

Certains autres, tel que le chitosane, sont cationiques.

2.2.3.4. La concentration totale en biopolymères

La concentration totale de biopolymères est aussi un paramètre non moins important dans

la formation de complexes par coacervation. Des études sur 80 systèmes ternaires

effectuées par Tolstoguzov (1986), ont montré qu'à des concentrations de biopolymères

supérieures à 4% l'apparition de complexes est supprimée au profit d'une séparation de


27

phases ségrégative. Cependant, en diluant le système déjà concentré en polymères totaux, la

formation de complexes devient possible à nouveau (Phares & Sperandio, 1964).

2.2.3.5. Le ratio protéine/polysaccharides

Le ratio protéine/polysaccharide (P:Ps) est un autre facteur influençant la charge nette et les

propriétés des complexes obtenus. Il en résulte une influence sur la solubilité des

complexes. En effet, à un pH et à une force ionique donnés, le ratio massique P:Ps va

conditionner la neutralisation des charges entre les deux macromolécules (Xia & Dubin,

1993). Si la neutralisation des complexes se produit à un ratio P:Ps de 1, toute

augmentation ou diminution de ce ratio entraînera un gain de solubilité des complexes et

par conséquent une diminution des complexes (Kaibara et al, 2000). À pH 5,65 et à une

force ionique de 10 mM, Bowman et al. (1997), ont démontré, en utilisant la diffusion de la

lumière à 90° (proportionnalité entre l'intensité de la lumière et l'association des

macromolécules), que l'association des molécules se trouve augmentée de 5 fois avec des

complexes au ratio gélatine/polélectrolyte de 12 par rapport au polyélectrolyte seul. Une

augmentation subséquente du ratio par ajout de gélatine a entraîné une diminution de

l'intensité de la lumière correspondant à l'intensité de la gélatine seule. Ceci confirme une

solubilisation des complexes formés par l'excès de gélatine. Dans une autre étude, il a été

démontré que la taille des complexes pouvait être contrôlée en faisant varier le ratio de P:Ps

(Laneuville et al, 2000). Dans cette étude, 44% des complexes avaient une taille

supérieure à 300um (surface mesurée par microscopie optique) avec un ratio supérieur à
28

15:1 alors que pour presque le même pourcentage (40%) la taille des complexes diminuait à

20 um2 avec un ratio entre 5:1 et 10:1.

2.2.3.6. Température

La température influence les interactions non coulombiennes. À titre d'exemple, les

liaisons hydrogène sont favorisées par une diminution de la température alors que les

interactions hydrophobes et liaisons covalentes sont favorisées par l'augmentation de la

température. La séparation de phases associative dans un système protéine/polysaccharide

est donc favorisée par une diminution de la température permettant l'établissement de

liaisons hydrogène. L'augmentation de la température peut aussi être indirectement

bénéfique à la séparation de phases associative (Schmitt et al, 1998) dû à l'exposition de

sites réactifs lors de la dénaturation des protéines ou au changement de conformation du

polysaccharide. Ces changements peuvent favoriser les interactions électrostatiques

associatives entre protéines et polysaccharides. Des protéines ayant été individuellement

dénaturées par la chaleur ont une interaction différente à la surface des gouttelettes d'huile

ou avec d'autres macromolécules, comme les polysaccharides, par rapport aux protéines

natives non traitées (Dickinson & Pawlowsky, 1996). L'effet de la température (25 à 90°C)

sur la formation de complexes sérum albumine bovine-alginate à pH 6.8 (Harding et al,

1993) a montré une formation de complexes à 25°C alors qu'il n'y a pas de formation de

complexes entre 35 et 70°C. Cependant quand le mélange sérum albumine bovine-alginate

est chauffé au dessus de 70°C la formation de complexes a lieu. Cette reprise de la

formation de complexes serait expliquée par la dénaturation de la sérum albumine bovine à


29

55°C et une fois cette température dépassée, le chauffage permettrait à la protéine d'exposer

plus de groupements réactifs favorables à la formation des complexes. La zone de

température entre 35 et 70°C correspondrait au processus de modification de la

conformation de la sérum albumine bovine pendant lequel les interactions avec l'alginate

ne sont pas favorisées.

2.2.3.7. Pression

Une nouvelle technique qui attire l'attention ces dernières années est l'utilisation de la

haute pression (Dickinson & Pawlowsky, 1996). Dans le domaine alimentaire, deux types

de pression peuvent être appliqués aux polymères en solution (Schmitt et al, 1998). Il

s'agit des traitements de haute pression hydrostatique et de la microfluidisation qui se fait

dans une chambre de microfluidisation. Cette dernière consisterait en une combinaison de

turbulence, de cavité gazeuse et de phénomène de cisaillement. L'effet de la haute pression

hydrostatique (400-700MPa) sur une solution de beta-lactoglobuline (Dickinson &

Pawlowsky, 1996), avant son émulsion avec une phase lipidique et avant l'ajout de

polysaccharide (dextrane), s'exprimerait par une dénaturation (pas aussi prononcée qu'avec

de la chaleur) de la protéine à la surface des gouttelettes. L'effet bénéfique des complexes

avec les hautes pressions et températures serait dû à la protection par blocage des sites

hydrophobes de la protéine par la molécule volumineuse de polysaccharide (Dickinson,

1998).
30

2.2.3.8. Agitation et temps d'agitation

L'effet de l'agitation a pu être mis en évidence dans plusieurs études. Par exemple, le

diamètre des complexes obtenus entre l'albumine et la gomme acacia était de 2,2um après

augmentation de la vitesse d'agitation à 420 rpm alors qu'il était de 3,1 um à 200 rpm

(Tirkkonen et al, 1994). Par contre dans une étude de Burgess et Singh (1993), aucun effet

de l'agitation à 0, 450 et 900 rpm pendant une heure n'est obtenu avec le même système

albumine/gomme acacia. Bien que ces deux études donnent des résultats différents, d'autres

(Schmitt et al, 1998) effectuées sur le complexe de bêta-lactoglobuline/gomme acacia avec

un ratio de 4 :1 à pH 4.0 et une concentration totale en polymères de 0,1% p/p ont montré

(par absorbance à 650 nra et par micrographie à contraste de phases) que la taille des

coacervats était dépendante du temps d'agitation. Après une courte durée (15s) d'agitation,

des coacervats de petite taille (lum) étaient obtenus alors que de longues durées (60s)

d'agitation permettaient une coalescence des particules (10-25um). Par ailleurs,

l'évaluation des paramètres d'encapsulation d'acides gras Q-3 insaturés par des complexes

gélatine-gomme arabique a permis de constater qu'une augmentation de l'homogénéisation

de l'émulsion huile (acides gras Q-3) dans eau (contenant des complexes gélatine-gomme

arabique), par agitation à 9000 rpm augmentait le taux d'encapsulation (Lamprecht et al,

2001). Cela pourrait s'expliquer par un changement de la structure du matériel encapsulant

en une structure de matrice (possible changement de conformation de la protéine)

favorisant l'encapsulation.
31

2.3. Biopolymères à l'étude

2.3.1. Les protéines du lactosérum

Le lactosérum est obtenu après l'acidification du lait, en général par l'ajout de bactéries

lactiques ou la coagulation de la caséine (ajout de la présure) pendant le processus de

fabrication de fromage. Pour obtenir des protéines de lactosérum sous forme concentrée

comme l'isolât de protéines de lactosérum (IPL), deux méthodes sont principalement

utilisées. Il s'agit de la séparation des protéines du lactosérum sur colonne échangeuse

d'ions ou par microfiltration. La séparation par échange d'ions permet d'obtenir une

concentration plus élevée de protéines (93-95%) que la séparation par microfiltration suivie

d'une ultrafiltration (90-95%) mais cette dernière permet de récupérer plus de

glycomacropeptides, lactoferrine, lactoperoxidase et de peptides bioactifs, qui sont des

molécules importantes pour la santé. Le produit final obtenu, l'isolât de protéines de

lactosérum, contient approximativement 64.47% de (3-lactoglobuline (P-lg), 23.02% d'a-

lactalbumine, 2.36% de sérum albumine bovine et de 2.67% d'immunoglobulines avec des

fractions mineures de glycomacropeptides et de protéoses peptones.

2.3.1.1. La p-lactoglobuline

La P-lg (Fig. 2.3) est la protéine la plus importante des protéines du lactosérum. Elle est très

nutritive car elle contient tous les acides aminés essentiels. Il existe 7 variants génétiques de

P-lg et les plus communs sont les variants A et B. La structure secondaire de la P-lg est

représentée par 15% d'a-hélice, 50% de feuillet P et le reste par une structure désordonnée

(Rutten et al, 2002 ; Sawyer & Kontopidis, 2000). La structure primaire de la molécule
32

consiste en 162 acides aminés dont un tiers des acides aminés sont apolaires (Rutten et al,

2002). La P-lg a une structure globulaire (3 nm de diamètre) sous sa forme native. Sous

cette forme, elle est stabilisée par des ponts hydrogène et deux ponts disulfures dont l'un

entre les résidus Cys 66 et Cys 160 et l'autre entre les résidus Cys 106 et Cys 119. Elle

contient aussi un groupement -SH libre entre les résidus 229 et 121 (Cheftel et al, 1985).

La P-lg a un poids moléculaire de 18 362 Da et un point isoélectrique de 5.2 (Rutten et al,

2002). Elle appartient à la famille des lipocalins qui sont caractérisés par leur habileté à se

solubiliser et à transporter des ligands hydrophobes tels que des acides gras (Ragona et al.,

2003). Par exemple, la fixation du rétinol dans la cavité centrale de la P-lactoglobuline a été

mise en évidence par Kontopidis et al., (2002). Par ailleurs, de la P-lactoglobuline (variants

A et B) immobilisée dans une colonne a été utilisée pour l'extraction et l'isolement des

protéines du lactosérum (Chiancone & Gattoni, 1991). La distribution de charges sur la P-lg

(Fig. 2.3) est représentée par plusieurs régions peptidiques, riches en acides aminés chargés

positivement (asparagine, histidine et lysine) et négativement (acide glutamique et acide

aspartique), responsables des zones chargées à la surface de la protéine. Plusieurs études

effectuées sur les interactions entre la P-lg et des polysaccharides anioniques ont démontré

la présence d'interactions électrostatiques au-dessus du point isoélectrique de la protéine,

lorsque les deux macromolécules portaient des charges nettes opposées (Girard et al, 2004;

Weinbreck et al, 2003). Ceci démontre l'importance de la présence de zones chargées à la

surface de la p-lg sur les interactions avec les polysaccharides.


33

\ 130 C-term

Figure 2.3. Structure tridimensionnelle d'un monomère de la P-lactoglobuline A (Oliveira


et al, 2001)

2.3.1.1.1. Facteurs influençant la structure

2.3.1.1.1.1. Le pH et les sels

La structure quaternaire de la B-lg est facilement influencée par le pH et les minéraux. Au

pH physiologique (6.8) la B-lg se trouve sous forme de dimère. Aux pH extrêmes (pH > 8,

pH < 3) elle se dissocie sous forme monomérique alors qu'entre pH 3.5 et 5.5 le variant A
34

aurait tendance à former des octamères (Sawyer & Kontopidis, 2000). L'ajout de sels à une

solution de P-lg peut neutraliser les charges de la protéine et favoriser les interactions

apolaires. L'ajout de calcium forme des ponts intramoléculaires qui peuvent favoriser les

interactions hydrophobes (par changement de conformation de la molécule) et la réactivité

des groupements sulfhydryles d'une part, et la formation de gel lorsque la P-lg est

partiellement dénaturée (Jeyarajah & Allen, 1994). La valence des ions joue un rôle

important au niveau de la gélifîcation de la P-lg (Kuhn & Foegeding, 1991). Les ions

bivalents provoquent une gélifîcation plus rapide que les ions monovalents (Foegeding et

al, 1992).

2.3.1.1.1.2. La température

L'effet de la température est lié aux conditions de pH et de force ionique du milieu. Il faut

noter qu'à 65°C à pH 6.7, la p-lg est dénaturée. Un chauffage entre 40 et 80°C à pH neutre

entraîne d'abord la dissociation des dimères de P-lg en monomères en exposant les

groupements sulfhydriles (Kella & Kinsella, 1988), puis le dépliement de la molécule causé

par la rupture de liens hydrogène (Hambling et al, 1992 ; Wong et al, 1996). Dans cet état,

la molécule subit des réactions d'agrégation dues à la formation de ponts disulfures

intermoléculaires, et aux interactions entre les régions hydrophobes exposées (Relkin,

1998; Verheul et al, 1998). Aux pHs proches du point isoélectrique, le chauffage peut

engendrer une forte agrégation causée par des interactions électrostatiques et hydrophobes,

suivie d'une précipitation (de Wit, 1990; Relkin, 1998).


35

2.3.1.2. L'a-lactalbumine

L'a-lactalbumine (a-lac) est la deuxième protéine en importance dans le lactosérum. C'est

une métalloprotéine de poids moléculaire de 14.2 kDa. Des études cristallographiques ont

montré une similarité entre la structure tridimensionnelle (Fig. 2.4) de l'a-lac et celle du

lysozyme (Acharya et al, 1991, 1994). L'a-lac appartient au groupe des protéines

globulaires (3nm) avec 8 résidus cystéines formant 4 ponts disulfures (Boye, et al., 1997).

L'a-lactalbumine est constituée de 123 acides aminés dont 1/3 sont apolaires. Sa structure

tertiaire est composée de 20% d'a-hélice, 15% de feuillet p et de 60% de structure

aléatoire. La particularité de cette protéine est qu'elle a une très grande affinité pour les

ions métalliques bivalents tels que le calcium et le zinc, d'où le nom de métalloprotéine

(Hiraoka et al., 1980; Permyakov & Berliner, 2000 ; Relkin et al, 1993). Sa conformation

est stabilisée par de fortes liaisons calcium. L'a-lac a un intérêt particulier pour la science

en ce sens qu'elle fait partie des quelques protéines qui adoptent une conformation

intermédiaire, appelée «molten globule- state» entre la forme native et la structure

secondaire à pH acide. Cette forme est caractérisée par une structure compacte avec un

rayon de 10-20% plus large que celui de la forme native et une absence d'interaction

(rencontrée le plus souvent dans les structures tertiaires) entre les acides aminés

(Kuwajima, 1989).
36

Figure 2. 4. Structure tridimensionnelle de l'a-albumine humain avec les deux sites de

fixation du calcium sous forme de cercles 1 et 2 (Chandra et al, 1998).

2.3.1.2.1. Influence du pH sur la structure

L'a-lac est soluble dans l'eau mais à forte concentration, elle peut se polymériser quand le

pH de la solution approche son point isoélectrique (pi) de 4.3. De part et d'autre de son

point isoélectrique, plusieurs interactions intermoléculaires se produisent, conduisant à

divers degrés de polymérisation. Les molécules d'a-lac subissent une transition acide à pH
37

4.2-3 et une transition alcaline à pH supérieur à 9 avec formation d'agrégats dans les deux

cas. Ces comportements seraient causées par l'exposition de surfaces hydrophobes entre les

molécules de protéine (Kronman et al., 1964; Kronman & Andreotti, 1964 ; Kuwajima,

1989). Les interactions hydrophobes seraient elles même causées, à pH acide, par le

remplacement des ions calcium par des ions hydrogène. Cependant à des pH entre 6.5 et 8,

il y aurait peu d'association (Kronman et al, 1967).

2.3.1.3. La Sérum Albumine Bovine

La sérum albumine bovine est la troisième protéine en importance des protéines du

lactosérum. C'est une protéine de type globulaire qui se distingue par son poids moléculaire

assez élevé de 66 kDa. Elle comporte 582 acides aminés dont 30% sont apolaires avec 17

ponts disulfures et un groupernent -SH libre à la position 34. C'est une protéine soluble

dans l'eau dont le pi est de 4,8. Sa dénaturation acide apparaît à des pH < 4. Sa structure

secondaire consiste en 54% d'hélice a et 40% de feuillet P (Kinsella & Whitehead, 1989).

2.3.2. La pectine

2.3.2.1. Caractéristiques structurales

Les pectines sont des hétéropolysaccharides ioniques des plantes (agrumes, tomate,

betterave à sucre, pomme). Elles sont largement utilisées dans l'industrie alimentaire pour

leurs propriétés gélifiantes, dans des produits tels les confitures et les gelées et pour leur

capacité à stabiliser les produits laitiers acides (Voragen et al, 1995). Ce sont des fibres

alimentaires solubles qui diminueraient les risques de cancer du colon (Nangia-Makker et


38

al., 2002). Les pectines sont extraites dans diverses conditions incluant des pH de 1 à 3 à

des températures de 60 à 100°C pendant 0.5 à 12 h, selon la capacité de gélification et le

degré de méthylation du produit fini (Canteri-Schemin et al, 2005 ; Schols & Voragen,

2002; Voragen et al, 1995). Les pectines (50 000 à 150 000 Da) couvrent divers groupes

de polysaccharides associés aux parois cellulaires et aux régions intercellulaires des plantes

(Voragen et al, 1995). Leur caractère anionique leur permettrait des interactions avec les

protéines (Tolstoguzov, 1991). Le résidu majeur de ces polysaccharides est une chaîne

linéaire d'unités acide a-D-galacturonique liées entre elles par des liaisons a-1,4 (Schols &

Voragen, 2002; Thibault & Rinaudo, 1985; Voragen et al, 1995). Les pectines

commerciales (principalement dérivées des agrumes, de betterave à sucre et de pomme)

sont constituées de longues régions lisses et des régions ramifiées (Fig. 2.5). La région lisse

est constituée de longues chaînes d'acide galacturonique alors que la région ramifiée est

représentée par des chaînes latérales neutres d'arabinose, de galactose, de glucose, de

mannose et de xylose connectés au rhamnose d'une chaîne d'acide glucuronique et de

rhamnose (Nangia-Makker et al., 2002). Les pectines peuvent être divisées en trois groupes

(homogalacturonanes, rhamnogalacturonanes-I et galacturonanes substitués) largement

caractérisés (O'Neill et al, 1990; Vincken et al, 2003).

Le premier groupe, l'homogalacturonane (Fig.2.6), est constitué d'une chaîne linéaire de

résidus acides 1,4 a-D-galacturonique correspondant à la région lisse, sur laquelle certains

groupements carboxyliques sont estérifîés par des groupements méthyles. Les

homogalacturonanes seraient aussi partiellement estérifîés par des groupements acétyles

aux carbones C-3 et C-2 des unités galacturoniques (Ishii, 1997).


39

Le deuxième groupe, les rhamnogalacturonanes-I font partie d'une famille de pectine

contenant un résidu répétitif de disaccharides [l,4)-a-D-acide galacturonique-(l,2)-a-L-

rhamnose-(l,4] correspondant à la région ramifiée. Les chaines latérales consistent en des

résidus linéaires et ramifiés de a-L-arabinofuranose et de p-D-galactose.

Le troisième groupe, les galacturonanes substitués, sont souvent référés comme des

rhamnogalacturonanes-II. Us représentent un autre type de polysaccharides constitués d'une

chaîne linéaire de résidus 1,4 acide a-D-galacturoniques (O'Neill et al, 1990). On les

retrouve dans toutes les plantes. Il à été démontré que le vin et certains jus de fruits

contiennent une quantité très élevée (20-150 mg/1) de rhamnogalacturonanes-II (Doco et

al, 1997). Ils lieraient les métaux lourds (Szpunar et al, 1999; Tahiri et al, 2000) et

auraient des activités immunologiques (Shin et al, 1998), d'où leur intérêt pour la santé et

la nutrition humaine.

Les pectines natives sont souvent très méthylées. Cependant des pectines à faible teneur en

ester peuvent être préparées par une désestérification acide contrôlée de pectines hautement

méthylées mais d'autres moyens tels que le traitement alcalin, enzymatique ou par de

l'ammoniac peuvent être utilisés. Les étapes de la production de pectines hautement

méthylées et faiblement méthylées consistent principalement en des procédures successives

d'extraction, de filtration, de précipitation, de lavage et de standardisation. La production

de pectines par des traitements acides, basiques ou par la pectine méthylestérase acide

permet une distribution aléatoire des groupements carboxyliques libres alors que le

traitement par la pectine méthylestérase alcaline conduit à un arrangement en bloc des

groupements carboxyliques libres sur la molécule de pectine (Thibault & Rinaudo, 1985).

La pectine produite peut avoir différents degrés d'estérification (DE). Le DE est le


40

pourcentage de groupements carboxyles estérifiés par des molécules de méthanol (Fig. 2.6).

La pectine ayant un DE inférieur à 50% est dite faiblement méthylée (PFM) alors que celle

dont le DE est supérieur à 50% est dite hautement méthylée (PHM). Finalement, lorsque le

DE est inférieur à 10%, la pectine est appelée acide pectique. La pectine produite au moyen

d'ammoniac donne différents types de pectine faiblement méthylée avec des groupements

carboxyliques amidés. Le degré d'amidation est le nombre de groupes carboxyliques

amidés par 100 unités acide D-galacturoniques (Ralet et al, 2001; Voragen et al, 1995).

La structure tertiaire de la pectine est une hélice tridimensionnelle. Larigiditéde la pectine

est causée principalement par les monomères d'acide D-galacturonique liés par un lien

axial-axial (Burton & Brant, 1983). Les groupements méthoxyles n'ont pas d'effet sur la

flexibilité du polysaccharide, contrairement au rhamnose dont une faible quantité suffit à

l'augmenter. La présence de groupements amidés augmente aussi larigiditédes chaînes de

la pectine (Axelos & Thibault, 1991).


41

jfraw
Homogalacturonan
ë
Rhamnogalacturonan II
qjtf,
Rhamnogalacturonan I

9 Acetyi ester * Methyl ester


• Galacturonic acid (GalA)
• Rhamnose (Rha)
• Apiosîe (Api)
• Fucose(Fuc)
• Aceric acid (AceA)
• Galactose (Gai)
O Arabinose (Ara)
o Xylose(Xyl)
o Glucuronic acid (GicA)
• Deoxylyxo- Ketodeoxymanno-
heptulopyranosyiaric acid (Dha) octulopyranosylonlc acid (KDO)

Figure 2.5. Structure de la pectine. Représentation schématique conventionnelle (A) et


structure alternative (B) (Willats et al, 2006).
42

coo

HO

?&â! COOCH,

\
Methy I esters

COOCH,
/

H,C - c - o ^ — - - \ - ^ |
OH i
o
/ )H

O-acetyl COO"

esters
coor

Figure 2.6. La structure de l'homogalaturonane, le polymère linéaire de résidus 1,4 a-D-


acide galacturonique. Certains des groupements carboxyliques des résidus acide
galacturoniques sont estérifiés avec du méthanol alors que certains autres sont estérifies
avec de l'acétique acide aux carbones C2 et C3 (Ridley et al, 2001).
43

2.3.2.2. Facteurs influençant la structure

2.3.2.2.1. Le pH

La pectine est plus stable à des pH entre 3 et 4. À des pH plus acides, les groupements

méthoxyle et acétyle sont éliminés et les sucres neutres hydrolyses (Schols & Voragen,

2002; Voragen et al, 1995). En fait, pour la PHM, une baisse du pH par adition d'acide

provoque une baisse de la viscosité jusqu'à une zone de pH (2.2 à 2.4) en dessous de

laquelle une baisse subséquente n'a plus d'effet sur la viscosité. Une augmentation du pH

aux environs de 6 par ajout d'hydroxyde de sodium entraîne un maximum de viscosité qui

serait causé par une réaction entre la pectine et la base conduisant à la formation de pectine

hautement ionisée (Kertesz, 1951). Au dessus de pH 4, la chaîne de galacturonane se

dépolymérise par un mécanisme connu sous le nom de P-élimination. Cette réaction

intervient au niveau des liaisons glycosidiques liant le C4 de l'acide glucuronique à son

groupement carboxylique en position C6. La PFM est plus résistante à la dépolymérisation

comparativement à la PHM. Au dessus de pH 8, une déméthylation ainsi que d'autres

changements causés par le milieu très basique apparaissent (Schols & Voragen, 2002).

2.3.2.2.2. Les minéraux

La pectine gélifie sous l'action combinée de divers mécanismes fondamentaux. La

gélification de la PHM est caractéristique des conditions classiques de production de

confiture, à savoir à pH 3, avec 65% de sucres dissous, ceci avec une ionisation des

groupements carboxyliques. Cependant, la gélification de la PFM à pH >3 et à une


• 44

concentration faible en sucre nécessite la présence d'ions métalliques di ou trivalents

(Ca^and Mg"1"1}. Plus la teneur en acide glucuronique non estérifié de la molécule de PFM

augmente, plus la gélification sera élevée. En présence d'ions divalents, les chaînes d'acide

D-galacturonique s'organisent en deux dimensions présentant des groupements

carboxyliques chargés négativement entre lesquels les ions viennent se loger. Le gel rigide

de pectine LMP ainsi obtenu est le résultat d'interactions entre les groupements carboxyles

libres et les ions (calcium), formant des ponts entre les molécules. Ce modèle est connu

sous le nom de «egg-box» ou boîte d'oeufs (Renard et Thibault, 1993; Schols & Voragen,

2002 ; Walkinshaw & Arnott, 1981). De plus, les pectines PFM peuvent former des gels à

pH <2.5 sous d'autres conditions (Schols & Voragen, 2002).

