Microencapsulation de Composés Nutraceutiques Dans Des Complexes Protéines-Polysaccharides

KOUADIO GERARD BEDIE
MICROENCAPSULATION DE COMPOSÉS
NUTRACEUTIQUES DANS DES COMPLEXES
PROTÉINES-POLYSACCHARIDES
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en Science et Technologie des Aliments
pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
Département des Sciences des aliments et de nutrition

FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
FÉVRIER 2008
© Gérard Kouadio Bédié, 2008

ii
RÉSUMÉ COURT
La caractérisation des complexes insolubles d'isolât de protéine de lactosérum/pectine
faiblement méthylée (IPL/PFM), formés aux ratios protéines:polysaccharide (P:Ps) de 2:1,
1:1 et 1:2, et à pH 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 par acidification avant ou après mélange des solutions
d'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement méthylée (PFM), a
démontré un rendement maximal en complexes à pH 3.5-3.0 avec le ratio 2:1. La taille des
complexes formés par acidification après mélange des solutions restait petite et constante
aux différents pH. La détermination du rendement en complexes après l'incorporation
d'ingrédients hydrosolubles à différentes concentrations suggère une saturation des
complexes par les hautes concentrations de thiamine, exprimée par une diminution du
rendement en complexes à pH 3.5. L'efficacité d'encapsulation la plus élevée a été
observée avec le ratio P:Ps de 2:1. L'effet protecteur des anthocyanes par les complexes a
été étudié dans du jus de pomme pasteurisé et entreposé pendant 14 jours à 11 000
lux/40°C. La pasteurisation a provoqué une diffusion d'une proportion importante des
anthocyanes encapsulés vers l'extérieur des complexes mais la quantité d'anthocyanes
résiduelle dans les complexes est demeurée constante tout au long de l'entreposage. Les
résultats de cette recherche démontrent que le complexe IPL/LMP constitue une approche
prometteuse pour l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides.

iii
RÉSUMÉ LONG
Des complexes insolubles d'IPL/PFM ont été formés à pH 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 par le
mélange de solutions d'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement
méthylée (PFM). L'acidification a été réalisée soit avant, ou après le mélange de solutions
avec des ratios protéines:polysaccharide (P:Ps) de 2:1, 1:1 et 1:2 (0.4% de polymères
totaux). La caractérisation des complexes a démontré, qu'au ratio 2:1, la turbidité et le
rendement en complexes étaient optimaux à un pH aux environs de 3.0. De plus, les
complexes obtenus par acidification après mélange des solutions avaient une taille plus
petite et constante. L'évaluation de Pencapsulation d'ingrédients hydrosolubles par les
complexes IPL/PFM en fonction de leur concentration a été effectuée aux pH 4.0, 3.5, 3.0
et 2.5 et au ratio P:Ps de 2:1. Les concentrations utilisées étaient de 0, 0.002, 0.01, 0.05 et
0.1% pour la thiamine et de 0.1, 0.2 et 0.3% pour les anthocyanes. L'encapsulation
d'anthocyanes en fonction du ratio P:Ps à pH 3.5 a été aussi évaluée avec l'incorporation de
0.025% p/p d'anthocyanes dans les complexes aux ratios de 2:1 et 1:1. Le contenu en
thiamine des complexes ainsi que l'efficacité d'encapsulation (4-7%) étaient optimaux à pH
3.5. Les hautes concentrations en thiamine ont entraîné une diminution du rendement en
complexes à pH 3.5 mais aussi une augmentation du contenu en thiamine dans les
complexes. L'efficacité d'encapsulation des anthocyanes était plus élevée avec le ratio P:Ps
2:1 comparativement au ratio 1:1. La protection d'ingrédients hydrosolubles par les
complexes IPL/PFM a été évaluée dans du jus de pomme (pH 3.5) contenant des
anthocyanes encapsulés. Le jus a été pasteurisé à 90°C/12 s et entreposé à 11 000 lux/40°C
pendant 14 jours. La chaleur a entraîné la diffusion d'une proportion importante des

iv
anthocyanes encapsulés vers l'extérieur des complexes mais la quantité d'anthocyanes
résiduelle dans les complexes est demeurée constante tout au long de l'entreposage.
L'étude de la stabilité des complexes IPL/PFM, contenant de la thiamine, dans un système
digestif modèle a démontré que les complexes ont libéré totalement leur contenu en
thiamine dans le compartiment stomacal. Cet effet serait du au pH très acide du
compartiment qui aurait dissocié le complexe IPL/PFM. Les résultats de cette recherche
démontrent que le complexe IPL/PFM constitue une approche prometteuse pour
l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides.

V
ABSTRACT
Insoluble WPI-LMP complexes hâve been formed at pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5 by mixing
whey protein isolate (WPI) and low methoxyl pectin (LMP) solutions. The acidification
was performed before or after the mixing of the solutions at proteimpolysaccharide (P:Ps)
ratios of 2:1, 1:1, and 1:2 (0.4% total polymer). Characterization of the complexes
demonstrated that at P:Ps ratio 2:1, the turbidity and the sedimental complex yield were
optimal around pH 3.0. In addition, complexes obtained by post-blending acidification had
small and constant particle sizes. Evaluation of water soluble ingrédients encapsulation by
WPI-LMP complexes as a function of ingrédients concentration was achieved at pH 4.0,
3.5, 3.0, and 2.5 and at P:Ps ratio 2:1. Ingrédients concentrations used were 0, 0.002, 0.01,
0.05 and 0.1% for thiamine and 0.1, 0.2 et 0.3% for anthocyanins. Anthocyanins
entrapment as a function of the ratio at pH 3.5 has also been achieved with the
incorporation of 0.025% w/w anthocyanins in the complexes at P:Ps ratios of 1:1 and 2:1.
Thiamine content of the complexes as well as the entrapment efficiency (4-7%) was
optimal at pH 3.5. High concentrations of thiamine induced a decrease of the sedimentable-
complexes yield at pH 3.5 but increased thiamine content of the complexes. P:Ps ratio 2:1
provided higher entrapment efficiency of anthocyanins than ratio 1:1. The protecting effect
of the WPI-LMP complexes was evaluated in apple juice (pH 3.5) containing encapsulated
anthocyanins. The juice was pasteurized at 90°C/12 s and stored at 11 000 lux/40°C for 14
days. Although the heat induced the diffusion of a large portion of anthocyanins out of the
complexes, the residual amount of anthocyanins in the complexes remained constant during
storage.
VI
The study of the stability of WPI-LMP complexes, containing thiamine, in a
gastrointestinal System demonstrated that complexes delivered the whole thiamine content
in the stomach compartment. This effect was probably due to the very acidic pH of the
compartment, which may hâve dissociated the complexes. The results of this project
demonstrated that WPI-LMP complexes represent a promising tool for water soluble
ingrédients encapsulation in acidic foods.

vii
AVANT-PROPOS
Les travaux de cette thèse ont été réalisés dans le cadre d'un projet de recherche financé par
le Conseil de la recherche en sciences naturelles et génie du Canada (CRSNG) et les
Industries Lassonde Inc. Cette thèse comporte 8 chapitres dont trois sont écrits sous forme
d'articles scientifiques, dont je suis l'auteur principal, et qui sont ou seront publiés dans des
revues scientifiques.
Le premier chapitre intitulé «Introduction» décrit très brièvement les connaissances
scientifiques actuelles sur les interactions protéine-polysaccharides et l'encapsulation
d'ingrédients par les complexes issus de ces interactions, pour aboutir à l'objectif principal
de cette thèse.
Le deuxième chapitre intitulé « Revue de littérature» fait une revue exhaustive des
méthodes de microencapsulation, les interactions protéine-polysaccharide, les facteurs
influençant la formation de complexes et le système isolât de protéines de lactosérum -
pectine faiblement méthylée.
Le troisième chapitre intitulé «Problématique d'ensemble, hypothèse, but, objectifs»
présente la problématique générale, l'hypothèse, le but et les objectifs de la thèse.
Le quatrième chapitre est intitulé «Formation of native whey protein isolate-low methoxyl
pectin complexes as a matrix for hydro-soluble food ingrédient entrapment in acidic foods»
viii
est sous presse dans le journal «Food Hydrocolloids». Il porte sur l'optimisation des
paramètres permettant la formation de complexe isolât de protéine de lactosérum/pectine
faiblement méthylée et l'encapsulation de thiamine comme ingrédient hydrosoluble
modèle. J'ai contribué à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des
manipulations au laboratoire du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la
rédaction de l'article. Dr. Sylvie Turgeon et Dr. Joseph Makhlouf ont apporté leurs soutiens
scientifiques lors des expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.
Le cinquième chapitre intitulé «Evaluation of the ability of whey protein isolate-low
methoxyl pectin complexes to entrap water-soluble ingrédients» porte sur l'évaluation de la
capacité de microencapsulation des complexes WPI-LMP formés avec les paramètres
optimisés et en fonction de la concentration des ingrédients modèles ajoutés. J'ai contribué
à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des manipulations au laboratoire
du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la rédaction de l'article. Dr.
Sylvie Turgeon et Dr. Joseph Makhlouf ont apporté leurs soutiens scientifiques lors des
expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.
Le sixième chapitre intitulé «Study of the protective effect of whey protein isolate-low
methoxyl pectin complexes on anthocyanins during storage and the release of encapsulated
thiamine in a dynamic in vitro gastrointestinal model» porte sur l'évaluation de l'effet de
protection des ingrédients hydrosolubles encapsulée dans des conditions d'entreposage
ainsi que sur la stabilité des complexes dans un système gastro-intestinal modèle. J'ai
contribué à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des manipulations au

ix
laboratoire du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la rédaction de
l'article. Dr. Sylvie Turgeon et Dr. Joseph Makhlouf ont apporté leurs soutiens
scientifiques lors des expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.
Finalement, la «Conclusion générale» présentée au chapitre 7 conclut le travail par une
discussion générale de l'ensemble des résultats présentés tout au long du document et par la
présentation des perspectives de recherche.
Le chapitre 8, intitulé «Bibliographie» à la fin de cette thèse, referme l'ensemble des
références citées dans ce document.

X
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier tout d'abord ma directrice de recherche, Dr. Sylvie Turgeon pour ses
précieux conseils et son encouragement continu qui m'ont permis de réaliser ce projet.
Je remercie aussi Dr. Joseph Makhlouf pour ses conseils pertinents et ses analyses critiques
qui m'ont souvent aidé à revenir sur le bon axe dans des situations d'écart de l'objectif
principal du projet.
Mes remerciements vont aussi au Conseil de la Recherche en Sciences Naturelles et Génie
du Canada (CRSNG) et aux Industries Lassonde Inc. Pour le financement de ce projet de
recherche.
Mes vifs remerciements vont à mes parents qui n'ont cessé de me soutenir matériellement
et spirituellement même si l'écart des continents fait que je ne peux les voir fréquemment.
Je tiens aussi à remercie ma stagiaire (Nafissatou Ndiaye) pour son aide dans les
manipulations relatives au chapitre 5.
J'aimerais remercier le personnel technique et professionnel des laboratoires du
département des sciences de l'alimentation et de nutrition de l'Université Laval pour leur
aide dans mon apprentissage de l'utilisation de l'équipement du département ainsi que

xi
toutes les personnes qui de loin ou de prêt m'ont aidé, sciemment ou inconsciemment, à
relever mon moral dans les situations difficiles.
Finalement, je remercie tous les étudiants qui m'ont tenu compagnie pendant les heures
tardives de manipulation au laboratoire, spécialement Kyung-Tae KIM.

xii
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ COURT ii
RÉSUMÉ LONG iii
ABSTRACT v
AVANT-PROPOS vii
REMERCIEMENTS x
TABLE DES MATIÈRES xii
LISTE DES TABLEAUX xvii
LISTE DES FIGURES xviii
CHAPITRE 1: Introduction 1
CHAPITRE 2: Revue de littérature 4
2.1 Les techniques de microencapsulation 4

2.1.1. Microencapsulation par séchage par atomisation 5
2.1.1.1. Avantages 6
2.1.1.2. Inconvénients 6
2.1.2. Les émulsions multiples 7
2.1.3. Microencapsulation par suspension 8
2.1.4. Microencapsulation par extrusion 9
2.1.5. Microencapsulation par refroidissement (spray-chilling or spray-cooling) 10
2.1.6. Microencapsulation par complexe d'inclusion 10
2.1.7. Microencapsulation par coacervation 11
2.1.7.1. Complexe de coacervation 12
2.1.7.2. Simple coacervation 13
2.2. Les interactions protéines-polysaccharides 14
2.2.1. Incompatibilité thermodynamique 16
2.2.2. Compatibilité thermodynamique 17
2.2.2.1. Co-solubilité 17
2.2.2.2. Séparation de phases associative 18
2.2.3. Facteurs influençant la formation de complexes 19
2.2.3.1. LepH 20
2.2.3.2. La force ionique 23
xiii
2.2.3.3. Charge des biopolymères 25

2.2.3.4. La concentration totale en biopolymères 26
2.2.3.5. Le ratio protéine/polysaccharides 27
2.2.3.6. Température 28
2.2.3.7. Pression 29
2.2.3.8. Agitation et temps d'agitation 30
2.3. Biopolymères à l'étude 31
2.3.1. Les protéines du lactosérum 31
2.3.1.1. La pMactoglobuline 31
2.3.1.1.1. Facteurs influençant la structure 33
2.3.1.1.1.1. Le pH et les sels 33
2.3.1.1.1.2. La température 34
2.3.1.2. L'a-lactalbumine 35
2.3.1.2.1. Influence du pH sur la structure 36
2.3.1.3. La Sérum Albumine Bovine 37
2.3.2. La pectine 37
2.3.2.1. Caractéristiques structurales 37
2.3.2.2. Facteurs influençant la structure 43
2.3.2.2.1. LepH '. 43
2.3.2.2.2. Les minéraux 43
2.4. Le système isolât de protéines de lactosérum - pectine faiblement méthylée 44
CHAPITRE 3: Problématique d'ensemble, hypothèse, but, objectifs 47
3.1. Problématique d'ensemble .47
3.2. Hypothèse 48
3.3. But 49
3.4. Objectifs spécifiques 49
CHAPITRE 4: Formation of native whey protein isolate-low methoxyl pectin complexes as

a matrix for hydro-soluble food ingrédient entrapment in acidic foods 50
4.1. RÉSUMÉ 51
4.2. ABSTRACT 52
4.3. INTRODUCTION 53
4.4. MATERIALS AND METHODS 56

xiv
4.4.1. Materials 56
4.4.2. Reagents 56
4.4.3. Préparation of solutions 56
4.4.4. Complex formation and thiamine entrapment 57
4.4.5. Turbidity measurement 58
4.4.6. Zêta potential measurement 59
4.4.7. Complex particle size 59
4.4.8. Sedimentable-complexes yield 59
4.4.9. Microscopic observation 60
4.4.10. Détermination of thiamine 60
4.4.11. Statistical analysis 61
4.5. RESULTS 62
4.5.1. Turbidity measurement 62
4.5.2. Small angle static light scattering 62
4.5.3. Zêta potential 63
4.5.4. Sedimentable-complexes yield 63
4.5.5. Microscopic observation 63
4.5.6. Thiamine entrapment 64
4.6. DISCUSSION 65
4.6.1. EffectofpH 65
4.6.2. Effect of protein:pectin ratio 66
4.6.3. Effect of acidification mode 67
4.6.4. Ability of the complexes to entrap thiamine 68
4.7. CONCLUSION 70
CHAPITRE 5: Evaluation of the ability of whey protein isolate-low methoxyl pectin
complexes to entrap water-soluble ingrédients 79
5.1. RÉSUMÉ 80
5.2. ABSTRACT 81

5.4.1. Materials ... 85
5.4.2. Reagents 85
5.4.3. Préparation of stock solutions 85
5.4.4. Thiamine entrapment 86
5.4.5. Détermination of thiamine 87
5.4.6. Anthocyanins entrapment 87
5.4.7. Détermination of total monomeric anthocyanins 88
XV
5.5. RESULTS AND DISCUSSION 90
5.5.1. Effect of thiamine concentration on the entrapment 90
5.5.1.1. Sedimentable-complexes yield 90
5.5.1.2. Thiamine entrapment 91

5.5.2. Effect of protein/polysaccharide ratio and anthocyanins concentration on the
entrapment 93
5.5.2.1. Protein:polysaccharide ratio 93
5.5.2.2. Anthocyanins entrapment 94
5.6. CONCLUSION 95
CHAPITRE 6: Study of the protective effect of whey protein isolate-low methoxyl pectin
complexes on anthocyanins during storage 103
6.1. RÉSUMÉ 104
6.2. ABSTRACT 104
6.4.1. Materials 108
6.4.2. Reagents 108
6.4.3. Préparation of solutions 109
6.4.4. Anthocyanins entrapment by WPI-LMP complexes 109
6.4.5. Heat treatment and storage 110
6.4.6. Extraction of monomeric anthocyanins 110
6.4.7. Détermination of monomeric anthocyanins 111

6.4.8. Kinetic of dégradation of anthocyanins 111
6.5. RESULTS AND DISCUSSION 112
6.5.1. Anthocyanins protection by WPI-LMP complexes during storage 112
6.5.1.1. Heat treatment 112

xvi
6.5.1.2. Storage 114

6.6. CONCLUSION 117
CHAPITRE 7: Conclusion générale 123
ANNEXES 163
ANNEXE A : Étude de la stabilité des complexes IPL/PFM dans un système gastro-
intestinal modèle 164
ANNEXE B : Détails de l'équation de la cinétique de dégradation des anthocyanes (relatif
au chapitre 6) 173
ANNEXE C : Résultats des analyses de variance 175
xvii
LISTE DES TABLEAUX
Table 4. 1. Least square means of the particle size of the control solutions 71
Table 6. 1. Effect of heat treatment on free and complexed anthocyanins' concentration in

clarifiedapplejuice 118
Table 6. 2. Kinetic parameters for anthocyanins dégradation during storage 118
xviii
LISTE DES FIGURES
Figure 2.1. Comportement des mélanges protéine/polysaccharide 16
Figure 2.3. Structure tridimensionnelle d'un monomère de la p-lactoglobuline A 33
Figure 2. 4. Structure tridimensionnelle de Pa-albumine humain 36
Figure 2.5. Structure de la pectine 41
Figure 2.6. La structure de l'homogalaturonane 42
Figure 4.1. Turbidity of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1, 1:1,
and 1:2 72
Figure 4.2. Size of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1, 1:1, and
1:2 73
Figure 4.3. Zêta potential of 0.13% LMP and WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer
and ratios of 2:1, 1:1, and 1:2 74
Figure 4.4. Sedimentable-complexes yieldof WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer

and ratios of 2:1,1:1, and 1:2 75
Figure 4.5. Phase contrast micrographs of WPI-LMP complexes dispersion obtained by

post-blending acidification and by pre-blending acidification, with a protein:pectin ratio of
2:1 76
Figure 4.6. Thiamine content of the complexes of WPI-LMP complexes obtained at ratio
2:1 by post-blending acidification and pre-blending acidification 77
Figure 4.7. Entrapment efficiency of WPI-LMP complexes at ratio 2:1 obtained by post-
blending acidification and pre-blending acidification 78
Figure 5.1. Sedimentable-complexes yield of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels

ofadded thiamine as a functionofpH 96
Figure 5.2. Thiamine content of the complexes of WPI/LMP complexes mixtures with 4
levels ofadded thiamine as a functionofpH 97
xix
Figure 5.3. Entrapment efficiency of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added
thiamine as a function of pH 98
Figure 5.4. Entrapment efficiency of WPI/LMP complexes at P:Ps ratios of 1:1 and 2:1 and
at pH 3.5, with 0.4% total polymer 99
Figure 5.5. Entrapment efficiency of WPI/LMP complexes at ratios 2:1 and at pH 3.5, with
3 levels of incorporated anthocyanins 100
Figure 5. 6. Structure of anthocyanins 101
Figure 5. 7. Structure of thiamine hydrochloride 102
Figure 6.1. Mechanism of structural transformation of anthocyanins in aqueous

média 119
Figure 6.2. Total anthocyanins content of WPI-LMP complexes during storage at pH 3.5,
with 0.4% of total polymer, and at a P:Ps ratio of 2:1 120
Figure 6.3. Percentage of anthocyanins during storage at pH 3.5, with 0.4% of total
polymer, and at a P:Ps ratio of 2:1 121
Figure 6.4. Dégradation of anthocyanins added to clarified apple juice during
storage 122
1
CHAPITRE 1: Introduction
Plusieurs études ont démontré que les interactions électrostatiques entre des polymères de
charges opposées pouvaient conduire à la formation de complexes (Biesheuvel & Stuart,
2004; Burgess, 1990; Girard et al, 2002; Kaibara et al, 2000; Mattison et al, 1995;
Schmitt et al, 1999). Les paramètres polymériques (densité de charge, masse molaire,
concentration, nature chimique et ratio) guidant la formation de ces complexes ont été
largement décrits dans la littérature (De Vries, 2004; Weinbreck et al, 2003; Wen &
Dubin, 1997). D'autres paramètres externes (température, effets de cisaillement et pression)
ainsi que les conditions de formation des complexes (pH, force ionique, type d'ions) ont
aussi été investigués (Galazka et al, 1997; Galazka et al, 1999a; Galazka et al, 1999b;
Schmitt et al, 1998 ; Weinbreck et al, 2003; Wen & Dubin, 1997). Ainsi, des limites de pH
indiquant la formation de complexes solubles et insolubles ont été déterminées (Weinbreck
et al, 2003).
Les complexes issus des interactions protéine-polysaccharide peuvent servir de matrice
d'encapsulation dans le processus d'enrichissement des aliments pauvres en nutriments
(Abrams & Atkinson, 2003; Dunn, 2003; Sinclair, 1979). La microencapsulation constitue
un moyen efficace de protection des nutriments contre les dommages environnementaux
(lumière, présence d'oxygène, interactions entre nutriments et particules alimentaires) tout
en leur assurant une bonne stabilité et une libération contrôlée dans les systèmes ciblés
(Versic, 1988). Les méthodes chimiques de microencapsulation, représentées par la
séparation de phases associative et les émulsions (de Kruif et al, 2004; Dziezak, 1988;
2
Versic, 1988; Yuliani et al, 2004), sont indiquées pour le domaine alimentaire, vu
l'utilisation de solvant comestible (eau). La plupart des méthodes de microencapsulation
par séparation de phases associative reposent sur la formation de complexes protéine-
polysaccharide (Chilvers et al, 1988; Tirkkonen et al, 1994; Tiyaboonchai et al, 2001).
L'utilisation des complexes protéine-polysaccharide serait très importante pour la
protection des ingrédients encapsulés notamment dans les aliments où les conditions de
préparation et d'entreposage (pH, traitements thermiques, exposition à la lumière etc..)
peuvent altérer rapidement les nutriments. La stabilité des nutriments dans les aliments (à
l'état non encapsulé) exposés à diverses conditions de transformation et d'entreposage a été
largement étudiée dans la littérature (Kirca, et al, 2003, 2006, 2007; Morais et al, 2002;
Turker et al. 2004). De plus, les études effectuées sur l'encapsulation ces dernières années
ont porté surtout sur les ingrédients liposolubles (Djordjevic, et al, 2004a & 2004b,
Jimenez et al, 2004, Jouzel et al, 2003, Kondo et al, 1996, Lamprecht et al, 2001, Liu et
al, 2001, Soottitantawat et al, 2005a & 2005b.); peu d'études se sont intéressées à la
protection des nutriments alimentaires hydrosolubles par l'encapsulation et à la stabilité des
systèmes d'encapsulation et la libération d'ingrédients encapsulés dans le système digestif
(Picot & Lacroix, 2004; Rao et al, 1995; Kim et al, 2006; Verwei et al, 2003). Malgré les
connaissances actuelles sur les paramètres de formation de complexes protéine-
polysaccharide, l'utilisation de la microencapsulation comme moyen d'enrichissement des
aliments et l'évaluation de la stabilité des systèmes matrice et des ingrédients encapsulés
ont été peu étudiées.
L'objectif général de cette recherche était de développer une matrice de complexes d'isolat
de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement méthylée (PFM) pour la

3
microencapsulation d'ingrédients nutraceutiques hydrosolubles dans un système
alimentaire de type acide et d'évaluer la protection de ces ingrédients encapsulés suite à un
traitement thermique et durant l'entreposage. La recherche visait aussi à étudier la stabilité
des complexes, contenant des ingrédients hydrosolubles, dans un système gastro-intestinal
modèle.
4
CHAPITRE 2: Revue de littérature
2.1 Les techniques de microencapsulation
L'encapsulation peut être définie comme le processus de formation de couche continue (i.e.
polymères, protéine-polysaccharide complexes) autour d'ingrédients à encapsuler qui
peuvent être des particules solides, des gouttelettes de liquide, du gaz ou des cellules
microbiennes (King, 1995). La taille des particules encapsulées peut être classée macro (>
5000u), micro (0.2 à 5000u) et nano (< 0.2u) (Jackson and Lee, 1991; King, 1995;
Ribeiro et ai, 1997).
Les techniques d'encapsulation sont des procédés qui existent depuis des décennies. En
effet, la microencapsulation a été utilisée pour la première fois en 1954 dans l'industrie du
papier sans carbone qui atteignait des productions de plus de 500 000 tonnes par année
(Dziezak, 1988). L'auteur rapporte aussi l'utilisation de cette méthode dans divers
domaines tels que la pharmacie et le domaine agro-alimentataire. Dans le domaine
alimentaire, les méthodes d'encapsulation sont diverses. Elles peuvent être divisées en
méthodes physiques incluant le séchage par atomisation (spray-drying), le séchage par
suspension (air suspension), l'extrusion, l'encapsulation par jet refroidissant (spray-chilling
ou spray-cooling), l'encapsulation par inclusion, et les méthodes chimiques qui incluent la
formation de complexes par séparation de phases associative (Viersic, 1988; Dziezak,
1988; Todd, 1970). Les émulsions peuvent être utilisées en combinaison avec certaines de
ces méthodes d'encapsulation (Liu et al, 2001). Selon Balassa & Fanger, (1971), les
5
avantages de l'utilisation de la microencapsulation pour l'industrie agroalimentaire sont
multiples : 1) un moyen efficace de confiner les ingrédients alimentaires sensibles à
l'intérieur d'un aliment à titre de protection contre les autres composants de l'aliment
pendant l'entreposage, 2) un moyen d'enrichir les aliments en nutriments perdus au cours
de la fabrication, 3) une méthode d'utilisation de nouveaux ingrédients ou d'ingrédients
sensibles pour la préparation d'aliments riches en ces composés, 4) un mécanisme de
libération inhabituelle et/ou rapide d'ingrédients dans les aliments, 5) une valeur ajoutée
ayant un effet attractif et favorable à la commercialisation des aliments. Bien que plusieurs
techniques soient utilisées en microencapsulation, nous ne passerons en revue que quelques
unes qui nous paraissent de plus grande importance.
2.1.1. Microencapsulation par séchage par atomisation (Spray-drying)
La technique d'encapsulation par atomisation est la technique la plus utilisée dans
l'industrie alimentaire (Dziezak, 1988; Risch, 1995) grâce à ses nombreux avantages. Cette
technique a été utilisée pour l'encapsulation des flaveurs pour la première fois dans les
années trente avec de la gomme d'acacia comme matrice protectrice (Dziezak, 1988). Cette
technique comporte d'abord une étape de préparation de la dispersion d'ingrédients actifs
dans une solution de biopolymères protecteurs qui peuvent être de la maltodextrine, de
l'amidon modifié, une gomme, ou une combinaison de biopolymères (Risch, 1995). Ensuite
la dispersion est homogénéisée pour réduire la taille des particules, puis séchée par
atomisation dans une chambre à air chaud soufflé (Gibbs et al, 1999). La
microencapsulation de flaveurs par séchage par atomisation (Liu et al, 2001) a été
6
effectuée avec du d-limonène et du butyrate d'éthyle comme ingrédients actifs et de la
cyclodextnne comme substance encapsulante dans une émulsion stabilisée avec de la
gomme arabique ou des polysaccharides de soja. Les résultats ont démontré une
encapsulation de près de 100% de d-limonène quelque soit la concentration d'encapsulant
alors que le pourcentage d'encapsulation d'éthyl butyrate variait selon la concentration
d'encapsulant et du type d'encapsulant.
2.1.1.1. Avantages
Les avantages de la microencapsulation par atomisation peuvent être regroupés ainsi:
- Une plus grande accessibilité de l'équipement incluant le matériel encapsulant (amidon et
amidon modifié, dextrine, protéines, polysaccharides, sucres, esters de cellulose);
- Un faible coût d'utilisation;
- Une production de capsules de haut rendement avec des ingrédients actifs moins volatils
et thermorésistants;
- Une facilité de solubilisation des capsules formées grâce à leur faible taille (<100u) et
large surface de contact;
-Une stabilité des substances encapsulantes pendant le séchage.
2.1.1.2. Inconvénients
Quant aux inconvénients, ils peuvent inclure :
- Une limitation du choix de substances encapsulantes caractérisées par une viscosité basse
à concentration relativement élevée;