2.4. Le système isolât de protéines de lactosérum - pectine faiblement méthylée

Des études intéressantes sur les interactions entre la pectine et les protéines du lactosérum

ont été rapportées dans la littérature. L'étude de l'effet de la pectine hautement méthylée

sur les propriétés d'une émulsion (huile dans eau) de tournesol stabilisée par différent types

de caséine (Dickinson et al, 1998) à pH 7.0 ou 5.5 et à force ionique entre 0.01 et 0.2 a

montré qu'en ajoutant de la pectine, les gouttelettes d'émulsion étaient légèrement plus

grosses à bas pH avec une charge nette négative. Cela suggérait que la présence de pectine

à l'interface huile/eau des gouttelettes d'émulsion à pH 5.5 stabilisait l'émulsion.

L'utilisation de pectine dépolymérisée, contenant une quantité (0.7-1%) résiduelle de

protéine (provenant de la même source que la pectine), comme stabilisateur d'émulsion

(huile de colza dans eau) a permis de constater que la protéine et la pectine sont associées à
45

l'interface des gouttelettes d'émulsion et que ce couple joue un excellent rôle de

stabilisateur d'émulsion (Akhtar et al, 2002). Les complexes protéines sériques-pectine ont

été utilisés pour l'encapsulation et la libération du 2-octanone (Burova et al, 1999).

L'encapsulation du 2-octanone a été obtenue avec le complexe sérum albumine bovine

(SAB)-pectine faiblement méthylée à pH 6.4. Les auteurs maintiennent qu'à ce pH, la co-

solubilité des deux polymères est assurée par des liaisons hydrogène alors que les

interactions entre le 2-octanone et la SAB sont représentées par des liaisons hydrogène et

des interactions hydrophobes. La libération du 2-octanone est effectuée grâce à sa capacité

de liaison aux complexes, forte à pH 6.4 et faible à pH 4.3, et au contrôle de la solubilité

des complexes par ajout de SAB à pH 6.4 suivi de la baisse du pH. La dénaturation de la

SAB par la diminution du pH entraîne la formation de nouveaux liens avec la pectine,

libérant ainsi les molécules de 2-octanone faiblement fixées. La combinaison de protéines

sériques avec la pectine sous certaines conditions peut former un gel. Ceci a été démontré

par Beaulieu et al, (2001) qui ont produit un gel d'isolat de protéine de lactosérum/pectine

à pH 6.0 et à 80°C en présence de 10 mM de calcium. Ils ont conclu une formation de gel,

par séparation de phases, dont la fermeté augmentait avec le pourcentage de pectine ainsi

que du calcium ajouté. Cette étude se rapproche du sujet de la présente thèse en ce sens que

les matériaux utilisés pour la formation de la matrice sont en partie les mêmes, à savoir des

protéines de lactosérum et de la pectine faiblement méthylée. De plus, les mélanges formés

à partir de ces matériaux ont été caractérisés dans les deux cas, mais avec des méthodes

différentes. Plusieurs aspects des travaux de Beaulieu et al. (2005) se distinguent de cette

thèse. En effet, ces auteurs ont procédé à la formation de gel à pH 6.0 avec un ajustement

de la force ionique résultant en la formation de ponts entre les différents types de polymère,
46

suivi d'un traitement thermique. Ils ont utilisé aussi des concentrations élevées d'IPL et de

pectine. Les interactions présentes dans la formation de gel sont en général des répulsions

électrostatiques, des interactions hydrophobes et la formation de liens disulfures. La

différence avec cette thèse est que nous formons une matrice composée de complexes

IPL/PFM, et non un gel, à des pH plus acides avec deux modes d'acidification différents

sans ajout de sel, d'où l'absence de ponts entre les polymères. La formation de complexes

IPL/PFM n'a pas nécessité de traitement thermique et les concentrations de polymères

utilisés sont très faibles. Finalement les interactions prévalant dans cette formation de

complexes sont des interactions de faibles forces incluant les attractions électrostatiques et

les liaisons hydrogène. Il est donc important de remarquer que les deux travaux s'inscrivent

dans l'étude des interactions protéines/polysaccharide lors de la formation de matrice

IPL/PFM par séparation de phases associative mais à des pH bien distincts. Ils se

distinguent aussi par les conditions de formation et les méthodes de caractérisation de ces

matrices. De plus dans le cas de cette thèse, les complexes formés ont été utilisés pour

l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles.


47

CHAPITRE 3: Problématique d'ensemble, hypothèse, but,

objectifs

3.1. Problématique d'ensemble

La microencapsulation est une méthode d'encapsulation très intéressante qui permet de

protéger les ingrédients encapsulés contre les facteurs externes et internes d'un aliment et

d'assurer leur stabilité pendant l'entreposage. Ceci est encore plus intéressant pour les

nutriments hydrosolubles sensibles perdus pendant la fabrication des aliments et qui ont

besoin d'être réincorporés dans les aliments lors de l'enrichissement de ceux-ci. La

majorité des études effectuées sur l'encapsulation ont porté surtout sur les ingrédients

liposolubles (Djordjevic, et al, 2004a & 2004b, Jimenez et al, 2004, Jouzel et al, 2003,

Kondo et al, 1996, Lamprecht et al, 2001, Liu et al, 2001, Soottitantawat et al, 2005a &

2005b). Peu d'études se sont penchées sur l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles et

moins sur la stabilité des systèmes d'encapsulation et la libération d'ingrédients encapsulés

dans le système digestif. Les quelques études effectuées sur l'encapsulation d'ingrédients

hydrosolubles ont été faites dans le domaine pharmaceutique (Cannon, 1993; Abra et al,

1984) avec l'utilisation de solvants non-comestibles, interdits dans le domaine alimentaire.

Finalement, les méthodes d'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles à incorporer dans les

aliments acides de type jus de fruits sont quasi inexistantes dans la littérature. Il est donc

important de développer une méthode de microencapsulation d'ingrédients hydrosolubles


48

dans le but d'enrichir ces aliments qui sont souvent entreposés dans des conditions de

température et de luminosité relativement élevées.

Les protéines de lactosérum et la pectine sont des composés naturels retrouvés dans le lait

et les agrumes, respectivement. Ces composés alimentaires sont largement disponibles à

l'état purifié sur le marché, ce qui fait d'eux une source très intéressante de matériaux

nécessaires à la formation de complexes pour l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles

et exempts de restriction gouvernementale. Ce sont des biopolymères chargés qui

permettent de former des complexes sur une large gamme de pH. Ceci est très intéressant

pour l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles polaires ou chargés qui peuvent être

attirés par l'un ou l'autre des polymères pendant la formation de complexes.

Les connaissances actuelles sur la microencapsulation d'ingrédients par des complexes

protéine-polysaccharide ont permis de comprendre certains aspects majeurs des interactions

entre ces polymères. Cependant, aucune étude n'a mis l'accent sur la relation entre les

caractéristiques (tailles et charge des particules) des complexes et les paramètres (pH,

modes d'acidification et ratio protéine: polysaccharide) gouvernant la formation de

complexes.

3.2. Hypothèse

Le complexe isolât de protéine de lactosérum/pectine faiblement méthylée est une matrice

adaptée à un système alimentaire acide qui permet d'encapsuler des ingrédients


49

hydrosolubles tels que la thiamine et les anthocyanes, et de les protéger contre les effets

dommageables du traitement thermique et des conditions d'entreposage. Ce complexe

permet aussi de libérer les ingrédients hydrosolubles dans un système digestif modèle.

3.3. But

Le but de ce projet est de proposer une technique d'encapsulation qui permet de protéger

des composés nutraceutiques hydrosolubles ajoutés aux jus de fruits.

3.4. Objectifs spécifiques

Objectif 1: Étudier les paramètres physico-chimiques (pH, ratio protéine:polysaccharide,

mode d'acidification) permettant la formation de complexes insolubles stables du système

IPL/PFM et établir les conditions optimales d'encapsulation de la thiamine, comme modèle

d'ingrédient hydrosoluble.

Objectif 2: Évaluer l'effet de la concentration sur l'encapsulation de thiamine et

d'anthocyanes par les complexes IPL-PFM et l'effet du ratio IPL:PFM sur l'efficacité

d'encapsulation des anthocyanes.

Objectif 3: Étudier la protection des ingrédients hydrosolubles par les complexes IPL/PFM

contre les effets dommageables du traitement thermique et durant l'entreposage, ainsi que

la stabilité des complexes dans un système digestif modèle, le TNO gastro-Intestinal tract

Model (TIM).
50

CHAPITRE 4:

Formation of native whey protein isolate-low methoxyl pectin

complexes as a matrix for hydro-soluble food ingrédient

entrapment in acidic foods

(Sous presse dans le Journal Food HydrocoUoids)


51

4.1. RÉSUMÉ

L'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et la pectine faiblement méthylée (PFM) peuvent

former des complexes solubles ou insolubles selon le ratio de polymères, du mode

d'acidification du milieu et du pH final. Les solutions d'IPL et de PFM ont été mélangées

afin d'obtenir des ratios protéine:pectine de 2:1, 1:1 et 1:2 à une concentration de polymère

(TPC) de 0.4% (p/p). Un ajustement du pH à 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 a été effectué avant ou

après mélange des solutions. Les complexes IPL/PFM obtenus à partir de ces solutions de

protéine:polysaccharide (P:Ps) à un ratio 2:1 ont été utilisés comme matrice

d'encapsulation de la thiamine. La turbidité, la taille des particules, le potentiel zêta et le

rendement des complexes (portion de complexes obtenus par centrifugation) ont été

évalués. Toutes ces caractéristiques observées ont révélé un effet du pH, du ratio de P:Ps et

du type d'acidification. Les complexes obtenus par acidification du milieu après le mélange

des solutions au ratio de P:Ps 2:1 étaient caractérisés par une plus petite taille qui restait

constante par rapport aux complexes obtenus par acidification des solutions avant leur

mélange. Le pH optimum pour un maximum de turbidité et de rendement de formation de

complexes au ratio 2:1 était aux environs de 3.0 avec les deux types d'acidification. La

diminution du ratio protéine :pectine entraînait un déplacement du maximum de

sédimentation vers les pH acides. La formation de complexes avec une acidification du

milieu avant le mélange des solutions résultait généralement en une plus grande masse de

complexes comparée à l'acidification après le mélange de solutions. L'optimum du contenu

de thiamine des complexes ainsi que celui de l'efficacité d'encapsulation, pour les deux

types d ' acidification était à pH 3.5.


52

4.2. ABSTRACT

Whey protein isolate (WPI) and low methoxyl pectin (LMP) may form soluble or insoluble

complexes depending on polymer ratios, mode of acidification and final pH. WPI and LMP

solutions were blended to obtain proteimpectin ratios of 2:1, 1:1 and 1:2 at a total polymer

concentration (TPC) of 0.4% (w/w) with pH adjustment to 4.0, 3.5, 3.0 2.5 either before or

after blending. WPI-LMP complexes, obtained from the mixing of WPI and LMP solutions

at proteimpolysaccharide (P:Ps) ratio 2:1, were used as thiamine carriers in the process of

thiamine entrapment. Suspension turbidity, particle size, zêta potential, sedimentable-

complexes yield (portion of complexes sedimentable by centrifugation), microscopic

appearance and thiamine content of the complexes as well as thiamine entrapment

efficiency (percent of thiamine entrapped) were evaluated. Ail observed characteristics

were largely dépendent on pH, proteimpectin ratios, and whether acidification was

performed before or after polymers blending (pre and post-blending acidification).

Complex size was constant and lower when acidification was done after mixing the

polymers at a proteimpectin ratio of 2:1 compared to when acidification was done before

the mixing. The optimum pH for maximum turbidity and sedimentable-complexes yield, at

a P:Ps ratio of 2:1, was around 3.0 with both pre and post-blending acidifications. With

decreasing protein :pectin ratio, the maximum sedimentable-complexes yield was shifted

towards acidic pH. Complex formation with pre-blending acidification produced generally

a larger mass of complexes than with post-blending acidification. The optimal thiamine

content of the complexes as well as the optimal entrapment efficiency, with ail acidification

modes, was found at pH 3.5.


53

4.3. INTRODUCTION

Protein and polyelectrolyte associative phase séparation has been actively studied in récent

years. Electrostatic interactions between oppositely charged polymers may lead to the

formation of polymer complexes (Biesheuvel & Stuart, 2004; Burgess, 1990; Kaibara,

Okazaki, Bohidar, & Dubin, 2000; Mattison, Brittain, & Dubin, 1995). This complex

formation is guided by polymer parameters (i.e. charge density, molar mass, concentration,

chemical nature and ratio) and by environmental conditions such as pH, ionic strength, and

ion type (Weinbreck, de Vries, Schrooyen, & de Kruif, 2003; Wen & Dubin, 1997).

External parameters such as température, shearing effect and pressure may affect the

formation and the stability of the complexes (Galazka, Ledward, Sumner, & Dickinson,

1997; Galazka, Smith & Ledward, 1999a; Galazka, Smith, Ledward, & Dickinson, 1999b;

Schmitt, Sanchez, Desobry-Banon, & Hardy, 1998). Complex formation may also be

influenced by intrinsic behaviours such as protein aggregation (Schmitt, 2000; Schmitt,

Sanchez, Despond, Renard, Thomas, & Hardy, 2000; Schmitt, Sanchez, Thomas, & Hardy,

1999). Complexes resulting from electrostatic interactions between a protein and an anionic

polysaccharide may be soluble or insoluble depending on environmental conditions and

they may concentrate, thus forming two solvent layers, one containing most of the polymer

complexes and the other relatively free of complex (Weinbreck et al., 2003). Interactions

between the two oppositely charged polymers, as the pH was lowered, hâve revealed a

séquence of events. First, soluble intrapolymer complexes, resulting from attractions

between protein and anionic polysaccharide molécules, are initiated at a spécifie pH called
54

complexation pH (pHc) (Girard, Sanchez, Laneuville, Turgeon, & Gauthier, 2004;

Weinbreck et al, 2003). As intrapolymer complexes become sufficiently neutralized, they

aggregate and form interpolymer complexes at a pH called pH,), where visual séparation can

be observed (Weinbreck et al, 2003). The same séquence of event could occur with a

protein and a cationic polysaccharide as the pH is increased (Kaibara et al., 2000; Mattison

et al, 1995; Mattison, Dubin, & Brittain, 1998; Wang, Gao, & Dubin, 1996; Wen & Dubin,

1997). Thèse critical pH boundaries may be shifted towards lower values by increasing the

ionic strength in the case of the System whey proteins/anionic Ps Systems (Weinbreck,

Nieuwenhuijse, Robijn, & de Kruif, 2004). Moreover, the addition of high concentrations

of sait may reduce or suppress complex formation (Bungenberg de Jong, 1949; Burgess,

1994; de Kruif, Weinbreck, & de Vries, 2004).

Numerous studies hâve focused on individual complex characteristics such as particle size,

charge, and parameters such as the pH, affecting protein/polyelectrolyte complex formation

(Kaibara et al, 2000; Mishra, Mann, Joshi, 2001; Savant, & Torres, 2000) and hâve thus

shed light on major aspects of the interactions between proteins and polysaccharides.

However, none hâve focused on the effects of différent acidification procédures on the

characteristics of whey protein isolate -low methyl pectin (WPI-LMP) complexes. WPI

contains a mixture of proteins. pMactoglobulin, its major component, is widely used in the

food industry in regard to its binding (Kontopidis, Holt, & Sawyer, 2002, 2004),

emulsifying (Léman, Dolgan, Smoczynski, & Dziuba, 2005), foaming (Bals & Kulozik,

2003), and gelling (Kerstens, Murray, & Dickinsbn, 2005) properties. Pectin is a

polysaccharide associated with the cell wall and intercellular régions of plants and fruits
55

(Schols & Voragen, 2002; Voragen, Pilnik, Thibault, Axelos, & Renard, 1995).

Commercial low methoxyl pectins are anionic polysaccharides with D-galacturonic acid

units, obtained from de-esterification of high methoxyl pectin (Robin, 2002). The degree of

esterification (ratio of esterified galacturonic acid groups to total galacturonic acid groups)

divides commercial pectin into high ester (HM) and low ester (LM). Pectin is widely used

as a gelling and stabilizing agent in foods. Water-soluble ingrédient encapsulation can be

achieved by différent means such as spray-chilling, spray-cooling, spray-drying, fluidized-

bed coating (Schrooyen, van der Meer, & De Kruif, 2001) but most of water-soluble

microencapsulation hâve been using several methods including coacervation (Huang,

Chung, & Tzeng, 1997), adsorption on microspheres (Lucinda-Sylva & Evangelista, 2003),

liposomes (Banville, Vuillemard, & Lacroix, 2000; Nii & Nishii, 2005), emulsion (Huang,

Chung, & Tzeng, 1997), and solvent evaporation (Huang, Chung, & Tzeng, 1997; Xu, Fu,

Hu, Duan, & Zhang, 2006).

In the présent study, the development of WPI-LMP complexes as a matrix for hydro-

soluble ingrédient entrapment in acidic média was investigated. Turbidity and différent

factors affecting the complex formation (particle size, sedimentable-complexes yield, and

charge) were measured as a function of pH decrease before (pre-blending) and after (post-

blending) mixing the polymer solutions. Thiamine was added during the complex

formation to evaluate the entrapment ability of the complexes. Thiamine hydrochloride is

stable at acidic pH and is a water-soluble vitamin which structure consists of a pyrimidine

ring and a thiazole ring (pka = 2.44) connected by one carbon link. The nitrogen in the

thiazole ring has a positive charge. Thus, thiamine was chosen as a model ingrédient to

evaluate entrapment by WPI-LMP complexes at acidic pH.


56

4.4. MATERIALS AND METHODS

4.4.1. Materials

The major protein content of BiPRO® whey protein isolate (Davisco Foods International

Inc., Le Sueur, MN, USA), was as follow: 64.47% pMactoglobulin, 23.02% a-lactalbumine,

2.36% Bovine Sérum Albumin, and 2.67% Immune Globulin G, total protein 91%). Low

methyl pectin (36% esterified, molar mass of 100 kDa) was kindly donated by CP Kelco

(Copenhagen, Denmark) while thiamine hydrochloride (molar mass of 337.27 g/mol) was

purchased from Sigma (St-Louis, MO, USA). Even though low methoxyl pectin samples

were from différent lots, variations due to that différence were not observed in the results

during the project.

4.4.2. Reagents

Dioctylsulfosuccinate sodium sait, formic acid (99%), potassium hydroxide, and

trichloroacetic acid (TCA) were purchased from Fisher scientific (Nepean, ON, CA),

HPLC-grade methanol was purchased from VWR international (West Chester, PA, USA).

4.4.3. Préparation of solutions

A protein solution free of insoluble particles and denatured proteins was obtained by

stirring a suspension of WPI (10% w/v) in HPLC-grade deionised water for two hours,

letting it stand at 4°C overnight, adjusting the pH to 5.0 (at which denatured proteins are

insoluble) with hydrochloric acid, and centriruging at 25 000 g for 40 min (Sorvall
57

Instruments RC5C, Du Pont Company, CT, USA). The pellet was discarded and the

supernatant was lyophilized. The protein content of the supernatant (90%), very close to the

measured protein content (91%) of the original WPI powder, was determined by an FP-528

Nitrogen/Protein determinator (Leco Co., St. Joseph, MI, USA). Both measurements were

performed on a dry basis. Stock solutions of 2% (w/v) WPI and 2% (w/v) LMP were

prepared by dispersing the lyophilized WPI powder and pectin powder in HPLC-grade

deionised water and stirring at ambient température for two hours. Heating at 80°C for 10

min prior to stirring was required for LMP for better solubilisation. The WPI and LMP

solutions were then stored at 4°C overnight to complète the hydration until use.

4.4.4. Complex formation and thiamine entrapment

The literature reports that increasing the TPC (0.05 to 0.15%) increased the complex

formation yield (Singh & Burgess, 1989). Schmitt, (2000) also reported that p-

lactoglobilin-acacia gum complex sizes increased up to 200um with the increase of the

TPC up to 1% at pH 4.2. Based on thèse works, preliminary trials on complex formation

were performed at WPLLMP ratio 2:1 with 2.0% (w/w) TPC at pH 3.0 and resulted in

higher particle sizes over 500|j.m (not shown). Furthermore, turbidity measurement of

WPI/LMP suspension (0.4, and 0.8% TPC (w/w) at ratios 2:1, 1:1, and 1:2 suggested that

complexation was maximum at pH 3.5 only with 0.4% TPC at ratio 2:1 while other ratios

and TPC indicated maximum complexation below pH 3.5. Considering literature reports

and preliminary trials, WPLLMP at 0.4% TPC (w/w) was chosen for complex formation at

acidic pH. For complexation by post-blending acidification, WPI and LMP stock solutions

were initially diluted to concentrations corresponding to WPLLMP ratios of 2:1, 1:1, and
58

1:2 for a TPC of 0.4%. The diluted WPI and LMP solutions were adjusted to pH 7.0, mixed

at the predetermined ratios and the pH of the mixture (pH 7.0) was brought gradually to

4.0, 3.5, 3.0 and 2.5 by addition of HCl (0.5N) with gentle magnetic stirring for 3 min at

each pH before decreasing it to the next pH. For complexation by pre-blending

acidification, diluted WPI and LMP solutions were individually acidified to pH 4.0, 3.5,

3.0, and 2.5 by addition of HCl (0.5N) after they were set to pH 7.0, then mixed at ratios of

2:1, 1:1 and 1:2 and gently stirred for 3 min. For each ratio, pH, and mode of acidification,

WPI-LMP complex formation was monitored by measuring solution turbidity, zêta

potential, complex size and sedimentable-complexes yield as well as by microscopic

observation. Thiamine entrapment was done by combining (0.4% w/w) thiamine solution

and LMP solution followed by adding WPI solution at a P:Ps ratio of 2:1 to give a final

suspension containing 0.27%WPI, 0.13% LMP and 0.1% thiamine. A 30g portion of this

solution was centrifuged (8000 g/30 min at 22°C) and the pellet was freeze-dried.

4.4.5. Turbidity measurement

Turbidity measurements (nephelometry) were done using a Laboratory Turbidimeter

(Nephelometer) 2100AN IS (Hach Company, Loveland, CO. USA) with 30ml samples of

complex suspension (mixed solutions). For each measurement, a sample cell (a 30 ml glass

tube) filled with a 30ml sample was placed in the cell compartment. A light emitting diode

source emits an infrared light (870 nm) through a sample cell path (2.5cm) to two scatter

detectors, a 90° detector, and a transmitted light detector. The resuit was displayed in

Nephelometric Turbidity Units (NTU).


59

4.4.6. Zêta potential measurement

The zêta potential or particle surface electrical potential at the liquid shear plane of the

complexes was measured using a Zetasizer 2000 (Malvern Instrument Ltd., Malvern,

Worcestershire, UK) with 10ml samples. Samples at WPLLMP ratio 1:1 at pH 3.0 and 2.5

required a two fold dilution in HPLC-quality water at the same pH. The zêta potential is

calculated from the electrophoretic mobility of the charged particles.

4.4.7. Complex particle size

Complex particle size was determined using a Mastersizer 2000S (Malvern Instruments

Ltd., Malvern, Worcestershire, UK) equipped with a 632.8 nm He-Ne laser source and a

measuring cell path length of 2.4mm. For each measurement, 150 ml samples were stirred

by the dispersion unit at 980 rpm and at a spécifie pH. This System measures particle sizes

(D[4,3]) ranging from 0.02 to 2000um.

4.4.8. Sedimentable-complexes yield

After 3 min stirring of WPI-LMP mixtures at a spécifie pH, 30g sample were centrifuged at

8,000 g for 30 min and the pellets were freeze dried. The dry pellets were kept at -18°C

until use. The sedimentable-complexes yield, or percent précipitation of the polymers in

complex formation, was calculated as foliows:


60

Sedimentable - complexes yield = — x 100


Weight of total polymers in 30 g of mixture
4.4.9. Microscopic observation

Complexes were observed with a phase contrast microscope (BX51TRF model, Olympus

Optical Co LTD., Melville, NY, USA) equipped with a caméra (Photometrics CoolSNAP

fx, Image Processing Solutions Inc., North Reading, MA, USA).

4.4.10. Détermination of thiamine

Complex-entrapped thiamine was determined by HPLC (Woollard & Indyk, 2002). A

freeze-dried pellet was suspended in 0.6M trichloroacetic acid (TCA) solution in order to

drop the pH to 1.0 and release thiamine as WPI-LMP complexes dissociate at this pH value

(the positive charge of WPI molécules and the neutral charge of LMP molécules prevented

their binding to thiamine molécules). The suspension was stirred for 1 hour andfîlteredon

0.2 um nylon membrane (Millipore Inc., Billerica, MA USA) to a final volume of 30 ml

with 0.6M TCA. A 2 ml portion of filtrate was centrifuged at 16 000 x g for 10 min

(Micromax model, International Equipment Company, MA USA) to obtain samples for

injection into the HPLC column. A HPLC model 126 (Beckman instruments Inc.,

Fullerton, CA, USA), equipped with LiChrospher 100 RP-18 column (250 x 4mm, 5.0 um)

and a LiChrospher 100 RP-18 Guard column (4.0 x 4 mm, 5 um) (Agilent Technologies

Inc., Mississauga, ON, CA) was used for thiamine quantification. An isocratic mobile

phase (1 g of dioctylsulfosuccinate sodium sait, 550 ml methanol, 10 ml formic acid, at pH

4.4) at a flow rate of 1 ml/min was used. Samples (40 ul) were injected by an autosampler

séries 1100 (HP, Mississauga, ON, Canada). Thiamine was detected by UV detector model
61

166 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA) at 254 nm and compared to an

external standard. The thiamine content of the complexes was calculated as follows:

_. » ■ Weightof thiamine in dry pellet 1 A n


Thiamine content of the complexes = — — x 100
Weight of dry pellet

The entrapment effïciency was calculated as follows:

™. Thiamine content in 30 g ofdissolved dry pellet ...


Entrapment effïciency= — x 100
Thiamine content in 3 0 g of initial complex suspension

4.4.11. Statistical analysis

Statistical analyses were performed with the SAS system (SAS Institute Inc. Cary, NC,

USA) as 3 (ratios) x 4 (pH) factorial experiments. The repeated measures ANOVA design

was adjusted to the post-blending acidification data with a three-level treatment (ratios 2:1,

1:1, and 1:2) and a four-level pH sub-treatment (pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5). Pre-blending

acidification data were analyzed as a randomized complète block design by ANOVA with

three treatments (ratios 2:1, 1:1, and 1:2) and four samplings (pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5).

Control data for size measurement were analyzed using the t Tests (LSD). Ail experiments

were performed in triplicates.


62

4.5. RESULTS

4.5.1. Turbidity measurement

The turbidity of WPI-LMP complex suspensions is presented in Figure 4.1. At each pH,

the turbidity decreased significantly (P<0.0001) with the decrease of the ratio, except at pH

2.5 for pre-blending acidification. In addition, at a given ratio the turbidity increased at pH

4.0 through pH 3.0 followed by a decrease at pH 2.5. However, the decrease in the turbidity

was not observed for ratios 1:1 and 1:2 in the post-blending acidification. Complexes

obtained by pre-blending acidification were generally more turbid than those obtained by

post-blending acidification.

4.5.2. Small angle static light scattering

Particles sizes in the control solutions (0.27% WPI solution and 0.13% LMP solution) were

lower than those of WPI-LMP complexes at ail pH studied. Indeed, particle size in 0.27%

WPI solution increased from 6.96 to 21.80um with the acidification (pH 4.0 to 2.5) while in

the case of 0.13% LMP solution, the particle size varied from 1.70 to 1.36 \im with the

acidification (Table 4.1). The size of complexes formed by post-blending acidification

increased significantly (p = 0.0096) as the P:Ps ratio decreased (Fig. 4.2). No such

behaviour was observed with the pre-blending acidification. However, complex size was

generally bigger for pre-blending acidification at ail three ratios compared to post-blending

acidification except at pH 4.0. For each ratio, pre-blending acidification resulted in a

significant increase (P - 0.0246) in complex sizes as the pH decreased while the size stayed

generally constant (P = 0.3781) with post-blending acidification.


63

4.5.3. Zêta potential

WPI solution (0.27%) was positively charged over the pH range studied, with zêta potential

values ranging from 17 to 32 mV (not shown). The zêta potential of both pectin solution

(0.13%) and WPI-LMP complex suspensions was négative but it decreased in magnitude

with the decrease of the pH (Fig. 4.3). In contrast, post and pre-blending acidifications of

WPI-LMP suspensions at ratios 2:1 and 1:1 resulted in small positive zêta potential values

at pH < 3.0. The effect of dilution at P:Ps ratio 1:1 (pH 3.0 and 2.5) slightly increased the

zêta potential values by approximatively 5 mV (not shown).

4.5.4. Sedimentable-complexes yield

In both post and pre-blending acidification modes, the sedimentable-complexes yield

increased (P < 0.0001) to a maximum at pH 2.5 for WPI:LMP ratios 1:1 and 1:2 (Fig. 4.4).

With WPI:LMP ratio 2:1, the sedimentable-complexes yield was highest at pH 3.5-3.0 and

decreased at pH 2.5. The maximum sédimentation shifted to more acidic pH with the

decrease of the P:Ps ratio.

4.5.5. Microscopic observation

Microscopic observation revealed that the structure of the complexes became more

compact as the pH of the mixture decreased in both complexation modes (Fig. 4.5).
64

Complexes obtained by post-blending acidification seemed more condensed. Also, the

visual cohésion of the complexes weakened with decreasing P:Ps ratio (not shown).

4.5.6. Thiamine entrapment

Thiamine content of WPI-LMP complexes and thiamine entrapment efficiency, at ratio 2:1

and with 0.1% added thiamine, are presented in Figure 4.6 and 4.7, respectively. Post-

blending acidification resulted in a decrease of the thiamine content of the complexes with

the decrease of the pH, while pre-blending acidification showed no spécifie pattern as a

function of pH. Maximum thiamine content of the complexes occurred at pH 4.0 for post-

blending acidification (2.2%) and at pH 3.5 for pre-blending acidification (1.9%). However,

the thiamine content of the complexes in pre-blending mode was higher (p< 0.0001) than

that of the post-blending mode from pH 3.5 to 2.5. The entrapment efficiency (Fig. 4.7)

showed an increase of the entrapment followed by a decrease, in both modes of

acidification. Maximum entrapment efficiency was found at pH 3.5 for pre-blending

acidification (6.99%) and at pH 3.5-3.0 for post-blending acidification (~4.50%).

Moreover, the entrapment efficiency in the pre-blended mode was higher than the

entrapment efficiency in the post-blended mode at ail pH studied.


65

4.6. DISCUSSION

This study has demonstrated that parameters such as pH, proteinrpectin ratio, and the

method of acidification hâve considérable influence on WPI-LMP complexes

characteristics. Thèse parameters had also a major impact on thiamine entrapment.

4.6.1. EffectofpH

At pH < 4.0, attractive interactions between oppositely charged WPI and LMP resulted in

complex formation characterized by various patterns of changes in turbidity (Fig. 4.1),

particle size (Fig. 4.2), and sedimentable-complexes yield (Fig. 4.4) as well as in decreasing

complex zêta potential (Fig. 4.3). In fact, the pH range of 4.0 to 2.5 corresponds to a zone

where insoluble interpolymer complexes form and phases separate (Girard et al., 2004).

Similar work with différent polymers (whey protein-gum arabic) suggested insoluble

complex formation at pH < 4.8 (Weinbreck et al, 2003). The decrease of the pH of the

WPI/LMP mixture increased the electrostatic attractions between the oppositely charged

polymers, allowing maximum complexation at a spécifie pH (pH 3.0 for WPI.LMP ratios

2:1 and pH 2.5 for WPLLMP ratios 1:1, and 1:2). At pH 3.0, maximum turbidity was

related to maximum sedimentable-complexes yield at P:Ps ratio of 2:1 (Fig. 4.1 & 4.4). The

decrease of the sedimentable-complexes yield at pH 2.5 with WPLLMP ratio 2:1 probably

results from the loss of charge on the pectin molécules, since this pH is below the pKa

(-3.4) of their carboxylic groups (Evageliou, Richardson, & Morris, 2000; Ralet, Dronnet,

Buchholt, & Thibault, 2001).


66

4.6.2. Effect of protein:pectin ratio

It is well known that the number of protein molécules available per pectin chain is

important in electrostatic complex formation (Girard, Turgeon, & Gauthier, 2003). For a

given P:Ps ratio, there is a spécifie pH at which electroneutrality of the complexes is

reached (Schmitt, 2000). This pH is defined as the electrical équivalence (EEQ) and

corresponds to the pH at which macromolecules carry equal and opposite charges, leading

to optimal complexation (Burgess, 1994). At our highest WPI-LMP ratio (2:1), neutrality of

WPI-LMP complexes was reached between pH 3.5 and 3.0 (Fig. 4.3), corresponding to

maximal turbidity (Fig. 4.1) and maximal sedimentable-complexes yield (Fig. 4.4). At pH

2.5, complex formation at ratio 1:1 was maximal and the zetapotential neared neutrality

(Fig. 4.3), while complexes of ratio 1:2 were still negatively charged, like pectin alone.

Thèse observations indicated that at a ratio of 1:2, neither EEQ nor maximum complexation

was reached. At that ratio, complexes had a négative zêta potential and after 3 minutes of

stirring, the complex formation was still incomplète. Decreasing the proteimpectin ratio

shifted the complexation maximum towards acidic pH. Indeed, since WPI content

decreased with the decrease of WPLLMP ratio, higher acidification may be required for

WPI molécules to neutralize LMP molécules. Furthermore, the size of the post-blending

acidification complexes appeared constant (P = 0.3781) at a ratio of 2:1 (Fig. 4.2A). This

size constancy may be the resuit of a better structured complex networks generated by the

post-blending acidification, due to enhanced display of positive groups by WPI molécules,

and hence binding to LMP molécules with greater strength. This may also explain the

compact structure observed on the micrographs (Fig. 4.5 Al-A4). In contrast, complexes
67

formed by pre-blending acidification increased in size as the pH decreased, suggesting that

there was insufficient time for WPI and LMP molécules to set sélective electrostatic

interactions (aggregation of intrapolymer complexes), resulting in less compact but more

turbid and bigger complex sizes. This behaviour is corroborated by the fibre-like structure

on the pre-blending complex micrographs (Fig. 4.5 B1-B4).

4.6.3. Effect of acidification mode

Pre-blending acidification generally provided WPI-LMP complexes with greater turbidity,

size, and zêta potential than did post-blending acidification. However, the size constancy in

the post-blend System may resuit from the graduai acidification which allowed more time

for complexes to rearrange in a compact structure. In contrast, no time was allowed to the

pre-blend System to rearrange as the complex formation was spontaneous at the mixing of

the polymer solutions. The effect of the method of complex formation was also

considérable on the sedimentable-complexes yield which appears to be inversely related to

the zêta potential of the complexes. Indeed, as the charge neared zéro, the sedimentable-

complexes yield reached its maximum value. Pre-blending acidification produced a larger

mass of complexes than did post-blending acidification (Fig. 4.4) at ratios of 2:1 (pH 4.0

and 3.5), 1:1 and 1:2 (pH 4.0 and 3.0), possibly by physically entrapping extra protein

molécules in the complex network during the quick mixing of WPI and LMP solutions.

Moreover, the highest proteimpectin ratio (2:1) in post-blending acidification mode

produced the smallest complex size at ail pH (Fig. 4.2A) which corroborâtes previous

works (Sanchez & Renard, 2002; Tiyaboonchai, Woiszwillo, & Middaugh, 2001). Possibly,
68

P:Ps ratios with lower proportions of protein form less compact complex networks

resembling the pre-blending-acidifïed fibrous complex networks with bigger complexes.

However, the gain of bigger complex sizes at pH 4.0 obtained by post-blending

acidification may be due to electrostatic attractions between WPI and LMP having already

initiated at pH 6.1, (pHc) (Girard, Turgeon, & Gauthier, 2002) during lowering of the pH

from 7.0, thus allowing an extra complex formation by the time the pH reached 4.0. With

both acidification modes at WPI:LMP ratio 2:1, more than 88% of the total polymer was

involved in complexation at pH 3.0 compared to about 76% polymer at pH 2.5.

4.6.4. Ability of the complexes to entrap thiamine

The observed effects of pH, protein:pectin ratio, and method of acidification on the

characteristics of the complexes suggested that post-blending acidification at a WPI-LMP

ratio of 2:1 provided small and constant complex size along with the greatest sedimentable-

complexes yield for thiamine entrapment at pH 3.0. This ratio should prevent précipitation

of larger complexes in a liquid food. Furthermore, the increased sedimentable-complexes

yield obtained with both types of acidification at pH 3.5 and 3.0 was compatible with the

maximal thiamine content of the complexes (Fig. 4.6) and the maximal entrapment

efficiency (Fig. 4.7) at pH 3.5. Indeed, much of the complexes formed at pH 3.5 were still

negatively charged, favouring the binding of positively charged thiamine molécules during

entrapment, while at pH 3.0 the complexes were positively charged. The slight extra

entrapment efficiency obtained with post-blending acidification at pH 3.0 (WPI:LMP ratio

2:1) compared to that at pH 3.5 may be associated with greater sedimentable-complexes

yield at the same pH and ratio (Fig. 4.4A). The relationship between the sedimentable-
69

complexes yield and thiamine entrapment suggested that the maximum entrapment of an

ingrédient within WPI-LMP complexes dépends on the combination of the amount of

complexes formed and their charge, and the charge of the ingrédient. On the other hand, the

decrease of the thiamine content of the complexes as pH decreased in the case of post-

blending acidification may be due to the decrease in négative charge of LMP as the pH is

lowered. Another reason may be the compétition between WPI and thiamine molécules in

binding to the decreasing-negative charged LMP. The higher thiamine content of the

complexes (pH 3.5-2.5, Fig. 4.6) and the higher entrapment efficiency (pH 4.0-2.5, Fig.

4.7) at ratio 2:1 obtained by complexing polymers after pre-blending acidification,

compared to post-blending acidification, may be related to extra physical entrapment.

Indeed, higher entropy generated by the quick mixing in the pre-blended system may hâve

helped the gathering of thiamine molécules and complexes. At pH 3.5 (in both methods of

acidification), the thiamine content of the complexes obtained, allows fulfilling the

Recommended Daily Allowance (Report of the Standing Committee on the Scientific

Evaluation of Dietary Référence Intakes and its Panel on Folate, Other B Vitamins, and

Choline and Subcommittee on Upper Référence Levels of Nutrients, Food and Nutrition

Board, Institute of Medicine, 1998; Health Canada, 2007) of the vitamin for an adult maie

(1.2 mg), with 70-80 mg of the dry complexes.


70

4.7. CONCLUSION

Our results indicate that complex formation by electrostatic interaction between whey

protein isolate and low methyl pectin is highly dépendent on the pH of the médium, the

proteimpectin ratio and the method of acidification. A pH of 3.5-3.0 was optimal for

maximum complex formation by both pre and post-blending acidifications at a ratio of 2:1.

Among the P:Ps ratios studied, complexes obtained at a ratio of 2:1 using post-blending

acidification were characterized by a constant and smaller particle size with a greater

amount of sedimentable-complexes formed, compared to bigger complexes found in the

case of pre-blending acidification. The characteristics associated with post-blending

acidification at a P:Ps ratio of 2:1 provided the best structure for thiamine entrapment.

Although thiamine entrapment with both pre and post-blend Systems indicated optimum

entrapment at pH 3.5, which is appropriate for acidic foods, post-blending acidification

may be preferred for hydro-soluble ingrédients, considering the structural advantages of the

resulting complexes. Maximum entrapment efficiency was approximatively 7% for pre-

blending acidification and 4.5% for post-blending acidification, respectively, at pH 3.5. A

relatively small amount of dry complexes would be needed to satisfy the Recommended

Daily Allowance of thiamine. Studies of the effect of vitamin concentration on thiamine

content of the complexes and the protective effect of the complexes on the entrapped-

vitamin are under investigation in our laboratory.


71

Table 4. 1. Least square means (SE, N = 9) of the particle size of the control solutions
(0.27% WPI and 0.13% LMP solutions)

pH 0.27% WPI 0.13% LMP


4.00 6.96d 1.70a
(0.25) (0.18)
3.50 15.42c 1.48b
(1.95) (0.09)
3.00 18.99b 1.38b
(2.03) (0.12)
2.50 21.80 1.36b
(1.32) (0.10)
abcd: means within a column lacking a common letter differ (Po0.05).
WPI: whey protein isolate.
LMP: low methoxyl pectin.
72

2500

2000
a
w 1500

| 1000
3
H
500
i
0 — 1

2500- B

2000-

w 1500 H
-S
| îooo H
500-1

0
lI
"r:

.1
4 3 5 3 2 5
» pH »
Figure 4.1. Turbidity (least squares means of NTU) of WPI-LMP complexes at 0.4% total

polymer and ratios of 2:1 (El), 1:1 (E2) and 1:2 (D): A) Post-blending acidification and B)

Pre-blending acidification. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
73

350-i
300-
250-
| 200-

ii
J 150-
§
mr> 11
i ■
100-
50-
0- i
B

350-
300-
250
| 200-!
r I
.§ 150i *Ê %
w
100
Y/ 1
50 H
Â
0
rWH
4 3,5 PH 3 I
2,5

Figure 4.2. Size (least squares means of um) of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer

and ratios of 2:1 (El), 1:1 (0) and 1:2 (D): A) Post-blending acidification and B) Pre-

blending acidification. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
74

3,5 2,5
10 n pH
1^
0
H
a -10
-20 I î
I
-30
!
-40-
N
-50-

-60-

10 t
B
0 r* ♦i
♦-

II
♦<
♦<
a-io ♦<
♦<
♦<
♦<
♦ ♦•
♦•
20-
1 ♦•

c
1 -30 i lll
a
| -40
SI -50-
-60-

Figure 4.3. Zêta potential (least squares means of mV) of 0.13% LMP (H) and WPI-LMP
complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1 (E3), 1:1 (E2) and 1:2 (□): A) Post-blending
acidification and B) Pre-blending acidification. Vertical bars represent standard errors of
the mean (N = 6).
75

Figure 4.4. Sedimentable-complexes yield (least squares means of % of polymer in


centrifugal pellet) of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1 (H), 1:1
(0) and 1:2 (D): A) Post-blending acidification and B) Pre-blending acidification. Vertical
bars represent standard errors of the mean (N = 6).
76

^M^RnÊÊfàSmmffl&ÊÊS&ÊBmSBm ■ ''^mSmFmxmm^m WÊSSmSmÊl^m^^^^m^wm^m fl^M&^^s^^l^l

Figure 4.5. Phase contrast micrographs of WPI-LMP complexes dispersion (0.4% total
polymer content) obtained by post-blending acidification (A) and by pre-blending
acidification (B), with a proteimpectin ratio of 2:1. Numbers 1-4 refer tofinalpH values of
4.0, 3.5, 3.0, and 2.5, respectively. The scale bars represent 100 um.
77

£ 2,0-

.9 1,0
S

4 3,5 2,5
pH

Figure 4.6. Thiamine content of the complexes (least squares means of % of thiamine in
centrifugal pellet) of WPI-LMP complexes obtained at ratio 2:1 by post-blending
acidification (S) and pre-blending acidification (D). Vertical bars represent standard errors
of the mean (N = 6).
78

3,5 2,5
pH

Figure 4.7. Entrapment efficiency (least squares means of % of thiamine in suspended


centrifugal pellet) of WPI-LMP complexes at ratio 2:1 obtained by post-blending
acidification QM) and pre-blending acidification (□). Vertical bars represent standard errors
ofthemean(N = 6).
79

CHAPITRE 5

Evaluation of the ability of whey protein isolate-low methoxyl

pectin complexes to entrap water-soluble ingrédients

Sera soumis pour publication dans le journal Food HydrocoUoids


80

5.1. RÉSUMÉ

L'encapsulation de thiamine et d'anthocyanes a été effectuée en utilisant les complexes

isolât de protéines de lactosérum (IPL)/pectine faiblement méthylée (PFM). Différentes

solutions de PFM contenant de la thiamine et des anthocyanes ont été ajoutées à des

solutions d'IPL pour obtenir des mélanges IPL/PFM contenant 0, 0.002, 0.01, 0.05 et 0.1%

de thiamine et 0.1, 0.2 et 0.3% d'anthocyanes avec un ratio P:Ps de 2:1 (0.4% de polymères

totaux). Séparément, des mélanges d'IPL/PFM contenant 0.025% p/p d'anthocyanes ont été

préparés aux ratios P:Ps de 2:1 et 1:1. Les mélanges contenant de la thiamine ont été ajustés

à pH 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 (chapitre 4, section 4.4.4.). Les complexes ont été séparés par

centrifugation. La thiamine et les anthocyanes ont été extraits et quantifiés par HPLC et par

spectrophotométrie, respectivement. L'effet de la concentration des ingrédients sur

l'efficacité d'encapsulation et le rendement en complexes (thiamine) a été évalué. Par

ailleurs, l'encapsulation des anthocyanes à différents ratio P:Ps a aussi été évaluée.

L'addition de thiamine n'a pas affecté le rendement en complexes excepté une chute à pH

3.5 qui semblait exprimer une saturation des complexes par des hautes concentrations de

thiamine. Le contenu de thiamine des complexes augmentait avec l'ajout de thiamine alors

que le maximum de l'efficacité d'encapsulation se trouvait à pH 3.5, dans les deux types

d'acidification. Le maximum d'encapsulation des anthocyanes a été obtenu avec le ratio

P:Ps de 2:1 comparé au ratio 1:1. De plus, l'efficacité d'encapsulation des anthocyanes

augmentait linéairement avec l'augmentation de la concentration en anthocyanes. Le

système IPL/PFM représente donc un moyen efficace d'encapsulation d'ingrédients

hydrosolubles en milieu acide.


81

5.2. ABSTRACT

Thiamine and anthocyanins were entrapped using whey protein isolate (WPI)-low methoxyl

pectin (LMP) complexes. LMP solutions containing 0, 0.004, 0.02, 0.1, and 0.2% (w/w) of

thiamine and 0.2, 0.4, and 0.6% (w/w) of anthocyanins were added to WPI solutions to

obtain WPI-LMP mixtures containing 0.002, 0.01, 0.05, and 0.1% thiamine, and 0.1, 0.2,

and 0.3% anthocyanins, respectively, with a protein:polysaccharide (P:Ps) ratio of 2:1.

Separately, WPI-LMP mixtures with 0.025% w/w anthocyanins were prepared at P:Ps

ratios of 2:1 and 1:1. Ail mixtures had 0.4% total polymer. Mixtures containing thiamine

were acidified to pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5 before and after blending the polymer solutions.

Complexes were obtained by centrifugation. Thiamine and anthocyanins were extracted

from the pellets and quantified by HPLC and UV-spectrophotometry, respectively. The

effect of ingrédients concentrations on their entrapment efficiency, and the sedimentable

complexes yield (thiamine), were evaluated. Anthocyanins entrapment with différent P:Ps

ratios was also investigated. Thiamine addition did not affect the sedimentable-complexes

yield except a drop at pH 3.5 which may express complex saturation by high concentrations

of thiamine. Thiamine content of the complexes increased with the increase of added

thiamine in both modes of acidification while the entrapment efficiency culminated at pH

3.5. Anthocyanins entrapment was higher with P:Ps ratio 2:1 compared to ratio 1:1.

Anthocyanins entrapment efficiency increased linearly with anthocyanins concentration.

This system represents an efficient means for water-soluble ingrédients entrapment in

acidic médium.
82

5.3. INTRODUCTION

Food enrichment has become an interesting way of replenishing food products with

essential nutrients lost during their processing (Sinclair, 1979) and it represents an excellent

mode of preventing diseases caused by the lack of thèse nutrients (Abrams & Atkinson,

2003; Dunn, 2003). However, many enriched food products suffer oxidation damages and

dégradations of added nutrients during storage. One way to prevent thèse damages may be

the use of microencapsulation in the food enrichment process. Microencapsulation may be

thought of as a process of forming a continuous layer around a small core ingrédient (Luzzi,

1970; Young, Sarda, & Rosenberg, 1993) which may be solid particles, liquid droplets, gas,

or microbial cells (Ouyang et al, 2004). Thus, microencapsulation may protect sensitive

nutrients from inner environmental damages (light, oxygen, food particles interactions) and

it provides not only stability to the encapsulated ingrédients but promûtes manipulation and

easy control of the released ingrédients in the targeted System (Versic, 1988). Although

various microencapsulation methods are used in the food industry, the application of each

one dépends on the purpose of the method. Microencapsulation could be separated in two

methods. Physical methods regroup spray-drying, air suspension coating, extrusion, spray-

chilling, and inclusion processes. Chemical methods are represented by phase séparation

methods and emulsions (Dziezak, 1988; Versic, 1988; Yuliani, Bhandari, Rutgers, &

D'Arcy, 2004).

Phase séparation is the process by which a single solid or liquid phase séparâtes into two or

more new phases (IUPAC, 1997). Moreover, associative phase séparation occurs in
83

présence of electrostatic attraction between two polymers in aqueous médium (de Kruif,

Weinbreck, de Vries, 2004) leading to polymers complex formation Several associative

phase séparation techniques used for microencapsulation of ingrédients utilizes

complexation between polymers of protein and polysaccharide (Chilvers, Gunning, &

Morris, 1988; Tirkkonen, Turakka, & Paronen, 1994; Tiyaboonchai, Woiszwillo, &

Middaugh, 2001). Advantages of using phase séparation methods in the food industry

include the absence of harsh treatments and the use of edible sol vent (water).

Various researches on microencapsulation of water-soluble ingrédients hâve used diverse

biopolymers Systems such as biodégradable polylactid/polyethylene glycol

microparticulates (Huang, Chung, & Tzeng, 1997) or alginate-chitosan microspheres

(Lucinda-Sylva & Evangelista, 2003) for drug release. Some other works reported the

microencapsulation of anthocyanins pigments either by spray drying, using cyclodextrin as

a coating agent (Ersus & Yurgadel, 2007) or using cyclodextrin as a simple carrier

(Yamada, Komiya, & Akaki, 1980). Indeed, anthocyanins (Fig. 5.6) which are water-

soluble nutraceutical compounds containing a stable positive charge in very acidic

condition (pH 1.0), exhibit a tertiary structure, in plant, which protect them from

nucleophilic attack by water. However, they are fragile at less acidic environments such as

in foods where this structure could be disrupted during food possessing (Clifford, 2000).