7
- La pulvérisation de la substance encapsulante pourrait entraîner une non-couverture de la
totalité des ingrédients actifs;
- La dégradation et l'oxydation des ingrédients actifs par la chaleur, pendant et juste après
séchage;
- La formation de capsules creuses avec une couche protectrice mince, qui augmente la
surface et favorise l'oxydation par rapport à une capsule pleine.
2.1.2. Les émulsions multiples
Une émulsion, dans le domaine alimentaire, consiste en des gouttelettes de gras ou d'huile
de diamètre variant de 0.5-2.5um suspendues dans un milieu aqueux (Dalgleish, 1997).
Cependant, l'interface entre les gouttelettes d'huile et le milieu aqueux doit être occupé par
des molécules de surfactant pour prévenir une coalescence ou une agrégation immédiate.
Les surfactants sont constitués de petites molécules amphiphiles (polysorbates,
monoglycérols, diacylglycérols et lécithines) et de grosses molécules tensioactives
(protéines).
Les émulsions multiples sont un système complexe d'émulsion dans une émulsion dans
lequel les gouttelettes de la phase dispersée contiennent elles-mêmes des petites gouttelettes
dispersées (Garti, 1997) qui peuvent renfermer un ingrédient à encapsuler. Les deux
principaux types d'émulsions multiples sont les doubles émulsions eau-dans-huile-dans-eau
(E-H-E) et huile-dans-eau-dans-huile (H-E-H). Une telle émulsion est un système
thermodynamique instable qui nécessite un mélange de surfactants hydrophobe et
hydrophile et un jeu d'homogénéisation pour le rendre stable. L'acétaminophène, un

8
ingrédient hydrosoluble a été encapsulé avec succès par double émulsion E-H-E (Lai &
Tsiang, 2005). Dans une double émulsion H-E-H, un composé hydrophobe, la fluméthrine,
a été encapsulée avec une efficacité d'encapsulation de plus de 95% en utilisant un mélange
de protéines de lactosérum et de gommes (xanthane, fenugrec) comme agent stabilisateur
(Benichou et al, 2007). La glycine, les immunoglobulines IgG du lait et des protéines du
colostrum ont aussi été encapsulées avec succès dans une émulsion double E-H-E avec un
pourcentage d'encapsulation allant jusqu'à 59, 21 et 50%, respectivement (Chen et al,
1999).
2.1.3. Microencapsulation par suspension (air suspension coating or fluidized bed)
C'est une technique qui peut être utilisée pour encapsuler des particules de tailles très
variées (50 à 5000 um). Les particules suspendues dans un courant d'air ascendant chaud
ou froid dans une enceinte, sont pulvérisées avec une solution contenant des agents
encapsulants (des dextrines, des dérivés de cellulose, de protéine ou d'amidon, et des
lipides). L'enrobage des particules se solidifie au contact de l'air froid ou il sèche par
évaporation au contact de l'air chaud. Le mouvement aléatoire des particules assure un
recouvrement satisfaisant des particules (Dziezak, 1988). C'est une méthode qui permet de
contrôler la température et l'humidité durant l'encapsulation. Cependant, un mauvais
contrôle de ces paramètres peut entraîner l'enrobage partiel des particules (DeZarn, 1995).
Parmi les inconvénients de cette méthode on peut citer l'agglomération des particules
encapsulées et le temps mis pour l'encapsulation pouvant atteindre plusieurs heures (Jono
et al, 2000). Ce type d'encapsulation trouve son application dans plusieurs domaines dont
9
l'industrie des suppléments nutritionnels (vitamine C et B, sulfate ferreux, ascorbate de
sodium) où l'usage de gras comme agent enrobant empêche les réactions entre l'acide
ascorbique par exemple et les composés environnants pouvant contenir du fer. La
microencapsulation par suspension est aussi utilisée en boulangerie pour la substitution de
certains additifs impopulaires tel que le borate de potassium par de la vitamine C
encapsulée. Un autre domaine d'utilisation de cette méthode est l'industrie de la viande où
des acides organiques encapsulés, tels l'acide lactique, permettent le développement de
saveur et de couleur spécifiques aux produits carnés tels que le pepperoni, le salami et les
saucisses (DeZarn, 1995).
2.1.4. Microencapsulation par extrusion
Cette méthode consiste en la dispersion du matériel actif dans une matrice liquide
pulvérisée, par l'intermédiaire d'une enceinte pressurisée, dans un système de collecte des
microcapsules (Dziezak, 1988 ; Schlameus, 1995). Ce système peut être de différents types
dépendamment du corps protecteur utilisé. Par exemple, l'utilisation d'alginate de sodium
seul ou en combinaison avec d'autres polymères va entraîner une collecte des capsules dans
un bain froid de sel de calcium. Cette solution insolubilise et durcit le corps protecteur de la
matrice en encapsulant les ingrédients actifs à l'intérieur des gouttelettes. Les filaments
formés (grâce à la pression) sont brisés et séchés. C'est une méthode qui produit des
particules de grandes tailles qui peuvent servir dans les produits secs tels que les mélanges
pour boisson, les mélanges pour gâteaux, les mélanges pour dessert à base de gélatine et les
mélanges pour cocktail (Dziezak, 1988). L'utilisation de gel (gélatine ou carraghénane)

10
comme agents encapsulants permet de récupérer les capsules dans de la poudre d'amidon
pour éviter l'agglutination de celles-ci.
2.1.5. Microencapsulation par refroidissement (spray-chilling or spray-cooling)
Ce type d'encapsulation est similaire à l'encapsulation par séchage par atomisation à
l'exception de l'absence d'évaporation. En effet, les ingrédients à encapsuler (généralement
solides) sont mélangés dans une phase liquide qui est atomisée dans un environnement à
température contrôlée, soit inférieure ou supérieure au point de fusion du corps enveloppant
(huile végétale fractionnée ou hydrogénée). Cette technique permet de contrôler la
libération des ingrédients dans les aliments ou dans le système digestif (Dziezak, 1988 ;
Risch, 1995). Cette zone de température de fusion ou de solidification qu'offre ce type
d'encapsulation nécessite beaucoup plus de précautions dans les éventuelles manipulations
et à l'entreposage pour conserver l'intégrité des microcapsules. Cette méthode est souvent
utilisée pour l'encapsulation de particules solides telles que les vitamines, les minéraux et
les acidulants (Rish, 1995).
2.1.6. Microencapsulation par complexe d'inclusion
La technique de microencapsulation par complexe d'inclusion décrite par Dziezak (1988),
est par exception une technique moléculaire. Elle met en évidence la conformation cyclique
des P-cyclodextrines qui sont des molécules chimiquement et physiquement stables
formées par modification enzymatique d*amidon et qui comportent 7 unités glucopyranose.
L'intérieur a un caractère hydrophobe tandis que l'extérieur est hydrophile (Rish, 1995). En
11
solution, cette conformation exhibe une cavité interne qui renferme des molécules d'eau.
Les ingrédients hydrophobes (vitamines liposolubles) à encapsuler vont substituer l'eau
dans la cavité et former des liens avec l'anneau de P-cyclodextrine. Les complexes
ingrédients-P-cyclodextrine forment un précipité récupérable par filtration et séchage. La
formation et les applications des complexes de cyclodextnne ont été largement décrites par
Hedges et al. (1995). Ainsi, les liaisons engagées dans la formation de ce précipité incluent
les forces de van Der Vaals, les interactions hydrophobes et les interactions dipôle-dipôle.
La microencapsulation par complexe d'inclusion avec la cyclodextrine améliore la stabilité
à la chaleur, à la lumière et aux conditions d'oxydation des complexes ingrédients
hydrophobes-cyclodextrine, et réduit la volatilité des composés complexés (Wong, 1998;
Bhandari & D'arcy, 1996).
2.1.7. Microencapsulation par coacervation
Le terme coacervation a été emprunté au domaine de la chimie des colloïdes et il réfère au
processus de formation de la paroi d'une capsule (Versic, 1988). L'avènement du papier à
écrire sans carbone en 1942 par Banett Green marque un grand pas dans l'évolution du
concept de coacervation (Dziezak , 1988). Versic divise le principe de coacervation en trois
étapes qui sont la formation de particules ou de gouttelettes, la formation de la paroi
capsulaire et l'isolement des capsules.

12
2.1.7.1. Complexe de coacervation
La formation de complexes est possible dans un système aqueux ayant deux polymères
hydrophiliques de charges opposées. Le procédé de formation de complexes peut être
résumé en ces lignes (Soper, 1995) : 1) un premier biopolymère (généralement une
protéine) est dissout dans l'eau ; 2) l'ingrédient actif est mélangé à la solution de
biopolymère ; 3) l'ajout d'un deuxième biopolymère de charge opposé entraîne la
neutralisation des charges du premier biopolymère et les complexes se forment. La
formation de complexes diminue la solubilité des biopolymères dans l'eau, entraînant une
séparation de phases avec une phase riche en complexes de biopolymères contenant
l'ingrédient actif et une autre phase presque dépourvue de biopolymère mais riche en
solvant (Versic, 1988). Ce sont ces complexes qui forment la paroi des microcapsules après
isolement. Il faut rappeler que cette formation de coacervat est influencée par plusieurs
conditions dont le pH, la force ionique, la concentration de polymères totaux, la
composition de polymères, ainsi que le ratio des deux polymères. King (1995), décrit une
méthode d'encapsulation par coacervation qui utilise la gélatine et la gomme gellane. Dans
ce procédé, le caractère amphotère de la gélatine lui permet de former un complexe de
coacervation avec un polysaccharide anionique, la gomme gellane. À pH > 6, ces deux
polymères sont miscibles (chargés négativement tous les deux, ils se repoussent
communément). Lorsque le pH est en dessous du point isoélectrique de la gélatine (elle
devient chargée positivement), les polymères interagissent et forment un complexe de
coacervation. Le système gélatine-gomme arabique est le système le plus utilisé. Versic
(1988), décrit la formation de microcapsule à partir de ces deux polymères. Il soutient qu'il
13
est possible de former un complexe de coacervation seulement lorsque le pH est en dessous
du point isoélectrique de la gélatine car à ce pH, la gélatine est chargée positivement tandis
que la gomme arabique demeure chargée négativement. Par conséquent, des interactions
électrostatiques peuvent se produire et entraîner la formation de coacervats.
L'encapsulation de gouttelettes d'huile de tournesol et de paraffine, ainsi que des particules
de poudre d'aluminium ont fait l'objet d'encapsulation dans des complexes de coacervation
utilisant la gélatine et le XM6, un polymère sécrété par Enterobater NCIB 11870 (Chilvers
étal, 1988).
2.1.7.2. Simple coacervation
Une simple coacervation peut se former avec un seul type de biopolymère dans un solvant
où le polymère n'est pas soluble ou par addition d'un composé (sels et alcools) ayant une
affinité plus élevée pour l'eau (Soper, 1995). De cette manière ce composé entre en
compétition avec le polymère en question. Lorsque les polymères perdent la couche d'eau
associée à leurs chaînes, il y a formation de coacervat entre les différentes chaînes
(Patwardhan & Das, 1983). Vandegaer (1973), a effectué l'encapsulation de gouttelettes
d'huile par simple coacervation avec de la gélatine. Dans sa technique, il renforce la
coquille capsulaire avec une solution de formaldéhyde à 37% avant séchage. Il mentionne
aussi que plus rapidement la gélatine gélifie, plus petits sont les pores des microcapsules et
par conséquent les gouttelettes ont moins de chance de s'échapper à travers la paroi
capsulaire. Une simple coacervation avec de la gliadine ayant un paramètre de solubilité
semblable à celui du solvant a permis de produire des particules de l'ordre du nanomètre

14
quelque soit les conditions d'extraction et de purification de la protéine (Duclairoir et al,
1998).
Jusqu'à présent, la plupart des techniques de microencapsulation citées dans cette revue ne
comportent pas d'étude d'encapsulation de composés hydrosolubles tel que la thiamine ou
les anthocyanes par la méthode de séparation de phases à l'exception de quelques travaux
portant sur l'encapsulation de L-tryptophan, de monoglycerate d'acide octanoique, de
propionate d'éthyle et de limonène par les émulsion multiples (Weiss et al, 2005; Shima et
a/.,2005;Cho et al, 2005).
2.2. Les interactions protéines-polysaccharides
Lorsque les protéines et les polysaccharides sont mélangés en solution, ils interagissent de
différentes façons selon les conditions du milieu. D'un point de vue thermodynamique,
deux types d'interaction (Fig. 2.1) peuvent se produire (Ledward, 1993, 1994; Samant et
al, 1993 ; Weinbreck et al, 2004). Il s'agit de l'incompatibilité thermodynamique ou
séparation de phases ségrégative et de la compatibilité thermodynamique qui se subdivise
en deux états : 1) l'état de co-solubilité qui consiste en un système où les deux polymères
forment un mélange homogène stable ; 2) l'état de séparation de phases associative où les
deux polymères interagissent de façon attractive pour former un système diphasique dans
lequel les deux polymères se retrouvent associés et concentrés dans une même phase tandis
que la deuxième phase est pauvre en polymère. Il en résulte dans le dernier cas la formation
15
de complexes électrostatiques entre les polymères. Selon le polysaccharide utilisé, il est
possible d'obtenir des gouttelettes de coacervats. Cette phase très visqueuse est obtenue
avec certains polysaccharides (par exemple, la gomme arabique comportant un segment
protéique).
16
Polysaccharides Proteins
*> W •
Ségrégation Association
Incompatibility / Co-solubiiity / Complexation /

Depletion No phase séparation Complex coacervation
Figure 2. 1. Comportement des mélanges protéine/polysaccharide (Weinbreck, 2004)
2.2.1. Incompatibilité thermodynamique
Dans l'état d'incompatibilité thermodynamique, il y a formation d'un système biphasique
liquide - liquide dans lequel la protéine et le polysaccharide se trouvent séparés, chacun
dans l'une des deux phases (Tolstoguzov, 1986). L'incompatibilité a lieu lorsque les
polymères en solution sont de même nature, i.e. les molécules des charges sont de même
signe. L'incompatibilité dépend aussi d'autres facteurs tels que, le pH du milieu, la
flexibilité des chaînes du polysaccharide, le poids moléculaire des polymères, la

17
concentration en sels ainsi que la concentration en solides totaux. Par exemple, pour des
systèmes protéine/polysaccharide anionique, l'incompatibilité peut survenir à des hautes
forces ioniques (supérieures à 0.25 M), à un pH supérieur ou égal au point isoélectrique de
la molécule de protéine et à des concentrations en solides totaux supérieures à 4%
(Tolstoguzov, 1986)
2.2.2. Compatibilité thermodynamique
Dans le cas d'une compatibilité thermodynamique, deux situations peuvent se présenter: 1)
la formation d'un mélange homogène et stable de polymères représentant l'état de co-
solubilité ; 2) un système biphasique où les deux polymères se retrouvent principalement
dans une des deux phases par séparation de phases associative (Ledward, 1994; Samant et
al, 1993; Tolstoguzov, 1997, 1991).
2.2.2.1. Co-solubilité
Dans le cas de la co-solubilité, le mélange spontané de protéines et de polysaccharides est
homogène et stable, permettant aux deux polymères de coexister en équilibre dans la même
solution. Cet état de co-solubilité peut en tout temps basculer en incompatibilité si la
différence de poids moléculaire entre les deux polymères augmente. Ceci pourrait
déséquilibrer le rapport des forces attractives et répulsives qui stabilisaient le système. La
formation de ce type de système est favorisée à de faibles ratios protéine - polysaccharide.
De plus le maintien des deux polymères en état de co-solubilité est assuré par des
18
interactions électrostatiques mais aussi par des liaisons hydrogène. Cet état de co-solubilité
est rarement observé vu la nature différente des polymères ainsi que la grande diversité de
leurs groupements fonctionnels qui pourraient conduire à des attractions ou des répulsions.
Cependant, un cas de co-solubilité entre la pectine et la sérum albumine bovine a été
rapporté dans la littérature (Semenova et al, 1991).
2.2.2.2. Séparation de phases associative
Dans le cas d'une séparation de phases associative, un système diphasique liquide-solide se
forme et les deux polymères se trouvent essentiellement dans une même phase. Ce système
est caractérisé par la formation d'un complexe protéine-polysaccharide, dans certains cas
appelé coacervation complexe, par le biais d'interactions électrostatiques entre des
polymères de charges opposées. Lors d'une séparation de phases associative, les
interactions électrostatiques favorisant l'association des polymères, sont représentées par
des forces attractives électrostatiques entre les groupements carboxyliques du
polysaccharide et les résidus chargés positivement de la protéine (Mattison et al. 1995;
Samant et al, 1993; Sanchez & Paquin, 1997). Il en résulte une formation de précipité qui
permet de distinguer une phase riche en complexes de polymères et une phase de solvant
presque complètement dépourvue de polymères (Tolstoguzov, 1991). Ces complexes sont
stabilisés par des liaisons hydrogène, des forces de van der Waals et des interactions
hydrophobes (Dickinson, 1998; Ganz, 1974; Imeson étal, 1977; Ledward, 1994; Samant et
al, 1993). La zone de pH favorable à la formation de ces complexes se retrouve
généralement entre le point isoélectrique de la protéine et le pKa des groupements

19
carboxyliques du polysaccharide. Cette formation de complexes est aussi favorisée par la
présence de faibles forces ioniques (Burgess, 1990). Les complexes formés peuvent
présenter différents aspects dépendamment du type de polymères utilisés. Des coacervats
complexes ont été obtenus par des mélanges gomme arabique/gélatine (Burgess & Carless,
1984, 1985; Peters et al, 1992), gomme arabique/albumine (Burgess et al, 1991, Burgess
& Singh 1993), gomme xanthane/protéine du lactosérum (Laneuville et al, 2000) et P-
lactoglobuline/gomme arabique (Schmitt et al, 2000). Des complexes impliquant la sérum
albumine bovine et un polyélectrolyte, poly(chlorure de diméthyldiallylammonium)
(PDMAAC) ont été largement rapportés dans la littérature (Mattison et al, 1995,
1998; Wang et al, 1996; Xia et Dubin, 1993).
2.2.3. Facteurs influençant la formation de complexes
La formation de complexes et la séparation de phases dépendent entre autres de la vitesse
d'agitation, du ratio ingrédients/polymères, de la vitesse du refroidissement et de l'ordre
d'addition des différents composés (Versic, 1988). Quant à la stabilité du complexe, elle
dépend d'un certain nombre de facteurs dont les groupements ionisables à la surface des
protéines et polysaccharides, la structure des protéines (dénaturée ou native), la flexibilité
des polysaccharides (Ledward, 1994), la concentration des polymères, l'environnement
ionique, le contenu en sucre, la température, le poids moléculaire et le pH du milieu
(Dickinson, 1998, Syrbe et al, 1998).

20
2.2.3.1. Le pH
Le pH joue un rôle très important dans le processus de formation de complexes entre les
protéines et les polysaccharides. En effet, le pH est responsable de l'ionisation des
macromolécules afin que des interactions électrostatiques puissent s'effectuer. Plus
précisément, le pH contrôle l'ionisation des groupements des chaînes latérales, des
groupements aminés et carboxyliques des protéines et des groupements carboxyliques des
polysaccharides (Schmitt, 2000). Les complexes formés peuvent être solubles ou insolubles
dépendamment du degré de neutralisation des charges opposées (Ledward, 1994;
Tolstoguzov, 1991). Des polymères fortement chargés, résultant de la variation du pH,
auront une conformation modifiée qui les amènera à former des agrégats insolubles au
détriment de la formation de complexes solubles (Burgess, 1990; Singh et Burgess, 1989).
En fait, pendant la formation de complexes entre protéine et polysaccharide anionique, la
charge nette (négative) des molécules de polysaccharides diminue progressivement, avec la
baisse du pH, pendant qu'elles s'attachent aux molécules de protéine chargées positivement
(Benichou et al, 2002). La conséquence directe qui en découle est la diminution de la
solubilité et de l'hygroscopicité de ces polymères et finalement la formation de complexes.
Le maximum d'interactions apparaît à un point appelé point d'équivalence électrique (PEE)
où la protéine et le polysaccharide possèdent des charges également opposées (Singh and
Burgess, 1989). Des études sur la formation de complexes entre la (i-lactoglobuline et la
gomme arabique (Weinbreck et al, 2003), ont montré que la formation de complexes se
faisait dans une zone de pH bien précise (Fig. 2.2). Selon ces auteurs, lors de 1' acidification
du mélange protéine/polysaccharide, un début de formation de complexes solubles apparaît

21
d'abord à un certain pH baptisé pHc qui serait dépendant de la force ionique, du point
isoélectrique de la protéine et de la densité de charges des polymères (Mattison et al,
1995). La valeur de ce pH pourrait aussi être influencée par la vitesse d'agitation, le ratio
ingrédients/polymères, les caractéristiques des polymères, les caractéristiques des
ingrédients (mouillabilité, solubilité), la vitesse du refroidissement et l'ordre d'addition des
différents composés (Versic, 1988). Avec la baisse du pH, les interactions deviennent de
plus en plus fortes, les complexes solubles s'agrègent et la séparation de phases apparaît à
un pH désigné pH«(,i. Si la baisse de pH continue, les complexes se dissocient à un autre pH
désigné pH,^ (non indiqué). Ces résultats sont confirmés par les recherches de Versic
(1988). Par ailleurs, le degré d'implication de la charge électrique nette d'un polymère dans
les interactions coulombiennes dépend de l'écart de pH entre le point isoélectrique (pi) du
polymère et le pH de la solution dans laquelle il se trouve. Ainsi, la plupart des protéines
alimentaires (pi autour de 5) peuvent former des complexes avec les polysaccharides
anioniques puisque les 2 polymères porteraient des charges opposées (Dickinson, 1998).
Cependant la tendance vers une formation de coacervation complexe insoluble est favorisée
par de faibles concentrations de sel et par des valeurs de pH en dessous du pi de la protéine
(Dickinson, 1998). Des travaux de compatibilité de l'albumine de l'œuf et de différents
amidons ont montré qu'un optimum de complexes insolubles était obtenu en variant la
quantité d'acide ajoutée (Schmitt, 2000). Dans une étude de purification de protéines du
lactosérum, Hansen et al. (1971), utilisèrent un nouveau procédé de complexation des
protéines avec la carboxyméthycellulose avec lequel 90% des protéines précipitaient à pH
3.2 et 10% pouvaient être complexés par ajustement du pH entre 7.5 et 8.0. Ceci indique
22
que la purification des protéines peut être spécifique par simple ajustement du pH (Strege et
al, 1990), comme c'est le cas en purification sur colonne échangeuses d'ions. Une autre
étude a conduit à 90% de complexation par ajustement du pH à 6.0 d'un mélange de
protéines de lactosérum et de polysaccharide cationique, le chitosane (Bough & Landes,
1976). L'utilisation de différents types d'acides (HC1, HNO3, AcOH, H2SO4) pour abaisser
le pH pendant la formation de complexes entre la gélatine et la gomme arabique (Daniels &
Mittermaier, 1995) a révélé qu'en général, il n'y avait pas de différence au niveau du
pourcentage de complexes formés (sur une base sèche). Cependant, avec l'acide sulfurique,
le pH d'équivalence électrique est décalé à des valeurs inférieures par rapport aux autres
types d'acide.
23
100 2.5
A B
Soluble Soluble Association of
3
80 polymers complexes complexes H 2.0
(0
ity
60 1.5 É
8 '■B
1c 1
O) 40 1.0
c
■c
atte
20 0.5
o
(0
citçrt?ft-M) V j
0 0.0
6.5 4.0 3.5
Figure 2.2. Représentation des zones de formation de complexes protéines du lactosérum-gomme
arabique. Diffusion de la lumière A et turbidité O des complexes ; diffusion de la lumière des
protéines du lactosérum □ et de la gomme arabique # en fonction du pH (Weinbreck et al., 2003).
2.2.3.2. La force ionique

Parmi les trois types d'équilibre qu'on trouve dans une solution binaire
protéine/polysaccharide, la miscibilité apparaît généralement à des forces ioniques plus
faibles que l'incompatibilité et la séparation de phases associative (Dickinson, 2003).