Therefore, anthocyanins represent ingrédients of choice for microencapsulation.

Blackcurrant anthocyanins hâve been encapsulated by glucan gel (Xiong, Melton, Easteal,

& Siew, 2006).


84

Whey protein and pectin hâve been widely used in the food industry for their diverse

functional properties (Bals & Kulozik, 2003; Léman, Dolgan, Smoczynski, & Dziuba,

2005; Kerstens, Murray, & Dickinson, 2005; Kontopidis, Holt, & Sawyer, 2002, 2004;

Schols & Voragen, 2002; Voragen, Pilnik, Thibault, Axelos, & Renard, 1995). In a récent

study, we demonstrated the possibility to encapsulate a water-soluble ingrédient by WPI-

LMP complexes using différent modes of acidification (Bedie, Turgeon, & Makhlouf,

2007). The encapsulation of thiamine (Fig. 5.7) was mostly driven by electrostatic

interactions between the positively charged thiamine and the negatively charged WPI-LMP

complexes formed at acidic pH. The complex formation was highly dépendent to the pH of

the médium. Thus, pH 3.5-3.0 represented the optimum pH for WPI-LMP complex

formation (P:Ps ratio 2:1 at 0.4% total polymer concentration) when acidification of the

médium was done before or after mixing WPI and LMP solutions. Microencapsulation of

ascorbic acid by WPI/LMP has also been evaluated (Boucher, 2007), demonstrating that the

WPI/LMP system can be applied to a wide range of water-soluble ingrédients. Despite the

growing interest in microencapsulation of water-soluble ingrédients, no study has focused

on the effect of ingrédients concentration or of P:Ps ratio on the entrapment of thèse

ingrédients by whey protein-pectin complexes. In this study, the effect of thiamine

concentration on the sedimentable-complexes yield and on thiamine entrapment, using

WPI-LMP complexes, were investigated in pre and post-blending acidification of the

WPI/LMP system at différent pH. Anthocyanins entrapment by WPI-LMP complexes at

two P:Ps ratios as well as the effect of anthocyanins concentration on the entrapment ability

was also examined.


85

5.4. MATERIALS AND METHODS

5.4.1. Materials

Whey protein isolate (BiPRO®), containing 64.47% p-lactoglobulin, 23.02% a-lactalbumin,

2.36% Bovine Sérum Albumin, and 2.67% Immune Globulin G, total protein 91%, was

purchased from Davisco Foods International Inc., (Le Sueur, MN, USA). Low methoxyl

pectin (36% esterified, molar mass of 100 kDa) was kindly donated by CP Kelco

(Copenhagen, Denmark). Thiamine hydrochloride (molar mass of 337.27 g/mol) was

purchased from Sigma (St-Louis, MO, USA). Mega Natural Rubired Grape Juice Extract

(25% total anthocyanins, 45% total phénols) was provided by Polyphenolics (Ladera, CA

USA).

5.4.2. Reagents

Dioctylsulfosuccinate sodium sait, formic acid (99%), potassium hydroxide, trichloroacetic

acid (TCA), potassium chloride (KC1), and sodium acétate trihydrate (NaAc) were

purchased from Fisher scientific (Fair lawn, NJ, USA). HPLC grade methanol was

purchased from VWR international (West Chester, PA, USA).

5.4.3. Préparation of stock solutions

Two percent (p/v) stock solutions of WPI and of LMP hâve been prepared by dispersing

appropriate amounts of polymer powders in deionised water (Quality HPLC) under


86

agitation. WPI used in this préparation was a powder from which aggregates or denatured

proteins hâve been removed by centrifugation (Bedie et al., 2007). The agitation was kept

at ambient température for 2 hours to allow hydration of the biopolymers. A 2% LMP

solution was heated at 80°C for 10 min prior to agitation for 2 hours. The solutions were

then stored at 4°C overnight to complète the hydration until use.

5.4.4. Thiamine entnipment

Thiamine entrapment by WPI/LMP complexes was performed by pre- and post-blending

acidifications of WPI/LMP mixtures. LMP solutions containing 0, 0.004, 0.02, 0.1, and

0.2% (w/w) of thiamine were added to WPI solutions in order to obtain WPI-LMP mixtures

containing 0, 0.002, 0.01, 0.05, and 0.1% thiamine with a protein:polysaccharide (P:Ps)

ratio of 2:1 and a total polymer concentration of 0.4% (0.27% WPI and 0.13% LMP). In the

post-blending acidification process, the initial pH of the WPI-LMP-thiamine mixtures was

adjusted to 7.0 before gradually decreasing it to 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5 under magnetic

stirring. During the pre-blending acidification, solutions of WPI and solutions of LMP-

thiamine were adjusted to pH 4.0, 3.5, 3.0, or 2.5 (from pH 7.0), separately, before they

were mixed together to form the final mixtures at the spécifie pH values. The mixtures were

stirred for 3 min at a spécifie pH before 30 g samples, in ail modes of acidification, were

collected centrifuged at 8000 g/30 min at 22°C (Sorvall Instruments RC5C, Du Pont

Company, CT, USA). The pellets were stored at -18°C overnight. The frozen pellets were

freeze dried (Virtic Co Inc., Kansas City, NY, USA) for 24 hours and their weights

recorded. The sedimentable-complexes yield was calculated as follows:


87

„ ,. ,. , . ,, Weightofdry pellet ,..


Sedimentable - complexesyield= - —*- x 100
Weightof total biopolymersin30g of mixture

5.4.5. Détermination of thiamine

Thiamine détermination was completed by HPLC (WooUard & Indyk, 2002) as described

in previous work (Bedie et al, 2007, chapter 4, section 4.4.10.).

5.4.6. Anthocyanins entrapment

The évaluation of P:Ps ratio for suitable ingrédient entrapment (Bedie et al, 2007)

suggested that WPI/LMP ratio 2:1 was the optimal ratio to use for the entrapment in acidic

médium. LMP solutions containing 0.2, 0.4, and 0.6% (w/w) of anthocyanins (0.4, 0.8, and

1.2% w/w of Mega Natural® Rubired Grape Juice Extract (25% total anthocyanins, 45%

total phénols) were added to LMP, respectively) was added to WPI solutions to obtain

WPI-LMP mixtures containing 0.1, 0.2, and 0.3% anthocyanins, with a

proteimpolysaccharide (P:Ps) ratio of 2:1. Likewise, WPI/LMP mixtures containing

0.025% anthocyanins were prepared at P:Ps ratios of 2:1 and 1:1. Ail mixtures had 0.4%

total polymer. Mixtures were set at pH 7.0 and acidified gradually to pH 3.5 by addition of

HC1 (0.5N) and gently stirred for 3 min, after blending the polymer solutions. 30 g samples

of the mixtures were centrifuged at 8000 g/30 min at 22°C. Anthocyanins were extracted

frorn the pellets and quantified by UV-spectrophotometry.


88

5.4.7. Détermination of total monomeric anthocyanins

After centrifugation, the pellet were weighed and suspended in 30 g of 0.6% (w/w) of 0.5N

HCl-methanol (pH 1.0) under magnetic stirring for 1 hour to provide better extraction of

the anthocyanins by dissociation of the complexes. After complex dissociation, the 30 g

samples were centrifuged for 9000 g/30 min at 22°C and the supernatants were collected.

The new pellets were re-extracted twice. Ail the supernatants were added together and the

total anthocyanins content was determined by the pH differential method (Lee, Dust, &

Wrolstad, 2005). One ml aliquots from heated and non heated samples (free anthocyanins

solution, supernatant, and anthocyanins from the pellet) were appropriately diluted in

potassium chloride buffer solution (pH 1.0) and sodium acétate buffer solution (pH 4.5) and

analyzed for total anthocyanins content with a spectrophometer séries 8453 (HP,

Mississauga, ON, Canada) at 520 nm. Absorbance was read against HPLC-quality water as

a blank. The results were expressed on a cyanidin-3-glucoside basis. The anthocyanins

concentration was calculated as follows:

xTotal
♦ ianthocyamns
A • concentration
* ♦• (mg/L)
< n\ = ■(AxMWxDFxlOQO
* j

Where A = (A52onm - A7oonm)pH 1.0 - (A520nm- A7oonm)pH 4.5; MW = Molar weight of

cyanidin-3-glucoside (cyd-3-glu) = 449.2 g/mol; DF = Dilution factor ; 10 = conversion

factor from g to mg; e = Molar extinction coefficient of cyd-3-glu (26 900 x L x mol"1 x

cm'1); L = Pathlength in cm (1 cm);


89

Percentage of anthocyanins in the samples at each storage time was calculated based on the

control samples as foliows:

_ , , . .... Anthocyanins content of a sampleat a storage day </v„


Total anthocyamns (%) = - - - xlOO
anthocyanins content of asample before storage atdayO

Once the anthocyanins concentration was determined, the entrapment efficiency was

calculated as foliows:

^ „ . ,.,,. Anthocyanins content of wet pellet ,nn


Entrapment efficiency (%)= - x 100
Anthocyanins content of initial WPI- LMP mixture

5.4.8. Statistical analysis

Statistical analyses were performed with the SAS System (SAS Institute Inc. Cary, NC,

USA). Data associated with the effect of thiamine concentration of thiamine entrapment

were analyzed as 5 (thiamine levels) x 4 (pH) factorial experiments. The repeated measures

ANOVA design was adjusted to both post- and pre blending acidification data with a five-

level treatment (0, 0.002, 0.01, 0.05, and 0.1%) and a four-level pH sub-treatment (pH 4.0,

3.5, 3.0, and 2.5). Data on WPI/LMP ratio were analyzed with a Fisher's LSD design as a

Pairwise Comparisons of ratios 1:1 and 2:1 treatment. Data related to the effect of

anthocyanins concentrations on the entrapment process were analyzed as a ONE WAY-


90

ANOVA design with 3 treatments (concentration: 0.1, 0.2, and 0.3%). AU expenments

were performed in triplicates.

5.5. RESULTS AND DISCUSSION

5.5.1. Effect of thiamine concentration on the entrapment

5.5.1.1. Sedimentable-complexes yield

The sedimentable-complexes yield of WPI/LMP System without thiamine and that of the

system containing four levels of thiamine, with both post- and pre-blending acidifications,

are presented in Fig. 5.1. At a spécifie pH in ail modes of acidification, the sedimentable-

complexes yield was generally not significantly différent (P > 0.068 for post-blending

acidification and P > 0.0789 for pre-blending acidification) between complexes with and

without thiamine, except at pH 3.5 (0.05 and 0.1% of added thiamine) in the post-blending

acidification (P < 0.0017) and at pH 4 in the pre-blending acidification (P < 0.0338). The

drop of the sedimentable-complexes yield at pH 3.5 during the post-blending acidification

may probably be the resuit of complex saturation by the addition of high concentrations of

thiamine, preventing the aggregation of interbiopolymers and limiting the increase of the

sedimentable-complexes yield. In revenge, at lower pH, the lift of the saturation effect may

be ascribed to the decreasing affinity between thiamine and the complexes which become

less and less negatively charged (chapter 4, section 4.5.3), clearing the way for more

complex aggregation. At thèse low pH, complex aggregation may be explained by the
91

display (by acidification) of new unbound sites from the dissociation into monomers or

single polypeptide chains of essentially (3-lactoglobulin molécules (Chiancone & Gattoni,

1991; Sawyer & Kontopidis, 2000). This may contribute to new interbiopolymer

interactions between thèse molécules with others such as molten globule state of a-

lactalbumin (Alexandrescu, Evans, Pikeathly, Baum & Dobson, 1993) and may increase the

sedimentable-complexes yield. Addition of thiamine may hâve increased the sedimentable

complexes yield at pH values corresponding to the lowest yield but this possible increase

was not observed in the post-blending acidification mode due to the packing effect of that

mode of acidification. The lack of such effect with the pre-blending acidification may

explain the increase of the sedimentables complexes yield at pH 4.0. Moreover, no drop in

the sedimentable-complexes yield was observed at pH 3.5 with the pre-blending

acidification. This may resuit from the mode of acidification of the pre-blended System in

which hasty molécules movement created by the quick mixing of the polymer solutions at a

spécifie pH could hâve helped WPI molécules binding to LMP molécules, being at the

same time detrimental to thiamine molécules. However, in ail cases, the overall lower

sedimentable-complexes yield at pH 4.0 (although with a greater négative zêta potential)

may resuit from low interactions between WPI (Boye, Ismail, & Alli, 1996) and pectin as

WPI molécules were less positively charged at pH 4.0 than at lower pH values.

5.5.1.2. Thiamine entrapment

Thiamine content of the complexes (g of thiamine per g of dry complexes) indicated an

increase as the level of incorporated thiamine increased at a spécifie pH in both types of


92

acidification (Fig. 5.2). Thèse results are in agreement with previous work on the

entrapment of insulin by chitosan-triphosphate ions nanoparticles at pH 4.0 (Pan et al,

2002) and on the microencapsulation of isoniazid by alginate-chitosan microspheres

(Lucinda-Silva & Evangelista, 2003). The maximum thiamine content of the complexes,

among ail thiamine levels, was found at pH 4.0 for post-blending acidification and at pH

3.5 for pre-blending acidification as found in previous study (Bedie, Turgeon, & Makhlouf,

2007). Indeed, positively charged thiamine molécules were preferably attracted by WPI-

LMP complexes at pH 4.0-3.5 (negatively charged) rather than at lower pH (positively

charged). However, the maximum thiamine content of the complexes at pH 3.5 in the pre-

blend system may be the resuit of the combination of négative charges of the complexes

and the physical entrapment of thiamine, which itself may be favoured by the relatively

positively charged thiamine. The decrease of thiamine content as the pH decreased, starting

from the maxima, may resuit from the lessening of negatively charged complexes at low

pH and probably from the compétition between protein and thiamine molécules in binding

to LMP molécules, which was detrimental to thiamine molécules.

Figure 5.3 shows thiamine entrapment efficiency in both pre- and post-blending

acidifications. Maximum entrapment efficiency appeared at pH 3.5, since at this pH,

substantial amount of complexes were formed with négative charges, in both cases (not

shown). This is in corrélation with high sedimentable complexes yield (Fig. 5.1 A and B)

and thiamine content of the complexes (Fig. 5.2 B) at the same pH except thiamine levels

of 0.05 and 0.1% in the post-blending acidification (Fig. 5.3A) as indicated by the

sedimentable complexes yield (Fig. 5.1 A). Saturation of the complexes by high
93

concentrations of thiamine which prevented the increase of the sedimentable complexes

yield may be the principal reason. At other spécifie pHs, the amount of complexes formed

(pH 4.0) and the positively charged complexes (pH 3.0 and 2.5) contributed to less

entrapment. At pH 3.5, the entrapment efficiency decreased as the amount of incorporated

thiamine increased. This was predictable, considering the entrapment efficiency formula.

Accordingly, Peltonen et al. (2004) observed similar behaviour when encapsulating

hydrophilic drug substance (sodiumeromoglycate) in poly(l)lactide nanoparticles.

5.5.2. Effect of protein/polysaccharide ratio and anthocyanins concentration on the

entrapment

5.5.2.1. Protein:polysaccharide ratio

The change in anthocyanins entrapment efficiency with increasing WPI/LMP ratio at pH

3.5 is presented in figure 5.4. Anthocyanins entrapment efficiency with WPI/LMP ratio 2:1

was more than 9% compared to that of WPI/LMP ratio 1:1 (4%). The great amount of

complexes associated to WPI/LMP ratio 2:1 was probably responsible for higher binding of

anthocyanins to WPI/LMP complexes. Indeed, positively charged anthocyanins molécules

at acidic pH (Giusti, Rodriguez-Saona, Griffin, & Wrolstad, 1999) were preferably

attracted by negatively charged and large mass of WPI/LMP complexes at ratio 2:1.

Anthocyanins entrapment efficiency (9%) at that ratio and at pH 3.5 with post-blending

acidification is greater than that of thiamine (4.50%) in the same conditions (Chapter 4,

section 4.5.6.). One reason for this great anthocyanins entrapment efficiency could be the
94

interactions of the many hydroxyl groups présent on the anthocyanins molécules (compared

to one on the thiamine molécule) with some positively charged zones of the WPI molécules

in the complexes. No work has been yet reported in the literature on anthocyanins

encapsulation by protein-polysaccharide complexes. However, in their work on

microencapsulation of anthocyanin pigments of black carrot by spray drying, Ersus et al.

(2007) reported that more than 500 mg/100 g of anthocyanins were encapsulated using a

solution of 6% anthocyanins and 20% cyclodextrin as a carrier. Our method of

encapsulation seems more efficient even though we obtained 220mg/100g of entrapped-

anthocyanins considering that we used 240 times less anthocyanins (0.025% vs 6%) and 50

times less carriers (0.4% of total polymers vs 20% cyclodextrin). Elsewhere, the

encapsulation of black currant anthocyanins by glucan gel resulted in more than 80%

anthocyanins recovery after freeze drying (Xiong et al, 2006). The method of

encapsulation in this case (gel) may be responsible for the high anthocyanins recovery. So

depending on the method used for the encapsulation, the final resuit may vary considerably.

5.5.2.2. Anthocyanins entrapment

We evaluated anthocyanins entrapment efficiency at pH 3.5 with an increase of

anthocyanins concentration (0.1, 0.2, and 0.3%) in a post-blending acidification (Fig. 5.3 A

and B). As a resuit, the entrapment efficiency of anthocyanins increases linearly (p <

0.0001) from 10 to 12.6% and from 10 to 14.9% as the concentration of anthocyanins

increased from 0.1 to 0.2 and 0.3% (Fig. 5.5). This corresponds to an increase of the

entrapment efficiency to 26 and 49% respectively. This resuit is not in agreement with

thiamine entrapment efficiency at pH 3.5 where the increase of thiamine concentration led
95

to a decrease of the entrapment efficiency at certain pH. A reason may be the used of

anthocyanins extract (not pure) in which other components may contribute to the

attachment of anthocyanins to the complexes. On the other hand, their structures are

différent and the mechanism of encapsulation may differ between thèse molécules.

5.6. CONCLUSION

This study demonstrated that, in gênerai, incorporation of thiamine into WPI/LMP

complexes may affect the sedimentable-complexes yield as well as the entrapment

efficiency, at a spécifie pH, depending on the type of acidification. The maximum of

thiamine entrapment efficiency was found at pH 3.5 while thiamine content of the

complexes increased with increasing thiamine concentration with maxima at pH 4.0 and 3.5

depending on the mode of acidification. Increase of total polymer/thiamine ratios may be

considered to avoid saturation of the complexes when high amounts of encapsulated

ingrédients are used. Anthocyanins exhibited high entrapment efficiency at a WPI/LMP

ratio of 2:1 and indicated an increase of the entrapment efficiency as the concentration of

the added anthocyanins increased. Studies of water-soluble ingrédient protection by

WPI/LMP complexes under storage conditions should also be carried.


96

A
120 i

B
120 T

Figure 5.1. Sedimentable-complexes yield (least squares means of % of polymer in


centrifugal pellet) of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added thiamine as a
function of pH: (A) post-blending acidification and (B) pre-blending acidification; ■
control, Il 0.002, @ 0.01, 0 0.05, □ 0.1%. Vertical bars represent standard errors of the
mean (N = 6).
97

A
2.5-

? 2.0-

Figure 5.2. Thiamine content of the complexes (least squares means of % of thiamine in the
dry pellet) of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added thiamine as a function
of pH: (A) post-blending acidification and (B) pre-blending acidification; □ 0.002, S 0.01,
E3 0.05, □ 0.1%. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
98

4.0 3.5 3.0 2.5


pH

Figure 5.3. Entrapment efficiency (least squares means of % of thiamine in suspended


centrifugal pellet) of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added thiamine as a
function of pH: (A) post-blending acidification and (B) pre-blending acidification; ■
0.002, M 0.01,0 0.05, □ 0.1%. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
99

12 n

cr 1 0 H

a 6-
&
S
a
«
a

Rl:l R2:l
Ratio

Figure 5.4. Entrapment efficiency (least squares means of % of anthocyanins in centrifugal


pellet) of WPI/LMP complexes at P:Ps ratios of 1:1 (RI: 1) and 2:1 (R2:l) and at pH 3.5,
with 0.4% total polymer. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
0.1 0.2 0.3
Added anthocyanins (%)

Figure 5.5. Entrapment efficiency (least squares means of % of anthocyanins in centrifugal


pellet) of WPI/LMP complexes at ratios 2:1 and at pH 3.5, with 3 levels (0.1, 0.2, and 0.3%
w/w) of incorporated anthocyanins. Vertical bars represent standard errors of the mean (N
= 6).
101

Ri
N 0 H
^ N ^ '
© F B !
HC
V^ A c
^Rz

S^ ^-^ 0—Glucose
OH
Figure 1. Anihocyanin skeletc m.

R, R» Anthocyanin

H H Po largonidh-3-glucos ide
OH H Cyan idin-3-glucoside
OH OH Dclphinidin-3-glucosido
OCH, H Poonidin-3-glucostdo
OCHa OH Petunidin-3-glucoside
OC H, OCH3 Mafvidin-3-gtucosido

Figure 5. 6. Structure of anthocyanins (Clifford, 2000)


102

NH 2

.CH2 CI" CH,


M ^v\
r" ~« 15 13 41

12 16

H 3 C^ H H S CH 2 CH 2 OH

Figure 5. 7. Structure of thiamine hydrochloride (Clémente et al., 1988)


CHAPITRE 6

Study of the protective effect of whey protein isolate-low

methoxyl pectin complexes on anthocyanins during storage.

Sera soumis pour publication dans le journal Food HydrocoUoids


104

6.1. RÉSUMÉ

Les complexes IPL/PFM composés de 0.27% d'IPL et 0.13% de PFM avec un ratio P:Ps de

2 :1 (0.4% de polymères totaux), ont été utilisés pour l'encapsulation d'anthocyanes (0.3%)

et de la thiamine (0.1%). Ces ingrédients hydrosolubles ont été incorporés aux complexes

IPL/PFM à travers des solutions de PFM, suivie d'une acidification graduelle du milieu à

pH 3.5. Les complexes ont été récupérés par centrifugation. Les échantillons de complexes

contenant des anthocyanes ont été pasteurisés (90°C/12 s) et entreposés à 40°C/11000 lux

pendant 14 jours. Aux jours 0, 6, 8, 10, 12 et 14, les échantillons ont été collectés,

centrifugés et les anthocyanes ont été dosés par spectrophotométrie. La pasteurisation a

dégradé 11.6% des anthocyanes dans le jus témoin (sans complexes IPL/PFM) alors qu'elle

a provoqué une diffusion des anthocyanes du culot vers le surnageant dans le jus additionné

de complexes IPL/PFM. Pendant l'entreposage, la dégradation des anthocyanes était

similaire dans le jus témoin et dans le surnageant du jus additionné de complexes IPL/PFM.

Cependant, le contenu en anthocyanes du culot est demeuré pratiquement constant (~ 45

mg/1) durant l'entreposage, suggérant une protection de ces composés par les complexes

IPL/PFM.

6.2. ABSTRACT

WPI-LMP complexes, containing 0.27% WPI and 0.13% LMP with a P:Ps ratio 2:1 (0.4%

TCP) were used to encapsulate anthocyanins (0.3% w/w) and thiamine (0.1%). Thèse
105

water-soluble ingrédients were added to WPI-LMP mixtures through LMP solutions,

foliowed by graduai acidification to pH 3.5. Complexes were obtained by centrifugation.

The pellets of complexes containing anthocyanins were pasteurized (90°C/12 s) and stored

at 40°C/11000 lux for 14 days. On days 0, 6, 8, 10, 12, and 14, samples were collected,

centrifuged, and analyzed for anthocyanins content by spectrophotometry. While the heat

degraded 11.6% of anthocyanins in the control juice (without WPI-LMP complexes), it

induced anthocyanins diffusion from the pellet to the supernatant in the juice containing

WPI-LMP complexes. During storage, anthocyanins dégradation was similar in both

control juice and the supernatant of the juice containing WPI-LMP complexes. However,

anthocyanins content of the pellet remained constant (~ 45 mg/1) during storage, suggesting

their protection by the WPI-LMP complexes.

6.3. INTRODUCTION

Microencapsulation has been largely used in food industry where its major purpose is the

protection of the added ingrédients against food environmental damages as well as the

delivery of the encapsulated ingrédients. Existing challenges faced by the ingrédients in

foods include loss of activity, oxidation reactions, reaction of ingrédients with the food

components, change of color or taste of the food product (Schrooyen, van der Meer, & De

Kruif, 2001). Ail thèse damages contribute to a limitation of the bioavailability of added

ingrédients. Microencapsulation processes use several methods including, spray-drying,

extrusion spray-chilling or inclusion with cyclodextrin molécules as a carriers (Ersus &


106

Yurgadel, 2007; Tayade & Kale, 2004; Yamada, Komiya, & Akaki, 1980). Some studies

hâve reported the microencapsulation of water-soluble ingrédients with protein-

polysaccharide complexes (Chilvers, Gunning, & Morris, 1988; Tirkkonen, Turakka, &

Paronen, 1994; Tiyaboonchai, Woiszwillo, & Middaugh, 2001). Others hâve performed the

encapsulation of anthocyanins by spray-drying (Ersus & Yurgadel, 2007) or by

polysacchande gel (Xiong, Melton, Easteal, & Siew, 2006). Previous study on water

soluble ingrédients encapsulation by WPI-LMP complexes (Bedie, Turgeon, & Makhlouf,

2007; Chapter 5) indicated a great entrapment efficiency at WPI:LMP ratio 2:1 and an

increase of the entrapment efficiency with anthocyanins concentration. Anthocyanins

(glycosides of anthocyanidins) are part of a large group known as flavonoids (Mazza &

Miniati, 1993). Glycosides of anthocyanidins which are polyhdroxy and polymethoxy

derivatives of 2-phenylbenzopyryliumor flavylium salts (Fig.5.6.) responsible for most red,

pink, mauve and blue colors of fruits, lowers and fruits. Their color is determined by the

number of hydroxyl groups, the degree of methylation of thèse hydroxyl groups, the nature

and number of sugars attached to the molécule and the position of attachment, the nature

and number of aliphatic or aromatic acids attached to the sugar and the physicochemical

médium in which they are viewed (Mazza & Brouillard, 1990). The six major

anthocyanidins frequently occurring in plants are pelarginidin, cyaniding, peonidin,

delphinidin, petunidin, and malvidin. Factors affecting the stability of anthocyanins in

aqueous média include structure, concentration of the pigment, pH, température, light, co-

pigments, self-association, metallic ions, oxygen, ascorbic acid, sugars and their

dégradation products, proteins, sulphur dioxide, organic acids, nucleotides, and

anthocyanins themselves (Mazza & Brouillard, 1990; Mazza & Miniati, 1993). In aqueous
107

solution at room température and in moderately acidic média (pH 4-6), anthocyanins exist

mainly in equilibrium between the colorless carbinol pseudobase (B) and chalcone (C),

favoring the carbinol pseudobase. In more acidic média (pH <4), the colored flavylium

cation (AH+) and the colorless carbinol pseudobase (B) predominate. At equilibrium and at

any other pH, the colored quinoidal base (A) is only présent to a very small extent

(Brouillard & Delaporte, 1977). The mechanism (A <=» AH+ <=> B) of interconversion, upon

pH change! suggested that placing the cation in the most acidic média (pH <3) rapidly sets

up the flavylium cation-carbinol equilibrium with the formation of barely détectable

amounts of quinoidal base and chalcone and when placing this same cation in slightly

acidic or basic média (pH >3) it immediately yields the quinoidal base. Studies of

anthocyanins stability in fruit juices under heat treatment and storage conditions, hâve

indicated that dégradation of anthocyanins (carrot and blood orange juices) under heat

treatment followed a first-order reaction kinetics. In addition, the dégradation of monomeric

anthocyanins increased with increasing solid content during heating, while it decreased

during storage at 20°C (Kirca, Ozkan, & Cemeroglu, 2003, 2006, 2007). Other studies

indicated that the stability of monomeric anthocyanins under storage conditions depended

on the time and température of storage with the effect of storage time being the most

important; the présence or absence of light exerted a negligible impact on the

décomposition rate (Morais, Ramos, Forgacs, Cserhati, & Oliviera, 2002; Turker, Aksay, &

Ekiz, 2004).

In this paper the stability of anthocyanins encapsulated by WPI-LMP complexes was

examined in clarified apple juice during storage. The sensitivity of anthocyanins to


108

température, light, and pH, makes them excellent choices for the study of the protective

effect of encapsulating complexes.

6.4. MATERIALS AND METHODS

6.4.1. Materials

BiPRO® whey protein isolate (64.47% p-lactoglobulin, 23.02% a-lactalbumin, 2.36%

Bovine Sérum Albumin, and 2.67% Immune Globulin G, total protein 91%) was furnished

by Davisco Foods International Inc. (Le Sueur, MN, USA). Low methyl pectin (36%

esterified, molar mass of 100 kDa) and Mega Natural® Rubired Grape Juice Extract (25%

total anthocyanins, 45% total phénols) were kindly donated by CP Kelco (Copenhagen,

Denmark) and Polyphenolics (Ladera, CA USA), respectively, and were used as receiyed.

Clarified apple juice concentrate (70.2°Brix) was kindly offered by Lassonde Industries Inc.

(Rougemont, Québec Canada).

6.4.2. Reagents

Potassium chloride (KC1) and sodium acétate trihydrate (NaAc) were purchased from

Fisher Scientific (Nepean, ON, CA).


109

6.4.3. Préparation of solutions

2% (w/v) stock solution of WPI and 2% (w/v) stock solution of LMP were prepared from

WPI powder (free of insoluble particles and denatured proteins) and pectin powder in

HPLC-grade deionised water and stirred at ambient température for two hours. Heating at

80°C for 10 min prior to stirring was required for LMP. The WPI and LMP solutions were

stored at 4°C ovemight to complète the hydration until use. 1000 g of apple juice of

10.6°Brix at 22°C (pH 3.5) were prepared by diluting 142.9 g of concentrated apple juice

(70.2°Brix) and 0.2 g of sodium azide (antimicrobial) in HPLC quality water.

6.4.4. Anthocyanins entrapment by WPI-LMP complexes

WPI and LMP stock solutions were diluted in HPLC-grade water and mixed together to

obtain WPI-LMP mixtures at a proteimpolysaccharide ratio of 2:1 with a total polymer

concentration of 0.4% w/w (0.26% LMP and 0.54% WPI). Anthocyanins from Mega

Natural® Rubired Grape Juice Extract (25% total anthocyanins) were added to LMP

solution before adding to WPI solution in order to obtain 500 g of a final WPI-LMP

mixture containing 0.27% WPI, 0.13% LMP and 0.3% w/w anthocyanins. The pH of the

mixture was adjusted to pH 7.0 before decreasing it gradually to pH 3.5 by addition of HC1

(0.5N) under moderate agitation followed by a gentle stirring for 3 min. The whole mixture

was centrifuged at 10 000 g/30 min at 22°C and the pellet (WPI-LMP complexes

containing anthocyanins) as well as the supernatant was collected and weighed. The pellet

was dissolved in 500 g of apple juice (10.6°Brix pH 3.5) under moderate stirring for lh.
110

Anthocyanins control juice was prepared by dissolving lg of Mega Natural Rubired Grape

Juice Extract (25% total anthocyanins) in 500 g ofapple juice (10.6°Brix) at pH 3.5.

6.4.5. Heat treatment and storage

30g of duplicate samples from control juice and juice with complex mixture containing

anthocyanins (WPI-LMP-anthocyanins) were collected in 50 ml tubes. The samples were

heat treated (90°C/12 s) in a water bath (Neslab Instruments Inc., Newington, NH, USA)

and immediately cooled to 25°C in an ice-water solution. The time necessary for the center

of the tubes to reach 90°C was 4 min. Samples of non heated WPI-LMP-anthocyanins

mixture and control juice were used as control samples. Ail heated samples were then

stored in a Conviron El 5 growth chamber (Controlled environment Ltd., Winnipeg, MB,

Canada) set at 40°C under light at 11 000 lux for 14 days. Samples were collected at day 0,

6, 8, 10, 12, and 14 for anthocyanins analysis: total anthocyanins content, anthocyanins in

the supernatant after centrifugation and anthocyanins in the complexes (pellets).

6.4.6. Extraction of monomeric anthocyanins

Ail samples of complexes containing anthocyanins were centrifuged at 10 000 g for 30 min.

The supernatants and the pellets were collected and weighed. To extract anthocyanins from

the pellets, the pellets were suspended in 30 g of 0.6% w/w of 0.5N HCl-methanol (pH
111

1.0), homogenized with an Ultra Turrax homogenizer, (IKA Works, Inc. Wilington, NC,

USA) at 17 500 rpm/1 min, and centrifuged at 10 000 g/30 min 22°C. The pellets were re-

extracted until a clear supematant was obtained. Combined supematants were well mixed

to form anthocyanins from the pellets.

6.4.7. Détermination of monomeric anthocyanins

Anthocyanins détermination was achieved by the pH differential method (Lee, Dust, &

Wrolstad, 2005) as described in previous work (Bedie, Turgeon, & Makhlouf, 2007;

chapter 5, section 5.4.7.).

6.4.8. Kinetic of dégradation of anthocyanins

First-order reaction rate (k) and half-life (ti/2) were calculated according to the following

, .At. , ln(2)
équations:ln(—) = -kt; h/2 = —-—
Ao k

where Ao is the initial anthocyanins concentration of the samples at day 0, At is the

anthocyanins concentration after t days of storage.

6.4.9. Statistical analysis

Statistical analyses were performed with the SAS System (SAS Institute Inc. Cary, NC,

USA). Data related to the effect of storage conditions on anthocyanins content were
112

analyzed as a repeated measures ANOVA design with 4 treatments (total free anthocyanins

in control juice, complexed anthocyanins in the supernatant, complexed anthocyanins in the

pellet, total calculated complexed anthocyanins in the juice) and a 7-level time sub-

treatment (control, do, d6, d8, dlO, dl2, and dl4). The same data were also analyzed by

contrasts with a Fisher's LSD design as a Pairwise Comparisons of anthocyanins content at

each storage day. Ail experiments were performed in triplicates.

6.5. RESULTS AND DISCUSSION

6.5.1. Anthocyanins protection by WPI-LMP complexes during storage

6.5.1.1. Heat treatment

The effects of heat treatment on anthocyanins in the control juice, in the supernatant, and in

the pellet are presented in table 6.1 while the effects of storage conditions on anthocyanins

are presented in figures 6.3 and 6.4. Before heat treatment, the control juice, which was

purposely prepared to contain anthocyanins concentration close to that of the pellets,

contained approximately 483.9 mg/1 of total anthocyanins while the total anthocyanins in

the juice with complexes (represented by the total anthocyanins in the supernatant and the

pellet), was about 474.2 mg/1 (Table 6.1). The great amount of anthocyanins found in the

supernatant (360.5 mg/1) after centrifugation of the dissolved complexes (containing

anthocyanins) in clarified apple juice suggest that an important portion (76%) of the

anthocyanins was not well bound to the complexes and was diffused in the supernatant.
113

This leaves 24% of anthocyanins in the pellet (113.7 mg/1 of juice-dissolved pellet). In

addition, the heat treatment had a significant (p < 0.0003) réduction effect on anthocyanins

in ail samples except for the supematant (P = 0.1389). In fact, a slight decrease of

anthocyanins content in the supematant (3.9%) compared to that of the control (11.6%)

(Table 6.1) could be explained by the diffusion of anthocyanins out of the pellet to the

supematant during the heat treatment, which may hâve compensated anthocyanins loss in

the supematant. In this case, the heat treatment seems to hâve an antagonistic effect on

anthocyanins content in the supematant. The calculated réduction of total anthocyanins in

the juice with complexes (including the supematant and the pellet) was 14.2%, which is not

significantly différent (p = 0.0559) from that of anthocyanins in the control juice.

Anthocyanins protection by WPI/LMP complexes in this thesis may be comparable to the

phenomenon of co-pigmentation of anthocyanins. Indeed, for a given pH and type of

anthocyanins, the secondary structures of anthocyanins play a rôle in the mechanism of co-

pigmentation. Without co-pigments (organic acids, other anthocyanins, polysaccharides,

amino acids, flavonoids), at pH 3.6 where the pigmentation effect is maximum, hydration

of the fiavilium form leads to the présence of the colorless hemicetal and cis-chalcone in

fast equilibrium with each other (Mazza & Brouillard, 1990). In the présence of co-

pigment, anthocyanins are stabilized by the interaction of the fiavilium cation with the co-

pigment which prevents the hydration of the cation to the colorless form. Dégradation of

anthocyanins by heat may be explained mainly by the breaking of the co-pigment-

anthocyanins structure, allowing the hydration reaction to occur and the colorless form of

anthocyanins to appear (Brouillard et al, 1989; Matsufuji et al, 2007). It has also been

demonstrated that it is not the polarity of water molécules that allows copigmentation to
114

take place but rather the unique feature of the water molécules association as a tetrahedral

network which force anthocyanins and co-pigments into close contact by hydrophobic

interaction (Brouillard et al, 1989). The heating of WPI/LMP complexes containing

anthocyanins resulted in the formation of big aggregates responsible for the diffusion of

anthocyanins from the complexes (Table 6.1). This heat-induced aggregate formation is in

agreement with previous work achieved by Beaulieu at al. (2005) on heat-induced protein

aggregates in whey protein/pectin mixtures. The author mentioned, however, that LMP has

a protective effect on WPI regarding aggregate formation as heated WPI resulted in more

aggregates than heated WPI/LMP, which itself is in agreement with Varunsatian et al.

(1983). Although the formation of aggregates induced anthocyanins diffusion from

WPI/LMP complexes, the remaining anthocyanins may be physically shielded from the

heat treatment, preventing further dégradation of anthocyanins. Furthermore, anthocyanins

molécules may interact with whey proteins and pectin to form a WPI/LMP/anthocyanins-

structure providing anthocyanins protection to hydration and preventing their dégradation.

Although no study focused on heat treatment of encapsulated anthocyanins, 90% of initial

anthocyanins from plums skin were reported to diffuse to the flesh or to the can liquid after

the canned plums were boiled for 20 min (Weinert, Solms, & Escher, 1990).

6.5.1.2. Storage

Storage under light at 40°C contributed to greater dégradation of anthocyanins in control

juice and in the supematant than it did in the pellet (Fig. 6.2 and 6.3). After 14 days of
115

storage, anthocyanins content of the control solution was 220.5 mg/1 while that of the

supematant was 186.81 mg/1 (Fig. 6.2). Thèse contents represent nearly half of the initial

concentrations. The similarity in the trend of dégradation of anthocyanins in the control

juice and in the supematant was expected since once the anthocyanins diffused from the

complexes network, they became subject to the direct effect of the heat and the light, as in

the control juice. Unlike the control juice, anthocyanins content in the pellet did not change

significantly (p > 0.1000). The amount of anthocyanins remaining in the pellet (45-49 mg/1)

may represent the true value of anthocyanins entrapped in the WPI-LMP system. This is

also shown in figure 6.3 where the percent loss of anthocyanins in the pellet reached a

constancy (p = 0.5266), from d8 to dl4, while it was accentuated with time in the

supematant and the control samples. This constancy may suggest that anthocyanins weakly

bound to the complexes hâve been completely diffused in the supematant after the heat

treatment and those strongly attached to the complexes were highly protected by the WPI-

LMP complexes under storage conditions.

The kinetic of combined temperature-light dégradation of anthocyanins sample and the

total anthocyanins in the complexes are presented in Fig. 6.4. Natural loganthm of

anthocyanins concentration was plotted against time of storage at 40°C/11000 lux and the

first-order reaction rate and the half-life were calculated according to the équation at

section 6.4.8. As a resuit, the linear Unes of the plot indicated that the destructive effect of

storage conditions on anthocyanins followed first-order reaction kinetics (Fig. 6.4) in

agreement with Kirca & al (2006, 2007). Furthermore, the almost superimposing display of

the supematant and the control juice hâve curves suggested that their hâve very close
116

dégradation rate. In addition, the half-lives (time needed for 50% anthocyanins

dégradation) of anthocyanins in the control solution and in the pellet were 14,7 days and 28

days (Table 6.2), respectively, confirming the protection of anthocyanins by the WPI-LMP

complexes. It is known that anthocyanins are more stable to light and heat at low pH

(Matsufuji et al, 2007). Indeed, in the study of the stability of acylated anthocyanins from

red radish extract to light, heat, and hydrogen peroxide, the authors conciuded that the

characteristics, the number, the binding site, and probably the spécial position of

intramolecular acyl units (co-pigments) affected the stability of acylated anthocyanins.

Diacylated anthocyanins were more stable to light than monoacetylated anthocyanins. The

authors suggested that mis stability was probably due to a sandwich type stacking by

hydrophobic interactions between the planar aromatic residues of intramolecular acyl units

and the flavilium nucleus. Pectin does not interact directly with anthocyanins but by

reacting with water, it could stabilize the flavilium cation with regard to hydration

(Mazzaracchio et al, 2004). By doing so, pectin may slightly increase flavilium cation

form which is in equilibrium with the pseudobase form at a same pH (Fig. 6.1). Moreover,

a weak hydrophobic interaction between methoxyl groups of the B ring of the aglycones

and the methoxyl groups of pectin could occur and favour co-pigmentation. pMactoglobulin

seems to hâve an absorption effect with anthocyanins as the latter formed cations at acidic

pH. Thèse absorption interactions may be due to hydrogen bond or hydrophobic or

electrostatic interactions (Mazzaracchio et al, 2004). WPI-LMP complexes network may

physically hide anthocyanins molécules from light by simple inclusion or physical

protection, like in the case of heat.


117

6.6. CONCLUSION

It can be highlighted from the results that heat treatment of encapsulated anthocyanins

increased the diffusion of anthocyanins, from WPI-LMP complexes to the environmental

médium, which already started upon the dissolution of the complexes in apple juice.

Although aggregation of WPI-LMP complexes by the heating process induced an important

diffusion of anthocyanins outside of the complexes, it may also provide a protective effect

for the remaining anthocyanins, forming hydrophobic interactions with anthocyanins and

preventing them from hydration or sheltering them from the heat. Storage conditions led to

a graduai dégradation of anthocyanins in the control solution and the supernatant for 14

days. Residual anthocyanins content in the pellet remained constant during storage. This

suggests a protection of encapsulated anthocyanins by WPI-LMP complexes. In fact,

interactions of WPI-LMP complexes with anthocyanins (i.e. hydrogen bonds or

hydrophobic interactions) may act as copigmentation effect. In addition, a spécial

disposition of the complexes, protect the anthocyanins from storage light or heat.

Substantial protection of anthocyanins during storage may require an increase of the P:Ps

ratio or the total polymer concentration in order to obtain higher mass of complex and more

anthocyanins encapsulated in the complex pellet.


118

Table 6. 1. Effect of heat treatment on free and complexed anthocyanins' concentration


(± Standard Error) in clarified apple juice

Treatment Anthocyanins (mg/1 of juice) Réduction (%)


Not heat treated After heat treatment "
Control 483.9 ±7.5 427.5 ± 7.2 11.6 ±4,5
Supernatant 360.5 ±3.2 346.4 ±1.7 3.9 ±1,4
Pellet 113.7±1.1 60.5 ±1.7 46.8 ± 4,6
3
Total 474.2 ± 4.3 406.7 ±1.6 14.2 ± 2,2

1
Total refer to pellet and supernatant
' At time 0 day

Table 6. 2. Kinetic parameters for anthocyanins dégradation during storage


(40°C/11000 lux)

Treatment klO^d"1) ti/2 (d)

Control 4.75 (0.98)a 14.7


Pellet 2.50(0.92) 28.1
^umbers in parenthesis are détermination coefficients.
119

R:

I O glueoM
0 gluCOM
quinoidal ba»e (A)

proton transfer
réaction

+H'

0 glucoae
flavylium cation (AH+) <1)
hydration
réaction
*lon IJW
♦1M>

> " 0 gluCOM


0 glu cota
carbinol pteudobaie (B)

■il t^irrâATÏi*
•**iivi*i*jri*- 1'
DC*CÎ6
reaction

^T 0 glucoae
0 glucoae
chaicone (C)

Figure 6.1. Mechanism of structural transformation of anthocyanins in aqueous média


(Brouillard & Delaporte, 1977).
120

0 6 8 10 12 14
Time (d)

Figure 6.2. Total anthocyanins content (least squares means of mg/1 of anthocyanins) of
WPI-LMP complexes during storage (11000 lux at 40°C) at pH 3.5, with 0.4% of total
polymer, and at a P:Ps ratio of 2:1. El Control juice, E3 Supematant, ■ Pellet. Vertical
bars represent standard errors of the mean (N = 6).
121

110-

100-

s 90

a 80
o
«
>> 70
O
J3
a 60
<
50-

40
0 8 10 12 14
Time (d)

Figure 6.3. Percentage of anthocyanins (least squares means of % of anthocyanins)


during storage (11 000 lux at 40°C) at pH 3.5, with 0.4% of total polymer, and at a P:Ps
ratio of 2:1. O Control juice, A Supematant, O Pellet. Vertical bars represent standard
errors of the mean (N = 6).
122

10
R2 = 0,98
o
a
S
ta
0 0 0
R2 = 0,92

I
4 9 14
Time (d)

Figure 6.4. Dégradation of anthocyanins (In (mg/l)) added to clarified apple juice at
10.6°Brix and pH 3.5 during 14 days of storage (40°C/11 000 lux). OPellet, X control
juice.
123

CHAPITRE 7: Conclusion générale


L'hypothèse de ce projet stipulait que le complexe isolât de protéine de lactosérum-pectine

faiblement méthylée est une matrice d'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles adaptée

aux aliments acides et qu'il permet de protéger ces ingrédients contre les effets

dommageables des traitements thermiques et des conditions d'entreposage. De plus, cette

matrice permet de libérer les ingrédients hydrosolubles dans un modèle de système digestif

humain. Cette hypothèse a été vérifiée expérimentalement par la préparation de complexes

insolubles d'isolat de protéine de lactosérum-pectine faiblement méthylée capables

d'encapsuler des ingrédients hydrosolubles, comme la thiamine et les anthocyanes, en

milieu acide. Cependant, le traitement thermique a eu des effets dommageables sur les

complexes entraînant une diffusion importante des ingrédients encapsulés à l'extérieur des

complexes. Par contre, les complexes ont protégé les ingrédients encapsulés durant

l'entreposage. L'évaluation de la stabilité des complexes dans un modèle de système

digestif humain a démontré que les ingrédients encapsulés étaient libérés au niveau de

l'estomac.

La formation de complexe par des interactions électrostatiques entre la L'IPL et la PFM est

fortement dépendante du pH du milieu, du ratio protéine/polysaccharide et d'un nouveau

facteur que nous avons évalué, le mode d'acidification du milieu. Le pH optimum de

formation des complexes était de 3.5 à 3.0 avec acidification du milieu avant et après

mélange des solutions d'IPL et de PFM pour un ratio P:Ps de 2:1. Avec une acidification
124

après mélange des solutions, les complexes obtenus au ratio 2:1 étaient caractérisés par une

petite taille qui était constante indépendamment du pH et par un rendement en complexes

relativement élevé, comparativement à l'acidification avant le mélange des solutions.

L'ajout de thiamine, à des concentrations élevées a affecté la masse de complexes formée

ainsi que l'efficacité d'encapsulation à pH 3.5 lorsque l'acidification du milieu était réalisée

après le mélange des solutions de polymères. Avec un maximum d'encapsulation d'environ

7% obtenu avec acidification avant le mélange des polymères, et de 4.5% obtenu après

mélange des polymères, une quantité relativement faible (70 mg) serait requise pour

satisfaire l'Apport Quotidien Recommandé en thiamine par Santé et Bien-être Canada qui

est de 1.2mg/jour.

L'encapsulation de la thiamine au ratio P:Ps 2:1 avec l'augmentation de la quantité de

thiamine ajoutée aux complexes IPL/PFM a révélé que la concentration de thiamine

n'affecte généralement ni la formation de complexe ni l'efficacité d'encapsulation, quel que

ce soit le mode d'acidification du milieu. Cependant, avec l'acidification du milieu après

mélange des polymères, la masse de complexes formés ainsi que l'efficacité

d'encapsulation ont été réduites, à pH 3.5, avec l'augmentation de la concentration de

thiamine probablement par effet de saturation. À ce pH, l'efficacité d'encapsulation des

anthocyanes avec le ratio P:Ps de 2:1 a été supérieure à celle obtenue avec le ratio 1:1. De

plus, avec acidification du milieu après mélange des polymères, l'efficacité d'encapsulation

des anthocyanes a augmenté avec l'augmentation de la quantité d'anthocyanes.


125

L'évaluation de l'effet protecteur des complexes à l'égard des ingrédients hydrosolubles

encapsulés, dans le jus de pomme clarifié après pasteurisation (90°C/12 s) et durant

l'entreposage à 40°C et à la lumière (11000 lux) pendant 14 jours, a révélé une diffusion

importante des anthocyanes encapsulées vers l'extérieur des complexes suite au traitement

thermique. Cependant, une partie des anthocyanes étaient demeurées liées aux complexes

pendant toute la période d'entreposage. Ces résultats démontrent une protection des

anthocyanes par les complexes durant l'entreposage. Cette protection pourrait s'expliquer

par les interactions hydrophobes ou des liaisons hydrogène entre les anthocyanes et les

complexes IPL/PFM qui pourraient agir comme copigments (Brouillard et al, 1989) en

empêchant l'hydratation des anthocyanes qui est accélérée par la lumière ou la chaleur.

Perspectives de recherche
Les résultats de cette thèse constituent une contribution importante dans le domaine de

l'encapsulation des ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides. Ils ouvrent la voie à

de nouvelles recherches afin d'optimiser l'utilisation des complexes IPL/PFM pour

l'encapsulation des ingrédients hydrosolubles et améliorer leur stabilité dans les conditions

qui prévalent en transformation des aliments. Ainsi, il serait intéressant d'augmenter le

rendement en complexes pour obtenir une masse de complexes plus importante. Cela

pourrait être réalisé par la formation de complexes à des ratios P:Ps supérieurs à 2:1 et

avec une concentration en polymères totaux plus élevée que 0.4%.