24
Cependant, des concentrations ioniques relativement faibles favorisent la formation de
complexes de biopolymères car le nombre de charges sur ces molécules est suffisant pour
effectuer des liens électrostatiques entre elles sans être significativement influencés par les
ions. Par contre à de fortes concentrations en ions, il y a un effet inverse, celui de la
suppression des complexes, qui se justifierait par l'entrée en compétition des ions, avec les
macromolécules. Cela veut dire en réalité qu'à forte concentration en ions dans la solution,
les charges portées par les biopolymères sont réduites par les interactions avec ces ions en
présence (en créant un effet d'écran électrostatique), ce qui empêcherait les interactions
électrostatiques entre les molécules de protéines et de polysaccharides (Mattison et al,
1995; Schmitt et al, 1998). Ces auteurs ont montré que les ions divalents supprimaient la
coacervation complexe à des concentrations ioniques plus faibles que les ions monovalents,
mais que cette suppression pouvait être levée si la solution des ions divalents était diluée.
Ceci démontrerait que l'effet ionique des ions divalents est plus fort que celui des ions
monovalents. Dans un système albumine/gomme arabique (Schmitt et al, 1998),
l'optimum de coacervation a lieu à lOmM de sel alors qu'à des valeurs plus hautes il se
produit une chute drastique de la coacervation. Ceci serait dû à l'adoption d'une
conformation linéaire des polysaccharides qui formeraient des agrégats au lieu de
complexes avec les protéines. L'effet de la concentration en sel sur les interactions du
système inhibiteur de trypsine de soja/polyampholytes (Nath et al, 1995) a montré qu'en
variant la concentration de 0 à 0,75M (c'est-à-dire : 0; 0,1; 0,35 et 0,75M), la turbidité
décroissait jusqu'à la suppression, ce qui indique que cet accroissement de la concentration
en sel est défavorable à la formation de complexes. Cependant il faut noter que cette
croissance en concentration de sel s'est produite à des valeurs assez éloignées qui auraient
25
pu ne pas mettre en évidence la concentration minimale de sel favorisant la formation de
complexes par le couple protéine-polymère.
2.2.3.3. Charge des biopolymères
Le processus de formation de complexes est principalement influencé par la nature et la
densité des charges présentes sur les macromolécules. La densité de charges des
biopolymères peut être définie comme le nombre de charges par unité de longueur. Ce
facteur est très important d'autant plus que si la densité de charges est trop faible,
l'interaction électrostatique n'intervient pas et la formation de complexes est inhibée. De
plus, la charge nette des complexes influence la solubilité de ceux-ci dans leur milieu. Par
exemple, si un polymère possède un excès de charge par rapport à un deuxième polymère,
les complexes formés auront tendance à interagir avec le solvant. Cependant si les charges
des deux polymères se neutralisent complètement pendant la formation de complexes,
ceux-ci seront insolubles. Ces complexes peuvent être à nouveau solubles par titration acide
ou par ajout de sels (Mattison étal, 1995; Tolstoguzov, 1997; Xia et Dubin, 1993).
Un autre facteur important relié à la densité de charges est la conformation des polymères.
Une molécule de protéine globulaire sera plus limitée dans son interaction avec la molécule
de polysaccharide par rapport à une molécule de structure plus désordonnée (gélatine,
caséine) qui offre plus de sites chargés, facilitant ainsi les interactions avec la molécule de
polysaccharide.
26
L'hétérogénéité de la distribution de charges à la surface des molécules globulaires de
protéine peut avoir comme conséquence la formation de complexes dans une zone
défavorable à la formation de complexes par rapport au point isoélectrique de la protéine
(De Vries et al, 2003, De Vries, 2004). Par exemple, les complexes peuvent être formés à
des pH supérieurs au point isoélectrique de la protéine comme rapporté dans une étude
mettant en interaction la sérum albumine bovine et un polyélectrolyte anionique, le sulfate
d'alcool polyvinylique (Park et al, 1992). Ce phénomène est attribué à la présence de
zones de densité de charges positives appelées «patches» sur la protéine qui a une charge
nette négative, et qui interagissent avec le polyélectrolyte chargé négativement (Bowman et
al, 1997).
La majorité des polysaccharides utilisés dans le domaine de l'alimentation sont de nature
anionique; par exemple, la pectine et la gomme arabique portent des groupements
carboxyles tandis que la carraghénine porte des groupements sulfates. D'autres
polysaccharides sécrétés par les bactéries lactiques possèdent des groupements phosphates.
Certains autres, tel que le chitosane, sont cationiques.
2.2.3.4. La concentration totale en biopolymères
La concentration totale de biopolymères est aussi un paramètre non moins important dans
la formation de complexes par coacervation. Des études sur 80 systèmes ternaires
effectuées par Tolstoguzov (1986), ont montré qu'à des concentrations de biopolymères
supérieures à 4% l'apparition de complexes est supprimée au profit d'une séparation de

27
phases ségrégative. Cependant, en diluant le système déjà concentré en polymères totaux, la
formation de complexes devient possible à nouveau (Phares & Sperandio, 1964).
2.2.3.5. Le ratio protéine/polysaccharides
Le ratio protéine/polysaccharide (P:Ps) est un autre facteur influençant la charge nette et les
propriétés des complexes obtenus. Il en résulte une influence sur la solubilité des
complexes. En effet, à un pH et à une force ionique donnés, le ratio massique P:Ps va
conditionner la neutralisation des charges entre les deux macromolécules (Xia & Dubin,
1993). Si la neutralisation des complexes se produit à un ratio P:Ps de 1, toute
augmentation ou diminution de ce ratio entraînera un gain de solubilité des complexes et
par conséquent une diminution des complexes (Kaibara et al, 2000). À pH 5,65 et à une
force ionique de 10 mM, Bowman et al. (1997), ont démontré, en utilisant la diffusion de la
lumière à 90° (proportionnalité entre l'intensité de la lumière et l'association des
macromolécules), que l'association des molécules se trouve augmentée de 5 fois avec des
complexes au ratio gélatine/polélectrolyte de 12 par rapport au polyélectrolyte seul. Une
augmentation subséquente du ratio par ajout de gélatine a entraîné une diminution de
l'intensité de la lumière correspondant à l'intensité de la gélatine seule. Ceci confirme une
solubilisation des complexes formés par l'excès de gélatine. Dans une autre étude, il a été
démontré que la taille des complexes pouvait être contrôlée en faisant varier le ratio de P:Ps
(Laneuville et al, 2000). Dans cette étude, 44% des complexes avaient une taille
supérieure à 300um (surface mesurée par microscopie optique) avec un ratio supérieur à
28
15:1 alors que pour presque le même pourcentage (40%) la taille des complexes diminuait à
20 um2 avec un ratio entre 5:1 et 10:1.
2.2.3.6. Température
La température influence les interactions non coulombiennes. À titre d'exemple, les
liaisons hydrogène sont favorisées par une diminution de la température alors que les
interactions hydrophobes et liaisons covalentes sont favorisées par l'augmentation de la
température. La séparation de phases associative dans un système protéine/polysaccharide
est donc favorisée par une diminution de la température permettant l'établissement de
liaisons hydrogène. L'augmentation de la température peut aussi être indirectement
bénéfique à la séparation de phases associative (Schmitt et al, 1998) dû à l'exposition de
sites réactifs lors de la dénaturation des protéines ou au changement de conformation du
polysaccharide. Ces changements peuvent favoriser les interactions électrostatiques
associatives entre protéines et polysaccharides. Des protéines ayant été individuellement
dénaturées par la chaleur ont une interaction différente à la surface des gouttelettes d'huile
ou avec d'autres macromolécules, comme les polysaccharides, par rapport aux protéines
natives non traitées (Dickinson & Pawlowsky, 1996). L'effet de la température (25 à 90°C)
sur la formation de complexes sérum albumine bovine-alginate à pH 6.8 (Harding et al,
1993) a montré une formation de complexes à 25°C alors qu'il n'y a pas de formation de
complexes entre 35 et 70°C. Cependant quand le mélange sérum albumine bovine-alginate
est chauffé au dessus de 70°C la formation de complexes a lieu. Cette reprise de la
formation de complexes serait expliquée par la dénaturation de la sérum albumine bovine à

29
55°C et une fois cette température dépassée, le chauffage permettrait à la protéine d'exposer
plus de groupements réactifs favorables à la formation des complexes. La zone de
température entre 35 et 70°C correspondrait au processus de modification de la
conformation de la sérum albumine bovine pendant lequel les interactions avec l'alginate
ne sont pas favorisées.
2.2.3.7. Pression
Une nouvelle technique qui attire l'attention ces dernières années est l'utilisation de la
haute pression (Dickinson & Pawlowsky, 1996). Dans le domaine alimentaire, deux types
de pression peuvent être appliqués aux polymères en solution (Schmitt et al, 1998). Il
s'agit des traitements de haute pression hydrostatique et de la microfluidisation qui se fait
dans une chambre de microfluidisation. Cette dernière consisterait en une combinaison de
turbulence, de cavité gazeuse et de phénomène de cisaillement. L'effet de la haute pression
hydrostatique (400-700MPa) sur une solution de beta-lactoglobuline (Dickinson &
Pawlowsky, 1996), avant son émulsion avec une phase lipidique et avant l'ajout de
polysaccharide (dextrane), s'exprimerait par une dénaturation (pas aussi prononcée qu'avec
de la chaleur) de la protéine à la surface des gouttelettes. L'effet bénéfique des complexes
avec les hautes pressions et températures serait dû à la protection par blocage des sites
hydrophobes de la protéine par la molécule volumineuse de polysaccharide (Dickinson,
1998).
30
2.2.3.8. Agitation et temps d'agitation
L'effet de l'agitation a pu être mis en évidence dans plusieurs études. Par exemple, le
diamètre des complexes obtenus entre l'albumine et la gomme acacia était de 2,2um après
augmentation de la vitesse d'agitation à 420 rpm alors qu'il était de 3,1 um à 200 rpm
(Tirkkonen et al, 1994). Par contre dans une étude de Burgess et Singh (1993), aucun effet
de l'agitation à 0, 450 et 900 rpm pendant une heure n'est obtenu avec le même système
albumine/gomme acacia. Bien que ces deux études donnent des résultats différents, d'autres
(Schmitt et al, 1998) effectuées sur le complexe de bêta-lactoglobuline/gomme acacia avec
un ratio de 4 :1 à pH 4.0 et une concentration totale en polymères de 0,1% p/p ont montré
(par absorbance à 650 nra et par micrographie à contraste de phases) que la taille des
coacervats était dépendante du temps d'agitation. Après une courte durée (15s) d'agitation,
des coacervats de petite taille (lum) étaient obtenus alors que de longues durées (60s)
d'agitation permettaient une coalescence des particules (10-25um). Par ailleurs,
l'évaluation des paramètres d'encapsulation d'acides gras Q-3 insaturés par des complexes
gélatine-gomme arabique a permis de constater qu'une augmentation de l'homogénéisation
de l'émulsion huile (acides gras Q-3) dans eau (contenant des complexes gélatine-gomme
arabique), par agitation à 9000 rpm augmentait le taux d'encapsulation (Lamprecht et al,
2001). Cela pourrait s'expliquer par un changement de la structure du matériel encapsulant
en une structure de matrice (possible changement de conformation de la protéine)
favorisant l'encapsulation.
31
2.3. Biopolymères à l'étude
2.3.1. Les protéines du lactosérum
Le lactosérum est obtenu après l'acidification du lait, en général par l'ajout de bactéries
lactiques ou la coagulation de la caséine (ajout de la présure) pendant le processus de
fabrication de fromage. Pour obtenir des protéines de lactosérum sous forme concentrée
comme l'isolât de protéines de lactosérum (IPL), deux méthodes sont principalement
utilisées. Il s'agit de la séparation des protéines du lactosérum sur colonne échangeuse
d'ions ou par microfiltration. La séparation par échange d'ions permet d'obtenir une
concentration plus élevée de protéines (93-95%) que la séparation par microfiltration suivie
d'une ultrafiltration (90-95%) mais cette dernière permet de récupérer plus de
glycomacropeptides, lactoferrine, lactoperoxidase et de peptides bioactifs, qui sont des
molécules importantes pour la santé. Le produit final obtenu, l'isolât de protéines de
lactosérum, contient approximativement 64.47% de (3-lactoglobuline (P-lg), 23.02% d'a-
lactalbumine, 2.36% de sérum albumine bovine et de 2.67% d'immunoglobulines avec des
fractions mineures de glycomacropeptides et de protéoses peptones.
2.3.1.1. La p-lactoglobuline
La P-lg (Fig. 2.3) est la protéine la plus importante des protéines du lactosérum. Elle est très
nutritive car elle contient tous les acides aminés essentiels. Il existe 7 variants génétiques de
P-lg et les plus communs sont les variants A et B. La structure secondaire de la P-lg est
représentée par 15% d'a-hélice, 50% de feuillet P et le reste par une structure désordonnée
(Rutten et al, 2002 ; Sawyer & Kontopidis, 2000). La structure primaire de la molécule
32
consiste en 162 acides aminés dont un tiers des acides aminés sont apolaires (Rutten et al,
2002). La P-lg a une structure globulaire (3 nm de diamètre) sous sa forme native. Sous
cette forme, elle est stabilisée par des ponts hydrogène et deux ponts disulfures dont l'un
entre les résidus Cys 66 et Cys 160 et l'autre entre les résidus Cys 106 et Cys 119. Elle
contient aussi un groupement -SH libre entre les résidus 229 et 121 (Cheftel et al, 1985).
La P-lg a un poids moléculaire de 18 362 Da et un point isoélectrique de 5.2 (Rutten et al,
2002). Elle appartient à la famille des lipocalins qui sont caractérisés par leur habileté à se
solubiliser et à transporter des ligands hydrophobes tels que des acides gras (Ragona et al.,
2003). Par exemple, la fixation du rétinol dans la cavité centrale de la P-lactoglobuline a été
mise en évidence par Kontopidis et al., (2002). Par ailleurs, de la P-lactoglobuline (variants
A et B) immobilisée dans une colonne a été utilisée pour l'extraction et l'isolement des
protéines du lactosérum (Chiancone & Gattoni, 1991). La distribution de charges sur la P-lg
(Fig. 2.3) est représentée par plusieurs régions peptidiques, riches en acides aminés chargés
positivement (asparagine, histidine et lysine) et négativement (acide glutamique et acide
aspartique), responsables des zones chargées à la surface de la protéine. Plusieurs études
effectuées sur les interactions entre la P-lg et des polysaccharides anioniques ont démontré
la présence d'interactions électrostatiques au-dessus du point isoélectrique de la protéine,
lorsque les deux macromolécules portaient des charges nettes opposées (Girard et al, 2004;
Weinbreck et al, 2003). Ceci démontre l'importance de la présence de zones chargées à la
surface de la p-lg sur les interactions avec les polysaccharides.

33
\ 130 C-term
Figure 2.3. Structure tridimensionnelle d'un monomère de la P-lactoglobuline A (Oliveira

et al, 2001)
2.3.1.1.1. Facteurs influençant la structure
2.3.1.1.1.1. Le pH et les sels
La structure quaternaire de la B-lg est facilement influencée par le pH et les minéraux. Au
pH physiologique (6.8) la B-lg se trouve sous forme de dimère. Aux pH extrêmes (pH > 8,
pH < 3) elle se dissocie sous forme monomérique alors qu'entre pH 3.5 et 5.5 le variant A
34
aurait tendance à former des octamères (Sawyer & Kontopidis, 2000). L'ajout de sels à une
solution de P-lg peut neutraliser les charges de la protéine et favoriser les interactions
apolaires. L'ajout de calcium forme des ponts intramoléculaires qui peuvent favoriser les
interactions hydrophobes (par changement de conformation de la molécule) et la réactivité
des groupements sulfhydryles d'une part, et la formation de gel lorsque la P-lg est
partiellement dénaturée (Jeyarajah & Allen, 1994). La valence des ions joue un rôle
important au niveau de la gélifîcation de la P-lg (Kuhn & Foegeding, 1991). Les ions
bivalents provoquent une gélifîcation plus rapide que les ions monovalents (Foegeding et
al, 1992).
2.3.1.1.1.2. La température
L'effet de la température est lié aux conditions de pH et de force ionique du milieu. Il faut
noter qu'à 65°C à pH 6.7, la p-lg est dénaturée. Un chauffage entre 40 et 80°C à pH neutre
entraîne d'abord la dissociation des dimères de P-lg en monomères en exposant les
groupements sulfhydriles (Kella & Kinsella, 1988), puis le dépliement de la molécule causé
par la rupture de liens hydrogène (Hambling et al, 1992 ; Wong et al, 1996). Dans cet état,
la molécule subit des réactions d'agrégation dues à la formation de ponts disulfures
intermoléculaires, et aux interactions entre les régions hydrophobes exposées (Relkin,
1998; Verheul et al, 1998). Aux pHs proches du point isoélectrique, le chauffage peut
engendrer une forte agrégation causée par des interactions électrostatiques et hydrophobes,
suivie d'une précipitation (de Wit, 1990; Relkin, 1998).

35
2.3.1.2. L'a-lactalbumine
L'a-lactalbumine (a-lac) est la deuxième protéine en importance dans le lactosérum. C'est
une métalloprotéine de poids moléculaire de 14.2 kDa. Des études cristallographiques ont
montré une similarité entre la structure tridimensionnelle (Fig. 2.4) de l'a-lac et celle du
lysozyme (Acharya et al, 1991, 1994). L'a-lac appartient au groupe des protéines
globulaires (3nm) avec 8 résidus cystéines formant 4 ponts disulfures (Boye, et al., 1997).
L'a-lactalbumine est constituée de 123 acides aminés dont 1/3 sont apolaires. Sa structure
tertiaire est composée de 20% d'a-hélice, 15% de feuillet p et de 60% de structure
aléatoire. La particularité de cette protéine est qu'elle a une très grande affinité pour les
ions métalliques bivalents tels que le calcium et le zinc, d'où le nom de métalloprotéine
(Hiraoka et al., 1980; Permyakov & Berliner, 2000 ; Relkin et al, 1993). Sa conformation
est stabilisée par de fortes liaisons calcium. L'a-lac a un intérêt particulier pour la science
en ce sens qu'elle fait partie des quelques protéines qui adoptent une conformation
intermédiaire, appelée «molten globule- state» entre la forme native et la structure
secondaire à pH acide. Cette forme est caractérisée par une structure compacte avec un
rayon de 10-20% plus large que celui de la forme native et une absence d'interaction
(rencontrée le plus souvent dans les structures tertiaires) entre les acides aminés
(Kuwajima, 1989).
36
Figure 2. 4. Structure tridimensionnelle de l'a-albumine humain avec les deux sites de
fixation du calcium sous forme de cercles 1 et 2 (Chandra et al, 1998).
2.3.1.2.1. Influence du pH sur la structure
L'a-lac est soluble dans l'eau mais à forte concentration, elle peut se polymériser quand le
pH de la solution approche son point isoélectrique (pi) de 4.3. De part et d'autre de son
point isoélectrique, plusieurs interactions intermoléculaires se produisent, conduisant à
divers degrés de polymérisation. Les molécules d'a-lac subissent une transition acide à pH
37
4.2-3 et une transition alcaline à pH supérieur à 9 avec formation d'agrégats dans les deux
cas. Ces comportements seraient causées par l'exposition de surfaces hydrophobes entre les
molécules de protéine (Kronman et al., 1964; Kronman & Andreotti, 1964 ; Kuwajima,
1989). Les interactions hydrophobes seraient elles même causées, à pH acide, par le
remplacement des ions calcium par des ions hydrogène. Cependant à des pH entre 6.5 et 8,
il y aurait peu d'association (Kronman et al, 1967).
2.3.1.3. La Sérum Albumine Bovine
La sérum albumine bovine est la troisième protéine en importance des protéines du
lactosérum. C'est une protéine de type globulaire qui se distingue par son poids moléculaire
assez élevé de 66 kDa. Elle comporte 582 acides aminés dont 30% sont apolaires avec 17
ponts disulfures et un groupernent -SH libre à la position 34. C'est une protéine soluble
dans l'eau dont le pi est de 4,8. Sa dénaturation acide apparaît à des pH < 4. Sa structure
secondaire consiste en 54% d'hélice a et 40% de feuillet P (Kinsella & Whitehead, 1989).
2.3.2. La pectine
2.3.2.1. Caractéristiques structurales
Les pectines sont des hétéropolysaccharides ioniques des plantes (agrumes, tomate,
betterave à sucre, pomme). Elles sont largement utilisées dans l'industrie alimentaire pour
leurs propriétés gélifiantes, dans des produits tels les confitures et les gelées et pour leur
capacité à stabiliser les produits laitiers acides (Voragen et al, 1995). Ce sont des fibres
alimentaires solubles qui diminueraient les risques de cancer du colon (Nangia-Makker et

38
al., 2002). Les pectines sont extraites dans diverses conditions incluant des pH de 1 à 3 à
des températures de 60 à 100°C pendant 0.5 à 12 h, selon la capacité de gélification et le
degré de méthylation du produit fini (Canteri-Schemin et al, 2005 ; Schols & Voragen,
2002; Voragen et al, 1995). Les pectines (50 000 à 150 000 Da) couvrent divers groupes
de polysaccharides associés aux parois cellulaires et aux régions intercellulaires des plantes
(Voragen et al, 1995). Leur caractère anionique leur permettrait des interactions avec les
protéines (Tolstoguzov, 1991). Le résidu majeur de ces polysaccharides est une chaîne
linéaire d'unités acide a-D-galacturonique liées entre elles par des liaisons a-1,4 (Schols &
Voragen, 2002; Thibault & Rinaudo, 1985; Voragen et al, 1995). Les pectines
commerciales (principalement dérivées des agrumes, de betterave à sucre et de pomme)
sont constituées de longues régions lisses et des régions ramifiées (Fig. 2.5). La région lisse
est constituée de longues chaînes d'acide galacturonique alors que la région ramifiée est
représentée par des chaînes latérales neutres d'arabinose, de galactose, de glucose, de
mannose et de xylose connectés au rhamnose d'une chaîne d'acide glucuronique et de
rhamnose (Nangia-Makker et al., 2002). Les pectines peuvent être divisées en trois groupes
(homogalacturonanes, rhamnogalacturonanes-I et galacturonanes substitués) largement
caractérisés (O'Neill et al, 1990; Vincken et al, 2003).
Le premier groupe, l'homogalacturonane (Fig.2.6), est constitué d'une chaîne linéaire de
résidus acides 1,4 a-D-galacturonique correspondant à la région lisse, sur laquelle certains
groupements carboxyliques sont estérifîés par des groupements méthyles. Les
homogalacturonanes seraient aussi partiellement estérifîés par des groupements acétyles
aux carbones C-3 et C-2 des unités galacturoniques (Ishii, 1997).

39
Le deuxième groupe, les rhamnogalacturonanes-I font partie d'une famille de pectine
contenant un résidu répétitif de disaccharides [l,4)-a-D-acide galacturonique-(l,2)-a-L-
rhamnose-(l,4] correspondant à la région ramifiée. Les chaines latérales consistent en des
résidus linéaires et ramifiés de a-L-arabinofuranose et de p-D-galactose.
Le troisième groupe, les galacturonanes substitués, sont souvent référés comme des
rhamnogalacturonanes-II. Us représentent un autre type de polysaccharides constitués d'une
chaîne linéaire de résidus 1,4 acide a-D-galacturoniques (O'Neill et al, 1990). On les
retrouve dans toutes les plantes. Il à été démontré que le vin et certains jus de fruits
contiennent une quantité très élevée (20-150 mg/1) de rhamnogalacturonanes-II (Doco et
al, 1997). Ils lieraient les métaux lourds (Szpunar et al, 1999; Tahiri et al, 2000) et
auraient des activités immunologiques (Shin et al, 1998), d'où leur intérêt pour la santé et
la nutrition humaine.
Les pectines natives sont souvent très méthylées. Cependant des pectines à faible teneur en
ester peuvent être préparées par une désestérification acide contrôlée de pectines hautement
méthylées mais d'autres moyens tels que le traitement alcalin, enzymatique ou par de
l'ammoniac peuvent être utilisés. Les étapes de la production de pectines hautement
méthylées et faiblement méthylées consistent principalement en des procédures successives
d'extraction, de filtration, de précipitation, de lavage et de standardisation. La production
de pectines par des traitements acides, basiques ou par la pectine méthylestérase acide
permet une distribution aléatoire des groupements carboxyliques libres alors que le
traitement par la pectine méthylestérase alcaline conduit à un arrangement en bloc des
groupements carboxyliques libres sur la molécule de pectine (Thibault & Rinaudo, 1985).
La pectine produite peut avoir différents degrés d'estérification (DE). Le DE est le

40
pourcentage de groupements carboxyles estérifiés par des molécules de méthanol (Fig. 2.6).
La pectine ayant un DE inférieur à 50% est dite faiblement méthylée (PFM) alors que celle
dont le DE est supérieur à 50% est dite hautement méthylée (PHM). Finalement, lorsque le
DE est inférieur à 10%, la pectine est appelée acide pectique. La pectine produite au moyen
d'ammoniac donne différents types de pectine faiblement méthylée avec des groupements
carboxyliques amidés. Le degré d'amidation est le nombre de groupes carboxyliques
amidés par 100 unités acide D-galacturoniques (Ralet et al, 2001; Voragen et al, 1995).
La structure tertiaire de la pectine est une hélice tridimensionnelle. Larigiditéde la pectine
est causée principalement par les monomères d'acide D-galacturonique liés par un lien
axial-axial (Burton & Brant, 1983). Les groupements méthoxyles n'ont pas d'effet sur la
flexibilité du polysaccharide, contrairement au rhamnose dont une faible quantité suffit à
l'augmenter. La présence de groupements amidés augmente aussi larigiditédes chaînes de
la pectine (Axelos & Thibault, 1991).

41
jfraw
Homogalacturonan
ë
Rhamnogalacturonan II
qjtf,
Rhamnogalacturonan I
9 Acetyi ester * Methyl ester

• Galacturonic acid (GalA)
• Rhamnose (Rha)
• Apiosîe (Api)
• Fucose(Fuc)
• Aceric acid (AceA)
• Galactose (Gai)
O Arabinose (Ara)
o Xylose(Xyl)
o Glucuronic acid (GicA)
• Deoxylyxo- Ketodeoxymanno-
heptulopyranosyiaric acid (Dha) octulopyranosylonlc acid (KDO)
Figure 2.5. Structure de la pectine. Représentation schématique conventionnelle (A) et

structure alternative (B) (Willats et al, 2006).
42
coo
HO
?&â! COOCH,
\
Methy I esters
COOCH,
/
H,C - c - o ^ — - - \ - ^ |
OH i
o
/ )H
O-acetyl COO"
esters
coor
Figure 2.6. La structure de l'homogalaturonane, le polymère linéaire de résidus 1,4 a-D-

acide galacturonique. Certains des groupements carboxyliques des résidus acide
galacturoniques sont estérifiés avec du méthanol alors que certains autres sont estérifies
avec de l'acétique acide aux carbones C2 et C3 (Ridley et al, 2001).
43
2.3.2.2. Facteurs influençant la structure
2.3.2.2.1. Le pH
La pectine est plus stable à des pH entre 3 et 4. À des pH plus acides, les groupements
méthoxyle et acétyle sont éliminés et les sucres neutres hydrolyses (Schols & Voragen,
2002; Voragen et al, 1995). En fait, pour la PHM, une baisse du pH par adition d'acide
provoque une baisse de la viscosité jusqu'à une zone de pH (2.2 à 2.4) en dessous de
laquelle une baisse subséquente n'a plus d'effet sur la viscosité. Une augmentation du pH
aux environs de 6 par ajout d'hydroxyde de sodium entraîne un maximum de viscosité qui
serait causé par une réaction entre la pectine et la base conduisant à la formation de pectine
hautement ionisée (Kertesz, 1951). Au dessus de pH 4, la chaîne de galacturonane se
dépolymérise par un mécanisme connu sous le nom de P-élimination. Cette réaction
intervient au niveau des liaisons glycosidiques liant le C4 de l'acide glucuronique à son
groupement carboxylique en position C6. La PFM est plus résistante à la dépolymérisation
comparativement à la PHM. Au dessus de pH 8, une déméthylation ainsi que d'autres
changements causés par le milieu très basique apparaissent (Schols & Voragen, 2002).
2.3.2.2.2. Les minéraux
La pectine gélifie sous l'action combinée de divers mécanismes fondamentaux. La
gélification de la PHM est caractéristique des conditions classiques de production de
confiture, à savoir à pH 3, avec 65% de sucres dissous, ceci avec une ionisation des
groupements carboxyliques. Cependant, la gélification de la PFM à pH >3 et à une

• 44
concentration faible en sucre nécessite la présence d'ions métalliques di ou trivalents
(Caând Mg"1"1}. Plus la teneur en acide glucuronique non estérifié de la molécule de PFM
augmente, plus la gélification sera élevée. En présence d'ions divalents, les chaînes d'acide
D-galacturonique s'organisent en deux dimensions présentant des groupements
carboxyliques chargés négativement entre lesquels les ions viennent se loger. Le gel rigide
de pectine LMP ainsi obtenu est le résultat d'interactions entre les groupements carboxyles
libres et les ions (calcium), formant des ponts entre les molécules. Ce modèle est connu
sous le nom de «egg-box» ou boîte d'oeufs (Renard et Thibault, 1993; Schols & Voragen,
2002 ; Walkinshaw & Arnott, 1981). De plus, les pectines PFM peuvent former des gels à
pH <2.5 sous d'autres conditions (Schols & Voragen, 2002).
2.4. Le système isolât de protéines de lactosérum - pectine faiblement méthylée
Des études intéressantes sur les interactions entre la pectine et les protéines du lactosérum
ont été rapportées dans la littérature. L'étude de l'effet de la pectine hautement méthylée
sur les propriétés d'une émulsion (huile dans eau) de tournesol stabilisée par différent types
de caséine (Dickinson et al, 1998) à pH 7.0 ou 5.5 et à force ionique entre 0.01 et 0.2 a
montré qu'en ajoutant de la pectine, les gouttelettes d'émulsion étaient légèrement plus
grosses à bas pH avec une charge nette négative. Cela suggérait que la présence de pectine
à l'interface huile/eau des gouttelettes d'émulsion à pH 5.5 stabilisait l'émulsion.
L'utilisation de pectine dépolymérisée, contenant une quantité (0.7-1%) résiduelle de
protéine (provenant de la même source que la pectine), comme stabilisateur d'émulsion
(huile de colza dans eau) a permis de constater que la protéine et la pectine sont associées à
45
l'interface des gouttelettes d'émulsion et que ce couple joue un excellent rôle de
stabilisateur d'émulsion (Akhtar et al, 2002). Les complexes protéines sériques-pectine ont
été utilisés pour l'encapsulation et la libération du 2-octanone (Burova et al, 1999).
L'encapsulation du 2-octanone a été obtenue avec le complexe sérum albumine bovine
(SAB)-pectine faiblement méthylée à pH 6.4. Les auteurs maintiennent qu'à ce pH, la co-
solubilité des deux polymères est assurée par des liaisons hydrogène alors que les
interactions entre le 2-octanone et la SAB sont représentées par des liaisons hydrogène et
des interactions hydrophobes. La libération du 2-octanone est effectuée grâce à sa capacité
de liaison aux complexes, forte à pH 6.4 et faible à pH 4.3, et au contrôle de la solubilité
des complexes par ajout de SAB à pH 6.4 suivi de la baisse du pH. La dénaturation de la
SAB par la diminution du pH entraîne la formation de nouveaux liens avec la pectine,
libérant ainsi les molécules de 2-octanone faiblement fixées. La combinaison de protéines
sériques avec la pectine sous certaines conditions peut former un gel. Ceci a été démontré
par Beaulieu et al, (2001) qui ont produit un gel d'isolat de protéine de lactosérum/pectine
à pH 6.0 et à 80°C en présence de 10 mM de calcium. Ils ont conclu une formation de gel,
par séparation de phases, dont la fermeté augmentait avec le pourcentage de pectine ainsi
que du calcium ajouté. Cette étude se rapproche du sujet de la présente thèse en ce sens que
les matériaux utilisés pour la formation de la matrice sont en partie les mêmes, à savoir des
protéines de lactosérum et de la pectine faiblement méthylée. De plus, les mélanges formés
à partir de ces matériaux ont été caractérisés dans les deux cas, mais avec des méthodes
différentes. Plusieurs aspects des travaux de Beaulieu et al. (2005) se distinguent de cette
thèse. En effet, ces auteurs ont procédé à la formation de gel à pH 6.0 avec un ajustement
de la force ionique résultant en la formation de ponts entre les différents types de polymère,
46
suivi d'un traitement thermique. Ils ont utilisé aussi des concentrations élevées d'IPL et de
pectine. Les interactions présentes dans la formation de gel sont en général des répulsions
électrostatiques, des interactions hydrophobes et la formation de liens disulfures. La
différence avec cette thèse est que nous formons une matrice composée de complexes
IPL/PFM, et non un gel, à des pH plus acides avec deux modes d'acidification différents
sans ajout de sel, d'où l'absence de ponts entre les polymères. La formation de complexes
IPL/PFM n'a pas nécessité de traitement thermique et les concentrations de polymères
utilisés sont très faibles. Finalement les interactions prévalant dans cette formation de
complexes sont des interactions de faibles forces incluant les attractions électrostatiques et
les liaisons hydrogène. Il est donc important de remarquer que les deux travaux s'inscrivent
dans l'étude des interactions protéines/polysaccharide lors de la formation de matrice
IPL/PFM par séparation de phases associative mais à des pH bien distincts. Ils se
distinguent aussi par les conditions de formation et les méthodes de caractérisation de ces
matrices. De plus dans le cas de cette thèse, les complexes formés ont été utilisés pour
l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles.

47
CHAPITRE 3: Problématique d'ensemble, hypothèse, but,
objectifs
3.1. Problématique d'ensemble
La microencapsulation est une méthode d'encapsulation très intéressante qui permet de
protéger les ingrédients encapsulés contre les facteurs externes et internes d'un aliment et
d'assurer leur stabilité pendant l'entreposage. Ceci est encore plus intéressant pour les
nutriments hydrosolubles sensibles perdus pendant la fabrication des aliments et qui ont
besoin d'être réincorporés dans les aliments lors de l'enrichissement de ceux-ci. La
majorité des études effectuées sur l'encapsulation ont porté surtout sur les ingrédients
liposolubles (Djordjevic, et al, 2004a & 2004b, Jimenez et al, 2004, Jouzel et al, 2003,
Kondo et al, 1996, Lamprecht et al, 2001, Liu et al, 2001, Soottitantawat et al, 2005a &
2005b). Peu d'études se sont penchées sur l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles et
moins sur la stabilité des systèmes d'encapsulation et la libération d'ingrédients encapsulés
dans le système digestif. Les quelques études effectuées sur l'encapsulation d'ingrédients
hydrosolubles ont été faites dans le domaine pharmaceutique (Cannon, 1993; Abra et al,
1984) avec l'utilisation de solvants non-comestibles, interdits dans le domaine alimentaire.
Finalement, les méthodes d'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles à incorporer dans les
aliments acides de type jus de fruits sont quasi inexistantes dans la littérature. Il est donc
important de développer une méthode de microencapsulation d'ingrédients hydrosolubles

48
dans le but d'enrichir ces aliments qui sont souvent entreposés dans des conditions de
température et de luminosité relativement élevées.
Les protéines de lactosérum et la pectine sont des composés naturels retrouvés dans le lait
et les agrumes, respectivement. Ces composés alimentaires sont largement disponibles à
l'état purifié sur le marché, ce qui fait d'eux une source très intéressante de matériaux
nécessaires à la formation de complexes pour l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles
et exempts de restriction gouvernementale. Ce sont des biopolymères chargés qui
permettent de former des complexes sur une large gamme de pH. Ceci est très intéressant
pour l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles polaires ou chargés qui peuvent être
attirés par l'un ou l'autre des polymères pendant la formation de complexes.
Les connaissances actuelles sur la microencapsulation d'ingrédients par des complexes
protéine-polysaccharide ont permis de comprendre certains aspects majeurs des interactions
entre ces polymères. Cependant, aucune étude n'a mis l'accent sur la relation entre les
caractéristiques (tailles et charge des particules) des complexes et les paramètres (pH,
modes d'acidification et ratio protéine: polysaccharide) gouvernant la formation de
complexes.
3.2. Hypothèse
Le complexe isolât de protéine de lactosérum/pectine faiblement méthylée est une matrice
adaptée à un système alimentaire acide qui permet d'encapsuler des ingrédients

49
hydrosolubles tels que la thiamine et les anthocyanes, et de les protéger contre les effets
dommageables du traitement thermique et des conditions d'entreposage. Ce complexe
permet aussi de libérer les ingrédients hydrosolubles dans un système digestif modèle.
3.3. But
Le but de ce projet est de proposer une technique d'encapsulation qui permet de protéger
des composés nutraceutiques hydrosolubles ajoutés aux jus de fruits.
3.4. Objectifs spécifiques
Objectif 1: Étudier les paramètres physico-chimiques (pH, ratio protéine:polysaccharide,
mode d'acidification) permettant la formation de complexes insolubles stables du système
IPL/PFM et établir les conditions optimales d'encapsulation de la thiamine, comme modèle
d'ingrédient hydrosoluble.
Objectif 2: Évaluer l'effet de la concentration sur l'encapsulation de thiamine et
d'anthocyanes par les complexes IPL-PFM et l'effet du ratio IPL:PFM sur l'efficacité
d'encapsulation des anthocyanes.
Objectif 3: Étudier la protection des ingrédients hydrosolubles par les complexes IPL/PFM
contre les effets dommageables du traitement thermique et durant l'entreposage, ainsi que
la stabilité des complexes dans un système digestif modèle, le TNO gastro-Intestinal tract
Model (TIM).
50
CHAPITRE 4:
Formation of native whey protein isolate-low methoxyl pectin
complexes as a matrix for hydro-soluble food ingrédient
entrapment in acidic foods
(Sous presse dans le Journal Food HydrocoUoids)

51
4.1. RÉSUMÉ
L'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et la pectine faiblement méthylée (PFM) peuvent
former des complexes solubles ou insolubles selon le ratio de polymères, du mode
d'acidification du milieu et du pH final. Les solutions d'IPL et de PFM ont été mélangées
afin d'obtenir des ratios protéine:pectine de 2:1, 1:1 et 1:2 à une concentration de polymère
(TPC) de 0.4% (p/p). Un ajustement du pH à 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 a été effectué avant ou
après mélange des solutions. Les complexes IPL/PFM obtenus à partir de ces solutions de
protéine:polysaccharide (P:Ps) à un ratio 2:1 ont été utilisés comme matrice
d'encapsulation de la thiamine. La turbidité, la taille des particules, le potentiel zêta et le
rendement des complexes (portion de complexes obtenus par centrifugation) ont été
évalués. Toutes ces caractéristiques observées ont révélé un effet du pH, du ratio de P:Ps et
du type d'acidification. Les complexes obtenus par acidification du milieu après le mélange
des solutions au ratio de P:Ps 2:1 étaient caractérisés par une plus petite taille qui restait
constante par rapport aux complexes obtenus par acidification des solutions avant leur
mélange. Le pH optimum pour un maximum de turbidité et de rendement de formation de
complexes au ratio 2:1 était aux environs de 3.0 avec les deux types d'acidification. La
diminution du ratio protéine :pectine entraînait un déplacement du maximum de
sédimentation vers les pH acides. La formation de complexes avec une acidification du
milieu avant le mélange des solutions résultait généralement en une plus grande masse de
complexes comparée à l'acidification après le mélange de solutions. L'optimum du contenu
de thiamine des complexes ainsi que celui de l'efficacité d'encapsulation, pour les deux
types d ' acidification était à pH 3.5.

52
4.2. ABSTRACT
Whey protein isolate (WPI) and low methoxyl pectin (LMP) may form soluble or insoluble
complexes depending on polymer ratios, mode of acidification and final pH. WPI and LMP
solutions were blended to obtain proteimpectin ratios of 2:1, 1:1 and 1:2 at a total polymer
concentration (TPC) of 0.4% (w/w) with pH adjustment to 4.0, 3.5, 3.0 2.5 either before or
after blending. WPI-LMP complexes, obtained from the mixing of WPI and LMP solutions
at proteimpolysaccharide (P:Ps) ratio 2:1, were used as thiamine carriers in the process of
thiamine entrapment. Suspension turbidity, particle size, zêta potential, sedimentable-
complexes yield (portion of complexes sedimentable by centrifugation), microscopic
appearance and thiamine content of the complexes as well as thiamine entrapment
efficiency (percent of thiamine entrapped) were evaluated. Ail observed characteristics
were largely dépendent on pH, proteimpectin ratios, and whether acidification was
performed before or after polymers blending (pre and post-blending acidification).
Complex size was constant and lower when acidification was done after mixing the
polymers at a proteimpectin ratio of 2:1 compared to when acidification was done before
the mixing. The optimum pH for maximum turbidity and sedimentable-complexes yield, at
a P:Ps ratio of 2:1, was around 3.0 with both pre and post-blending acidifications. With
decreasing protein :pectin ratio, the maximum sedimentable-complexes yield was shifted
towards acidic pH. Complex formation with pre-blending acidification produced generally
a larger mass of complexes than with post-blending acidification. The optimal thiamine
content of the complexes as well as the optimal entrapment efficiency, with ail acidification
modes, was found at pH 3.5.

53
4.3. INTRODUCTION
Protein and polyelectrolyte associative phase séparation has been actively studied in récent
years. Electrostatic interactions between oppositely charged polymers may lead to the
formation of polymer complexes (Biesheuvel & Stuart, 2004; Burgess, 1990; Kaibara,
Okazaki, Bohidar, & Dubin, 2000; Mattison, Brittain, & Dubin, 1995). This complex
formation is guided by polymer parameters (i.e. charge density, molar mass, concentration,
chemical nature and ratio) and by environmental conditions such as pH, ionic strength, and
ion type (Weinbreck, de Vries, Schrooyen, & de Kruif, 2003; Wen & Dubin, 1997).
External parameters such as température, shearing effect and pressure may affect the
formation and the stability of the complexes (Galazka, Ledward, Sumner, & Dickinson,
1997; Galazka, Smith & Ledward, 1999a; Galazka, Smith, Ledward, & Dickinson, 1999b;
Schmitt, Sanchez, Desobry-Banon, & Hardy, 1998). Complex formation may also be
influenced by intrinsic behaviours such as protein aggregation (Schmitt, 2000; Schmitt,
Sanchez, Despond, Renard, Thomas, & Hardy, 2000; Schmitt, Sanchez, Thomas, & Hardy,
1999). Complexes resulting from electrostatic interactions between a protein and an anionic
polysaccharide may be soluble or insoluble depending on environmental conditions and
they may concentrate, thus forming two solvent layers, one containing most of the polymer
complexes and the other relatively free of complex (Weinbreck et al., 2003). Interactions
between the two oppositely charged polymers, as the pH was lowered, hâve revealed a
séquence of events. First, soluble intrapolymer complexes, resulting from attractions
between protein and anionic polysaccharide molécules, are initiated at a spécifie pH called
54
complexation pH (pHc) (Girard, Sanchez, Laneuville, Turgeon, & Gauthier, 2004;
Weinbreck et al, 2003). As intrapolymer complexes become sufficiently neutralized, they
aggregate and form interpolymer complexes at a pH called pH,), where visual séparation can
be observed (Weinbreck et al, 2003). The same séquence of event could occur with a
protein and a cationic polysaccharide as the pH is increased (Kaibara et al., 2000; Mattison
et al, 1995; Mattison, Dubin, & Brittain, 1998; Wang, Gao, & Dubin, 1996; Wen & Dubin,
1997). Thèse critical pH boundaries may be shifted towards lower values by increasing the
ionic strength in the case of the System whey proteins/anionic Ps Systems (Weinbreck,
Nieuwenhuijse, Robijn, & de Kruif, 2004). Moreover, the addition of high concentrations
of sait may reduce or suppress complex formation (Bungenberg de Jong, 1949; Burgess,
1994; de Kruif, Weinbreck, & de Vries, 2004).
Numerous studies hâve focused on individual complex characteristics such as particle size,
charge, and parameters such as the pH, affecting protein/polyelectrolyte complex formation
(Kaibara et al, 2000; Mishra, Mann, Joshi, 2001; Savant, & Torres, 2000) and hâve thus
shed light on major aspects of the interactions between proteins and polysaccharides.
However, none hâve focused on the effects of différent acidification procédures on the
characteristics of whey protein isolate -low methyl pectin (WPI-LMP) complexes. WPI
contains a mixture of proteins. pMactoglobulin, its major component, is widely used in the
food industry in regard to its binding (Kontopidis, Holt, & Sawyer, 2002, 2004),
emulsifying (Léman, Dolgan, Smoczynski, & Dziuba, 2005), foaming (Bals & Kulozik,
2003), and gelling (Kerstens, Murray, & Dickinsbn, 2005) properties. Pectin is a
polysaccharide associated with the cell wall and intercellular régions of plants and fruits
55
(Schols & Voragen, 2002; Voragen, Pilnik, Thibault, Axelos, & Renard, 1995).
Commercial low methoxyl pectins are anionic polysaccharides with D-galacturonic acid
units, obtained from de-esterification of high methoxyl pectin (Robin, 2002). The degree of
esterification (ratio of esterified galacturonic acid groups to total galacturonic acid groups)
divides commercial pectin into high ester (HM) and low ester (LM). Pectin is widely used
as a gelling and stabilizing agent in foods. Water-soluble ingrédient encapsulation can be
achieved by différent means such as spray-chilling, spray-cooling, spray-drying, fluidized-
bed coating (Schrooyen, van der Meer, & De Kruif, 2001) but most of water-soluble
microencapsulation hâve been using several methods including coacervation (Huang,
Chung, & Tzeng, 1997), adsorption on microspheres (Lucinda-Sylva & Evangelista, 2003),
liposomes (Banville, Vuillemard, & Lacroix, 2000; Nii & Nishii, 2005), emulsion (Huang,
Chung, & Tzeng, 1997), and solvent evaporation (Huang, Chung, & Tzeng, 1997; Xu, Fu,
Hu, Duan, & Zhang, 2006).
In the présent study, the development of WPI-LMP complexes as a matrix for hydro-
soluble ingrédient entrapment in acidic média was investigated. Turbidity and différent
factors affecting the complex formation (particle size, sedimentable-complexes yield, and
charge) were measured as a function of pH decrease before (pre-blending) and after (post-
blending) mixing the polymer solutions. Thiamine was added during the complex
formation to evaluate the entrapment ability of the complexes. Thiamine hydrochloride is
stable at acidic pH and is a water-soluble vitamin which structure consists of a pyrimidine
ring and a thiazole ring (pka = 2.44) connected by one carbon link. The nitrogen in the
thiazole ring has a positive charge. Thus, thiamine was chosen as a model ingrédient to
evaluate entrapment by WPI-LMP complexes at acidic pH.

56
4.4. MATERIALS AND METHODS
4.4.1. Materials
The major protein content of BiPRO® whey protein isolate (Davisco Foods International
Inc., Le Sueur, MN, USA), was as follow: 64.47% pMactoglobulin, 23.02% a-lactalbumine,
2.36% Bovine Sérum Albumin, and 2.67% Immune Globulin G, total protein 91%). Low
methyl pectin (36% esterified, molar mass of 100 kDa) was kindly donated by CP Kelco
(Copenhagen, Denmark) while thiamine hydrochloride (molar mass of 337.27 g/mol) was
purchased from Sigma (St-Louis, MO, USA). Even though low methoxyl pectin samples
were from différent lots, variations due to that différence were not observed in the results
during the project.
4.4.2. Reagents
Dioctylsulfosuccinate sodium sait, formic acid (99%), potassium hydroxide, and
trichloroacetic acid (TCA) were purchased from Fisher scientific (Nepean, ON, CA),
HPLC-grade methanol was purchased from VWR international (West Chester, PA, USA).
4.4.3. Préparation of solutions
A protein solution free of insoluble particles and denatured proteins was obtained by
stirring a suspension of WPI (10% w/v) in HPLC-grade deionised water for two hours,
letting it stand at 4°C overnight, adjusting the pH to 5.0 (at which denatured proteins are
insoluble) with hydrochloric acid, and centriruging at 25 000 g for 40 min (Sorvall
57
Instruments RC5C, Du Pont Company, CT, USA). The pellet was discarded and the
supernatant was lyophilized. The protein content of the supernatant (90%), very close to the
measured protein content (91%) of the original WPI powder, was determined by an FP-528
Nitrogen/Protein determinator (Leco Co., St. Joseph, MI, USA). Both measurements were
performed on a dry basis. Stock solutions of 2% (w/v) WPI and 2% (w/v) LMP were
prepared by dispersing the lyophilized WPI powder and pectin powder in HPLC-grade
deionised water and stirring at ambient température for two hours. Heating at 80°C for 10
min prior to stirring was required for LMP for better solubilisation. The WPI and LMP
solutions were then stored at 4°C overnight to complète the hydration until use.
4.4.4. Complex formation and thiamine entrapment
The literature reports that increasing the TPC (0.05 to 0.15%) increased the complex
formation yield (Singh & Burgess, 1989). Schmitt, (2000) also reported that p-
lactoglobilin-acacia gum complex sizes increased up to 200um with the increase of the
TPC up to 1% at pH 4.2. Based on thèse works, preliminary trials on complex formation
were performed at WPLLMP ratio 2:1 with 2.0% (w/w) TPC at pH 3.0 and resulted in
higher particle sizes over 500|j.m (not shown). Furthermore, turbidity measurement of
WPI/LMP suspension (0.4, and 0.8% TPC (w/w) at ratios 2:1, 1:1, and 1:2 suggested that
complexation was maximum at pH 3.5 only with 0.4% TPC at ratio 2:1 while other ratios
and TPC indicated maximum complexation below pH 3.5. Considering literature reports
and preliminary trials, WPLLMP at 0.4% TPC (w/w) was chosen for complex formation at
acidic pH. For complexation by post-blending acidification, WPI and LMP stock solutions
were initially diluted to concentrations corresponding to WPLLMP ratios of 2:1, 1:1, and
58
1:2 for a TPC of 0.4%. The diluted WPI and LMP solutions were adjusted to pH 7.0, mixed
at the predetermined ratios and the pH of the mixture (pH 7.0) was brought gradually to
4.0, 3.5, 3.0 and 2.5 by addition of HCl (0.5N) with gentle magnetic stirring for 3 min at
each pH before decreasing it to the next pH. For complexation by pre-blending
acidification, diluted WPI and LMP solutions were individually acidified to pH 4.0, 3.5,
3.0, and 2.5 by addition of HCl (0.5N) after they were set to pH 7.0, then mixed at ratios of
2:1, 1:1 and 1:2 and gently stirred for 3 min. For each ratio, pH, and mode of acidification,
WPI-LMP complex formation was monitored by measuring solution turbidity, zêta
potential, complex size and sedimentable-complexes yield as well as by microscopic
observation. Thiamine entrapment was done by combining (0.4% w/w) thiamine solution
and LMP solution followed by adding WPI solution at a P:Ps ratio of 2:1 to give a final
suspension containing 0.27%WPI, 0.13% LMP and 0.1% thiamine. A 30g portion of this
solution was centrifuged (8000 g/30 min at 22°C) and the pellet was freeze-dried.
4.4.5. Turbidity measurement
Turbidity measurements (nephelometry) were done using a Laboratory Turbidimeter
(Nephelometer) 2100AN IS (Hach Company, Loveland, CO. USA) with 30ml samples of
complex suspension (mixed solutions). For each measurement, a sample cell (a 30 ml glass
tube) filled with a 30ml sample was placed in the cell compartment. A light emitting diode
source emits an infrared light (870 nm) through a sample cell path (2.5cm) to two scatter
detectors, a 90° detector, and a transmitted light detector. The resuit was displayed in
Nephelometric Turbidity Units (NTU).

59
4.4.6. Zêta potential measurement
The zêta potential or particle surface electrical potential at the liquid shear plane of the
complexes was measured using a Zetasizer 2000 (Malvern Instrument Ltd., Malvern,
Worcestershire, UK) with 10ml samples. Samples at WPLLMP ratio 1:1 at pH 3.0 and 2.5
required a two fold dilution in HPLC-quality water at the same pH. The zêta potential is
calculated from the electrophoretic mobility of the charged particles.
4.4.7. Complex particle size
Complex particle size was determined using a Mastersizer 2000S (Malvern Instruments
Ltd., Malvern, Worcestershire, UK) equipped with a 632.8 nm He-Ne laser source and a
measuring cell path length of 2.4mm. For each measurement, 150 ml samples were stirred
by the dispersion unit at 980 rpm and at a spécifie pH. This System measures particle sizes
(D[4,3]) ranging from 0.02 to 2000um.
4.4.8. Sedimentable-complexes yield
After 3 min stirring of WPI-LMP mixtures at a spécifie pH, 30g sample were centrifuged at
8,000 g for 30 min and the pellets were freeze dried. The dry pellets were kept at -18°C
until use. The sedimentable-complexes yield, or percent précipitation of the polymers in
complex formation, was calculated as foliows:

60
Sedimentable - complexes yield = — x 100

Weight of total polymers in 30 g of mixture
4.4.9. Microscopic observation
Complexes were observed with a phase contrast microscope (BX51TRF model, Olympus
Optical Co LTD., Melville, NY, USA) equipped with a caméra (Photometrics CoolSNAP
fx, Image Processing Solutions Inc., North Reading, MA, USA).
4.4.10. Détermination of thiamine
Complex-entrapped thiamine was determined by HPLC (Woollard & Indyk, 2002). A
freeze-dried pellet was suspended in 0.6M trichloroacetic acid (TCA) solution in order to
drop the pH to 1.0 and release thiamine as WPI-LMP complexes dissociate at this pH value
(the positive charge of WPI molécules and the neutral charge of LMP molécules prevented
their binding to thiamine molécules). The suspension was stirred for 1 hour andfîlteredon
0.2 um nylon membrane (Millipore Inc., Billerica, MA USA) to a final volume of 30 ml
with 0.6M TCA. A 2 ml portion of filtrate was centrifuged at 16 000 x g for 10 min
(Micromax model, International Equipment Company, MA USA) to obtain samples for
injection into the HPLC column. A HPLC model 126 (Beckman instruments Inc.,
Fullerton, CA, USA), equipped with LiChrospher 100 RP-18 column (250 x 4mm, 5.0 um)
and a LiChrospher 100 RP-18 Guard column (4.0 x 4 mm, 5 um) (Agilent Technologies
Inc., Mississauga, ON, CA) was used for thiamine quantification. An isocratic mobile
phase (1 g of dioctylsulfosuccinate sodium sait, 550 ml methanol, 10 ml formic acid, at pH
4.4) at a flow rate of 1 ml/min was used. Samples (40 ul) were injected by an autosampler
séries 1100 (HP, Mississauga, ON, Canada). Thiamine was detected by UV detector model
61
166 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA) at 254 nm and compared to an
external standard. The thiamine content of the complexes was calculated as follows:
_. » ■ Weightof thiamine in dry pellet 1 A n

Thiamine content of the complexes = — — x 100
Weight of dry pellet
The entrapment effïciency was calculated as follows:
™. Thiamine content in 30 g ofdissolved dry pellet ...

Entrapment effïciency= — x 100
Thiamine content in 3 0 g of initial complex suspension
4.4.11. Statistical analysis
Statistical analyses were performed with the SAS system (SAS Institute Inc. Cary, NC,
USA) as 3 (ratios) x 4 (pH) factorial experiments. The repeated measures ANOVA design
was adjusted to the post-blending acidification data with a three-level treatment (ratios 2:1,
1:1, and 1:2) and a four-level pH sub-treatment (pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5). Pre-blending
acidification data were analyzed as a randomized complète block design by ANOVA with
three treatments (ratios 2:1, 1:1, and 1:2) and four samplings (pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5).
Control data for size measurement were analyzed using the t Tests (LSD). Ail experiments
were performed in triplicates.

62
4.5. RESULTS
4.5.1. Turbidity measurement
The turbidity of WPI-LMP complex suspensions is presented in Figure 4.1. At each pH,
the turbidity decreased significantly (P<0.0001) with the decrease of the ratio, except at pH
2.5 for pre-blending acidification. In addition, at a given ratio the turbidity increased at pH
4.0 through pH 3.0 followed by a decrease at pH 2.5. However, the decrease in the turbidity
was not observed for ratios 1:1 and 1:2 in the post-blending acidification. Complexes
obtained by pre-blending acidification were generally more turbid than those obtained by
post-blending acidification.
4.5.2. Small angle static light scattering
Particles sizes in the control solutions (0.27% WPI solution and 0.13% LMP solution) were
lower than those of WPI-LMP complexes at ail pH studied. Indeed, particle size in 0.27%
WPI solution increased from 6.96 to 21.80um with the acidification (pH 4.0 to 2.5) while in
the case of 0.13% LMP solution, the particle size varied from 1.70 to 1.36 \im with the
acidification (Table 4.1). The size of complexes formed by post-blending acidification
increased significantly (p = 0.0096) as the P:Ps ratio decreased (Fig. 4.2). No such
behaviour was observed with the pre-blending acidification. However, complex size was
generally bigger for pre-blending acidification at ail three ratios compared to post-blending
acidification except at pH 4.0. For each ratio, pre-blending acidification resulted in a
significant increase (P - 0.0246) in complex sizes as the pH decreased while the size stayed
generally constant (P = 0.3781) with post-blending acidification.

63
4.5.3. Zêta potential
WPI solution (0.27%) was positively charged over the pH range studied, with zêta potential
values ranging from 17 to 32 mV (not shown). The zêta potential of both pectin solution
(0.13%) and WPI-LMP complex suspensions was négative but it decreased in magnitude
with the decrease of the pH (Fig. 4.3). In contrast, post and pre-blending acidifications of
WPI-LMP suspensions at ratios 2:1 and 1:1 resulted in small positive zêta potential values
at pH < 3.0. The effect of dilution at P:Ps ratio 1:1 (pH 3.0 and 2.5) slightly increased the
zêta potential values by approximatively 5 mV (not shown).
4.5.4. Sedimentable-complexes yield
In both post and pre-blending acidification modes, the sedimentable-complexes yield
increased (P < 0.0001) to a maximum at pH 2.5 for WPI:LMP ratios 1:1 and 1:2 (Fig. 4.4).
With WPI:LMP ratio 2:1, the sedimentable-complexes yield was highest at pH 3.5-3.0 and
decreased at pH 2.5. The maximum sédimentation shifted to more acidic pH with the
decrease of the P:Ps ratio.
4.5.5. Microscopic observation
Microscopic observation revealed that the structure of the complexes became more
compact as the pH of the mixture decreased in both complexation modes (Fig. 4.5).
64
Complexes obtained by post-blending acidification seemed more condensed. Also, the
visual cohésion of the complexes weakened with decreasing P:Ps ratio (not shown).
4.5.6. Thiamine entrapment
Thiamine content of WPI-LMP complexes and thiamine entrapment efficiency, at ratio 2:1
and with 0.1% added thiamine, are presented in Figure 4.6 and 4.7, respectively. Post-
blending acidification resulted in a decrease of the thiamine content of the complexes with
the decrease of the pH, while pre-blending acidification showed no spécifie pattern as a
function of pH. Maximum thiamine content of the complexes occurred at pH 4.0 for post-
blending acidification (2.2%) and at pH 3.5 for pre-blending acidification (1.9%). However,
the thiamine content of the complexes in pre-blending mode was higher (p< 0.0001) than
that of the post-blending mode from pH 3.5 to 2.5. The entrapment efficiency (Fig. 4.7)
showed an increase of the entrapment followed by a decrease, in both modes of
acidification. Maximum entrapment efficiency was found at pH 3.5 for pre-blending
acidification (6.99%) and at pH 3.5-3.0 for post-blending acidification (~4.50%).
Moreover, the entrapment efficiency in the pre-blended mode was higher than the
entrapment efficiency in the post-blended mode at ail pH studied.