126

Un des avantages résultant de l'augmentation du ratio ou de la concentration en polymères

totaux serait une protection suffisante des ingrédients encapsulés due à l'augmentation de la

masse de complexes. Ceci aura pour conséquence une durée de vie plus longue des

ingrédients encapsulés pendant l'entreposage. Cette augmentation de la concentration en

polymères totaux ou du ratio P:Ps permettrait d'éviter une saturation des complexes à de

hautes concentrations d'ingrédient à encapsuler tel qu'observée au chapitre 4.

Un autre aspect fort intéressant à considérer serait l'effet de l'inclusion physique sur

l'efficacité d'encapsulation des ingrédients hydrosolubles. Pour ce faire, il serait important

de réaliser une étude de l'effet de la concentration totale en polymère, en combinaison avec

le ratio P:Ps, sur la structure microscopique des complexes. Ceci serait plus intéressant dans

le cadre de l'acidification du milieu après le mélange des polymères vu leur structure

compacte par rapport à l'acidification avant le mélange des polymères.

Il serait aussi intéressant d'évaluer les interactions électrostatiques entre complexes

IPL/PFM et les ingrédients hydrosolubles sur l'encapsulation des ces ingrédients. Une

étude comparative de l'encapsulation de plusieurs ingrédients hydrosolubles pourrait aider

à déterminer ceux qui seraient le mieux adaptés au système IPL/PFM chargé négativement.

Il a été démontré dans ce projet qu'à pH 3.5, les complexes IPL/PFM étaient chargés

négativement tandis que les anthocyanes étaient chargés positivement. Cependant, les

anthocyanes ne sont pas stables sous la forme d'ion flavilium chargé positivement. Elles

sont en équilibre avec la forme pseudobase qui est neutre. Un ingrédient hydrosoluble

cationique stable à ce pH serait un ingrédient idéal pour l'encapsulation. Puisqu'il est connu
127

que des groupements acétyles et glycosyls sont attachés aux anthocyanes, ceux-ci

pourraient être modifiés pour contenir des charges positives qui réagiraient avec les

complexes IPL/PFM (négatifs) pour renforcer l'encapsulation des anthocyanes par la

formation de liaisons électrostatiques.

La résistance des complexes au traitement thermique est un aspect important à étudier en

raison de la sensibilité des protéines de lactosérum à la chaleur. À ce niveau il serait

intéressant de trouver un équilibre entre la concentration en polymères totaux et le ratio

P:Ps afin d'obtenir une résistance maximale à la chaleur. L'utilisation de pontage avec des

ions tels que Ca"^, Mg"1-1", Na+, à de faibles concentrations pourrait être une technique

intéressante pour renforcer la résistance des complexes à la chaleur sans formation de gel.

Finalement, il faudra étudier l'utilisation des complexes IPL/PFM dans les aliments acides

complexes de type jus de fruits non clarifiés. Dans ce domaine l'utilisation de

concentrations élevées de polymères totaux pourrait se faire sans que l'on s'inquiète des

problèmes de sédimentation puisque ces jus (jus de pomme non clarifié, jus de mangue,

etc..) contiennent en général un dépôt de matières solides. Cependant il serait intéressant

d'étudier les interactions entre les complexes et les composantes des aliments pour

déterminer les facteurs qui pourraient affecter l'ajout de ces complexes dans les aliments.
128

CHAPITRE 8: Bibliographie
Abra, R. M., Anthony Hunt, C , Lau, D. T. (1984). Liposome Disposition In Vivo VI:

Delivery to the Lung. Journal of Pharmaceutical Sciences, 73,203-206.

Abrams, S. A. & Atkinson, S. A. (2003). Calcium, magnésium, phosphorus and vitamin D

fortification of complementary foods. The Journal of Nutrition, 133, 2994S-2999S.

Acharya, K. R., Ren, J., Stuart, D. I., Phillips, D. C , & Fenna R. E. (1991). Crystal

structure of human a-lactalbumin at 1.7 Â resolution. Journal ofMolecular Biology, 221,

571-581.

Acharya, K. R., Stuart, D. I., Phillips, D. C , McKenzie, H. A., & Teahan, C. G. (1994).

Models of the three-dimensional structures of echidna, horse, and pigeon lysozymes:

calcium-binding lysozymes and their relationship with a-lactalbumins. Journal of Protein

Chemistry, 13, 569-584.

Akhtar, M., Dickinson, E., Mazoyer, J., & Langendorft, V. (2002). Emulsion stabilizing

properties of depolymerized pectin. Food Hydrocolloids, 16,249-256

Alexandrescu, A. T., Evans, P. A., Pitkeathly, M., Baum, J., & Dobson, C. M. (1993).

Structure and dynamics of the acid-denatured molten globule state of a-lactalbumin: A two

dimensional NMR study. Biochemistry, 32, 1707-1718.


129

Arkbâge, K. Verwei, M., Havenaar, R., & Witthoft, C. (2003). Bioaccessibility of folie acid

and (6S)-5-methyltetrahydrofolate decreases after the addition of folate-binding protein to

yogurt as studied in a dynamic in vitro gastrointestinal model 1, 2. Journal of Nutrition,

133,3678-3683.

Axelos, M. A. V. & Thibault, J.-F. (1991). Influence of the substituents of the carboxyl

groups and of the rhamnose content on the solution properties and flexibility of pectins.

International Journal ofBiological Macromolecules, 13, 77-82.

Balassa, L. L. & Fanger, G. O. (1971): Encapsulation in the food industry. CRC Critical

Reviews in Food Technology, 2, 245-265.

Bals, A. & Kulozik, U. (2003). Effect of preheating on the foaming properties of whey

protein isolate using a membrane foaming apparatus. International Dairy Journal. 13, 903-

908.

Banville, C , Vuillemard, J. C , & Lacroix C. (2000). Comparison of différent methods for

fortifying Cheddar cheese with vitamin D. International Dairy Journal. 10,375-382.

Beaulieu, M., Turgeon, S. L., & Doublier, J.- L. (2001). Rheology, texture and

microstructure of whey proteins/low methoxyl pectins mixed gels with added calcium

International Dairy Journal, 11, 961-967.


130

Beaulieu, M., Corredig, M., Turgeon, S. L., Wicker, & Doublier, J. - L. (2005). The

formation of heat-induced protein aggregates in whey protein/pectin mixtures studied by

size exclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering détection.

Food Hydrocolloids, 19, 803-812.

Bedie, K. G., Turgeon, S.L. & Makhlouf, J. (2007). Formation of native whey protein

isolate-low methoxyl pectin complexes as a matrix for hydro-soluble food ingrédient

entrapment in acidic foods. Food Hydrocolloids, (in press).

Benichou, A., Aserin A and Garti N. (2002). Protein-polysaccharide interactions for

stabilization of food emulsions. Journal of Dispersion Science and Technology, 23: 93-123.

Benichou, A., Aserin, A., & Garti, N. (2007). O/W/O double emulsions stabilized with

WPI-polysaccharide conjugates. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and

Engineering Aspects, 297, 211-220.

Bhandari, B. R. & D'arcy, B. R. (1996). Microencapsulation of flavour compounds. Food

Australia, 48, 547-551.

Biesheuvel, P. M. & Stuart, M. A. (2004). Electrostatic free energy of weakly charged

macromolecules in solution and intermacromolecular complexes consisting of oppositely

charged polymers. Langmuir, 20, 2785-2791


131

Blanquet, S., Zeijdner, E., Beyssac, E., Meunier., J.-P., Denis, S., Havenaar, R., & Alric,

M. (2004). A dynamic artificial gastrointestinal System for studying the behavior of orally

administered drug dosage forms under various physiological conditions. Pharmaceutical

Research, 21, 585-591.

Boucher, M.-C. (2007). Impact des traitements physiques sur la stabilité des matrices

d'encapsulation à base d'isolat de protéines de lactosérum et de pectine faiblement

méthylée. Mémoire de maîtrise, Université Laval, Québec, Canada.

Bough, W. A. & Landes D, R. (1976). Recovery and nutritional évaluation of proteinaceous

solids separated from whey by coagulation with chitosan. Journal of Dairy Science, 59

1874-1880.

Bowman, W. A., Rubinstein, M. et Tan, J. S. (1997). Polyelectrolyte-gelatin complexation:

light scattering study. Macromolecules, 30, 3262-3270.

Boye, J. I., Alli, I., & Ismail, A. A. (1997). Use of differential scanning calorimetry and

infrared spectroscopy in the study of thermal and structural stability of a-lactalbumin.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 1116-1125.

Boye, J. I., Ismail, A. A, & Alli, I. (1996). Effect of physicochemical factors on the

secondary structure of P-lactoglobulin. Journal of Dairy Research, 63, 97-109.


132

Brouillard, R. & Delaporte, B. (1977). Chemistry of Anthocyanin Pigments. 2. Kinetic and

Thermodynamic Study of Proton Transfer, Hydration, and Tautomeric Reactions of

Malvidin 3-Glucoside. Journal of the American Chemical Society, 99, 8461-8468.

Brouillard, R., Mazza, G., Saad, Z., Albrecht-Gary, A. M., & Cheminât, A. (1989). The

copigmentation reaction of anthocyanins: a microprobe for the structural study of aqueous

solutions. Journal ofthe American Chemical Society, 11,2604-2610.

Bungenberg de Jong, (1949). Crystallization-coacervation-flocculation. In: H. R. Kruyt,

Colloid Science (Vol. 2) (pp232-258). Oxford Clarendon press.

Burgess, D. J. (1990). Practical analysis of complex coacervate Systems. Journal ofColloid

and Interface Science, 140, 227-238.

Burgess, D. J. (1994). Complex coacervation: micro-capsule formation. In : P. Dubin, J.

Bock, R. Davis, D. N. Schulz, C. Thies, Macromolecules Complexes in Chemistry and

biology (pp. 285-299). Springer-Verlag press.

Burgess, D. J. & Carless, J. E. (1984). Microelectrophoretic studies of gelatin and acacia

gum for prédiction of complex coacervation. Journal of Colloid and Interface Science, 88,

1-8.
133

Burgess, D. J. & Carless, J. E. (1985). Manufacture of gelatin/gelatin coacervate

microcapsules. International Journal ofPharmaceutics, 27, 61-70.

Burgess, D. J., Kwok, K. K. & Megremis, P. T. (1991) Characterization of albumin-acacia

complex coacervation. Journal ofPharmacy and Pharmacology, 43, 232-236.

Burgess, D. J. & Singh O. N. (1993). Spontaneous formation of small sized albumin/acacia

coacervate particles. Journal ofPharmacy and Pharmacology, 43,232-236.

Burova, T. V., Grinberg, N. V., Golubeva, I. A., Mashkevich, A. Y., Grinberg, V. Y.,

Tolstoguzov, V. B. (1999) . Flavour release in model bovine sérum albumin/pectin/2-

octanone Systems. Food Hydrocolloids, 13, 7-14.

Burton, B. A. & Brant, D. A. (1983). Comparative flexibility, extension, and conformation

of some simple polysaccharide chains. Biopolymers, 22,1769-1792.

Cannon, J. (1993). Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.

Journal ofpharmaceutical sciences, 82,435-446.

Canteri-Schemin, M. H., Fertonani, H. C. R., Waszczynskyj, N., & Wosiacki. (2005).

Extraction of pectin from apple pomace. Brazilian Archieves of Biology and Technology,

48, 259-266.
134

Chandra, N., Brew, K., & Acharya, R. (1998). Structural évidence for the présence of a

secondary calcium binding site in human R-lactalbumin. Biochemistry, 37, 4767-4772.

Cheftel J.-C, Cuq J.-L. & Lorient D. (1985). Protéines alimentaires. In: Cheftel, J.-C, Cuq,

J.-L., & Lorient, D. Biochimie-Propriétés Fonctionnelles - Valeur Nutritionnelle -

Modifications Chimiques, (pp. 156-192). Technique et Documentation Lavoisier.

Chen, C-C, Tu, Y.-Y, & Chang, H.-M. (1999). Efficiency and protective effect of

encapsulation of milk immunoglobulin G in multiple emulsion. Journal of Agriculture and

Food Chemistry, 47, 407-410.

Chiancone, E. & Gattoni, M. (1991). Sélective extraction of native pMactoglobulin from

whey. Journal o/Chromatography, 539,455-463.

Chilvers, G. R., Gunning, A. P., & Morris, V. J. (1988). Coacervation of gelatine-XM6

mixture and their use in microencapsulation. Carbohydrate Polymers, 8, 55-61

Cho, Y.-H., Lee, J.-J., Park, I.-B., Huh, C-S., Baek, Y.-J., & Park J. (2005). Protective

effect of microencapsulation consisting of multiple emulsification and heat gelation

processes on immunoglobulin in yolk. Journal of Food Science, 70, E148-E151.


135

Clémente, D. A., Marzotto, A., & Valle, G. (1988). Crystal and molecular structure of

thiamine monochloride. Journal of Crystallographic and Spectroscopic Research, 18, 147-

156.

Clifford, M. N. (2000). Anthocyanins - nature, occurrence and dietary burden. Journal of

the Science of Food and Agriculture, 80, 1063-1070.

Dalgleish, D. G. (1997). Adsorption of protein and the stability of emulsions. Trends in

Food Science & Technology, 8,1-6.

Daniels, R. & Mittermaier E. M. (1995). Influence of pH adjustment on microcapsules

obtained from complex coacervation of gelatin and acacia. Journal of Microencapsulation,

12, 591-599.

De Kruif, C. G., Weinbreck, F., & de Vries, R. (2004). Complex coacervation of proteins

and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 9, 340-349.

De Vries, R. (2004). Monte Carlo simulations of flexible polyanions complexing with whey

proteins at their isoelectric point. Journal of Chemical Physics, 120, 3475-3481.

De Vries, R., Weinbreck, F., de Kruif, C. G. (2003). Theory of polyelectrolyte adsorption

on heterogeneously charged surfaces applied to soluble protein-polyelectrolyte complexes.

Journal of Chemical Physics, 118, 4649-4659.


136

De Wit, J. N. (1990). Thermal stability and functionality of whey proteins. Journal ofDairy

Science, 73, 3602-3612

DeZarn, T. J. (1995). Food ingrédient encapsulation: an overview. ACS Symposium Séries,

590, 74-86.

Dickinson, E. (1998). Stability and rheological implications of electrostatic milk protein-

polysaccharides interactions. Trends in food science and technology, 9,347-354.

Dickinson, E. (2003). HydrocoUoids at interfaces and the influence on the properties of

dispersed Systems. Food HydrocoUoids, 17,25-39.

Dickinson, E.; Pawlowski, K. (1996) Effect of high-pressure treatment of protein on the

rheology of flocculated emulsions containing protein and polysaccharide. Journal of

Agricultural and Food Chemisîry, 44, 2992-3000.

Dickinson, E., Semenova, M. G., Antipova, A. S., & Pelan, E. G. (1998). Effect of high-

methoxy pectin on properties of casein-stabilized emulsions. Food HydrocoUoids, 12, 425-

432
137

Djordjevic, D., Kim, H.-J., McClements, D. J., & Decker, E. A. (2004a). Physical stability

of whey protein-stabilized oil-in-water emulsions at pH 3: potential co-3 fatty acid delivery

Systems (Part A). Journal of Food Science, 69, C351-C355.

Djordjevic, D., McClements, D. J., & Decker, E. A. (2004b). Oxidative Stability of Whey

Protein-stabilized Oil-in-water Emulsions at pH 3: Potential _-3 Fatty Acid Delivery

Systems (Part B). Journal of Food Science, 69, C356-C362.

Doco, T., Williams, P., Vidal, S., Pellerin, P. (1997). Rhaninogalacturonan II, a dominant

polysaccharide in juices produced by enzymic liquéfaction of fruits and vegetables.

Carbohydrate Research, 297, 181-186.

Duclairoir, C , Nakache E, Marchais H et Orecchioni A.-M. (1998). Formation of gliadin

nanoparticles : Influence of the solubility parameter of the protein solvent. Colloid and

Polymer Science, 276, 321-327.

Dunn, J. T. (2003). Iodine should be routinely added to complementary foods. The Journal

of Nutrition, 133, 3008S-3010S.

Dziezak, J. D. (1988). Microencapsulation and encapsulated ingrédients. Food Technology,

42,136-153.
138

Ersus, S. & Yurdagel, U. (2007). Microencapsulation of anthocyanin pigments of black

carrot (Daucuscarota L.) by spray drier. Journal of Food Engineering, 80, 805-812.

Evageliou, V., Richardson, R. K., & Morris, E. R. (2000) Effect of pH, sugar type and

thermal annealing on high-methoxy pectin gels. Carbohydrate Polymers, 42, 245-259.

Foegeding, E. A.; Kuhn, P. R.; Hardin, C. C. (1992). Spécifie divalent cation-induced

changes during gelation of pMactoglobulin. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

40,2092-2097.

Galazka, V. B., Ledward, D. A., Sumner, I. G., & Dickinson, E. (1997). Influence of high

pressure on bovine sérum albumin and its complex with dextran sulphate. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 45, 3465-3471.

Galazka, V. B., Smith D., & Ledward, D. A. (1999a). Influence of ovalbumin with

sulphated polysaccharides: effects of pH, ionic strength, heat and high pressure treatment.

FoodHydrocolloids, 13, 81-88.

Galazka, V. B., Smith D., Ledward, D. A. & Dickinson, E. (1999b). Complexes of bovine

sérum albumin with sulphated polysaccharides: effects of pH, ionic strength and high

pressure treatment. Food Chemistry, 64, 303-310.

Ganz AJ. (1974). How gum reacts with proteins. Food Engineering, 6, 67-69.
139

Garti, N. (1997). Progress in stabilization and transport phenomena of double emulsions in

food applications. Lebensmittel - Wissenschaft und Technologie, 30, 222-235.

Gibbs, B. F., Kermasha, S., Alli, L, & Mulligan, C. N. (1999). Encapsulation in the food

industry: a review. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 50, 213-224.

Girard M., Sanchez C , Laneuville, S. L, Turgeon, S. L., & Gauthier, S. F. (2004).

Associative phase séparation of pMactoglobulin/pectin solutions: a kinetic study by small

angle static light scattering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 35, 15-22.

Girard, M., Turgeon, S., & Gauthier, S. (2002). Interbiopolymer complexing between 0-

lactoglobulin and low- and high-methylated pectin measured by potentiometric titration and

ultrafiltration. Food Hydrocolloids, 16, 585-591.

Girard, M., Turgeon, S., & Gauthier, S. (2003). Quantification of the interactions between

pMactoglobulin and pectin through capillary electrophoresis analysis. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 51, 6043-6049.

Giusti, M. M., Rodriguez-Saona, L. E., Griffin, D., & Wrolstad, R. E. (1999). Electrospray

and tandem mass spectroscopy as tools for anthocyanin characterization. Journal of

Agricultural Food and Chemistry, 47,4657-4664.


140

Hambling S.G., McAlpine A.S. & Sawyer L. (1992). P-Lactoglobulin. In: P.F. Fox,

Advanced Dairy Chemistry 1: Proteins, (pp. 141-190). Elsevier Sci. Publisher Ltd.

Hansen, P. M. T., Hidalgo, J., & Gould, I. A. (1971). Réclamation of Whey Protein with

Carboxymethylcellulose. Journal of dairy science, 54, 830-834.

Harding, S., Jumel, K., Kelly, R., Gudo, E., Horton, J. C. et Mitchell, J. R. (1993). The

structure and nature of protein-polysaccharide complexes. In K. D. Schwenke & R. Mothes,

Food Proteins, Structure and Functionality (pp. 216-226), Weinheim: VCH.

Health Canada (2007). Multi-vitamine/minerai supplément monograph, pp. 1-46.

http://www.hc-sc.gc.ca/dhp-mps/alt_formats/hpfb-dgpsa/pdf/

prodnaWmultivit_min_mono_e.pdf

Hedges, A. R., Shieh, W. J., & Sikorski, C. T. (1995). Use of cyclodextrins for

encapsulation in the use and treatment of food products. ACS Symposium Séries, 590, 60-

71.

Hiraoka, Y., Segawa, T., Kuwajimar, K., Sugai, S., & Murai, N. (1980). a-Lactalbumin: a

calcium metalloprotein. Biochemical and Biophysical Research Communications, 95, 1098-

1104.
141

Huang, Y.-Y., Chung, T.-W., & Tzeng, T.-W. (1997). Drug release from PLA/PEG

microparticlates. International Journal of Pharmaceutics, 156, 9-15.

Imeson, A.P.; Ledward, D.A.; Mitchell, J.R. (1977). On the nature on the interaction

between some anionic polysaccharides and proteins. Journal of the Science of Food and

Agriculture, 28, 669-672.

International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Compendium of Chemical

Technology 1997.

Ishii, T. (1997). O-acetylated oligosaccharides from pectins of potato tuber cell walls. Plant

Physiology, 11 3,1265-1 272.

Jackson, L. S. & Lee K. (1991). Microcapsulation and the food industry. Lebensmittel -

Wissenschaft und Technologie, 24,289-297.

Jeyarajah, S. Allen, J.C. (1994). Calcium binding and salt-induced structural changes of

native and preheated pMactoglobulin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, 80-

85.

Jimenez, M., Garcia, H. S., & Beristain, C. I. (2004). Spray-drying microencapsulation and

oxidative stability of conjugated linoleic acid. European Food Research and Technology,

219, 588-592.
142

Jono, K., Ichikawa, H., Miyamoto, M., & Fukumori, Y. (2000). A review of particulate

design for pharmaceutical powders and their production by spouted bed coating. Powder

Technology, 113, 269-277.

Jouzel, B., Pennarun, A.-L., Prost, C , Renard, D., Poncelet, D., & Demainay, M. (2003).

Encapsulation of a lipid precursor, the eicosapentaenoic acid, to study the development of

the Crassostrea gigas oyster flavours. Journal ofmicroencapsulation, 20, 35-46.

Kaibara, K., Okazaki, T., Bohidar, H. B. et Dubin, P. L. (2000). pH-induced coacervation

in complexes of bovine sérum albumin and cationic polyelectrolytes. Biomacromolecules,

1,100-107.

Kella, N. K.; Kinsella, J.E. (1988). Structural stability of P-lactoglobulin in the présence of

kosmotropic salts. International Journal of Peptide and Protein, 32, 396-405.

Kerstens, S., Murray, B. S., & Dickinson, E. (2005). Confocal microscopy of heat-induced

aggregation and gelation of P-lactoglobulin in présence of non-ionic surfactant. Food

Hydrocolloids, 19, 625-633.

Kertesz, Z. I. (1951). The pectic substances (PP. 161-168). Interscience publishers Inc.
143

Kim, N. C , Jeon, B. J., & Kwak, H. S. (2006). In Vitro Study of Microencapsulated

Isoflavone and P-Galactosidase. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 2582-

2586.

King, A. H. (1995). Encapsulation of food ingrédients: A review of available technology,

focusing on hydrocolloids. ACS Symposium Séries, 590, 26-39.

Kinsella J.E. & Whitehead, D. M. (1989). Proteins in whey: chemical, physical, and

functional properties. Advances in Food and Nutrition Research, 343-438.

Kirca, A., Zkan, M. O., & Cemeroglu, B. (2003). Thermal stability of black carrot

anthocyanins in blond orange juice. Journal of Food Quality, 26, 361-366.

Kirca, A., Zkan, M. O., & Cemeroglu, B. (2006). Stability of black carrot anthocyanins in

various fruit juices and nectars. Food Chemistry, 97. 598-05.

Kirca, A., Zkan, M. O., & Cemeroglu, B. (2007). Effects of température, solid content and

pH on the stability of black carrot anthocyanins. Food Chemistry, 101,212-218.

Kondo, T., Hafez, E., Abdel-Monem, H., Muramatsu, N., El-Haras, S., El-Gibaly, I. (1996).

Préparation and évaluation of microencapsulated sulfadiazine resin comp\ex.Powder

Technology, 88, 101-105.


144

Kontopidis, G, Holt, C , & Sawyer, L. (2002). The ligand-binding site of bovine 0-

lactoglobulin: évidence for a fonction? Journal ofMolecular Biology, 318, 1043-1055.

Kontopidis, G., Holt, C , & Sawyer, L. (2004). Invited Review: /Mactoglobulin: binding

properties, structure, and fonction. Journal ofDairy Science, 87, 785-796.

Kronman, M, J. & Andreotti, R. E. (1964). Inter- and intramolecular interactions of a-

lactalbumin. I. The apparent heterogeneity at acid pH. Biochemistry, 3,1145-1151.

Kronman, M. J., Andreotti, R., & Vitols, R. (1964). Inter- and intramolecular interactions

of a-lactalbumin. II. Aggregation reactions at acid pH. Biochemistry, 3,1152-1160.

Kronman, M. J., Holmes, G. L., & Robbins, F. M. (1967). Inter-and intramolecular

interactions of a-lactalbumin VIII. The alkaline conformational change. Biochemica et

Biophysica Acta, 133, 46-55.

Kuhn, P.R. Foegeding, E.A. (1991). Minerai sait effects on whey protein gelation. Journal

ofAgricultural and Food Chemistry, 39, 1013-1016.

Kuwajima, K. (1989). The molten globule state as a clue for understanding the folding and

cooperativity of globular-protein structure. PROTEINS: Structure, Function, and Genetics,

6, 87-103.
145

Lai, M.-K. & Tsiang, R. C.-C. (2005). Microencapsulation of acetaminophen into poly(L-

lactide) by three différent emulsion solvent-evaporation methods. Journal of

Microencapsulation, 22,261-274.