65
4.6. DISCUSSION
This study has demonstrated that parameters such as pH, proteinrpectin ratio, and the
method of acidification hâve considérable influence on WPI-LMP complexes
characteristics. Thèse parameters had also a major impact on thiamine entrapment.
4.6.1. EffectofpH
At pH < 4.0, attractive interactions between oppositely charged WPI and LMP resulted in
complex formation characterized by various patterns of changes in turbidity (Fig. 4.1),
particle size (Fig. 4.2), and sedimentable-complexes yield (Fig. 4.4) as well as in decreasing
complex zêta potential (Fig. 4.3). In fact, the pH range of 4.0 to 2.5 corresponds to a zone
where insoluble interpolymer complexes form and phases separate (Girard et al., 2004).
Similar work with différent polymers (whey protein-gum arabic) suggested insoluble
complex formation at pH < 4.8 (Weinbreck et al, 2003). The decrease of the pH of the
WPI/LMP mixture increased the electrostatic attractions between the oppositely charged
polymers, allowing maximum complexation at a spécifie pH (pH 3.0 for WPI.LMP ratios
2:1 and pH 2.5 for WPLLMP ratios 1:1, and 1:2). At pH 3.0, maximum turbidity was
related to maximum sedimentable-complexes yield at P:Ps ratio of 2:1 (Fig. 4.1 & 4.4). The
decrease of the sedimentable-complexes yield at pH 2.5 with WPLLMP ratio 2:1 probably
results from the loss of charge on the pectin molécules, since this pH is below the pKa
(-3.4) of their carboxylic groups (Evageliou, Richardson, & Morris, 2000; Ralet, Dronnet,
Buchholt, & Thibault, 2001).

66
4.6.2. Effect of protein:pectin ratio
It is well known that the number of protein molécules available per pectin chain is
important in electrostatic complex formation (Girard, Turgeon, & Gauthier, 2003). For a
given P:Ps ratio, there is a spécifie pH at which electroneutrality of the complexes is
reached (Schmitt, 2000). This pH is defined as the electrical équivalence (EEQ) and
corresponds to the pH at which macromolecules carry equal and opposite charges, leading
to optimal complexation (Burgess, 1994). At our highest WPI-LMP ratio (2:1), neutrality of
WPI-LMP complexes was reached between pH 3.5 and 3.0 (Fig. 4.3), corresponding to
maximal turbidity (Fig. 4.1) and maximal sedimentable-complexes yield (Fig. 4.4). At pH
2.5, complex formation at ratio 1:1 was maximal and the zetapotential neared neutrality
(Fig. 4.3), while complexes of ratio 1:2 were still negatively charged, like pectin alone.
Thèse observations indicated that at a ratio of 1:2, neither EEQ nor maximum complexation
was reached. At that ratio, complexes had a négative zêta potential and after 3 minutes of
stirring, the complex formation was still incomplète. Decreasing the proteimpectin ratio
shifted the complexation maximum towards acidic pH. Indeed, since WPI content
decreased with the decrease of WPLLMP ratio, higher acidification may be required for
WPI molécules to neutralize LMP molécules. Furthermore, the size of the post-blending
acidification complexes appeared constant (P = 0.3781) at a ratio of 2:1 (Fig. 4.2A). This
size constancy may be the resuit of a better structured complex networks generated by the
post-blending acidification, due to enhanced display of positive groups by WPI molécules,
and hence binding to LMP molécules with greater strength. This may also explain the
compact structure observed on the micrographs (Fig. 4.5 Al-A4). In contrast, complexes
67
formed by pre-blending acidification increased in size as the pH decreased, suggesting that
there was insufficient time for WPI and LMP molécules to set sélective electrostatic
interactions (aggregation of intrapolymer complexes), resulting in less compact but more
turbid and bigger complex sizes. This behaviour is corroborated by the fibre-like structure
on the pre-blending complex micrographs (Fig. 4.5 B1-B4).
4.6.3. Effect of acidification mode
Pre-blending acidification generally provided WPI-LMP complexes with greater turbidity,
size, and zêta potential than did post-blending acidification. However, the size constancy in
the post-blend System may resuit from the graduai acidification which allowed more time
for complexes to rearrange in a compact structure. In contrast, no time was allowed to the
pre-blend System to rearrange as the complex formation was spontaneous at the mixing of
the polymer solutions. The effect of the method of complex formation was also
considérable on the sedimentable-complexes yield which appears to be inversely related to
the zêta potential of the complexes. Indeed, as the charge neared zéro, the sedimentable-
complexes yield reached its maximum value. Pre-blending acidification produced a larger
mass of complexes than did post-blending acidification (Fig. 4.4) at ratios of 2:1 (pH 4.0
and 3.5), 1:1 and 1:2 (pH 4.0 and 3.0), possibly by physically entrapping extra protein
molécules in the complex network during the quick mixing of WPI and LMP solutions.
Moreover, the highest proteimpectin ratio (2:1) in post-blending acidification mode
produced the smallest complex size at ail pH (Fig. 4.2A) which corroborâtes previous
works (Sanchez & Renard, 2002; Tiyaboonchai, Woiszwillo, & Middaugh, 2001). Possibly,
68
P:Ps ratios with lower proportions of protein form less compact complex networks
resembling the pre-blending-acidifïed fibrous complex networks with bigger complexes.
However, the gain of bigger complex sizes at pH 4.0 obtained by post-blending
acidification may be due to electrostatic attractions between WPI and LMP having already
initiated at pH 6.1, (pHc) (Girard, Turgeon, & Gauthier, 2002) during lowering of the pH
from 7.0, thus allowing an extra complex formation by the time the pH reached 4.0. With
both acidification modes at WPI:LMP ratio 2:1, more than 88% of the total polymer was
involved in complexation at pH 3.0 compared to about 76% polymer at pH 2.5.
4.6.4. Ability of the complexes to entrap thiamine
The observed effects of pH, protein:pectin ratio, and method of acidification on the
characteristics of the complexes suggested that post-blending acidification at a WPI-LMP
ratio of 2:1 provided small and constant complex size along with the greatest sedimentable-
complexes yield for thiamine entrapment at pH 3.0. This ratio should prevent précipitation
of larger complexes in a liquid food. Furthermore, the increased sedimentable-complexes
yield obtained with both types of acidification at pH 3.5 and 3.0 was compatible with the
maximal thiamine content of the complexes (Fig. 4.6) and the maximal entrapment
efficiency (Fig. 4.7) at pH 3.5. Indeed, much of the complexes formed at pH 3.5 were still
negatively charged, favouring the binding of positively charged thiamine molécules during
entrapment, while at pH 3.0 the complexes were positively charged. The slight extra
entrapment efficiency obtained with post-blending acidification at pH 3.0 (WPI:LMP ratio
2:1) compared to that at pH 3.5 may be associated with greater sedimentable-complexes
yield at the same pH and ratio (Fig. 4.4A). The relationship between the sedimentable-
69
complexes yield and thiamine entrapment suggested that the maximum entrapment of an
ingrédient within WPI-LMP complexes dépends on the combination of the amount of
complexes formed and their charge, and the charge of the ingrédient. On the other hand, the
decrease of the thiamine content of the complexes as pH decreased in the case of post-
blending acidification may be due to the decrease in négative charge of LMP as the pH is
lowered. Another reason may be the compétition between WPI and thiamine molécules in
binding to the decreasing-negative charged LMP. The higher thiamine content of the
complexes (pH 3.5-2.5, Fig. 4.6) and the higher entrapment efficiency (pH 4.0-2.5, Fig.
4.7) at ratio 2:1 obtained by complexing polymers after pre-blending acidification,
compared to post-blending acidification, may be related to extra physical entrapment.
Indeed, higher entropy generated by the quick mixing in the pre-blended system may hâve
helped the gathering of thiamine molécules and complexes. At pH 3.5 (in both methods of
acidification), the thiamine content of the complexes obtained, allows fulfilling the
Recommended Daily Allowance (Report of the Standing Committee on the Scientific
Evaluation of Dietary Référence Intakes and its Panel on Folate, Other B Vitamins, and
Choline and Subcommittee on Upper Référence Levels of Nutrients, Food and Nutrition
Board, Institute of Medicine, 1998; Health Canada, 2007) of the vitamin for an adult maie
(1.2 mg), with 70-80 mg of the dry complexes.

70
4.7. CONCLUSION
Our results indicate that complex formation by electrostatic interaction between whey
protein isolate and low methyl pectin is highly dépendent on the pH of the médium, the
proteimpectin ratio and the method of acidification. A pH of 3.5-3.0 was optimal for
maximum complex formation by both pre and post-blending acidifications at a ratio of 2:1.
Among the P:Ps ratios studied, complexes obtained at a ratio of 2:1 using post-blending
acidification were characterized by a constant and smaller particle size with a greater
amount of sedimentable-complexes formed, compared to bigger complexes found in the
case of pre-blending acidification. The characteristics associated with post-blending
acidification at a P:Ps ratio of 2:1 provided the best structure for thiamine entrapment.
Although thiamine entrapment with both pre and post-blend Systems indicated optimum
entrapment at pH 3.5, which is appropriate for acidic foods, post-blending acidification
may be preferred for hydro-soluble ingrédients, considering the structural advantages of the
resulting complexes. Maximum entrapment efficiency was approximatively 7% for pre-
blending acidification and 4.5% for post-blending acidification, respectively, at pH 3.5. A
relatively small amount of dry complexes would be needed to satisfy the Recommended
Daily Allowance of thiamine. Studies of the effect of vitamin concentration on thiamine
content of the complexes and the protective effect of the complexes on the entrapped-
vitamin are under investigation in our laboratory.

71
Table 4. 1. Least square means (SE, N = 9) of the particle size of the control solutions
(0.27% WPI and 0.13% LMP solutions)
pH 0.27% WPI 0.13% LMP

4.00 6.96d 1.70a
(0.25) (0.18)
3.50 15.42c 1.48b
(1.95) (0.09)
3.00 18.99b 1.38b
(2.03) (0.12)
2.50 21.80 1.36b
(1.32) (0.10)
abcd: means within a column lacking a common letter differ (Po0.05).
WPI: whey protein isolate.
LMP: low methoxyl pectin.
72
2500
2000
a
w 1500
| 1000
3
H
500
i
0 — 1
2500- B
2000-
w 1500 H
-S
| îooo H
500-1
0
lI
"r:
.1
4 3 5 3 2 5
» pH »
Figure 4.1. Turbidity (least squares means of NTU) of WPI-LMP complexes at 0.4% total
polymer and ratios of 2:1 (El), 1:1 (E2) and 1:2 (D): A) Post-blending acidification and B)
Pre-blending acidification. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
73
350-i
300-
250-
| 200-
ii
J 150-
§
mr> 11
i ■
100-
50-
0- i
B
350-
300-
250
| 200-!
r I
.§ 150i *Ê %
w
100
Y/ 1
50 H
Â
0
rWH
4 3,5 PH 3 I
2,5
Figure 4.2. Size (least squares means of um) of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer
and ratios of 2:1 (El), 1:1 (0) and 1:2 (D): A) Post-blending acidification and B) Pre-
blending acidification. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
74
3,5 2,5
10 n pH
1^
0
H
a -10
-20 I î
I
-30
!
-40-
N
-50-
-60-
10 t
B
0 r* ♦i
♦-
II
♦<
♦<
a-io ♦<
♦<
♦<
♦<
♦ ♦•
♦•
20-
1 ♦•
c
1 -30 i lll
a
| -40
SI -50-
-60-
Figure 4.3. Zêta potential (least squares means of mV) of 0.13% LMP (H) and WPI-LMP
complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1 (E3), 1:1 (E2) and 1:2 (□): A) Post-blending
acidification and B) Pre-blending acidification. Vertical bars represent standard errors of
the mean (N = 6).
75
Figure 4.4. Sedimentable-complexes yield (least squares means of % of polymer in

centrifugal pellet) of WPI-LMP complexes at 0.4% total polymer and ratios of 2:1 (H), 1:1
(0) and 1:2 (D): A) Post-blending acidification and B) Pre-blending acidification. Vertical
bars represent standard errors of the mean (N = 6).
76
^M^RnÊÊfàSmmffl&ÊÊS&ÊBmSBm ■ ''^mSmFmxmm^m WÊSSmSmÊl^m^^^^m^wm^m fl^M&^^s^^l^l
Figure 4.5. Phase contrast micrographs of WPI-LMP complexes dispersion (0.4% total
polymer content) obtained by post-blending acidification (A) and by pre-blending
acidification (B), with a proteimpectin ratio of 2:1. Numbers 1-4 refer tofinalpH values of
4.0, 3.5, 3.0, and 2.5, respectively. The scale bars represent 100 um.
77
£ 2,0-
.9 1,0
S
4 3,5 2,5
pH
Figure 4.6. Thiamine content of the complexes (least squares means of % of thiamine in
centrifugal pellet) of WPI-LMP complexes obtained at ratio 2:1 by post-blending
acidification (S) and pre-blending acidification (D). Vertical bars represent standard errors
of the mean (N = 6).
78
3,5 2,5
pH
Figure 4.7. Entrapment efficiency (least squares means of % of thiamine in suspended

centrifugal pellet) of WPI-LMP complexes at ratio 2:1 obtained by post-blending
acidification QM) and pre-blending acidification (□). Vertical bars represent standard errors
ofthemean(N = 6).
79
CHAPITRE 5
Evaluation of the ability of whey protein isolate-low methoxyl
pectin complexes to entrap water-soluble ingrédients
Sera soumis pour publication dans le journal Food HydrocoUoids

80
5.1. RÉSUMÉ
L'encapsulation de thiamine et d'anthocyanes a été effectuée en utilisant les complexes
isolât de protéines de lactosérum (IPL)/pectine faiblement méthylée (PFM). Différentes
solutions de PFM contenant de la thiamine et des anthocyanes ont été ajoutées à des
solutions d'IPL pour obtenir des mélanges IPL/PFM contenant 0, 0.002, 0.01, 0.05 et 0.1%
de thiamine et 0.1, 0.2 et 0.3% d'anthocyanes avec un ratio P:Ps de 2:1 (0.4% de polymères
totaux). Séparément, des mélanges d'IPL/PFM contenant 0.025% p/p d'anthocyanes ont été
préparés aux ratios P:Ps de 2:1 et 1:1. Les mélanges contenant de la thiamine ont été ajustés
à pH 4.0, 3.5, 3.0 et 2.5 (chapitre 4, section 4.4.4.). Les complexes ont été séparés par
centrifugation. La thiamine et les anthocyanes ont été extraits et quantifiés par HPLC et par
spectrophotométrie, respectivement. L'effet de la concentration des ingrédients sur
l'efficacité d'encapsulation et le rendement en complexes (thiamine) a été évalué. Par
ailleurs, l'encapsulation des anthocyanes à différents ratio P:Ps a aussi été évaluée.
L'addition de thiamine n'a pas affecté le rendement en complexes excepté une chute à pH
3.5 qui semblait exprimer une saturation des complexes par des hautes concentrations de
thiamine. Le contenu de thiamine des complexes augmentait avec l'ajout de thiamine alors
que le maximum de l'efficacité d'encapsulation se trouvait à pH 3.5, dans les deux types
d'acidification. Le maximum d'encapsulation des anthocyanes a été obtenu avec le ratio
P:Ps de 2:1 comparé au ratio 1:1. De plus, l'efficacité d'encapsulation des anthocyanes
augmentait linéairement avec l'augmentation de la concentration en anthocyanes. Le
système IPL/PFM représente donc un moyen efficace d'encapsulation d'ingrédients
hydrosolubles en milieu acide.

81
5.2. ABSTRACT
Thiamine and anthocyanins were entrapped using whey protein isolate (WPI)-low methoxyl
pectin (LMP) complexes. LMP solutions containing 0, 0.004, 0.02, 0.1, and 0.2% (w/w) of
thiamine and 0.2, 0.4, and 0.6% (w/w) of anthocyanins were added to WPI solutions to
obtain WPI-LMP mixtures containing 0.002, 0.01, 0.05, and 0.1% thiamine, and 0.1, 0.2,
and 0.3% anthocyanins, respectively, with a protein:polysaccharide (P:Ps) ratio of 2:1.
Separately, WPI-LMP mixtures with 0.025% w/w anthocyanins were prepared at P:Ps
ratios of 2:1 and 1:1. Ail mixtures had 0.4% total polymer. Mixtures containing thiamine
were acidified to pH 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5 before and after blending the polymer solutions.
Complexes were obtained by centrifugation. Thiamine and anthocyanins were extracted
from the pellets and quantified by HPLC and UV-spectrophotometry, respectively. The
effect of ingrédients concentrations on their entrapment efficiency, and the sedimentable
complexes yield (thiamine), were evaluated. Anthocyanins entrapment with différent P:Ps
ratios was also investigated. Thiamine addition did not affect the sedimentable-complexes
yield except a drop at pH 3.5 which may express complex saturation by high concentrations
of thiamine. Thiamine content of the complexes increased with the increase of added
thiamine in both modes of acidification while the entrapment efficiency culminated at pH
3.5. Anthocyanins entrapment was higher with P:Ps ratio 2:1 compared to ratio 1:1.
Anthocyanins entrapment efficiency increased linearly with anthocyanins concentration.
This system represents an efficient means for water-soluble ingrédients entrapment in
acidic médium.
82
5.3. INTRODUCTION
Food enrichment has become an interesting way of replenishing food products with
essential nutrients lost during their processing (Sinclair, 1979) and it represents an excellent
mode of preventing diseases caused by the lack of thèse nutrients (Abrams & Atkinson,
2003; Dunn, 2003). However, many enriched food products suffer oxidation damages and
dégradations of added nutrients during storage. One way to prevent thèse damages may be
the use of microencapsulation in the food enrichment process. Microencapsulation may be
thought of as a process of forming a continuous layer around a small core ingrédient (Luzzi,
1970; Young, Sarda, & Rosenberg, 1993) which may be solid particles, liquid droplets, gas,
or microbial cells (Ouyang et al, 2004). Thus, microencapsulation may protect sensitive
nutrients from inner environmental damages (light, oxygen, food particles interactions) and
it provides not only stability to the encapsulated ingrédients but promûtes manipulation and
easy control of the released ingrédients in the targeted System (Versic, 1988). Although
various microencapsulation methods are used in the food industry, the application of each
one dépends on the purpose of the method. Microencapsulation could be separated in two
methods. Physical methods regroup spray-drying, air suspension coating, extrusion, spray-
chilling, and inclusion processes. Chemical methods are represented by phase séparation
methods and emulsions (Dziezak, 1988; Versic, 1988; Yuliani, Bhandari, Rutgers, &
D'Arcy, 2004).
Phase séparation is the process by which a single solid or liquid phase séparâtes into two or
more new phases (IUPAC, 1997). Moreover, associative phase séparation occurs in
83
présence of electrostatic attraction between two polymers in aqueous médium (de Kruif,
Weinbreck, de Vries, 2004) leading to polymers complex formation Several associative
phase séparation techniques used for microencapsulation of ingrédients utilizes
complexation between polymers of protein and polysaccharide (Chilvers, Gunning, &
Morris, 1988; Tirkkonen, Turakka, & Paronen, 1994; Tiyaboonchai, Woiszwillo, &
Middaugh, 2001). Advantages of using phase séparation methods in the food industry
include the absence of harsh treatments and the use of edible sol vent (water).
Various researches on microencapsulation of water-soluble ingrédients hâve used diverse
biopolymers Systems such as biodégradable polylactid/polyethylene glycol
microparticulates (Huang, Chung, & Tzeng, 1997) or alginate-chitosan microspheres
(Lucinda-Sylva & Evangelista, 2003) for drug release. Some other works reported the
microencapsulation of anthocyanins pigments either by spray drying, using cyclodextrin as
a coating agent (Ersus & Yurgadel, 2007) or using cyclodextrin as a simple carrier
(Yamada, Komiya, & Akaki, 1980). Indeed, anthocyanins (Fig. 5.6) which are water-
soluble nutraceutical compounds containing a stable positive charge in very acidic
condition (pH 1.0), exhibit a tertiary structure, in plant, which protect them from
nucleophilic attack by water. However, they are fragile at less acidic environments such as
in foods where this structure could be disrupted during food possessing (Clifford, 2000).
Therefore, anthocyanins represent ingrédients of choice for microencapsulation.
Blackcurrant anthocyanins hâve been encapsulated by glucan gel (Xiong, Melton, Easteal,
& Siew, 2006).

84
Whey protein and pectin hâve been widely used in the food industry for their diverse
functional properties (Bals & Kulozik, 2003; Léman, Dolgan, Smoczynski, & Dziuba,
2005; Kerstens, Murray, & Dickinson, 2005; Kontopidis, Holt, & Sawyer, 2002, 2004;
Schols & Voragen, 2002; Voragen, Pilnik, Thibault, Axelos, & Renard, 1995). In a récent
study, we demonstrated the possibility to encapsulate a water-soluble ingrédient by WPI-
LMP complexes using différent modes of acidification (Bedie, Turgeon, & Makhlouf,
2007). The encapsulation of thiamine (Fig. 5.7) was mostly driven by electrostatic
interactions between the positively charged thiamine and the negatively charged WPI-LMP
complexes formed at acidic pH. The complex formation was highly dépendent to the pH of
the médium. Thus, pH 3.5-3.0 represented the optimum pH for WPI-LMP complex
formation (P:Ps ratio 2:1 at 0.4% total polymer concentration) when acidification of the
médium was done before or after mixing WPI and LMP solutions. Microencapsulation of
ascorbic acid by WPI/LMP has also been evaluated (Boucher, 2007), demonstrating that the
WPI/LMP system can be applied to a wide range of water-soluble ingrédients. Despite the
growing interest in microencapsulation of water-soluble ingrédients, no study has focused
on the effect of ingrédients concentration or of P:Ps ratio on the entrapment of thèse
ingrédients by whey protein-pectin complexes. In this study, the effect of thiamine
concentration on the sedimentable-complexes yield and on thiamine entrapment, using
WPI-LMP complexes, were investigated in pre and post-blending acidification of the
WPI/LMP system at différent pH. Anthocyanins entrapment by WPI-LMP complexes at
two P:Ps ratios as well as the effect of anthocyanins concentration on the entrapment ability
was also examined.

85
5.4.1. Materials
Whey protein isolate (BiPRO®), containing 64.47% p-lactoglobulin, 23.02% a-lactalbumin,
2.36% Bovine Sérum Albumin, and 2.67% Immune Globulin G, total protein 91%, was
purchased from Davisco Foods International Inc., (Le Sueur, MN, USA). Low methoxyl
pectin (36% esterified, molar mass of 100 kDa) was kindly donated by CP Kelco
(Copenhagen, Denmark). Thiamine hydrochloride (molar mass of 337.27 g/mol) was
purchased from Sigma (St-Louis, MO, USA). Mega Natural Rubired Grape Juice Extract
(25% total anthocyanins, 45% total phénols) was provided by Polyphenolics (Ladera, CA
USA).
5.4.2. Reagents
Dioctylsulfosuccinate sodium sait, formic acid (99%), potassium hydroxide, trichloroacetic
acid (TCA), potassium chloride (KC1), and sodium acétate trihydrate (NaAc) were
purchased from Fisher scientific (Fair lawn, NJ, USA). HPLC grade methanol was
purchased from VWR international (West Chester, PA, USA).
5.4.3. Préparation of stock solutions
Two percent (p/v) stock solutions of WPI and of LMP hâve been prepared by dispersing
appropriate amounts of polymer powders in deionised water (Quality HPLC) under

86
agitation. WPI used in this préparation was a powder from which aggregates or denatured
proteins hâve been removed by centrifugation (Bedie et al., 2007). The agitation was kept
at ambient température for 2 hours to allow hydration of the biopolymers. A 2% LMP
solution was heated at 80°C for 10 min prior to agitation for 2 hours. The solutions were
then stored at 4°C overnight to complète the hydration until use.
5.4.4. Thiamine entnipment
Thiamine entrapment by WPI/LMP complexes was performed by pre- and post-blending
acidifications of WPI/LMP mixtures. LMP solutions containing 0, 0.004, 0.02, 0.1, and
0.2% (w/w) of thiamine were added to WPI solutions in order to obtain WPI-LMP mixtures
containing 0, 0.002, 0.01, 0.05, and 0.1% thiamine with a protein:polysaccharide (P:Ps)
ratio of 2:1 and a total polymer concentration of 0.4% (0.27% WPI and 0.13% LMP). In the
post-blending acidification process, the initial pH of the WPI-LMP-thiamine mixtures was
adjusted to 7.0 before gradually decreasing it to 4.0, 3.5, 3.0, and 2.5 under magnetic
stirring. During the pre-blending acidification, solutions of WPI and solutions of LMP-
thiamine were adjusted to pH 4.0, 3.5, 3.0, or 2.5 (from pH 7.0), separately, before they
were mixed together to form the final mixtures at the spécifie pH values. The mixtures were
stirred for 3 min at a spécifie pH before 30 g samples, in ail modes of acidification, were
collected centrifuged at 8000 g/30 min at 22°C (Sorvall Instruments RC5C, Du Pont
Company, CT, USA). The pellets were stored at -18°C overnight. The frozen pellets were
freeze dried (Virtic Co Inc., Kansas City, NY, USA) for 24 hours and their weights
recorded. The sedimentable-complexes yield was calculated as follows:

87
„ ,. ,. , . ,, Weightofdry pellet ,..

Sedimentable - complexesyield= - —*- x 100
Weightof total biopolymersin30g of mixture
5.4.5. Détermination of thiamine
Thiamine détermination was completed by HPLC (WooUard & Indyk, 2002) as described
in previous work (Bedie et al, 2007, chapter 4, section 4.4.10.).
5.4.6. Anthocyanins entrapment
The évaluation of P:Ps ratio for suitable ingrédient entrapment (Bedie et al, 2007)
suggested that WPI/LMP ratio 2:1 was the optimal ratio to use for the entrapment in acidic
médium. LMP solutions containing 0.2, 0.4, and 0.6% (w/w) of anthocyanins (0.4, 0.8, and
1.2% w/w of Mega Natural® Rubired Grape Juice Extract (25% total anthocyanins, 45%
total phénols) were added to LMP, respectively) was added to WPI solutions to obtain
WPI-LMP mixtures containing 0.1, 0.2, and 0.3% anthocyanins, with a
proteimpolysaccharide (P:Ps) ratio of 2:1. Likewise, WPI/LMP mixtures containing
0.025% anthocyanins were prepared at P:Ps ratios of 2:1 and 1:1. Ail mixtures had 0.4%
total polymer. Mixtures were set at pH 7.0 and acidified gradually to pH 3.5 by addition of
HC1 (0.5N) and gently stirred for 3 min, after blending the polymer solutions. 30 g samples
of the mixtures were centrifuged at 8000 g/30 min at 22°C. Anthocyanins were extracted
frorn the pellets and quantified by UV-spectrophotometry.