Lamprecht, A., Schaëferj U., & Lehr, C.-M. (2001). Influences of process parameters on

préparation of microparticle used as a carrier System for Q-3 unsaturated fatty acid ethyl

esters used in supplementary nutrition. Journal of microencapsulation, 18, 347-357.

Laneuville, S. I., Paquin, P. et Turgeon, S. L. (2000). Effect of préparation conditions on

the characteristics of whey protein-xanthan gum complexes. Food Hydrocolloids, 14, 305-

314.

Larsson, M., Minekus, M., & Havenaar R. (1997). Estimation of the bioavailability of iron

and phosphorus in cereals using a dynamic in vitro gastrointestinal model. Journal ofthe

Science of Food and Agriculture, 74, 99-106.

Ledward, D. A. (1993). Creating textures from mixed biopolymer Systems. Trends in Food

Science & Technology, 41, 402-405.

Ledward, D. A. (1994). Protein-polysaccharide interactions. In N. S. Hettiaracchy & C. R.

Ziegler Protein functionality in food Systems (pp. 225-259). Marcel Dekker.


146

Lee, J., Dust, W., & Wrolstad, R. E. (2005). Détermination of total monomeric

anthocyanins pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the

pH differential method: collaborative study. Journal of AOACInternational, 88, 1269-1278

Léman, J., Dolgan, T., Smoczynski, M., & Dziuba, Z. (2005). Fractal characteristics of

microstructure of beta-lactoglobulin préparations and their emulsifying properties.

Electronic Journal ofPolish Agricultural Universities, 8(3) #29.

Liu, X.-D., Atarashi, T., Furuta, T., Yoshii, H., Aishima, S., Ohkawara, M., & Linto, P.

(2001). Microencapsulation of emulsified hydrophobic flavors by spray drying. Drying

Technology, 19, 1361-1374.

Lucinda-Sylva, R. M. & Evangelista, R. C. (2003). Microspheres of alginate-chitosan

containing isoniazid. Journal of Microencapsulation, 20, 145-152.

Luzzi, L. A. (1970). Microencapsulation. Journal of Pharmaceutical Sciences, 59, 1367-

131376.

Matsufuji, H., Kido, H., Misawa, H, Yaguchi J., Otsuki, T., Chino, M., Takeda, M., &

Yamagata, K. (2007). Stability to light, heat, and hydrogen peroxide at différent pH values

and DPPH radical scavenging activity of acylated anthocyanins from red radish extract.

Journal of Agriculture and Food Chemistry, 55, 3692-3701.


147

Mattison, K. W., Brittain I. J. & Dubin P. L. (1995). Protein-polyelectrolyte boundaries.

Biotecnologyprogress, 11, 632-637.

Mattison, K.W.; Dubin, P. L.; Brittain, L J. (1998). Complex formation between bovine

sérum albumin and strong polyelectrolytes: effects of polymer charge density. Journal of

Physical ChemistryB, 102, 3830-3836.

Mazza, G. & Brouillard, R. (1990). The mechanism of co-pigmentation of Anthocyanins in

aqueous solutions. Phytochemistry, 29, 1097-1102.

Mazza, G. & Miniati, E. (1993). Chapterl. Introduction. In: G. Mazza, E. Miniati,

Anthocyanins in Fruits, Vegetables, and Grains (pp 1-20). CRC Press Inc.

Mazzaracchio, P., Pifferi, P., Kindt, M., Munyaneza, A., & Barbiroli, G. (2004).

Interactions between anthocyanins and organic food molécules in model Systems.

International Journal ofFood Science and Technology, 39, 53-59.

Minekus, M. Jelier, M., Xiao, J.-Z., Kondo, S., Iwatsuki, K., Kokubo, S., Bos, M.,

Dunnewind, B., & Havenaar, R. (2005). Effect of partial hydrolyzed guar gum (PHGG) on

the bioaccessibility of fat and cholestérol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50,

2308-2312.
148

Mishra, S., Mann, B., & Joshi, V. K. (2001). Functional improvement of whey protein

concentrate on interaction with pectin. FoodHydrocolloids, 15, 9-15.

Morais, H., Ramos, C , Forgacs, E., Cserhati, T., & Oliviera, J. (2002). Influence of storage

conditions on the stability of monomeric anthocyanins studied by reversed-phase high-

performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B, 770, 297-301.

Nangia-Makker, P.; Conklin, J.; Hogan, V.; Raz, A. (2002) Carbohydrate-binding proteins

in cancer, and their ligands as therapeutic agents. Trends in Molecular Medicine, 8, 187-

192.

Nath, S., Patrickios C. S. And Hatton T. A. (1995). Turbidimetric titration study of the

interaction of proteins with acrylic polyampholytes. Biotecnology progress, 11, 99-103.

Nii, T. & Ishii, F. (2005). Encapsulation efficiency of water-soluble and insoluble drugs in

liposomes prepared by the microencapsulation vesicle method. International Journal of

Pharmaceutics, 298, 198-205.

Oliveira, K. M. G., Valente-Mesquita, V, L., Botelho, M. M., Sawyer, L., Ferreira, S. T., &

Polikarpov I. (2001). Crystal structures of bovine b-lactoglobulin in the orthorhombic space

group C2221. Structural différences between genetic variants A and B and features of the

Tanford transition. European Journal of Biochemistry, 268,477-483.


149

O'Neill, M., Albersheim, P., & Darvill, A. (1990). The pectic polysaccharides of primary

cell walls. In: D.M. Dey, Methods in Plant Biochemistry, Vol. 2. (pp. 415-441). Académie

Press.

Ouyang, W., Chen, H., Jones, M. L., Metz, T., Haque, T., Martoni, C , & Prakash, S.

(2004). Artificial cell microcapsule for oral delivery of live bacterial cells for therapy:

design, préparation, and in-vitro characterization. Journal of Pharmaceutical Sciences, 7,

315-324.

Pan, Y., Li, Y.J., Zhao, H.-Y., Zheng, J.-M., Xu, H., Wei, G., Hao, J.-S., & Cui, F.-D.

(2002). Bioadhesive polysaccharide in protein delivery system: chitosan nonoparticles

improve the intestinal absorption of insulin in vivo. International Journal of

Pharmaceutics, 249,139-147.

Park, J. M., Muhoberac B. B., Dublin P. L. and Xia J. (1992). Effect of protein charge

heterogeneity in protein-polyelectrolyte complexation. Macromolecules, 25,290-295.

Patwardhan, S. A. & Das K. G. (1983). Microencapsulation. In K. G. Das, Controlled-

released technology (pp. 121-141). John Wiley & sons.

Peltonen, L., Aitta, J., Hyvônen, S., Karjalainen, M., & Hirvonen, J. (2004). Improved

entrapment efficiency of hydrophilic drug substance during nanoprecipitation of

poly(l)lactide nanoparticles. American Association of Pharmaceutical Scientists


150

PharmSciTech, 5,1-6.

Perez-Vicente, A., Gil-Izquierdo A., & Garcia-Viguera, C. (2002). In vitro gastrointestinal

digestion study of pomegranate juice phenolic compounds, anthocyanins, and vitamin C.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2308-2312.

Permyakov, E. A. &, Berliner, L. J. (2000). a-Lactalbumin: structure and function. FEBS

Letters, 473,269-274.

Peters, H. J. W., van Bommel, E. M. G. et Fokkens, J. G. (1992). Effect of gelatin

properties in complex coacervation processes. Drug Development and Industrial

Pharmacy, 18,123-134.

Phares, R. E. Jr. & Sperandio, G. J. (1964). Préparation of a phase diagram for

coacervation. Journal of Pharmaceutical Sciences, 53, 518-521.

Picot, A., Lacroix, C. (2004). Encapsulation of bifidobacteria in whey protein-based

microcapsules and survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt.

International Dairy Journal, 14 505-515.

Ragona, L., Fogolari, F., Catalano, M., Ugolini, R., Zetta, L., & Molinari, H. (2003). EF

loop conformational change triggers ligahd binding in P-lactoglobulins. The journal of

Biological Chemistry, 278, 38840-38846.


151

Ralet, M. - C, Dronnet, V., Buchholt, H. C, & Thibault, J. - F. (2001). Enzymatically and

chemically de-esterified lime pectins: characterisation, polyelectrolyte behaviour and

calcium binding properties. Carbohydrate Research, 336,117-125.

Rao, D. R., Chawan, C. B., & Veeramachaneni, R. (1995). Liposomal encapsulation of p-

galactosidase: comparison of two methods of encapsulation and in vitro lactose

digestibility. Journal ofFood Biochemistry, 18,239-251.

Relkin P. (1998). Reversibility of heat-induced conformational changes and surface

exposed hydrophobic clusters of (3-lactoglobulin: their rôle in heat-induced sol-gel state

transition. Biological Macromolecules, 22, 59-66.

Relkin P., Launay, B., & Eynard, L. (1993). Effect of sodium and calcium addition on

thermal denaturation of Apo-a-lactalbumin: a differential scanning calorimetric study.

Journal ofDairy Science, 76, 36-47.

Renard, C. M. G. C. & Thibault, J.-F. (1993). Structure and properties of apple and sugar-

beet pectins extracted by chelating agents. Carbohydrate Research, 244, 99-114.

Report of the Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Référence

Intakes and its Panel on Folate, Other B Vitamins, and Choline and Subcommittee on

Upper Référence Levels of Nutrients, Food and Nutrition Board, Institute of Medicine
152

(1998). Dietary Référence Intakes for Thiamin, Riboflavin, Niacin, Vitamin B6, Folate,

Vitamin B12, Pantothenic Acid, Biotin, and Choline.

http://www.nap.edu/catalog/6015.html.

Ribeiro, A., Arnaud P., Frazao S, Venâncio F and Chaumeil J. C. (1997). Development of

vegetable extracts by microencapsulation. Journal of Microencapsulation. 14, 735-742.

Ridley, B. L., O'NeiU, M. A., & Mohnen, D. (2001). Pectins: structure, biosynthesis, and

oligogalacturonide-related signaling. Phytochemistry, 57, 929-967.

Risch, S. J. (1995). Encapsulation: Overview of uses and techniques. ACS Symposium

Séries, 590, 2-7.

Robin, C. (2002). Commercial pectin préparations. In: G. B. Seymour & J. P. Knox,

Pectins and their Manipulation, (pp 222-241). CRC Press Inc..

Rutten, A.A.C.M., Bouwman, W.G., & van der Leeden, M.C. (2002). |3-Lactoglobulin as

an idéal random polymer coil. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering

Aspects, 210, 243-252.

Samant, S.K.; Singhal, R.S.; Kulkarni, P.R.; Rege, D.V. (1993) Protein-polysaccharide

interactions: a new approach in food formulation. International Journal of Food Science

and Technology, 28, 547-562.


153

Sanchez, C. & Paquin, P. (1997). Protein and protein-polysaccharide microparticles. In S.

Damodaran & A. Paraf, Food Proteins and Their Applications (pp. 503-528). Marcel

Dekker, Inc.

Sanchez, C. & Renard, D. (2002). Stability and structure of protein-polysaccharide

coacervates in the présence of protein aggregates. International Journal of Pharmaceutics,

242,319-324.

Savant, V. D. and Torres, J. A. (2000). Chitosan-based coagulation agents for treatment of

cheddaicheesewhey.Biotechnologyand Progress, 16, 1091-1097.

Sawyer, L.; Kontopidis, G. (2000).The core lipocalin, bovine pMactoglobulin. Biochimica

et Biophysica Act, 1482, 136-148.

Schlameus, W. (1995). Centrifugal Extrusion Encapsulation. ACS Symposium Séries. 590,

96-103.

Schmitt, C. (2000). Etude de la coacervation complexe entre la P-lactoglobuline et la

gomme d'acacia en solution aqueuse. Thèse de Doctorat, Institut National Polytechnique de

Lorraine, France.
154

Schmitt, C , Sanchez C , Desobry-Banon S. & Hardy J. (1998). Structure and

technorunctional properties of protein-polysaccharide complexes. Critical reviews in food

science and nutrition, 38, 689-753.

Schmitt, C , Sanchez, C, Thomas, F. & Hardy, J. (1999). Complex coacervation between

pMactoglobulin and acacia gum in aqueous médium. Food Hydrocolloids, 13, 483-496.

Schmitt, C , Sanchez, C , Despond, S., Renard, D., Thomas, F., & Hardy, J. (2000). Effect

of protein aggregates on the complex coacervation between b-lactoglobulin and acacia gum

at pH 4.2. Food Hydrocolloids, 14, 403-413.

Schols H. A. and Voragen A. G. J. (2002). The chemical structure of pectins. In: G. B.

Seymour, J. P. Knoox, Pectins and their manipulation (pp 1-29). CRC Press Inc.

Schrooyen, P. M. M., van der Meer, R., & De Kruif, C. G. (2001). Microencapsulation: its

application in nutrition. Proceedings ofthe Nutrition Society, 60,475-479.

Semenova, M. G., Bolotina V. S. and Dmitrochenko A. P. (1991). The factors affecting the

compatibility of sérum albumin and pectinate in aqueous médium. Carbohydrate polymers,

15,367-385.
155

Shima, M., Tanaka, M., Kimura, Y., Adachi, S., & Matsuno, R. (2005). Enhancement in

transport of a hydrophilic marker through intestinal epithelial cell (Caco-2) monolayer by

W/O/W multiple emulsion containing C8TG. Food Hydrocolloids, 19, 321-328.

Shin, K.-S., Kiyohara, H., Matsumoto, T., Yamada, H. (1998). Rhamnogalacturonan II

dimers cross-linked by borate diesters from the leaves of Panax ginseng C.A. Meyer are

responsible for expression of their IL-6 production enhancing activities. Carbohydrate

Research, 307, 97-106.

Sinclair, H. M. (1979). Optimisation of food nutrient composition. In: G. G. Birch, K. J.

Parker, Food and Health: science and technology (pp. 425-440). Applied Science

Publishers Ltd.

Singh, O. N. & Burgess G. J. (1989). Characterization of albumin-alginic acid complex

coacervation. Journal ofPharmacy and Pharmacology, 41, 670-673.

Soottitantawat, A., Bigeard, F., Yoshii,H., Furuta, T., Ohkawara, M., & Linko, P. (2005a).

Influence of emulsion and powder size on the stability of encapsulated d-limonene by spray

drying. Food Science and Emerging Technologies, 6, 107-114.

Soottitantawat, A., Takayama, K., Okamura, K., Muranaka, D., Yoshii, H., Furuta, T.,

Ohkawara, M., & Linko, P. (2005b). Microencapsulation of 1-menthol by spray drying and
156

its release characteristics. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 6, 163-

170.

Soper, J. (1995). Utilization of Coacervated Flavors. ACS Symposium Séries, 590,104-112.

Strege, M. A., Dublin P. L., West, J. S., & Flinta, C. D. (1990). Protein séparation via

polyelectrolyte complexation. ACS Symposium Séries, 427, 66-79.

Syrbe, A., Bauer W. J., Klostermeyer H. (1998). Polymer science concepts in dairy System

- An overview of milk protein and food hydrocolloid interaction. International Dairy

Journal, 8,179-193.

Szpunar, J., Pellerin, P., Makarov, A., Doco, T., Williams,P., & Lobinski, R. (1999).

Speciation of metal-carbohydrate complexes in fruit and vegetable samples by size-

exclusion HPLC-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 639-644.

Tahiri, M., Pellerin, P., Tressol, J. C , Doco, T., Pépin, D., Rayssiguier, Y., & Coudray, C.

(2000). The rhamnogalacturonan-II dimer decreases intestinal absorption and

tissue accumulation of lead in rats. Journal of Nutrition, 130, 249-253.

Tayade, P. T., & Kale, R. D. (2004). Encapsulation of water-insoluble drug by a cross-

linking technique: effect of process and formulation variables on encapsulation efficiency,


157

particle size, and in vitro dissolution rate. AAPS PharmSci, 6 (1) #12 ppl-8,

(http://www.aapspharmsci.org).

Thibault, J. F, & Rinaudo, M. (1985). Interactions of mono- and divalent counterions with

alkali- and enzyme-deesterified pectins in salt-free solutions. Biopolymers, 24,2131-2143.

Tirkkonen, S. Turakka, L. et Paronen, P. (1994). Microencapsulation of indpmethacin by

gelatin-acacia complex coacervation in présence of surfactants. Journal of

Microencapsulation, 11, 615-626.

Tiyaboonchai, W., Woiszwillo, J., & Middaugh, C. R. (2001). Formulation and

characterization of amphotericin P-polyethylenimine-dextran sulfate nanoparticles. Journal

Pharmaceutical Sciences, 90, 902-914.

Todd, R. D. (1970). Microencapsulation and flavour industry. Theflavour Industry, 1, 768-

771.

Tolstoguzov, V. B. (1986). Functional properties of protein-polysaccharide mixtures. In J.

R. Mitchell & D. A. Ledward, Functional properties of macromolecules (pp. 385-415).

Elsevier Applied Science.

Tolstoguzov, V.B. (1991). Functional properties of food proteins and rôle of protein-

polysaccharide interaction. Food Hydrocolloids, 4,429-468.


158

Tolstoguzov, V. B. (1997). Protein-polysaccharide interactions. In S. Damodaran & A.

Paraf, Food Proteins and Their Applications (pp. 171-198). Marcel Dekker, Inc.

Turker, N., Aksay, S., & Ekiz, H. I. (2004). Effect of storage température on the stability of

anthocyanins of a fermented black carrot (Daucus carota var. L.) beverage: shalgam.

Journal of Agriculture and Food Chemistry, 52, 3807-3813.

Vandegaer, J. E. (1973). Encapsulation by coacervation. In J. E. Vandegaer,

Microencapsulation: Processes and Applications, (pp 21-37). Penum Press.

Varunsatian, S., Watanabe, K., Hayakawa, S., & Nakamura, R. (1983). Effects of Ca**,

Mg**, and Na+ on heat aggregation of whey protein concentrâtes. Journal ofFood Science,

48,42-46.

Verheul M., Roefs S.P.F.M., Mellema J. & de Kruif K.G. (1998). Kinetics of heat-induced

aggregation of P-lactoglobulin. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 46, 896-903.

Versic, R. J. (1988). Flavor encapsulation. ACS Symposium Séries, 370,1-6.

Verwei, M., Arkbâge, K., Havenaar, R., van den Berg, H., Witthoft, C , & Schaafsma, G.

(2003). Folie acid and 5-methyltetrahydrofolate in fortified milk are bioaccessible as


159

determined in a dynamic in vitro gastrointestinal model. Journal of Nutrition, 133, 2377-

2383.

Verwei, M., Arkbâge, K., Mocking, H., Havenaar, R. & Groten, J. (2004). The binding of

folie acid and 5-methyltetrahydrofolate to folate-binding proteins during gastric passage

differs in a dynamic in vitro gastrointestinal model. Journal of Nutrition, 134, 31-37,2004.

Vincken, J. P., Schols, H. A., Oomen, R. J. F. J., McCann, M. C , Ulvskov, P., Voragen, G.

J., & Visser, R. G. F. (2003). If homogalacturonan were a side chain of hamnogalacturonan

I. Implications for cell wall architecture. Plant Physiology, 132, 1781-1789.

Voragen, A. G. J., Pilnik, W., Thibault, J.-F., Axelos, M. A. V., & Renard, C. M. G. C.

(1995). Pectins. In: A. M. Stephen, Food polysaccharides and their applications (pp. 287-

339). CRC Press Inc..

Walkinshaw, M. I. & Arnott, S. (1981). Conformations and interactions of pectins

II. Models for junction zones in pectinic acid and calcium pectate gels. Journal of

Molecular Biology, 153, 1075-1085.


<

Wang, Y.-F., Gao J. Y. and Dubin P. L. (1996). Protein séparation via polyelectrolyte

coacervation: selectivity and efficiency. Biotechnology Progress. 12: 356-362.


160

Weinbreck, F., de Vries, R., Schrooyen, P., & de Kruif, C. G. (2003). Complex

coacervation of whey proteins and gum arabic. Biomacromolecules. 4, 293-303.

Weinbreck, F., Nieuwenhuijse, H., Robijn, G. W., & de Kruif, C. G. (2004). Complexation

of whey proteins with carrageenan. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3550-

3555.

Weinert, I. A. G., Solms, J., & Escher, F. (1990). Diffusion of anthocyanins during

processing and storage of canned plums. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 23,

396-399.

Weiss, J., Scherze, L, & Muschiolik, G. (2005). Polysaccharide gel with multiple emulsion.

Food Hydrocolloids, 19, 605-615.

Wen, Y.-P. & Dubin, P. L. (1997). Potentiometric studies of the interactions of bovine

sérum albumin and poly(dimethyldiallylammonium chloride). Macromolecules, 30, 7856-

7861.

Willats, W. G. T., Knox, J. P., & Mikkelson, J. D. (2006). Pectin: new insights into an old

polymer are starting to gel. Trends in Food Science & Technology, 17, 97-104.
161

Wong, V. K. (1998). Microencapsulation of amino acids for prawn feed additives.

Undergraduate Thesis, Department of Chemical Engineering of the University of

Queensland, Australia.

Wong, D. W. S., Camirand W.M. & Pavlath A.E. (1996). Structures and functionalities of

milk proteins. CRC Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 36, 807-844.

Woollard, D. C. & Indyk, H. E. (2002). Rapid détermination of thiamine, riboflavin,

pyridoxine, and niacinamide in infant formulas by liquid chromatography. Journal of

AOAC International, 85, 945-951.

Xia, J.; Dubin, P.L. (1993). Dynamic and electrophoretic light scattering of a water-soluble

complex formed between pepsin and poly(ethylene glycol). Macromolecules, 26, 6688-

6690.

Xiong, S., Melton, L. D., Easteal, A. J., & Siew, D. (2006). Stability and antioxidant

activity of black currant anthocyanins in solution and encapsulated in glucan gel. Journal of

Agricultural Food and Chemistry, 54, 6201-6208.

Xu, X., Fu, Y., Hu, H., Duan, Y. & Zhang, Z. (2006). Quantitative détermination of insulin

entrapment efficiency in triblock copolymeric nanoparticles by high-performance liquid

chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomédical Analysis, 41,266-273.


162

Yamada, T., Komiya, T. & Akaki, M. (1980). Formation of an inclusion complex of

anthocyanin with cyclodextrin. Agricultural andBiological Chemistry, 44, 1411-1413.

Young, S. L., Sarda, X., & Rosenberg, M. (1993). Microencapsulating properties of whey

proteins.2. Combination of whey proteins with carbohydrates. Journal of Dairy Science,

76,2878-2885.

Yuliani, S., Bhandari R., Rutgers, R., & D'Arcy B. (2004). Application of

microencapsulatedflavorto extrusion product. Food Reviews International, 20,163-185.


163

ANNEXES
164

ANNEXE A

Étude de la stabilité des complexes IPL/PFM dans un système

gastro-intestinal modèle.

1. INTRODUCTION

La microencapsulation est largement utilisée dans l'industrie alimentaire. Le but principal

de la microencapsulation, dans ce domaine, est la protection des ingrédients encapsulés

contre les effets dommageables de leur environnement immédiat ainsi que la libération de

ces ingrédients dans un système cible. Les dommages affectant les ingrédients directement

ajoutés aux aliments incluent la perte d'activité des ingrédients, les réactions entre les

ingrédients et les composantes de l'aliment, les réactions d'oxydation et le changement de

couleur ou de goût de l'aliment (Schrooyen, van der Meer, & De Kruif, 2001). Ces effets

négatifs contribuent à la limitation de la biodisponibilité des ingrédients. Plusieurs travaux

ont été faits sur la microencapsulation d'ingrédients hydrosolubles par des complexes

protéines/polysaccharides (Chilvers, Gunning, & Morris, 1988; Tirkkonen, Turakka, &

Paronen, 1994; Tiyaboonchai, Woiszwillo, & Middaugh, 2001). Précédemment, une étude

(Bédié, Turgeon, & Makhlouf, 2007, Chapter 5) portant sur la microencapsulation de la

thiamine par les complexes d'isolât de protéines de lactosérum (IPL)/pectine faiblement

méthylée (PFM) a résulté en un maximum de l'efficacité d'encapsulation au ratio P:Ps de


165

2 :1. Des études ont porté sur la stabilité d'un système à base de lait et contenant des

ingrédients hydrosolubles dans un système gastro-intestinal modèle (Verwei, Arkbâge,

Mocking, Havenaar, & Groten, 2004; Verwei, Arkbâge, Havenaar, van den Berg, Witthôft,

& Schaafsma, 2003) tandis que dans d'autres l'utilisation du système gastro-intestinal a

porté sur la biodisponibilité de l'acide folique (Arkbâge, Verwei, Havenaar, & Witthôft,

2003), de gras et de cholestérol (Minekus et al, 2005), ainsi que des composés

phénoliques, des anthocyanes et de la vitamine C (Perez-Vicente, Gil-Izquierdo, & Garcia-

Viguera, 2002). Certaines autres se sont penchées sur le processus de libération de

l'isoflavone et de la p-galactosidase encapsulés (Kim, Jeon, Ahn, & Kwak, 2006; Rao,

Chawan, & Veeramachaneni, 1995) ainsi que celle de bifidobactéries (Picot & Lacroix,

2004).