88
5.4.7. Détermination of total monomeric anthocyanins
After centrifugation, the pellet were weighed and suspended in 30 g of 0.6% (w/w) of 0.5N
HCl-methanol (pH 1.0) under magnetic stirring for 1 hour to provide better extraction of
the anthocyanins by dissociation of the complexes. After complex dissociation, the 30 g
samples were centrifuged for 9000 g/30 min at 22°C and the supernatants were collected.
The new pellets were re-extracted twice. Ail the supernatants were added together and the
total anthocyanins content was determined by the pH differential method (Lee, Dust, &
Wrolstad, 2005). One ml aliquots from heated and non heated samples (free anthocyanins
solution, supernatant, and anthocyanins from the pellet) were appropriately diluted in
potassium chloride buffer solution (pH 1.0) and sodium acétate buffer solution (pH 4.5) and
analyzed for total anthocyanins content with a spectrophometer séries 8453 (HP,
Mississauga, ON, Canada) at 520 nm. Absorbance was read against HPLC-quality water as
a blank. The results were expressed on a cyanidin-3-glucoside basis. The anthocyanins
concentration was calculated as follows:
xTotal
♦ ianthocyamns
A • concentration
* ♦• (mg/L)
< n\ = ■(AxMWxDFxlOQO
* j
Where A = (A52onm - A7oonm)pH 1.0 - (A520nm- A7oonm)pH 4.5; MW = Molar weight of
cyanidin-3-glucoside (cyd-3-glu) = 449.2 g/mol; DF = Dilution factor ; 10 = conversion
factor from g to mg; e = Molar extinction coefficient of cyd-3-glu (26 900 x L x mol"1 x
cm'1); L = Pathlength in cm (1 cm);

89
Percentage of anthocyanins in the samples at each storage time was calculated based on the
control samples as foliows:
_ , , . .... Anthocyanins content of a sampleat a storage day </v„

Total anthocyamns (%) = - - - xlOO
anthocyanins content of asample before storage atdayO
Once the anthocyanins concentration was determined, the entrapment efficiency was
calculated as foliows:
^ „ . ,.,,. Anthocyanins content of wet pellet ,nn

Entrapment efficiency (%)= - x 100
Anthocyanins content of initial WPI- LMP mixture
Statistical analyses were performed with the SAS System (SAS Institute Inc. Cary, NC,
USA). Data associated with the effect of thiamine concentration of thiamine entrapment
were analyzed as 5 (thiamine levels) x 4 (pH) factorial experiments. The repeated measures
ANOVA design was adjusted to both post- and pre blending acidification data with a five-
level treatment (0, 0.002, 0.01, 0.05, and 0.1%) and a four-level pH sub-treatment (pH 4.0,
3.5, 3.0, and 2.5). Data on WPI/LMP ratio were analyzed with a Fisher's LSD design as a
Pairwise Comparisons of ratios 1:1 and 2:1 treatment. Data related to the effect of
anthocyanins concentrations on the entrapment process were analyzed as a ONE WAY-

90
ANOVA design with 3 treatments (concentration: 0.1, 0.2, and 0.3%). AU expenments
were performed in triplicates.
5.5. RESULTS AND DISCUSSION
5.5.1. Effect of thiamine concentration on the entrapment
5.5.1.1. Sedimentable-complexes yield
The sedimentable-complexes yield of WPI/LMP System without thiamine and that of the
system containing four levels of thiamine, with both post- and pre-blending acidifications,
are presented in Fig. 5.1. At a spécifie pH in ail modes of acidification, the sedimentable-
complexes yield was generally not significantly différent (P > 0.068 for post-blending
acidification and P > 0.0789 for pre-blending acidification) between complexes with and
without thiamine, except at pH 3.5 (0.05 and 0.1% of added thiamine) in the post-blending
acidification (P < 0.0017) and at pH 4 in the pre-blending acidification (P < 0.0338). The
drop of the sedimentable-complexes yield at pH 3.5 during the post-blending acidification
may probably be the resuit of complex saturation by the addition of high concentrations of
thiamine, preventing the aggregation of interbiopolymers and limiting the increase of the
sedimentable-complexes yield. In revenge, at lower pH, the lift of the saturation effect may
be ascribed to the decreasing affinity between thiamine and the complexes which become
less and less negatively charged (chapter 4, section 4.5.3), clearing the way for more
complex aggregation. At thèse low pH, complex aggregation may be explained by the
91
display (by acidification) of new unbound sites from the dissociation into monomers or
single polypeptide chains of essentially (3-lactoglobulin molécules (Chiancone & Gattoni,
1991; Sawyer & Kontopidis, 2000). This may contribute to new interbiopolymer
interactions between thèse molécules with others such as molten globule state of a-
lactalbumin (Alexandrescu, Evans, Pikeathly, Baum & Dobson, 1993) and may increase the
sedimentable-complexes yield. Addition of thiamine may hâve increased the sedimentable
complexes yield at pH values corresponding to the lowest yield but this possible increase
was not observed in the post-blending acidification mode due to the packing effect of that
mode of acidification. The lack of such effect with the pre-blending acidification may
explain the increase of the sedimentables complexes yield at pH 4.0. Moreover, no drop in
the sedimentable-complexes yield was observed at pH 3.5 with the pre-blending
acidification. This may resuit from the mode of acidification of the pre-blended System in
which hasty molécules movement created by the quick mixing of the polymer solutions at a
spécifie pH could hâve helped WPI molécules binding to LMP molécules, being at the
same time detrimental to thiamine molécules. However, in ail cases, the overall lower
sedimentable-complexes yield at pH 4.0 (although with a greater négative zêta potential)
may resuit from low interactions between WPI (Boye, Ismail, & Alli, 1996) and pectin as
WPI molécules were less positively charged at pH 4.0 than at lower pH values.
5.5.1.2. Thiamine entrapment
Thiamine content of the complexes (g of thiamine per g of dry complexes) indicated an
increase as the level of incorporated thiamine increased at a spécifie pH in both types of

92
acidification (Fig. 5.2). Thèse results are in agreement with previous work on the
entrapment of insulin by chitosan-triphosphate ions nanoparticles at pH 4.0 (Pan et al,
2002) and on the microencapsulation of isoniazid by alginate-chitosan microspheres
(Lucinda-Silva & Evangelista, 2003). The maximum thiamine content of the complexes,
among ail thiamine levels, was found at pH 4.0 for post-blending acidification and at pH
3.5 for pre-blending acidification as found in previous study (Bedie, Turgeon, & Makhlouf,
2007). Indeed, positively charged thiamine molécules were preferably attracted by WPI-
LMP complexes at pH 4.0-3.5 (negatively charged) rather than at lower pH (positively
charged). However, the maximum thiamine content of the complexes at pH 3.5 in the pre-
blend system may be the resuit of the combination of négative charges of the complexes
and the physical entrapment of thiamine, which itself may be favoured by the relatively
positively charged thiamine. The decrease of thiamine content as the pH decreased, starting
from the maxima, may resuit from the lessening of negatively charged complexes at low
pH and probably from the compétition between protein and thiamine molécules in binding
to LMP molécules, which was detrimental to thiamine molécules.
Figure 5.3 shows thiamine entrapment efficiency in both pre- and post-blending
acidifications. Maximum entrapment efficiency appeared at pH 3.5, since at this pH,
substantial amount of complexes were formed with négative charges, in both cases (not
shown). This is in corrélation with high sedimentable complexes yield (Fig. 5.1 A and B)
and thiamine content of the complexes (Fig. 5.2 B) at the same pH except thiamine levels
of 0.05 and 0.1% in the post-blending acidification (Fig. 5.3A) as indicated by the
sedimentable complexes yield (Fig. 5.1 A). Saturation of the complexes by high
93
concentrations of thiamine which prevented the increase of the sedimentable complexes
yield may be the principal reason. At other spécifie pHs, the amount of complexes formed
(pH 4.0) and the positively charged complexes (pH 3.0 and 2.5) contributed to less
entrapment. At pH 3.5, the entrapment efficiency decreased as the amount of incorporated
thiamine increased. This was predictable, considering the entrapment efficiency formula.
Accordingly, Peltonen et al. (2004) observed similar behaviour when encapsulating
hydrophilic drug substance (sodiumeromoglycate) in poly(l)lactide nanoparticles.
5.5.2. Effect of protein/polysaccharide ratio and anthocyanins concentration on the
entrapment
5.5.2.1. Protein:polysaccharide ratio
The change in anthocyanins entrapment efficiency with increasing WPI/LMP ratio at pH
3.5 is presented in figure 5.4. Anthocyanins entrapment efficiency with WPI/LMP ratio 2:1
was more than 9% compared to that of WPI/LMP ratio 1:1 (4%). The great amount of
complexes associated to WPI/LMP ratio 2:1 was probably responsible for higher binding of
anthocyanins to WPI/LMP complexes. Indeed, positively charged anthocyanins molécules
at acidic pH (Giusti, Rodriguez-Saona, Griffin, & Wrolstad, 1999) were preferably
attracted by negatively charged and large mass of WPI/LMP complexes at ratio 2:1.
Anthocyanins entrapment efficiency (9%) at that ratio and at pH 3.5 with post-blending
acidification is greater than that of thiamine (4.50%) in the same conditions (Chapter 4,
section 4.5.6.). One reason for this great anthocyanins entrapment efficiency could be the
94
interactions of the many hydroxyl groups présent on the anthocyanins molécules (compared
to one on the thiamine molécule) with some positively charged zones of the WPI molécules
in the complexes. No work has been yet reported in the literature on anthocyanins
encapsulation by protein-polysaccharide complexes. However, in their work on
microencapsulation of anthocyanin pigments of black carrot by spray drying, Ersus et al.
(2007) reported that more than 500 mg/100 g of anthocyanins were encapsulated using a
solution of 6% anthocyanins and 20% cyclodextrin as a carrier. Our method of
encapsulation seems more efficient even though we obtained 220mg/100g of entrapped-
anthocyanins considering that we used 240 times less anthocyanins (0.025% vs 6%) and 50
times less carriers (0.4% of total polymers vs 20% cyclodextrin). Elsewhere, the
encapsulation of black currant anthocyanins by glucan gel resulted in more than 80%
anthocyanins recovery after freeze drying (Xiong et al, 2006). The method of
encapsulation in this case (gel) may be responsible for the high anthocyanins recovery. So
depending on the method used for the encapsulation, the final resuit may vary considerably.
5.5.2.2. Anthocyanins entrapment
We evaluated anthocyanins entrapment efficiency at pH 3.5 with an increase of
anthocyanins concentration (0.1, 0.2, and 0.3%) in a post-blending acidification (Fig. 5.3 A
and B). As a resuit, the entrapment efficiency of anthocyanins increases linearly (p <
0.0001) from 10 to 12.6% and from 10 to 14.9% as the concentration of anthocyanins
increased from 0.1 to 0.2 and 0.3% (Fig. 5.5). This corresponds to an increase of the
entrapment efficiency to 26 and 49% respectively. This resuit is not in agreement with
thiamine entrapment efficiency at pH 3.5 where the increase of thiamine concentration led
95
to a decrease of the entrapment efficiency at certain pH. A reason may be the used of
anthocyanins extract (not pure) in which other components may contribute to the
attachment of anthocyanins to the complexes. On the other hand, their structures are
différent and the mechanism of encapsulation may differ between thèse molécules.
5.6. CONCLUSION
This study demonstrated that, in gênerai, incorporation of thiamine into WPI/LMP
complexes may affect the sedimentable-complexes yield as well as the entrapment
efficiency, at a spécifie pH, depending on the type of acidification. The maximum of
thiamine entrapment efficiency was found at pH 3.5 while thiamine content of the
complexes increased with increasing thiamine concentration with maxima at pH 4.0 and 3.5
depending on the mode of acidification. Increase of total polymer/thiamine ratios may be
considered to avoid saturation of the complexes when high amounts of encapsulated
ingrédients are used. Anthocyanins exhibited high entrapment efficiency at a WPI/LMP
ratio of 2:1 and indicated an increase of the entrapment efficiency as the concentration of
the added anthocyanins increased. Studies of water-soluble ingrédient protection by
WPI/LMP complexes under storage conditions should also be carried.

96
A
120 i
B
120 T
Figure 5.1. Sedimentable-complexes yield (least squares means of % of polymer in

centrifugal pellet) of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added thiamine as a
function of pH: (A) post-blending acidification and (B) pre-blending acidification; ■
control, Il 0.002, @ 0.01, 0 0.05, □ 0.1%. Vertical bars represent standard errors of the
mean (N = 6).
97
A
2.5-
? 2.0-
Figure 5.2. Thiamine content of the complexes (least squares means of % of thiamine in the
dry pellet) of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added thiamine as a function
of pH: (A) post-blending acidification and (B) pre-blending acidification; □ 0.002, S 0.01,
E3 0.05, □ 0.1%. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
98
4.0 3.5 3.0 2.5

pH
Figure 5.3. Entrapment efficiency (least squares means of % of thiamine in suspended

centrifugal pellet) of WPI/LMP complexes mixtures with 4 levels of added thiamine as a
function of pH: (A) post-blending acidification and (B) pre-blending acidification; ■
0.002, M 0.01,0 0.05, □ 0.1%. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
99
12 n
cr 1 0 H
a 6-
&
S
a
«
a
Rl:l R2:l
Ratio
Figure 5.4. Entrapment efficiency (least squares means of % of anthocyanins in centrifugal

pellet) of WPI/LMP complexes at P:Ps ratios of 1:1 (RI: 1) and 2:1 (R2:l) and at pH 3.5,
with 0.4% total polymer. Vertical bars represent standard errors of the mean (N = 6).
0.1 0.2 0.3
Added anthocyanins (%)
Figure 5.5. Entrapment efficiency (least squares means of % of anthocyanins in centrifugal

pellet) of WPI/LMP complexes at ratios 2:1 and at pH 3.5, with 3 levels (0.1, 0.2, and 0.3%
w/w) of incorporated anthocyanins. Vertical bars represent standard errors of the mean (N
= 6).
101
Ri
N 0 H
^ N ^ '
© F B !
HC
V^ A c
^Rz
S^ ^-^ 0—Glucose
OH
Figure 1. Anihocyanin skeletc m.
R, R» Anthocyanin
H H Po largonidh-3-glucos ide
OH H Cyan idin-3-glucoside
OH OH Dclphinidin-3-glucosido
OCH, H Poonidin-3-glucostdo
OCHa OH Petunidin-3-glucoside
OC H, OCH3 Mafvidin-3-gtucosido
Figure 5. 6. Structure of anthocyanins (Clifford, 2000)

102
NH 2
.CH2 CI" CH,

M ^v\
r" ~« 15 13 41
12 16
H 3 C^ H H S CH 2 CH 2 OH
Figure 5. 7. Structure of thiamine hydrochloride (Clémente et al., 1988)

CHAPITRE 6
Study of the protective effect of whey protein isolate-low
methoxyl pectin complexes on anthocyanins during storage.
Sera soumis pour publication dans le journal Food HydrocoUoids

104
6.1. RÉSUMÉ
Les complexes IPL/PFM composés de 0.27% d'IPL et 0.13% de PFM avec un ratio P:Ps de
2 :1 (0.4% de polymères totaux), ont été utilisés pour l'encapsulation d'anthocyanes (0.3%)
et de la thiamine (0.1%). Ces ingrédients hydrosolubles ont été incorporés aux complexes
IPL/PFM à travers des solutions de PFM, suivie d'une acidification graduelle du milieu à
pH 3.5. Les complexes ont été récupérés par centrifugation. Les échantillons de complexes
contenant des anthocyanes ont été pasteurisés (90°C/12 s) et entreposés à 40°C/11000 lux
pendant 14 jours. Aux jours 0, 6, 8, 10, 12 et 14, les échantillons ont été collectés,
centrifugés et les anthocyanes ont été dosés par spectrophotométrie. La pasteurisation a
dégradé 11.6% des anthocyanes dans le jus témoin (sans complexes IPL/PFM) alors qu'elle
a provoqué une diffusion des anthocyanes du culot vers le surnageant dans le jus additionné
de complexes IPL/PFM. Pendant l'entreposage, la dégradation des anthocyanes était
similaire dans le jus témoin et dans le surnageant du jus additionné de complexes IPL/PFM.
Cependant, le contenu en anthocyanes du culot est demeuré pratiquement constant (~ 45
mg/1) durant l'entreposage, suggérant une protection de ces composés par les complexes
IPL/PFM.
6.2. ABSTRACT
WPI-LMP complexes, containing 0.27% WPI and 0.13% LMP with a P:Ps ratio 2:1 (0.4%
TCP) were used to encapsulate anthocyanins (0.3% w/w) and thiamine (0.1%). Thèse
105
water-soluble ingrédients were added to WPI-LMP mixtures through LMP solutions,
foliowed by graduai acidification to pH 3.5. Complexes were obtained by centrifugation.
The pellets of complexes containing anthocyanins were pasteurized (90°C/12 s) and stored
at 40°C/11000 lux for 14 days. On days 0, 6, 8, 10, 12, and 14, samples were collected,
centrifuged, and analyzed for anthocyanins content by spectrophotometry. While the heat
degraded 11.6% of anthocyanins in the control juice (without WPI-LMP complexes), it
induced anthocyanins diffusion from the pellet to the supernatant in the juice containing
WPI-LMP complexes. During storage, anthocyanins dégradation was similar in both
control juice and the supernatant of the juice containing WPI-LMP complexes. However,
anthocyanins content of the pellet remained constant (~ 45 mg/1) during storage, suggesting
their protection by the WPI-LMP complexes.
6.3. INTRODUCTION
Microencapsulation has been largely used in food industry where its major purpose is the
protection of the added ingrédients against food environmental damages as well as the
delivery of the encapsulated ingrédients. Existing challenges faced by the ingrédients in
foods include loss of activity, oxidation reactions, reaction of ingrédients with the food
components, change of color or taste of the food product (Schrooyen, van der Meer, & De
Kruif, 2001). Ail thèse damages contribute to a limitation of the bioavailability of added
ingrédients. Microencapsulation processes use several methods including, spray-drying,
extrusion spray-chilling or inclusion with cyclodextrin molécules as a carriers (Ersus &

106
Yurgadel, 2007; Tayade & Kale, 2004; Yamada, Komiya, & Akaki, 1980). Some studies
hâve reported the microencapsulation of water-soluble ingrédients with protein-
polysaccharide complexes (Chilvers, Gunning, & Morris, 1988; Tirkkonen, Turakka, &
Paronen, 1994; Tiyaboonchai, Woiszwillo, & Middaugh, 2001). Others hâve performed the
encapsulation of anthocyanins by spray-drying (Ersus & Yurgadel, 2007) or by
polysacchande gel (Xiong, Melton, Easteal, & Siew, 2006). Previous study on water
soluble ingrédients encapsulation by WPI-LMP complexes (Bedie, Turgeon, & Makhlouf,
2007; Chapter 5) indicated a great entrapment efficiency at WPI:LMP ratio 2:1 and an
increase of the entrapment efficiency with anthocyanins concentration. Anthocyanins
(glycosides of anthocyanidins) are part of a large group known as flavonoids (Mazza &
Miniati, 1993). Glycosides of anthocyanidins which are polyhdroxy and polymethoxy
derivatives of 2-phenylbenzopyryliumor flavylium salts (Fig.5.6.) responsible for most red,
pink, mauve and blue colors of fruits, lowers and fruits. Their color is determined by the
number of hydroxyl groups, the degree of methylation of thèse hydroxyl groups, the nature
and number of sugars attached to the molécule and the position of attachment, the nature
and number of aliphatic or aromatic acids attached to the sugar and the physicochemical
médium in which they are viewed (Mazza & Brouillard, 1990). The six major
anthocyanidins frequently occurring in plants are pelarginidin, cyaniding, peonidin,
delphinidin, petunidin, and malvidin. Factors affecting the stability of anthocyanins in
aqueous média include structure, concentration of the pigment, pH, température, light, co-
pigments, self-association, metallic ions, oxygen, ascorbic acid, sugars and their
dégradation products, proteins, sulphur dioxide, organic acids, nucleotides, and
anthocyanins themselves (Mazza & Brouillard, 1990; Mazza & Miniati, 1993). In aqueous
107
solution at room température and in moderately acidic média (pH 4-6), anthocyanins exist
mainly in equilibrium between the colorless carbinol pseudobase (B) and chalcone (C),
favoring the carbinol pseudobase. In more acidic média (pH <4), the colored flavylium
cation (AH+) and the colorless carbinol pseudobase (B) predominate. At equilibrium and at
any other pH, the colored quinoidal base (A) is only présent to a very small extent
(Brouillard & Delaporte, 1977). The mechanism (A <=» AH+ <=> B) of interconversion, upon
pH change! suggested that placing the cation in the most acidic média (pH <3) rapidly sets
up the flavylium cation-carbinol equilibrium with the formation of barely détectable
amounts of quinoidal base and chalcone and when placing this same cation in slightly
acidic or basic média (pH >3) it immediately yields the quinoidal base. Studies of
anthocyanins stability in fruit juices under heat treatment and storage conditions, hâve
indicated that dégradation of anthocyanins (carrot and blood orange juices) under heat
treatment followed a first-order reaction kinetics. In addition, the dégradation of monomeric
anthocyanins increased with increasing solid content during heating, while it decreased
during storage at 20°C (Kirca, Ozkan, & Cemeroglu, 2003, 2006, 2007). Other studies
indicated that the stability of monomeric anthocyanins under storage conditions depended
on the time and température of storage with the effect of storage time being the most
important; the présence or absence of light exerted a negligible impact on the
décomposition rate (Morais, Ramos, Forgacs, Cserhati, & Oliviera, 2002; Turker, Aksay, &
Ekiz, 2004).
In this paper the stability of anthocyanins encapsulated by WPI-LMP complexes was
examined in clarified apple juice during storage. The sensitivity of anthocyanins to

108
température, light, and pH, makes them excellent choices for the study of the protective
effect of encapsulating complexes.
6.4.1. Materials
BiPRO® whey protein isolate (64.47% p-lactoglobulin, 23.02% a-lactalbumin, 2.36%
Bovine Sérum Albumin, and 2.67% Immune Globulin G, total protein 91%) was furnished
by Davisco Foods International Inc. (Le Sueur, MN, USA). Low methyl pectin (36%
esterified, molar mass of 100 kDa) and Mega Natural® Rubired Grape Juice Extract (25%
total anthocyanins, 45% total phénols) were kindly donated by CP Kelco (Copenhagen,
Denmark) and Polyphenolics (Ladera, CA USA), respectively, and were used as receiyed.
Clarified apple juice concentrate (70.2°Brix) was kindly offered by Lassonde Industries Inc.
(Rougemont, Québec Canada).
6.4.2. Reagents
Potassium chloride (KC1) and sodium acétate trihydrate (NaAc) were purchased from
Fisher Scientific (Nepean, ON, CA).

109
6.4.3. Préparation of solutions
2% (w/v) stock solution of WPI and 2% (w/v) stock solution of LMP were prepared from
WPI powder (free of insoluble particles and denatured proteins) and pectin powder in
HPLC-grade deionised water and stirred at ambient température for two hours. Heating at
80°C for 10 min prior to stirring was required for LMP. The WPI and LMP solutions were
stored at 4°C ovemight to complète the hydration until use. 1000 g of apple juice of
10.6°Brix at 22°C (pH 3.5) were prepared by diluting 142.9 g of concentrated apple juice
(70.2°Brix) and 0.2 g of sodium azide (antimicrobial) in HPLC quality water.
6.4.4. Anthocyanins entrapment by WPI-LMP complexes
WPI and LMP stock solutions were diluted in HPLC-grade water and mixed together to
obtain WPI-LMP mixtures at a proteimpolysaccharide ratio of 2:1 with a total polymer
concentration of 0.4% w/w (0.26% LMP and 0.54% WPI). Anthocyanins from Mega
Natural® Rubired Grape Juice Extract (25% total anthocyanins) were added to LMP
solution before adding to WPI solution in order to obtain 500 g of a final WPI-LMP
mixture containing 0.27% WPI, 0.13% LMP and 0.3% w/w anthocyanins. The pH of the
mixture was adjusted to pH 7.0 before decreasing it gradually to pH 3.5 by addition of HC1
(0.5N) under moderate agitation followed by a gentle stirring for 3 min. The whole mixture
was centrifuged at 10 000 g/30 min at 22°C and the pellet (WPI-LMP complexes
containing anthocyanins) as well as the supernatant was collected and weighed. The pellet
was dissolved in 500 g of apple juice (10.6°Brix pH 3.5) under moderate stirring for lh.
110
Anthocyanins control juice was prepared by dissolving lg of Mega Natural Rubired Grape
Juice Extract (25% total anthocyanins) in 500 g ofapple juice (10.6°Brix) at pH 3.5.
6.4.5. Heat treatment and storage
30g of duplicate samples from control juice and juice with complex mixture containing
anthocyanins (WPI-LMP-anthocyanins) were collected in 50 ml tubes. The samples were
heat treated (90°C/12 s) in a water bath (Neslab Instruments Inc., Newington, NH, USA)
and immediately cooled to 25°C in an ice-water solution. The time necessary for the center
of the tubes to reach 90°C was 4 min. Samples of non heated WPI-LMP-anthocyanins
mixture and control juice were used as control samples. Ail heated samples were then
stored in a Conviron El 5 growth chamber (Controlled environment Ltd., Winnipeg, MB,
Canada) set at 40°C under light at 11 000 lux for 14 days. Samples were collected at day 0,
6, 8, 10, 12, and 14 for anthocyanins analysis: total anthocyanins content, anthocyanins in
the supernatant after centrifugation and anthocyanins in the complexes (pellets).
6.4.6. Extraction of monomeric anthocyanins
Ail samples of complexes containing anthocyanins were centrifuged at 10 000 g for 30 min.
The supernatants and the pellets were collected and weighed. To extract anthocyanins from
the pellets, the pellets were suspended in 30 g of 0.6% w/w of 0.5N HCl-methanol (pH
111
1.0), homogenized with an Ultra Turrax homogenizer, (IKA Works, Inc. Wilington, NC,
USA) at 17 500 rpm/1 min, and centrifuged at 10 000 g/30 min 22°C. The pellets were re-
extracted until a clear supematant was obtained. Combined supematants were well mixed
to form anthocyanins from the pellets.
6.4.7. Détermination of monomeric anthocyanins
Anthocyanins détermination was achieved by the pH differential method (Lee, Dust, &
Wrolstad, 2005) as described in previous work (Bedie, Turgeon, & Makhlouf, 2007;
chapter 5, section 5.4.7.).
6.4.8. Kinetic of dégradation of anthocyanins
First-order reaction rate (k) and half-life (ti/2) were calculated according to the following
, .At. , ln(2)
équations:ln(—) = -kt; h/2 = —-—
Ao k
where Ao is the initial anthocyanins concentration of the samples at day 0, At is the
anthocyanins concentration after t days of storage.
Statistical analyses were performed with the SAS System (SAS Institute Inc. Cary, NC,
USA). Data related to the effect of storage conditions on anthocyanins content were
112
analyzed as a repeated measures ANOVA design with 4 treatments (total free anthocyanins
in control juice, complexed anthocyanins in the supernatant, complexed anthocyanins in the
pellet, total calculated complexed anthocyanins in the juice) and a 7-level time sub-
treatment (control, do, d6, d8, dlO, dl2, and dl4). The same data were also analyzed by
contrasts with a Fisher's LSD design as a Pairwise Comparisons of anthocyanins content at
each storage day. Ail experiments were performed in triplicates.
6.5. RESULTS AND DISCUSSION
6.5.1. Anthocyanins protection by WPI-LMP complexes during storage
6.5.1.1. Heat treatment
The effects of heat treatment on anthocyanins in the control juice, in the supernatant, and in
the pellet are presented in table 6.1 while the effects of storage conditions on anthocyanins
are presented in figures 6.3 and 6.4. Before heat treatment, the control juice, which was
purposely prepared to contain anthocyanins concentration close to that of the pellets,
contained approximately 483.9 mg/1 of total anthocyanins while the total anthocyanins in
the juice with complexes (represented by the total anthocyanins in the supernatant and the
pellet), was about 474.2 mg/1 (Table 6.1). The great amount of anthocyanins found in the
supernatant (360.5 mg/1) after centrifugation of the dissolved complexes (containing
anthocyanins) in clarified apple juice suggest that an important portion (76%) of the
anthocyanins was not well bound to the complexes and was diffused in the supernatant.
113
This leaves 24% of anthocyanins in the pellet (113.7 mg/1 of juice-dissolved pellet). In
addition, the heat treatment had a significant (p < 0.0003) réduction effect on anthocyanins
in ail samples except for the supematant (P = 0.1389). In fact, a slight decrease of
anthocyanins content in the supematant (3.9%) compared to that of the control (11.6%)
(Table 6.1) could be explained by the diffusion of anthocyanins out of the pellet to the
supematant during the heat treatment, which may hâve compensated anthocyanins loss in
the supematant. In this case, the heat treatment seems to hâve an antagonistic effect on
anthocyanins content in the supematant. The calculated réduction of total anthocyanins in
the juice with complexes (including the supematant and the pellet) was 14.2%, which is not
significantly différent (p = 0.0559) from that of anthocyanins in the control juice.
Anthocyanins protection by WPI/LMP complexes in this thesis may be comparable to the
phenomenon of co-pigmentation of anthocyanins. Indeed, for a given pH and type of
anthocyanins, the secondary structures of anthocyanins play a rôle in the mechanism of co-
pigmentation. Without co-pigments (organic acids, other anthocyanins, polysaccharides,
amino acids, flavonoids), at pH 3.6 where the pigmentation effect is maximum, hydration
of the fiavilium form leads to the présence of the colorless hemicetal and cis-chalcone in
fast equilibrium with each other (Mazza & Brouillard, 1990). In the présence of co-
pigment, anthocyanins are stabilized by the interaction of the fiavilium cation with the co-
pigment which prevents the hydration of the cation to the colorless form. Dégradation of
anthocyanins by heat may be explained mainly by the breaking of the co-pigment-
anthocyanins structure, allowing the hydration reaction to occur and the colorless form of
anthocyanins to appear (Brouillard et al, 1989; Matsufuji et al, 2007). It has also been
demonstrated that it is not the polarity of water molécules that allows copigmentation to
114
take place but rather the unique feature of the water molécules association as a tetrahedral
network which force anthocyanins and co-pigments into close contact by hydrophobic
interaction (Brouillard et al, 1989). The heating of WPI/LMP complexes containing
anthocyanins resulted in the formation of big aggregates responsible for the diffusion of
anthocyanins from the complexes (Table 6.1). This heat-induced aggregate formation is in
agreement with previous work achieved by Beaulieu at al. (2005) on heat-induced protein
aggregates in whey protein/pectin mixtures. The author mentioned, however, that LMP has
a protective effect on WPI regarding aggregate formation as heated WPI resulted in more
aggregates than heated WPI/LMP, which itself is in agreement with Varunsatian et al.
(1983). Although the formation of aggregates induced anthocyanins diffusion from
WPI/LMP complexes, the remaining anthocyanins may be physically shielded from the
heat treatment, preventing further dégradation of anthocyanins. Furthermore, anthocyanins
molécules may interact with whey proteins and pectin to form a WPI/LMP/anthocyanins-
structure providing anthocyanins protection to hydration and preventing their dégradation.
Although no study focused on heat treatment of encapsulated anthocyanins, 90% of initial
anthocyanins from plums skin were reported to diffuse to the flesh or to the can liquid after
the canned plums were boiled for 20 min (Weinert, Solms, & Escher, 1990).
6.5.1.2. Storage
Storage under light at 40°C contributed to greater dégradation of anthocyanins in control
juice and in the supematant than it did in the pellet (Fig. 6.2 and 6.3). After 14 days of
115
storage, anthocyanins content of the control solution was 220.5 mg/1 while that of the
supematant was 186.81 mg/1 (Fig. 6.2). Thèse contents represent nearly half of the initial
concentrations. The similarity in the trend of dégradation of anthocyanins in the control
juice and in the supematant was expected since once the anthocyanins diffused from the
complexes network, they became subject to the direct effect of the heat and the light, as in
the control juice. Unlike the control juice, anthocyanins content in the pellet did not change
significantly (p > 0.1000). The amount of anthocyanins remaining in the pellet (45-49 mg/1)
may represent the true value of anthocyanins entrapped in the WPI-LMP system. This is
also shown in figure 6.3 where the percent loss of anthocyanins in the pellet reached a
constancy (p = 0.5266), from d8 to dl4, while it was accentuated with time in the
supematant and the control samples. This constancy may suggest that anthocyanins weakly
bound to the complexes hâve been completely diffused in the supematant after the heat
treatment and those strongly attached to the complexes were highly protected by the WPI-
LMP complexes under storage conditions.
The kinetic of combined temperature-light dégradation of anthocyanins sample and the
total anthocyanins in the complexes are presented in Fig. 6.4. Natural loganthm of
anthocyanins concentration was plotted against time of storage at 40°C/11000 lux and the
first-order reaction rate and the half-life were calculated according to the équation at
section 6.4.8. As a resuit, the linear Unes of the plot indicated that the destructive effect of
storage conditions on anthocyanins followed first-order reaction kinetics (Fig. 6.4) in
agreement with Kirca & al (2006, 2007). Furthermore, the almost superimposing display of
the supematant and the control juice hâve curves suggested that their hâve very close
116
dégradation rate. In addition, the half-lives (time needed for 50% anthocyanins
dégradation) of anthocyanins in the control solution and in the pellet were 14,7 days and 28
days (Table 6.2), respectively, confirming the protection of anthocyanins by the WPI-LMP
complexes. It is known that anthocyanins are more stable to light and heat at low pH
(Matsufuji et al, 2007). Indeed, in the study of the stability of acylated anthocyanins from
red radish extract to light, heat, and hydrogen peroxide, the authors conciuded that the
characteristics, the number, the binding site, and probably the spécial position of
intramolecular acyl units (co-pigments) affected the stability of acylated anthocyanins.
Diacylated anthocyanins were more stable to light than monoacetylated anthocyanins. The
authors suggested that mis stability was probably due to a sandwich type stacking by
hydrophobic interactions between the planar aromatic residues of intramolecular acyl units
and the flavilium nucleus. Pectin does not interact directly with anthocyanins but by
reacting with water, it could stabilize the flavilium cation with regard to hydration
(Mazzaracchio et al, 2004). By doing so, pectin may slightly increase flavilium cation
form which is in equilibrium with the pseudobase form at a same pH (Fig. 6.1). Moreover,
a weak hydrophobic interaction between methoxyl groups of the B ring of the aglycones
and the methoxyl groups of pectin could occur and favour co-pigmentation. pMactoglobulin
seems to hâve an absorption effect with anthocyanins as the latter formed cations at acidic
pH. Thèse absorption interactions may be due to hydrogen bond or hydrophobic or
electrostatic interactions (Mazzaracchio et al, 2004). WPI-LMP complexes network may
physically hide anthocyanins molécules from light by simple inclusion or physical
protection, like in the case of heat.

117
6.6. CONCLUSION
It can be highlighted from the results that heat treatment of encapsulated anthocyanins
increased the diffusion of anthocyanins, from WPI-LMP complexes to the environmental
médium, which already started upon the dissolution of the complexes in apple juice.
Although aggregation of WPI-LMP complexes by the heating process induced an important
diffusion of anthocyanins outside of the complexes, it may also provide a protective effect
for the remaining anthocyanins, forming hydrophobic interactions with anthocyanins and
preventing them from hydration or sheltering them from the heat. Storage conditions led to
a graduai dégradation of anthocyanins in the control solution and the supernatant for 14
days. Residual anthocyanins content in the pellet remained constant during storage. This
suggests a protection of encapsulated anthocyanins by WPI-LMP complexes. In fact,
interactions of WPI-LMP complexes with anthocyanins (i.e. hydrogen bonds or
hydrophobic interactions) may act as copigmentation effect. In addition, a spécial
disposition of the complexes, protect the anthocyanins from storage light or heat.
Substantial protection of anthocyanins during storage may require an increase of the P:Ps
ratio or the total polymer concentration in order to obtain higher mass of complex and more
anthocyanins encapsulated in the complex pellet.

118
Table 6. 1. Effect of heat treatment on free and complexed anthocyanins' concentration

(± Standard Error) in clarified apple juice
Treatment Anthocyanins (mg/1 of juice) Réduction (%)

Not heat treated After heat treatment "
Control 483.9 ±7.5 427.5 ± 7.2 11.6 ±4,5
Supernatant 360.5 ±3.2 346.4 ±1.7 3.9 ±1,4
Pellet 113.7±1.1 60.5 ±1.7 46.8 ± 4,6
3
Total 474.2 ± 4.3 406.7 ±1.6 14.2 ± 2,2
1
Total refer to pellet and supernatant
' At time 0 day
Table 6. 2. Kinetic parameters for anthocyanins dégradation during storage

(40°C/11000 lux)
Treatment klO^d"1) ti/2 (d)
Control 4.75 (0.98)a 14.7

Pellet 2.50(0.92) 28.1
ûmbers in parenthesis are détermination coefficients.
119
R:
I O glueoM
0 gluCOM
quinoidal ba»e (A)
proton transfer
réaction
+H'
0 glucoae
flavylium cation (AH+) <1)
hydration
réaction
*lon IJW
♦1M>
> " 0 gluCOM

0 glu cota
carbinol pteudobaie (B)
■il tîrrâATÏi*
•**iivi*i*jri*- 1'
DC*CÎ6
reaction
^T 0 glucoae
0 glucoae
chaicone (C)
Figure 6.1. Mechanism of structural transformation of anthocyanins in aqueous média

(Brouillard & Delaporte, 1977).
120
0 6 8 10 12 14
Time (d)
Figure 6.2. Total anthocyanins content (least squares means of mg/1 of anthocyanins) of
WPI-LMP complexes during storage (11000 lux at 40°C) at pH 3.5, with 0.4% of total
polymer, and at a P:Ps ratio of 2:1. El Control juice, E3 Supematant, ■ Pellet. Vertical
bars represent standard errors of the mean (N = 6).
121
110-
100-
s 90
5»
a 80
o
«
>> 70
O
J3
a 60
<
50-
40
0 8 10 12 14
Time (d)
Figure 6.3. Percentage of anthocyanins (least squares means of % of anthocyanins)

during storage (11 000 lux at 40°C) at pH 3.5, with 0.4% of total polymer, and at a P:Ps
ratio of 2:1. O Control juice, A Supematant, O Pellet. Vertical bars represent standard
errors of the mean (N = 6).
122
10
R2 = 0,98
o
a
S
ta
0 0 0
R2 = 0,92
I
4 9 14
Time (d)
Figure 6.4. Dégradation of anthocyanins (In (mg/l)) added to clarified apple juice at
10.6°Brix and pH 3.5 during 14 days of storage (40°C/11 000 lux). OPellet, X control
juice.
123
CHAPITRE 7: Conclusion générale

L'hypothèse de ce projet stipulait que le complexe isolât de protéine de lactosérum-pectine
faiblement méthylée est une matrice d'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles adaptée
aux aliments acides et qu'il permet de protéger ces ingrédients contre les effets
dommageables des traitements thermiques et des conditions d'entreposage. De plus, cette
matrice permet de libérer les ingrédients hydrosolubles dans un modèle de système digestif
humain. Cette hypothèse a été vérifiée expérimentalement par la préparation de complexes
insolubles d'isolat de protéine de lactosérum-pectine faiblement méthylée capables
d'encapsuler des ingrédients hydrosolubles, comme la thiamine et les anthocyanes, en
milieu acide. Cependant, le traitement thermique a eu des effets dommageables sur les
complexes entraînant une diffusion importante des ingrédients encapsulés à l'extérieur des
complexes. Par contre, les complexes ont protégé les ingrédients encapsulés durant
l'entreposage. L'évaluation de la stabilité des complexes dans un modèle de système
digestif humain a démontré que les ingrédients encapsulés étaient libérés au niveau de
l'estomac.
La formation de complexe par des interactions électrostatiques entre la L'IPL et la PFM est
fortement dépendante du pH du milieu, du ratio protéine/polysaccharide et d'un nouveau
facteur que nous avons évalué, le mode d'acidification du milieu. Le pH optimum de
formation des complexes était de 3.5 à 3.0 avec acidification du milieu avant et après
mélange des solutions d'IPL et de PFM pour un ratio P:Ps de 2:1. Avec une acidification
124
après mélange des solutions, les complexes obtenus au ratio 2:1 étaient caractérisés par une
petite taille qui était constante indépendamment du pH et par un rendement en complexes
relativement élevé, comparativement à l'acidification avant le mélange des solutions.
L'ajout de thiamine, à des concentrations élevées a affecté la masse de complexes formée
ainsi que l'efficacité d'encapsulation à pH 3.5 lorsque l'acidification du milieu était réalisée
après le mélange des solutions de polymères. Avec un maximum d'encapsulation d'environ
7% obtenu avec acidification avant le mélange des polymères, et de 4.5% obtenu après
mélange des polymères, une quantité relativement faible (70 mg) serait requise pour
satisfaire l'Apport Quotidien Recommandé en thiamine par Santé et Bien-être Canada qui
est de 1.2mg/jour.
L'encapsulation de la thiamine au ratio P:Ps 2:1 avec l'augmentation de la quantité de
thiamine ajoutée aux complexes IPL/PFM a révélé que la concentration de thiamine
n'affecte généralement ni la formation de complexe ni l'efficacité d'encapsulation, quel que
ce soit le mode d'acidification du milieu. Cependant, avec l'acidification du milieu après
mélange des polymères, la masse de complexes formés ainsi que l'efficacité
d'encapsulation ont été réduites, à pH 3.5, avec l'augmentation de la concentration de
thiamine probablement par effet de saturation. À ce pH, l'efficacité d'encapsulation des
anthocyanes avec le ratio P:Ps de 2:1 a été supérieure à celle obtenue avec le ratio 1:1. De
plus, avec acidification du milieu après mélange des polymères, l'efficacité d'encapsulation
des anthocyanes a augmenté avec l'augmentation de la quantité d'anthocyanes.

125
L'évaluation de l'effet protecteur des complexes à l'égard des ingrédients hydrosolubles
encapsulés, dans le jus de pomme clarifié après pasteurisation (90°C/12 s) et durant
l'entreposage à 40°C et à la lumière (11000 lux) pendant 14 jours, a révélé une diffusion
importante des anthocyanes encapsulées vers l'extérieur des complexes suite au traitement
thermique. Cependant, une partie des anthocyanes étaient demeurées liées aux complexes
pendant toute la période d'entreposage. Ces résultats démontrent une protection des
anthocyanes par les complexes durant l'entreposage. Cette protection pourrait s'expliquer
par les interactions hydrophobes ou des liaisons hydrogène entre les anthocyanes et les
complexes IPL/PFM qui pourraient agir comme copigments (Brouillard et al, 1989) en
empêchant l'hydratation des anthocyanes qui est accélérée par la lumière ou la chaleur.
Perspectives de recherche
Les résultats de cette thèse constituent une contribution importante dans le domaine de
l'encapsulation des ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides. Ils ouvrent la voie à
de nouvelles recherches afin d'optimiser l'utilisation des complexes IPL/PFM pour
l'encapsulation des ingrédients hydrosolubles et améliorer leur stabilité dans les conditions
qui prévalent en transformation des aliments. Ainsi, il serait intéressant d'augmenter le
rendement en complexes pour obtenir une masse de complexes plus importante. Cela
pourrait être réalisé par la formation de complexes à des ratios P:Ps supérieurs à 2:1 et
avec une concentration en polymères totaux plus élevée que 0.4%.

126
Un des avantages résultant de l'augmentation du ratio ou de la concentration en polymères
totaux serait une protection suffisante des ingrédients encapsulés due à l'augmentation de la
masse de complexes. Ceci aura pour conséquence une durée de vie plus longue des
ingrédients encapsulés pendant l'entreposage. Cette augmentation de la concentration en
polymères totaux ou du ratio P:Ps permettrait d'éviter une saturation des complexes à de
hautes concentrations d'ingrédient à encapsuler tel qu'observée au chapitre 4.
Un autre aspect fort intéressant à considérer serait l'effet de l'inclusion physique sur
l'efficacité d'encapsulation des ingrédients hydrosolubles. Pour ce faire, il serait important
de réaliser une étude de l'effet de la concentration totale en polymère, en combinaison avec
le ratio P:Ps, sur la structure microscopique des complexes. Ceci serait plus intéressant dans
le cadre de l'acidification du milieu après le mélange des polymères vu leur structure
compacte par rapport à l'acidification avant le mélange des polymères.
Il serait aussi intéressant d'évaluer les interactions électrostatiques entre complexes
IPL/PFM et les ingrédients hydrosolubles sur l'encapsulation des ces ingrédients. Une
étude comparative de l'encapsulation de plusieurs ingrédients hydrosolubles pourrait aider
à déterminer ceux qui seraient le mieux adaptés au système IPL/PFM chargé négativement.
Il a été démontré dans ce projet qu'à pH 3.5, les complexes IPL/PFM étaient chargés
négativement tandis que les anthocyanes étaient chargés positivement. Cependant, les
anthocyanes ne sont pas stables sous la forme d'ion flavilium chargé positivement. Elles
sont en équilibre avec la forme pseudobase qui est neutre. Un ingrédient hydrosoluble
cationique stable à ce pH serait un ingrédient idéal pour l'encapsulation. Puisqu'il est connu
127
que des groupements acétyles et glycosyls sont attachés aux anthocyanes, ceux-ci
pourraient être modifiés pour contenir des charges positives qui réagiraient avec les
complexes IPL/PFM (négatifs) pour renforcer l'encapsulation des anthocyanes par la
formation de liaisons électrostatiques.
La résistance des complexes au traitement thermique est un aspect important à étudier en
raison de la sensibilité des protéines de lactosérum à la chaleur. À ce niveau il serait
intéressant de trouver un équilibre entre la concentration en polymères totaux et le ratio
P:Ps afin d'obtenir une résistance maximale à la chaleur. L'utilisation de pontage avec des
ions tels que Ca"^, Mg"1-1", Na+, à de faibles concentrations pourrait être une technique
intéressante pour renforcer la résistance des complexes à la chaleur sans formation de gel.
Finalement, il faudra étudier l'utilisation des complexes IPL/PFM dans les aliments acides
complexes de type jus de fruits non clarifiés. Dans ce domaine l'utilisation de
concentrations élevées de polymères totaux pourrait se faire sans que l'on s'inquiète des
problèmes de sédimentation puisque ces jus (jus de pomme non clarifié, jus de mangue,
etc..) contiennent en général un dépôt de matières solides. Cependant il serait intéressant
d'étudier les interactions entre les complexes et les composantes des aliments pour
déterminer les facteurs qui pourraient affecter l'ajout de ces complexes dans les aliments.
128
CHAPITRE 8: Bibliographie
Abra, R. M., Anthony Hunt, C , Lau, D. T. (1984). Liposome Disposition In Vivo VI:
Delivery to the Lung. Journal of Pharmaceutical Sciences, 73,203-206.
Abrams, S. A. & Atkinson, S. A. (2003). Calcium, magnésium, phosphorus and vitamin D
fortification of complementary foods. The Journal of Nutrition, 133, 2994S-2999S.
Acharya, K. R., Ren, J., Stuart, D. I., Phillips, D. C , & Fenna R. E. (1991). Crystal
structure of human a-lactalbumin at 1.7 Â resolution. Journal ofMolecular Biology, 221,
571-581.
Acharya, K. R., Stuart, D. I., Phillips, D. C , McKenzie, H. A., & Teahan, C. G. (1994).
Models of the three-dimensional structures of echidna, horse, and pigeon lysozymes:
calcium-binding lysozymes and their relationship with a-lactalbumins. Journal of Protein
Chemistry, 13, 569-584.
Akhtar, M., Dickinson, E., Mazoyer, J., & Langendorft, V. (2002). Emulsion stabilizing
properties of depolymerized pectin. Food Hydrocolloids, 16,249-256
Alexandrescu, A. T., Evans, P. A., Pitkeathly, M., Baum, J., & Dobson, C. M. (1993).
Structure and dynamics of the acid-denatured molten globule state of a-lactalbumin: A two
dimensional NMR study. Biochemistry, 32, 1707-1718.

129
Arkbâge, K. Verwei, M., Havenaar, R., & Witthoft, C. (2003). Bioaccessibility of folie acid
and (6S)-5-methyltetrahydrofolate decreases after the addition of folate-binding protein to
yogurt as studied in a dynamic in vitro gastrointestinal model 1, 2. Journal of Nutrition,
133,3678-3683.
Axelos, M. A. V. & Thibault, J.-F. (1991). Influence of the substituents of the carboxyl
groups and of the rhamnose content on the solution properties and flexibility of pectins.
International Journal ofBiological Macromolecules, 13, 77-82.
Balassa, L. L. & Fanger, G. O. (1971): Encapsulation in the food industry. CRC Critical
Reviews in Food Technology, 2, 245-265.
Bals, A. & Kulozik, U. (2003). Effect of preheating on the foaming properties of whey
protein isolate using a membrane foaming apparatus. International Dairy Journal. 13, 903-
908.
Banville, C , Vuillemard, J. C , & Lacroix C. (2000). Comparison of différent methods for
fortifying Cheddar cheese with vitamin D. International Dairy Journal. 10,375-382.
Beaulieu, M., Turgeon, S. L., & Doublier, J.- L. (2001). Rheology, texture and
microstructure of whey proteins/low methoxyl pectins mixed gels with added calcium
International Dairy Journal, 11, 961-967.

130
Beaulieu, M., Corredig, M., Turgeon, S. L., Wicker, & Doublier, J. - L. (2005). The
formation of heat-induced protein aggregates in whey protein/pectin mixtures studied by
size exclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering détection.
Food Hydrocolloids, 19, 803-812.
Bedie, K. G., Turgeon, S.L. & Makhlouf, J. (2007). Formation of native whey protein
isolate-low methoxyl pectin complexes as a matrix for hydro-soluble food ingrédient
entrapment in acidic foods. Food Hydrocolloids, (in press).
Benichou, A., Aserin A and Garti N. (2002). Protein-polysaccharide interactions for
stabilization of food emulsions. Journal of Dispersion Science and Technology, 23: 93-123.
Benichou, A., Aserin, A., & Garti, N. (2007). O/W/O double emulsions stabilized with
WPI-polysaccharide conjugates. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and
Engineering Aspects, 297, 211-220.
Bhandari, B. R. & D'arcy, B. R. (1996). Microencapsulation of flavour compounds. Food
Australia, 48, 547-551.
Biesheuvel, P. M. & Stuart, M. A. (2004). Electrostatic free energy of weakly charged
macromolecules in solution and intermacromolecular complexes consisting of oppositely
charged polymers. Langmuir, 20, 2785-2791

131
Blanquet, S., Zeijdner, E., Beyssac, E., Meunier., J.-P., Denis, S., Havenaar, R., & Alric,
M. (2004). A dynamic artificial gastrointestinal System for studying the behavior of orally
administered drug dosage forms under various physiological conditions. Pharmaceutical
Research, 21, 585-591.
Boucher, M.-C. (2007). Impact des traitements physiques sur la stabilité des matrices
d'encapsulation à base d'isolat de protéines de lactosérum et de pectine faiblement
méthylée. Mémoire de maîtrise, Université Laval, Québec, Canada.
Bough, W. A. & Landes D, R. (1976). Recovery and nutritional évaluation of proteinaceous
solids separated from whey by coagulation with chitosan. Journal of Dairy Science, 59
1874-1880.
Bowman, W. A., Rubinstein, M. et Tan, J. S. (1997). Polyelectrolyte-gelatin complexation:
light scattering study. Macromolecules, 30, 3262-3270.
Boye, J. I., Alli, I., & Ismail, A. A. (1997). Use of differential scanning calorimetry and
infrared spectroscopy in the study of thermal and structural stability of a-lactalbumin.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 1116-1125.
Boye, J. I., Ismail, A. A, & Alli, I. (1996). Effect of physicochemical factors on the
secondary structure of P-lactoglobulin. Journal of Dairy Research, 63, 97-109.

132
Brouillard, R. & Delaporte, B. (1977). Chemistry of Anthocyanin Pigments. 2. Kinetic and
Thermodynamic Study of Proton Transfer, Hydration, and Tautomeric Reactions of
Malvidin 3-Glucoside. Journal of the American Chemical Society, 99, 8461-8468.
Brouillard, R., Mazza, G., Saad, Z., Albrecht-Gary, A. M., & Cheminât, A. (1989). The
copigmentation reaction of anthocyanins: a microprobe for the structural study of aqueous
solutions. Journal ofthe American Chemical Society, 11,2604-2610.
Bungenberg de Jong, (1949). Crystallization-coacervation-flocculation. In: H. R. Kruyt,
Colloid Science (Vol. 2) (pp232-258). Oxford Clarendon press.
Burgess, D. J. (1990). Practical analysis of complex coacervate Systems. Journal ofColloid
and Interface Science, 140, 227-238.
Burgess, D. J. (1994). Complex coacervation: micro-capsule formation. In : P. Dubin, J.
Bock, R. Davis, D. N. Schulz, C. Thies, Macromolecules Complexes in Chemistry and
biology (pp. 285-299). Springer-Verlag press.
Burgess, D. J. & Carless, J. E. (1984). Microelectrophoretic studies of gelatin and acacia
gum for prédiction of complex coacervation. Journal of Colloid and Interface Science, 88,
1-8.
133
Burgess, D. J. & Carless, J. E. (1985). Manufacture of gelatin/gelatin coacervate
microcapsules. International Journal ofPharmaceutics, 27, 61-70.
Burgess, D. J., Kwok, K. K. & Megremis, P. T. (1991) Characterization of albumin-acacia
complex coacervation. Journal ofPharmacy and Pharmacology, 43, 232-236.
Burgess, D. J. & Singh O. N. (1993). Spontaneous formation of small sized albumin/acacia
coacervate particles. Journal ofPharmacy and Pharmacology, 43,232-236.
Burova, T. V., Grinberg, N. V., Golubeva, I. A., Mashkevich, A. Y., Grinberg, V. Y.,
Tolstoguzov, V. B. (1999) . Flavour release in model bovine sérum albumin/pectin/2-
octanone Systems. Food Hydrocolloids, 13, 7-14.
Burton, B. A. & Brant, D. A. (1983). Comparative flexibility, extension, and conformation
of some simple polysaccharide chains. Biopolymers, 22,1769-1792.
Cannon, J. (1993). Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.
Journal ofpharmaceutical sciences, 82,435-446.
Canteri-Schemin, M. H., Fertonani, H. C. R., Waszczynskyj, N., & Wosiacki. (2005).
Extraction of pectin from apple pomace. Brazilian Archieves of Biology and Technology,
48, 259-266.
134
Chandra, N., Brew, K., & Acharya, R. (1998). Structural évidence for the présence of a
secondary calcium binding site in human R-lactalbumin. Biochemistry, 37, 4767-4772.
Cheftel J.-C, Cuq J.-L. & Lorient D. (1985). Protéines alimentaires. In: Cheftel, J.-C, Cuq,
J.-L., & Lorient, D. Biochimie-Propriétés Fonctionnelles - Valeur Nutritionnelle -
Modifications Chimiques, (pp. 156-192). Technique et Documentation Lavoisier.
Chen, C-C, Tu, Y.-Y, & Chang, H.-M. (1999). Efficiency and protective effect of
encapsulation of milk immunoglobulin G in multiple emulsion. Journal of Agriculture and
Food Chemistry, 47, 407-410.
Chiancone, E. & Gattoni, M. (1991). Sélective extraction of native pMactoglobulin from
whey. Journal o/Chromatography, 539,455-463.
Chilvers, G. R., Gunning, A. P., & Morris, V. J. (1988). Coacervation of gelatine-XM6
mixture and their use in microencapsulation. Carbohydrate Polymers, 8, 55-61
Cho, Y.-H., Lee, J.-J., Park, I.-B., Huh, C-S., Baek, Y.-J., & Park J. (2005). Protective
effect of microencapsulation consisting of multiple emulsification and heat gelation
processes on immunoglobulin in yolk. Journal of Food Science, 70, E148-E151.

135
Clémente, D. A., Marzotto, A., & Valle, G. (1988). Crystal and molecular structure of
thiamine monochloride. Journal of Crystallographic and Spectroscopic Research, 18, 147-
156.
Clifford, M. N. (2000). Anthocyanins - nature, occurrence and dietary burden. Journal of
the Science of Food and Agriculture, 80, 1063-1070.
Dalgleish, D. G. (1997). Adsorption of protein and the stability of emulsions. Trends in
Food Science & Technology, 8,1-6.
Daniels, R. & Mittermaier E. M. (1995). Influence of pH adjustment on microcapsules
obtained from complex coacervation of gelatin and acacia. Journal of Microencapsulation,
12, 591-599.
De Kruif, C. G., Weinbreck, F., & de Vries, R. (2004). Complex coacervation of proteins
and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 9, 340-349.
De Vries, R. (2004). Monte Carlo simulations of flexible polyanions complexing with whey
proteins at their isoelectric point. Journal of Chemical Physics, 120, 3475-3481.
De Vries, R., Weinbreck, F., de Kruif, C. G. (2003). Theory of polyelectrolyte adsorption
on heterogeneously charged surfaces applied to soluble protein-polyelectrolyte complexes.
Journal of Chemical Physics, 118, 4649-4659.