Bien que plusieurs études aient été effectuées sur certains aspects tels que la libération ou la

bioaccessibilité d'ingrédients encapsulés dans un système gastro-intestinal in vitro, il n'y a

aucune étude traitant de la stabilité des complexes protéines/polysaccharides contenant des

ingrédients hydrosolubles dans un système gastro-intestinal modèle.

Dans ce projet, la stabilité des complexes IPL/PFM contenant de la thiamine a été évaluée

dans un système gastro-intestinal modèle. La stabilité de la thiamine par rapport aux

températures élevées et à la lumière fait d'elle un ingrédient de choix pour cette étude.
166

2. MATÉRIEL ET MÉTHODES

2.1. Matériel

L'isolât de protéines de lactosérum (BiPRO®) contenant 64.47% de pMactoglobuline,

23.02%) d'a-lactalbumine, 2.36% de Sérum Albumine Bovine et 2.67% d'Immune

Globuline G, pour un total de protéines de 91%) provient de Davisco Foods International

Inc. (Le Sueur, MN, USA). La pectine faiblement méthylée (36% estérifié, masse molaire

de 100 kDa) a été offerte par CP Kelco (Copenhagen, Denmark).

2.2. Réactifs

Le Dioctylsulfosuccinate de sodium, l'acide formique (99%), l'hydroxyde de potassium et

l'acide trichloracétique (TCA) ont été achetés chez Fisher Scientifique (Nepean, ON, CA)

alors que le méthanol de grade HPLC provient de VWR international (West Chester, PA,

USA).

2.3. Stabilité des complexes IPL/PFM dans le TIM

Un mélange de IPL-PFM (ratio P:Ps de 2:1) contenant 0.27% d'IPL, 0.13% de PFM et

0.1% de thiamine a été préparé en ajoutant une solution de 0.26% de PFM contenant de la

thiamine (0.05%) à une solution de 0.54% d'IPL. Le pH a été ajusté à 7.0 et graduellement

baissé à 3.5 par ajout de NaOH et HC1. Après 3 min d'agitation, 200 ml du mélange ont été

centrifugés (8000 g/30 min à 22°C) et le culot obtenu a été lyophilisé. Le culot lyophilisé a

été dissout dans 300 ml d'eau de qualité HPLC à pH 3.5 sous agitation modérée. 300 ml de

la solution témoin de thiamine (0.1%) ont aussi été préparées. Le système gastro-intestinal
167

modèle, le TNO gastro-intestinal tract Model (TIM), comme présenté par Larsson,

Minekus, & Havenaar (1997), représente quatre compartiments successifs simulant

l'estomac (production de la pepsine pour la digestion des protéines), le duodénum

(production de trypsine et de chymotrypsine, de. lipases pour la digestion des protéines,

lipides et carbohydrates dans l'intestin grêle), le jéjunum (digestion et absorption de la

majorité des nutriments) et l'iléon (absorption de la vitamine B12 et des sels biliaires). La

connection entre ces différents compartiments ainsi que la sécrétion des sucs gastriques

sont contrôlées par ordinateur. 300 ml de solution témoin de thiamine et 300 ml de

mélange IPL/PFM contenant de la thiamine ont été ajoutés séparément dans le TIM et des

échantillons ont été collectés toutes les heures pendant quatre heures.

2.4. Détermination de la thiamine

Des échantillons de thiamine témoin et ceux de thiamine encapsulée ont été collectés et

analysés au HPLC comme décrit précédemment (Bedie, Turgeon, & Makhlouf, 2007,

chapter 4, section 4.4.10.) en se basant sur la méthode de Woollard & Indyk (2002).

2.5. Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées avec le système SAS (SAS Institute Inc. Cary,

NC, USA). Les statistiques descriptives ont été appliquées aux données recueillies du TIM

compte tenu du fait qu'une seule répétition a été effectuée.


168

3. RÉSULTATS ET DISCUSSION

3.1. Libération de la thiamine par les complexes IPL/PFM

La détermination de la thiamine dans les échantillons avant leur ajout dans le TIM a révélé

une concentration de 1000 mg/1 de thiamine dans les échantillons témoin et 37 mg/1 de

thiamine dans les complexes correspondant à ~ 4% d'efficacité d'encapsulation. Après

ajout des échantillons dans le TIM, la détermination de la concentration de thiamine s'est

effectuée automatiquement par le système gastro-intestinal. Ainsi, en 120 minutes où la

concentration est la plus élevée dans tous les compartiments, nous avons obtenu 142.7, 45.7

et 84.8 mg/1 de thiamine dans le compartiment stomacal, dans le dialysat de l'iléon et à la

sortie de l'iléon, respectivement, pour l'échantillon témoin. Au niveau de l'échantillon de

thiamine encapsulée, la détermination de thiamine a révélé 0.7, 0.3 et 0.5 mg/1 de thiamine

dans les mêmes compartiments et dans le même temps. Ces bas niveaux de thiamine par

rapport aux niveaux ajoutés s'expliqueraient par l'utilisation d'une grande quantité

(plusieurs litres) de solutions tampon nécessaires à l'obtention des dialysats, qui viennent

diluer les 300 ml initialement ajoutés. Il pourrait s'y ajouter la faible sensibilité du TIM

pour les faibles quantités de thiamine utilisées par comparaison à des études précédents sur

le TIM qui ont utilisé des quantités élevées d'échantillon tel que 500 mg de paracétamol

dans 300g de liquide (Blanquet et al, 2004) ou de la P-galactosidase encapsulée à 91%

(Kim et al, 2006). Les résultats montrent que toutes les concentrations de thiamine dans les

différents compartiments baissent avec le temps. Cependant on observe le même profil

(augmentation et baisse) de la variation de la concentration de thiamine dans tous les

compartiments avec un maximum à 120 min, suivie d'une baisse jusqu'à 300 min pour le
169

témoin et 240 min pour la thiamine encapsulée (Fig. 1 et 2). Ce maximum de thiamine à

120 min dans les échantillons encapsulés résulterait de la dissociation des complexes

(formés à pH 3.5), due au très bas pH (< 2.0) du compartiment stomacal, entraînant la

libération totale de leur contenu. En effet, à pH 2.5, déjà les complexes IPL/PFM sont

chargés positivement avec les protéines chargées positivement et la pectine étant neutre

(Chapitre 4, Fig. 4.3). À pH 2.0 dans le compartiment stomacal, la thiamine (positive) n'est

plus retenue par les complexes et elle est totalement libérée. Ces résultats sont soutenus par

l'étude de la bioaccessibilté de l'acide folique contenu dans du yogourt et ajouté à un

système gastro-intestinal modèle et libéré en deux heures (Arkbâge et al. 2003). La

libération totale de thiamine en 240 min par les complexes par rapport à 300 min par la

solution témoin s'expliquerait par la faible concentration de thiamine dans les complexes.

La faible sensibilité du TIM ajouté au coût élevé d'une analyse ne nous ont pas permis

d'effectuer une deuxième répétition. Par conséquent il nous était impossible d'ajuster les

concentrations de thiamine de la solution témoin à celle des complexes avant analyse. En

fait les complexes IPL/PFM au ratio 2 :1 ne pouvant pas encapsuler plus que 4.5% de

thiamine (chapitre 4, section 4.5.6.) il serait très difficile d'augmenter la concentration de

thiamine dans ces complexes pour atteindre un niveau facilement détectable par le TIM. De

plus, comme mentionné plus haut, l'utilisation de plusieurs litres de solution tampon aurait

grandement dilué la concentration de thiamine (37 mg/1), la rendant difficile à détecter par

HPLC.
170

4. CONCLUSION

L'étude de la stabilité des complexes IPL/PFM contenant de la thiamine dans un modèle de

système digestif humain composé de compartiments stomacal et intestinaux a démontré

que la libération de la thiamine encapsulée a lieu en deux heures, correspondant à une

dissociation complète des complexes et la libération de la vitamine dans le compartiment

stomacal. Plusieurs obstacles ont contribué à créer des limites à l'utilisation du TIM. Des

essais préliminaires d'ajustement des concentrations échantillons contrôles et de thiamine

encapsulée auraient permis d'utiliser une seule concentration dans le but d'une

comparaison. Il aurait fallu au moins deux répétitions pour renforcer les résultats obtenus.

Les analyses n'ont pas été complétées dû au coût d'utilisation du TIM et au temps

nécessaire aux expérimentations. D'autres travaux seront nécessaires pour établir les

vitesses de libération lors de l'ingestion de tels composés encapsulés dans des complexes

protéines/polysaccharides.
171

160 -i
140
120

J, 100
Thiamine

80
60
40 -
20
0
60 120 180 240 300
Temps (min)

Figure 1. Thiamine libérée (moyenne de deux mesures de la concentration de thiamine dans


la solution témoin) dans le système gastro-intestinale Dialysat du Jéjunum, ■ Dialysat de
l'iléon, A Sortie de l'iléon. Les bars verticales représentent l'écart-type de deux mesures
d'une répétition (N = 2).
172

0,8
0,7
çM) 0,6
a 0,5
ine

0,4
gos
0,3
M
H 0,2
0,1
0,0
60 120 180 240 300
Temps (min)

Figure 2. Thiamine libérée (moyenne de deux mesures de la concentration de thiamine dans


les complexes) dans le système gastro-intestinal. ▼ Dialysat du Jéjunum, ■ Dialysat de
l'iléon, A Sortie de l'iléon. Les bars verticales représentent l'écart-type de deux mesures
d'une répétition (N = 2)
173

ANNEXE B

Détails de l'équation de la cinétique de dégradation des

anthocyanes (relatif au chapitre 6)

. .At. , ln(2)
ln(—) = -kt ; tm = ——
Ao k
Où Ao est la concentration initiale d'anthocyanes des échantillons au jour 0, At est la

concentration des anthocyanes après t jours d'entreposage.

Tableau 1. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (témoin)

Jour Control (mg/1) log control k tl/2


0 427,48 6,06
6 310,88 5,74 0,05 13,1
8 311,02 5,74 0,04 17,4
10 260,69 5,56 0,05 14,0
12 239,92 5,48 0,05 14,4
14 220,46 5,40 0,05 14,7

Tableau 2. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (total du culot + le


surnageant)
Jour Complexes (mg/1) log complexes k tl/2
0 406,72 6,01
6 308,62 5,73 0,05 15,1
8 285,34 5,65 0,04 15,6
10 262,54 5,57 0,04 15,8
12 241,84 5,49 0,04 16,0
14 232,4 5,45 0,04 17,3
Tableau 3. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (surnageant)

Jour Diffusion (mg/1) log surnageant k tl/2


0 346,37 5,85
6 256,56 5,55 0,05 13,9
8 237,53 5,47 0,05 14,7
10 216,3 5,38 0,05 14,7
12 197,03 5,28 0,05 14,7
14 186,81 5,23 0,04 15,7

Tableau 4. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (culot)

Jour Culot (mg/1) log culot k tl/2


0 60,35 4,10
6 52,07 3,95 0,03 28,2
8 47,81 3,87 0,03 23,8
10 46,24 3,83 0,03 26,0
12 44,81 3,80 0,02 27,9
14 45,6 3,82 0,02 34,6
175

ANNEXE C

Résultats des analyses de variance


176

Effects of pro teins :polysaccharide ratio on the caracteristics of post-blending


acidified complexes as a function of pH (chapitre 4)

Table 1: Mixed procédure of the turbidity of post-blending


acidified complexes mixture at différent pH values for post-
blending acidification
Effects DF F Value Fit statistics
Bloc 2 0.32
Ratio 2 148.20***
pH 3 75.42***
ratio*pH 6 26.61***
Linear effects
pHlin 1 150.61***
Quadratic effects
pHquad 1 73.91***
Cubic effects
pHcub 1 7.82*
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 7.10**
Ratio*Ph-quad 2 70.62***
Ratio*Ph-cub 2 2.82
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood 234.8
AIC (smaller is better) 238.8
AICC (smaller is better) 239.4
BIC (smaller is better) 239.1

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; F = Fisher


ratio; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic effects of
pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio is a discrète variable.
Ratio = discrète variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05;
(**) = p < 0.01; (***) - p < 0.001.
Table 2: Mixed procédure of the sizes of post-blending acidified
complexes mixture at différent pH values for post-blending
acidification
Effects DF F Value Fit statistics
Bloc 2 2.23
Ratio 2 18.39**
pH 3 4.79*
ratio *pH 6 1.14
Linear effects
pHlin 1 2.24
Quadratic effects
pHquad 1 0.01
Cubic effects
pHcub 1 11.16*
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 0.31
Ratio *Ph-quad 2 0.19
Ratio*Ph-cub 2 2.82
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood 224.3
AIC (smaller is better) 228.3
AICC (smaller is better) 228.9
BIC (smaller is better) 228.7
Abréviations and symbols: DF ■ degree of freedom; F = Fisher
ratio; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic effects of
pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio is a discrète variable.
Ratio = discrète variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05;
(**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001.
Table 3: Mixed procédure of the charges of post-blending
acidified complexes at différent pH values for post-blending
acidification

Effects DF F Value Fit statistics


Bloc 2 0.84
Ratio 2 47.69**
pH 3 358.47***
ratio*pH 6 17.54***
Linear effects
pHlin 1 1040.30***
Quadratic effects
pHquad 1 20.23***
Cubic effects
pHcub 1 0.77
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 6.85**
Ratio *Ph-quad 2 42.25***
Ratio*Ph-cub 2 4.64*
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood 112.2
AIC (smaller is better) 116.2
AICC (smaller is better) 116.8
BIC (smaller is better) 116.6
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; F = Fisher
ratio; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic effects of
pH; pHcub == cubic effects of pH. Ratio is a discrète variable.
Ratio = discrète variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05;
(**) = p< 0.01; (***) = p< 0.001.
Table 4: Mixed procédure of sedimentable complexes yield of
post-blending acidified complexes mixture at différent pH values
for post-blending acidification

Effects DF F Value Fit statistics


Bloc 2 0.96
Ratio 2 231.89***
pH 3 670.27***
ratio*pH 6 109.58***
Linear effects
pHlin 1 1903.09***
Quadratic effects
pHquad 1 36.61***
Cubic effects
pHcub 1 3.62
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 54.45***
Ratio *Ph-quad 2 222.67***
Ratio*Ph-cub 2 59.14***
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood -30.3
AIC (smaller is better) -26.3
AICC (smaller is better) -25.6
BIC (smaller is better) -25.9

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; F = Fisher


ratio; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic effects
of pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio = discrète variable.
Levelsof significance: (*) = p<0.05; (**) = p<0.01; (***) = p
< 0.001.
180

Effects of pro teins :polysaccharide ratio on the caracteristics of pre-blending acidified


complexes as a function of pH (chapitre 4)

Table 5: Analysis of variance of the turbidity of pre-


blending acidified complexes mixture at différent pH
values (R-squart = 0.953210; Root MSE =123.8069)

Source of variation DF SS F Value


Model 13 29352792.39 147.30***

Bloc 2 285685.170 9.32***


Ratio 2 12301783.72 401.28***
pH 3 11763794.48 255.82***
Ratio*pH 6 5001529.020 54.38***
Linear effects
pHlin 1 1220275.741 79.61***
Quadratic effects
pHqua 1 9962696.333 649.96***
Cubic effects
pHcub 1 580822.407 37.89***
Contrasts
Ratio*pHlin 2 2988520.026 97.48***
Ratio*pHquad 2 1150473.722 37.53***
Ratio*pHcub 2 862535.270 28.14***

Error 94 1440846.610
Total 107 0793639.000

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS =


sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of
détermination; Root MSE = root squart of mean squart
error; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic
effects of pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio = discrète
variable. Levels of signifïcance: (*) = p < 0.05; (**) = p <
0.01; (***) = p< 0.001.
Table 6: Analysis of variance of the sizes of pre-blending
acidified complexes at différent pH values (R-squart =
0.823607; Root MSE - 41.38395)

Source of variation DF SS F Value


Model 13 751676.708 33.76***

Bloc 2 13745.151 4.01*


Ratio 2 21824.758 6.37**
pH 3 699793.046 136.20***
Ratio*pH 6 16313.752 1.59
Linear effects
pHlin 1 623231.560 363.90***
Quadratic effects
pHqua 1 22264.319 13.00***
Cubic effects
pHcub 1 54297.168 31.70***
Contrasts
Ratio*pHlin 2 8520.9505 363.90***
Ratio*pHquad 2 22264.319 13.00***
Ratio*pHcub 2 54297.168 31.70***

Error 94 160987.350
Total 107 912664.058

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; S S =


sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of
détermination; Root MSE = root squart of mean squart
error; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic
effects of pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio = discrète
variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05; (**) = p <
0.01; ( * * * ) < 0.001.
Table 7: Analysis of variance of the charges of pre-
blending acidified complexes at différent pH values (R-
squart = 0.977040; Root MSE = 3.154150)

Source of variation DF SS F Value


Model 13 39794.613 307.69***

Bloc 2 63.570 3.19*


Ratio 2 1513.145 76.05***
pH 3 37846.872 1268.07***
Ratio*pH 6 371.026 6.22***
Linear effects
pHlin 1 34545.602 3472.39***
Quadratic effects
pHqua 1 3276.908 329.38***
Cubic effects
pHcub 1 24.363 2.45
Contrasts
Ratio*pHlin 2 45.435 2.28
Ratio*pHquad 2 206.511 10.38***
Ratio*pHcub 2 119.080 5.98**

Error 94 935.174
Total 107 40729.788

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS =


sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of
détermination; Root MSE = root squart of mean squart
error; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic
effects of pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio = discrète
variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05; (**) = p <
0.01;(***) = p<0.001.
Table 8: Analysis of variance of the sedimentable complex
yield of pre-blending acidified complexes at différent pH
values (R-squart = 0.860216; Root MSE = 10.92391)
Source of variation DF SS F Value
Model 13 69029.15857 44.50***

Bloc 2 307.172 1.29


Ratio 2 16468.278 69.00***
pH 3 46421.800 129.67***
Ratio*pH 6 5831.909 8.15***
Linear effects
pHlin 1 37635.723 315.39***
Quadratic effects
pHqua 1 7676.729 64.33***
Cubic effects
pHcub 1 1109.348 9.30**
Contrasts
Ratio*pHlin 2 4.25*
Ratio*pHquad 2 15.12***
Ratio*pHcub 2 5.06**

Error 94 11217.180
Total 107 80246.339

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; S S =


sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart - coefficient of
détermination; Root MSE = root squart of mean squart
error; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic
effects of pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio = discrète
variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05; (**) = p <
0.01; (***) = p < 0.001.
Effects of added thiamine concentration on thiamine entrapment
proteins:polysaccharide ratio 2:1 with post-blending acidification (chapitre 5)

Table 9: Analysis of variance of encapsulated thiamine


concentration at différent pH values for post-blending
acidification with différent concentrations of added thiamine
(R-squart = 0.988192; Root MSE =0.001762)

Source of variation DF SS F Value


Model 15 0.021 446.34***

Linear effects
Nivbllin 0.017 5556.15***
pHlin 0.000 120.01***
Quadratic effects
Nivblquad 0.000 17.17***
pHquad 0.001 437.03***
Cubic effects
Nivblcub 0.000 2.65
pHcub 0.000 52.96***
Cross effects
Nivbl*pH 9 0.002 56.92***

Error 80 0.000
Total 95 0.021

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS = sum of


squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of détermination;
Root MSE - root squart of mean squart error; Nivbllin, pHlin =
linear effects of thiamine level and pH; Nivblquad, pHquad =
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub =
cubic effects of thiamine levels and pH. Levels of significance:
(*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) - p < 0.001.
Table 10: Mixed procédure of sedimentable complexes yield at
différent pH values for post-blending acidification with différent
concentrations of added thiamine (R-squart = 0.988192; Root
MSE =0.001762)

Effects DF F Value Fit statistics


Bloc 2 5.01*
Nivbl 4 2.64
PH 3 491.29***
ratio*pH 12 7 49***
Linear effects
Nivbl lin 2.55
pHlin 788.64***
Quadratic effects
Nivblquad 2.34
pHquad 667.38***
Cubic effects
Nivblcub 3.15
pHcub 1.00
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood 265.0
AIC (smaller is better) 269.0
AICC (smaller is better) 269.3
BIC (smaller is better) 270.4

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS - sum of


squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of détermination;
Root MSE = root squart of mean squart error; Nivbl lin, pHlin =
linear effects of thiamine level and pH; Nivbl quad, pHquad =
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivbl cub, pHcub -
cubic effects of thiamine levels and pH. Levels of significance:
(*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001. -2 Res Log
Likelihood = restricted log Likewood; AIC = Akaike's
information criterion; AICC = Hurvich and Tsai's criterion; BIC
= Schwarz's Bayesian criterion
Table 11: Analysis of variance of thiamine encapsulation
effïciency at différent pH values for post-blending acidification
with différent concentrations of added thiamine (R-squart -
0.980695; Root MSE = 0.101317)

Source of variation DF SS F Value


Model 15 41.717 270.93***

Linear effects
Nivbllin 1 33.206 3234.81***
pHIin 1 4.479 436.35***
Quadratic effects
Nivblquad 1 0.391 38.04***
pHquad 1 0.159 15.50***
Cubic effects
Nivblcub 1 0.001 0.06
pHcub 1 0.212 20.68***
Cross effects
Nivbl*pH 9 3.293 157.51***

Error 80 0.821
Total 95 42.539

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS = sum of


squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of détermination;
Root MSE = root squart of mean squart error; Nivbllin, pHIin =
linear effects of thiamine level and pH; Nivblquad, pHquad =
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub =
cubic effects of thiamine levels and pH. Levels of significance:
(*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001.
Effects of added thiamine concentration on thiamine entrapment
proteins:polysaccharide ratio 2:1 with pre-blending acidification (chapitre 5)

Table 12: Analysis of variance of encapsulated


thiamine concentration at différent pH values for pre-
blending acidification with différent concentrations
of added thiamine (R-squart = 0.991774; Root MSE
=0.002088)
Source of variation DF SS F Value
Model 15 0.042 643.04***

Linear effects
Nivbllin 0.036 8293.23***
pHlin 0.000 6.48***
Quadratic effects
Nivblquad 0.000 37.10***
pHquad 0.002 390.91***
Cubic effects
Nivblcub 0.000 0.04
pHcub 0.001 336.35***
Cross effects
Nivbl*pH 9 0.003 65.00***

Error 80 0.000
Total 95 0.042

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom;


SS = sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart =
coefficient of détermination; Root MSE = root squart
of mean squart error; Nivbllin, pHlin = linear effects
of thiamine level and pH; Nivblquad, pHquad -
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivblcub,
pHcub = cubic effects of thiamine levels and pH.
Levels of signifïcance: (*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01;
(***) = p< 0.001.
Table 13: Analysis of variance of sedimentable
complexes yield at différent pH values for pre-blending
acidification with différent concentrations of added
thiamine (R-squart - 0.917580; Root MSE = 5.616065)

Source of variation DF SS F Value


Model 15 28090.905 59.38***

Linear effects
Nivbllin 1 126.017 4.00*
pHlin 1 8796.650 278.90***
Quadratic effects
Nivblquad 1 1.917 0.06
pHquad 1 18106.081 574.06***
Cubic effects
Nivblcub 1 10.387 0.33
pHcub 1 685.983 21.75***
Cross effects
Nivbl*pH 9 363.377 1.28

Error 80 30614.120
Total 95 2523.215

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS =


sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of
détermination; Root MSE = root squart of mean squart
error; Nivbllin, pHlin = linear effects of thiamine level
and pH; Nivblquad, pHquad = quadratic effects of
thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub = cubic effects
of thiamine levels and pH. Levels of significance: (*) = p
< 0.05; (**) = p < 0.01; (***) - p < 0.001.
Table 14: Analysis of variance of thiamine
encapsulation efficiency at différent pH values for
pre-blending acidification with différent
concentrations of added thiamine (R-squart =
0.995447; Root MSE - 0.046589)

Source of variation DF SS F Value


Model 15 37.964 1166.05***

Linear effects
Nivbllin 1 35.972 16573.2***
pHlin 1 0.503 231.85***
Quadratic effects
Nivblquad 1 0.141 64 97***
pHquad 1 0.008 3.90
Cubic effects
Nivblcub 1 0.001 0.59
pHcub 1 0.655 301.93***
Cross effects
Nivbl*pH 9 0.698 35.72

Error 80 38.138
Total 95 0.174

Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS


= sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient
of détermination; Root MSE = root squart of mean
squart error; Nivbllin, pHlin = linear effects of thiamine
level and pH; Nivblquad, pHquad = quadratic effects of
thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub = cubic effects
of thiamine levels and pH. Levels of significance: (*) =
p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001.
Effects of storage on anthocyanins encapsulation (Chapitre 6)

Table 15: Mixed procédure of the effects of storage on


anthocyanins encapsulation (post-blending acidification)
Effects DF F Value Fit statistics
typ 3 516.96***
Temps 5 159.24***
typ*temps 15 14.75***
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood 418.2
AIC (smaller is better) 422.2
AICC (smaller is better) 422.5
BIC (smaller is better) 423.2
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; F = Fisher
ratio; typ, temps = différent types of samples and storage time.
Typ = discrète variable. Levels of significançe: (*) = p < 0.05;
(**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001. -2 Res Log Likelihood =
restricted log Likewood; AIC = Akaike's information criterion;
AICC = Hurvich and Tsai's criterion; BIC = Schwarz's
Bayesian criterion