136
De Wit, J. N. (1990). Thermal stability and functionality of whey proteins. Journal ofDairy
Science, 73, 3602-3612
DeZarn, T. J. (1995). Food ingrédient encapsulation: an overview. ACS Symposium Séries,
590, 74-86.
Dickinson, E. (1998). Stability and rheological implications of electrostatic milk protein-
polysaccharides interactions. Trends in food science and technology, 9,347-354.
Dickinson, E. (2003). HydrocoUoids at interfaces and the influence on the properties of
dispersed Systems. Food HydrocoUoids, 17,25-39.
Dickinson, E.; Pawlowski, K. (1996) Effect of high-pressure treatment of protein on the
rheology of flocculated emulsions containing protein and polysaccharide. Journal of
Agricultural and Food Chemisîry, 44, 2992-3000.
Dickinson, E., Semenova, M. G., Antipova, A. S., & Pelan, E. G. (1998). Effect of high-
methoxy pectin on properties of casein-stabilized emulsions. Food HydrocoUoids, 12, 425-
432
137
Djordjevic, D., Kim, H.-J., McClements, D. J., & Decker, E. A. (2004a). Physical stability
of whey protein-stabilized oil-in-water emulsions at pH 3: potential co-3 fatty acid delivery
Systems (Part A). Journal of Food Science, 69, C351-C355.
Djordjevic, D., McClements, D. J., & Decker, E. A. (2004b). Oxidative Stability of Whey
Protein-stabilized Oil-in-water Emulsions at pH 3: Potential _-3 Fatty Acid Delivery
Systems (Part B). Journal of Food Science, 69, C356-C362.
Doco, T., Williams, P., Vidal, S., Pellerin, P. (1997). Rhaninogalacturonan II, a dominant
polysaccharide in juices produced by enzymic liquéfaction of fruits and vegetables.
Carbohydrate Research, 297, 181-186.
Duclairoir, C , Nakache E, Marchais H et Orecchioni A.-M. (1998). Formation of gliadin
nanoparticles : Influence of the solubility parameter of the protein solvent. Colloid and
Polymer Science, 276, 321-327.
Dunn, J. T. (2003). Iodine should be routinely added to complementary foods. The Journal
of Nutrition, 133, 3008S-3010S.
Dziezak, J. D. (1988). Microencapsulation and encapsulated ingrédients. Food Technology,
42,136-153.
138
Ersus, S. & Yurdagel, U. (2007). Microencapsulation of anthocyanin pigments of black
carrot (Daucuscarota L.) by spray drier. Journal of Food Engineering, 80, 805-812.
Evageliou, V., Richardson, R. K., & Morris, E. R. (2000) Effect of pH, sugar type and
thermal annealing on high-methoxy pectin gels. Carbohydrate Polymers, 42, 245-259.
Foegeding, E. A.; Kuhn, P. R.; Hardin, C. C. (1992). Spécifie divalent cation-induced
changes during gelation of pMactoglobulin. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
40,2092-2097.
Galazka, V. B., Ledward, D. A., Sumner, I. G., & Dickinson, E. (1997). Influence of high
pressure on bovine sérum albumin and its complex with dextran sulphate. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 45, 3465-3471.
Galazka, V. B., Smith D., & Ledward, D. A. (1999a). Influence of ovalbumin with
sulphated polysaccharides: effects of pH, ionic strength, heat and high pressure treatment.
FoodHydrocolloids, 13, 81-88.
Galazka, V. B., Smith D., Ledward, D. A. & Dickinson, E. (1999b). Complexes of bovine
sérum albumin with sulphated polysaccharides: effects of pH, ionic strength and high
pressure treatment. Food Chemistry, 64, 303-310.
Ganz AJ. (1974). How gum reacts with proteins. Food Engineering, 6, 67-69.
139
Garti, N. (1997). Progress in stabilization and transport phenomena of double emulsions in
food applications. Lebensmittel - Wissenschaft und Technologie, 30, 222-235.
Gibbs, B. F., Kermasha, S., Alli, L, & Mulligan, C. N. (1999). Encapsulation in the food
industry: a review. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 50, 213-224.
Girard M., Sanchez C , Laneuville, S. L, Turgeon, S. L., & Gauthier, S. F. (2004).
Associative phase séparation of pMactoglobulin/pectin solutions: a kinetic study by small
angle static light scattering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 35, 15-22.
Girard, M., Turgeon, S., & Gauthier, S. (2002). Interbiopolymer complexing between 0-
lactoglobulin and low- and high-methylated pectin measured by potentiometric titration and
ultrafiltration. Food Hydrocolloids, 16, 585-591.
Girard, M., Turgeon, S., & Gauthier, S. (2003). Quantification of the interactions between
pMactoglobulin and pectin through capillary electrophoresis analysis. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 51, 6043-6049.
Giusti, M. M., Rodriguez-Saona, L. E., Griffin, D., & Wrolstad, R. E. (1999). Electrospray
and tandem mass spectroscopy as tools for anthocyanin characterization. Journal of
Agricultural Food and Chemistry, 47,4657-4664.

140
Hambling S.G., McAlpine A.S. & Sawyer L. (1992). P-Lactoglobulin. In: P.F. Fox,
Advanced Dairy Chemistry 1: Proteins, (pp. 141-190). Elsevier Sci. Publisher Ltd.
Hansen, P. M. T., Hidalgo, J., & Gould, I. A. (1971). Réclamation of Whey Protein with
Carboxymethylcellulose. Journal of dairy science, 54, 830-834.
Harding, S., Jumel, K., Kelly, R., Gudo, E., Horton, J. C. et Mitchell, J. R. (1993). The
structure and nature of protein-polysaccharide complexes. In K. D. Schwenke & R. Mothes,
Food Proteins, Structure and Functionality (pp. 216-226), Weinheim: VCH.
Health Canada (2007). Multi-vitamine/minerai supplément monograph, pp. 1-46.
http://www.hc-sc.gc.ca/dhp-mps/alt_formats/hpfb-dgpsa/pdf/
prodnaWmultivit_min_mono_e.pdf
Hedges, A. R., Shieh, W. J., & Sikorski, C. T. (1995). Use of cyclodextrins for
encapsulation in the use and treatment of food products. ACS Symposium Séries, 590, 60-
71.
Hiraoka, Y., Segawa, T., Kuwajimar, K., Sugai, S., & Murai, N. (1980). a-Lactalbumin: a
calcium metalloprotein. Biochemical and Biophysical Research Communications, 95, 1098-
1104.
141
Huang, Y.-Y., Chung, T.-W., & Tzeng, T.-W. (1997). Drug release from PLA/PEG
microparticlates. International Journal of Pharmaceutics, 156, 9-15.
Imeson, A.P.; Ledward, D.A.; Mitchell, J.R. (1977). On the nature on the interaction
between some anionic polysaccharides and proteins. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 28, 669-672.
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Compendium of Chemical
Technology 1997.
Ishii, T. (1997). O-acetylated oligosaccharides from pectins of potato tuber cell walls. Plant
Physiology, 11 3,1265-1 272.
Jackson, L. S. & Lee K. (1991). Microcapsulation and the food industry. Lebensmittel -
Wissenschaft und Technologie, 24,289-297.
Jeyarajah, S. Allen, J.C. (1994). Calcium binding and salt-induced structural changes of
native and preheated pMactoglobulin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, 80-
85.
Jimenez, M., Garcia, H. S., & Beristain, C. I. (2004). Spray-drying microencapsulation and
oxidative stability of conjugated linoleic acid. European Food Research and Technology,
219, 588-592.
142
Jono, K., Ichikawa, H., Miyamoto, M., & Fukumori, Y. (2000). A review of particulate
design for pharmaceutical powders and their production by spouted bed coating. Powder
Technology, 113, 269-277.
Jouzel, B., Pennarun, A.-L., Prost, C , Renard, D., Poncelet, D., & Demainay, M. (2003).
Encapsulation of a lipid precursor, the eicosapentaenoic acid, to study the development of
the Crassostrea gigas oyster flavours. Journal ofmicroencapsulation, 20, 35-46.
Kaibara, K., Okazaki, T., Bohidar, H. B. et Dubin, P. L. (2000). pH-induced coacervation
in complexes of bovine sérum albumin and cationic polyelectrolytes. Biomacromolecules,
1,100-107.
Kella, N. K.; Kinsella, J.E. (1988). Structural stability of P-lactoglobulin in the présence of
kosmotropic salts. International Journal of Peptide and Protein, 32, 396-405.
Kerstens, S., Murray, B. S., & Dickinson, E. (2005). Confocal microscopy of heat-induced
aggregation and gelation of P-lactoglobulin in présence of non-ionic surfactant. Food
Hydrocolloids, 19, 625-633.
Kertesz, Z. I. (1951). The pectic substances (PP. 161-168). Interscience publishers Inc.
143
Kim, N. C , Jeon, B. J., & Kwak, H. S. (2006). In Vitro Study of Microencapsulated
Isoflavone and P-Galactosidase. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 2582-
2586.
King, A. H. (1995). Encapsulation of food ingrédients: A review of available technology,
focusing on hydrocolloids. ACS Symposium Séries, 590, 26-39.
Kinsella J.E. & Whitehead, D. M. (1989). Proteins in whey: chemical, physical, and
functional properties. Advances in Food and Nutrition Research, 343-438.
Kirca, A., Zkan, M. O., & Cemeroglu, B. (2003). Thermal stability of black carrot
anthocyanins in blond orange juice. Journal of Food Quality, 26, 361-366.
Kirca, A., Zkan, M. O., & Cemeroglu, B. (2006). Stability of black carrot anthocyanins in
various fruit juices and nectars. Food Chemistry, 97. 598-05.
Kirca, A., Zkan, M. O., & Cemeroglu, B. (2007). Effects of température, solid content and
pH on the stability of black carrot anthocyanins. Food Chemistry, 101,212-218.
Kondo, T., Hafez, E., Abdel-Monem, H., Muramatsu, N., El-Haras, S., El-Gibaly, I. (1996).
Préparation and évaluation of microencapsulated sulfadiazine resin comp\ex.Powder
Technology, 88, 101-105.

144
Kontopidis, G, Holt, C , & Sawyer, L. (2002). The ligand-binding site of bovine 0-
lactoglobulin: évidence for a fonction? Journal ofMolecular Biology, 318, 1043-1055.
Kontopidis, G., Holt, C , & Sawyer, L. (2004). Invited Review: /Mactoglobulin: binding
properties, structure, and fonction. Journal ofDairy Science, 87, 785-796.
Kronman, M, J. & Andreotti, R. E. (1964). Inter- and intramolecular interactions of a-
lactalbumin. I. The apparent heterogeneity at acid pH. Biochemistry, 3,1145-1151.
Kronman, M. J., Andreotti, R., & Vitols, R. (1964). Inter- and intramolecular interactions
of a-lactalbumin. II. Aggregation reactions at acid pH. Biochemistry, 3,1152-1160.
Kronman, M. J., Holmes, G. L., & Robbins, F. M. (1967). Inter-and intramolecular
interactions of a-lactalbumin VIII. The alkaline conformational change. Biochemica et
Biophysica Acta, 133, 46-55.
Kuhn, P.R. Foegeding, E.A. (1991). Minerai sait effects on whey protein gelation. Journal
ofAgricultural and Food Chemistry, 39, 1013-1016.
Kuwajima, K. (1989). The molten globule state as a clue for understanding the folding and
cooperativity of globular-protein structure. PROTEINS: Structure, Function, and Genetics,
6, 87-103.
145
Lai, M.-K. & Tsiang, R. C.-C. (2005). Microencapsulation of acetaminophen into poly(L-
lactide) by three différent emulsion solvent-evaporation methods. Journal of
Microencapsulation, 22,261-274.
Lamprecht, A., Schaëferj U., & Lehr, C.-M. (2001). Influences of process parameters on
préparation of microparticle used as a carrier System for Q-3 unsaturated fatty acid ethyl
esters used in supplementary nutrition. Journal of microencapsulation, 18, 347-357.
Laneuville, S. I., Paquin, P. et Turgeon, S. L. (2000). Effect of préparation conditions on
the characteristics of whey protein-xanthan gum complexes. Food Hydrocolloids, 14, 305-
314.
Larsson, M., Minekus, M., & Havenaar R. (1997). Estimation of the bioavailability of iron
and phosphorus in cereals using a dynamic in vitro gastrointestinal model. Journal ofthe
Science of Food and Agriculture, 74, 99-106.
Ledward, D. A. (1993). Creating textures from mixed biopolymer Systems. Trends in Food
Science & Technology, 41, 402-405.
Ledward, D. A. (1994). Protein-polysaccharide interactions. In N. S. Hettiaracchy & C. R.
Ziegler Protein functionality in food Systems (pp. 225-259). Marcel Dekker.

146
Lee, J., Dust, W., & Wrolstad, R. E. (2005). Détermination of total monomeric
anthocyanins pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the
pH differential method: collaborative study. Journal of AOACInternational, 88, 1269-1278
Léman, J., Dolgan, T., Smoczynski, M., & Dziuba, Z. (2005). Fractal characteristics of
microstructure of beta-lactoglobulin préparations and their emulsifying properties.
Electronic Journal ofPolish Agricultural Universities, 8(3) #29.
Liu, X.-D., Atarashi, T., Furuta, T., Yoshii, H., Aishima, S., Ohkawara, M., & Linto, P.
(2001). Microencapsulation of emulsified hydrophobic flavors by spray drying. Drying
Technology, 19, 1361-1374.
Lucinda-Sylva, R. M. & Evangelista, R. C. (2003). Microspheres of alginate-chitosan
containing isoniazid. Journal of Microencapsulation, 20, 145-152.
Luzzi, L. A. (1970). Microencapsulation. Journal of Pharmaceutical Sciences, 59, 1367-
131376.
Matsufuji, H., Kido, H., Misawa, H, Yaguchi J., Otsuki, T., Chino, M., Takeda, M., &
Yamagata, K. (2007). Stability to light, heat, and hydrogen peroxide at différent pH values
and DPPH radical scavenging activity of acylated anthocyanins from red radish extract.
Journal of Agriculture and Food Chemistry, 55, 3692-3701.

147
Mattison, K. W., Brittain I. J. & Dubin P. L. (1995). Protein-polyelectrolyte boundaries.
Biotecnologyprogress, 11, 632-637.
Mattison, K.W.; Dubin, P. L.; Brittain, L J. (1998). Complex formation between bovine
sérum albumin and strong polyelectrolytes: effects of polymer charge density. Journal of
Physical ChemistryB, 102, 3830-3836.
Mazza, G. & Brouillard, R. (1990). The mechanism of co-pigmentation of Anthocyanins in
aqueous solutions. Phytochemistry, 29, 1097-1102.
Mazza, G. & Miniati, E. (1993). Chapterl. Introduction. In: G. Mazza, E. Miniati,
Anthocyanins in Fruits, Vegetables, and Grains (pp 1-20). CRC Press Inc.
Mazzaracchio, P., Pifferi, P., Kindt, M., Munyaneza, A., & Barbiroli, G. (2004).
Interactions between anthocyanins and organic food molécules in model Systems.
International Journal ofFood Science and Technology, 39, 53-59.
Minekus, M. Jelier, M., Xiao, J.-Z., Kondo, S., Iwatsuki, K., Kokubo, S., Bos, M.,
Dunnewind, B., & Havenaar, R. (2005). Effect of partial hydrolyzed guar gum (PHGG) on
the bioaccessibility of fat and cholestérol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50,
2308-2312.
148
Mishra, S., Mann, B., & Joshi, V. K. (2001). Functional improvement of whey protein
concentrate on interaction with pectin. FoodHydrocolloids, 15, 9-15.
Morais, H., Ramos, C , Forgacs, E., Cserhati, T., & Oliviera, J. (2002). Influence of storage
conditions on the stability of monomeric anthocyanins studied by reversed-phase high-
performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B, 770, 297-301.
Nangia-Makker, P.; Conklin, J.; Hogan, V.; Raz, A. (2002) Carbohydrate-binding proteins
in cancer, and their ligands as therapeutic agents. Trends in Molecular Medicine, 8, 187-
192.
Nath, S., Patrickios C. S. And Hatton T. A. (1995). Turbidimetric titration study of the
interaction of proteins with acrylic polyampholytes. Biotecnology progress, 11, 99-103.
Nii, T. & Ishii, F. (2005). Encapsulation efficiency of water-soluble and insoluble drugs in
liposomes prepared by the microencapsulation vesicle method. International Journal of
Pharmaceutics, 298, 198-205.
Oliveira, K. M. G., Valente-Mesquita, V, L., Botelho, M. M., Sawyer, L., Ferreira, S. T., &
Polikarpov I. (2001). Crystal structures of bovine b-lactoglobulin in the orthorhombic space
group C2221. Structural différences between genetic variants A and B and features of the
Tanford transition. European Journal of Biochemistry, 268,477-483.

149
O'Neill, M., Albersheim, P., & Darvill, A. (1990). The pectic polysaccharides of primary
cell walls. In: D.M. Dey, Methods in Plant Biochemistry, Vol. 2. (pp. 415-441). Académie
Press.
Ouyang, W., Chen, H., Jones, M. L., Metz, T., Haque, T., Martoni, C , & Prakash, S.
(2004). Artificial cell microcapsule for oral delivery of live bacterial cells for therapy:
design, préparation, and in-vitro characterization. Journal of Pharmaceutical Sciences, 7,
315-324.
Pan, Y., Li, Y.J., Zhao, H.-Y., Zheng, J.-M., Xu, H., Wei, G., Hao, J.-S., & Cui, F.-D.
(2002). Bioadhesive polysaccharide in protein delivery system: chitosan nonoparticles
improve the intestinal absorption of insulin in vivo. International Journal of
Pharmaceutics, 249,139-147.
Park, J. M., Muhoberac B. B., Dublin P. L. and Xia J. (1992). Effect of protein charge
heterogeneity in protein-polyelectrolyte complexation. Macromolecules, 25,290-295.
Patwardhan, S. A. & Das K. G. (1983). Microencapsulation. In K. G. Das, Controlled-
released technology (pp. 121-141). John Wiley & sons.
Peltonen, L., Aitta, J., Hyvônen, S., Karjalainen, M., & Hirvonen, J. (2004). Improved
entrapment efficiency of hydrophilic drug substance during nanoprecipitation of
poly(l)lactide nanoparticles. American Association of Pharmaceutical Scientists

150
PharmSciTech, 5,1-6.
Perez-Vicente, A., Gil-Izquierdo A., & Garcia-Viguera, C. (2002). In vitro gastrointestinal
digestion study of pomegranate juice phenolic compounds, anthocyanins, and vitamin C.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2308-2312.
Permyakov, E. A. &, Berliner, L. J. (2000). a-Lactalbumin: structure and function. FEBS
Letters, 473,269-274.
Peters, H. J. W., van Bommel, E. M. G. et Fokkens, J. G. (1992). Effect of gelatin
properties in complex coacervation processes. Drug Development and Industrial
Pharmacy, 18,123-134.
Phares, R. E. Jr. & Sperandio, G. J. (1964). Préparation of a phase diagram for
coacervation. Journal of Pharmaceutical Sciences, 53, 518-521.
Picot, A., Lacroix, C. (2004). Encapsulation of bifidobacteria in whey protein-based
microcapsules and survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt.
International Dairy Journal, 14 505-515.
Ragona, L., Fogolari, F., Catalano, M., Ugolini, R., Zetta, L., & Molinari, H. (2003). EF
loop conformational change triggers ligahd binding in P-lactoglobulins. The journal of
Biological Chemistry, 278, 38840-38846.

151
Ralet, M. - C, Dronnet, V., Buchholt, H. C, & Thibault, J. - F. (2001). Enzymatically and
chemically de-esterified lime pectins: characterisation, polyelectrolyte behaviour and
calcium binding properties. Carbohydrate Research, 336,117-125.
Rao, D. R., Chawan, C. B., & Veeramachaneni, R. (1995). Liposomal encapsulation of p-
galactosidase: comparison of two methods of encapsulation and in vitro lactose
digestibility. Journal ofFood Biochemistry, 18,239-251.
Relkin P. (1998). Reversibility of heat-induced conformational changes and surface
exposed hydrophobic clusters of (3-lactoglobulin: their rôle in heat-induced sol-gel state
transition. Biological Macromolecules, 22, 59-66.
Relkin P., Launay, B., & Eynard, L. (1993). Effect of sodium and calcium addition on
thermal denaturation of Apo-a-lactalbumin: a differential scanning calorimetric study.
Journal ofDairy Science, 76, 36-47.
Renard, C. M. G. C. & Thibault, J.-F. (1993). Structure and properties of apple and sugar-
beet pectins extracted by chelating agents. Carbohydrate Research, 244, 99-114.
Report of the Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Référence
Intakes and its Panel on Folate, Other B Vitamins, and Choline and Subcommittee on
Upper Référence Levels of Nutrients, Food and Nutrition Board, Institute of Medicine
152
(1998). Dietary Référence Intakes for Thiamin, Riboflavin, Niacin, Vitamin B6, Folate,
Vitamin B12, Pantothenic Acid, Biotin, and Choline.
http://www.nap.edu/catalog/6015.html.
Ribeiro, A., Arnaud P., Frazao S, Venâncio F and Chaumeil J. C. (1997). Development of
vegetable extracts by microencapsulation. Journal of Microencapsulation. 14, 735-742.
Ridley, B. L., O'NeiU, M. A., & Mohnen, D. (2001). Pectins: structure, biosynthesis, and
oligogalacturonide-related signaling. Phytochemistry, 57, 929-967.
Risch, S. J. (1995). Encapsulation: Overview of uses and techniques. ACS Symposium
Séries, 590, 2-7.
Robin, C. (2002). Commercial pectin préparations. In: G. B. Seymour & J. P. Knox,
Pectins and their Manipulation, (pp 222-241). CRC Press Inc..
Rutten, A.A.C.M., Bouwman, W.G., & van der Leeden, M.C. (2002). |3-Lactoglobulin as
an idéal random polymer coil. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering
Aspects, 210, 243-252.
Samant, S.K.; Singhal, R.S.; Kulkarni, P.R.; Rege, D.V. (1993) Protein-polysaccharide
interactions: a new approach in food formulation. International Journal of Food Science
and Technology, 28, 547-562.

153
Sanchez, C. & Paquin, P. (1997). Protein and protein-polysaccharide microparticles. In S.
Damodaran & A. Paraf, Food Proteins and Their Applications (pp. 503-528). Marcel
Dekker, Inc.
Sanchez, C. & Renard, D. (2002). Stability and structure of protein-polysaccharide
coacervates in the présence of protein aggregates. International Journal of Pharmaceutics,
242,319-324.
Savant, V. D. and Torres, J. A. (2000). Chitosan-based coagulation agents for treatment of
cheddaicheesewhey.Biotechnologyand Progress, 16, 1091-1097.
Sawyer, L.; Kontopidis, G. (2000).The core lipocalin, bovine pMactoglobulin. Biochimica
et Biophysica Act, 1482, 136-148.
Schlameus, W. (1995). Centrifugal Extrusion Encapsulation. ACS Symposium Séries. 590,
96-103.
Schmitt, C. (2000). Etude de la coacervation complexe entre la P-lactoglobuline et la
gomme d'acacia en solution aqueuse. Thèse de Doctorat, Institut National Polytechnique de
Lorraine, France.
154
Schmitt, C , Sanchez C , Desobry-Banon S. & Hardy J. (1998). Structure and
technorunctional properties of protein-polysaccharide complexes. Critical reviews in food
science and nutrition, 38, 689-753.
Schmitt, C , Sanchez, C, Thomas, F. & Hardy, J. (1999). Complex coacervation between
pMactoglobulin and acacia gum in aqueous médium. Food Hydrocolloids, 13, 483-496.
Schmitt, C , Sanchez, C , Despond, S., Renard, D., Thomas, F., & Hardy, J. (2000). Effect
of protein aggregates on the complex coacervation between b-lactoglobulin and acacia gum
at pH 4.2. Food Hydrocolloids, 14, 403-413.
Schols H. A. and Voragen A. G. J. (2002). The chemical structure of pectins. In: G. B.
Seymour, J. P. Knoox, Pectins and their manipulation (pp 1-29). CRC Press Inc.
Schrooyen, P. M. M., van der Meer, R., & De Kruif, C. G. (2001). Microencapsulation: its
application in nutrition. Proceedings ofthe Nutrition Society, 60,475-479.
Semenova, M. G., Bolotina V. S. and Dmitrochenko A. P. (1991). The factors affecting the
compatibility of sérum albumin and pectinate in aqueous médium. Carbohydrate polymers,
15,367-385.
155
Shima, M., Tanaka, M., Kimura, Y., Adachi, S., & Matsuno, R. (2005). Enhancement in
transport of a hydrophilic marker through intestinal epithelial cell (Caco-2) monolayer by
W/O/W multiple emulsion containing C8TG. Food Hydrocolloids, 19, 321-328.
Shin, K.-S., Kiyohara, H., Matsumoto, T., Yamada, H. (1998). Rhamnogalacturonan II
dimers cross-linked by borate diesters from the leaves of Panax ginseng C.A. Meyer are
responsible for expression of their IL-6 production enhancing activities. Carbohydrate
Research, 307, 97-106.
Sinclair, H. M. (1979). Optimisation of food nutrient composition. In: G. G. Birch, K. J.
Parker, Food and Health: science and technology (pp. 425-440). Applied Science
Publishers Ltd.
Singh, O. N. & Burgess G. J. (1989). Characterization of albumin-alginic acid complex
coacervation. Journal ofPharmacy and Pharmacology, 41, 670-673.
Soottitantawat, A., Bigeard, F., Yoshii,H., Furuta, T., Ohkawara, M., & Linko, P. (2005a).
Influence of emulsion and powder size on the stability of encapsulated d-limonene by spray
drying. Food Science and Emerging Technologies, 6, 107-114.
Soottitantawat, A., Takayama, K., Okamura, K., Muranaka, D., Yoshii, H., Furuta, T.,
Ohkawara, M., & Linko, P. (2005b). Microencapsulation of 1-menthol by spray drying and
156
its release characteristics. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 6, 163-
170.
Soper, J. (1995). Utilization of Coacervated Flavors. ACS Symposium Séries, 590,104-112.
Strege, M. A., Dublin P. L., West, J. S., & Flinta, C. D. (1990). Protein séparation via
polyelectrolyte complexation. ACS Symposium Séries, 427, 66-79.
Syrbe, A., Bauer W. J., Klostermeyer H. (1998). Polymer science concepts in dairy System
- An overview of milk protein and food hydrocolloid interaction. International Dairy
Journal, 8,179-193.
Szpunar, J., Pellerin, P., Makarov, A., Doco, T., Williams,P., & Lobinski, R. (1999).
Speciation of metal-carbohydrate complexes in fruit and vegetable samples by size-
exclusion HPLC-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 639-644.
Tahiri, M., Pellerin, P., Tressol, J. C , Doco, T., Pépin, D., Rayssiguier, Y., & Coudray, C.
(2000). The rhamnogalacturonan-II dimer decreases intestinal absorption and
tissue accumulation of lead in rats. Journal of Nutrition, 130, 249-253.
Tayade, P. T., & Kale, R. D. (2004). Encapsulation of water-insoluble drug by a cross-
linking technique: effect of process and formulation variables on encapsulation efficiency,

157
particle size, and in vitro dissolution rate. AAPS PharmSci, 6 (1) #12 ppl-8,
(http://www.aapspharmsci.org).
Thibault, J. F, & Rinaudo, M. (1985). Interactions of mono- and divalent counterions with
alkali- and enzyme-deesterified pectins in salt-free solutions. Biopolymers, 24,2131-2143.
Tirkkonen, S. Turakka, L. et Paronen, P. (1994). Microencapsulation of indpmethacin by
gelatin-acacia complex coacervation in présence of surfactants. Journal of
Microencapsulation, 11, 615-626.
Tiyaboonchai, W., Woiszwillo, J., & Middaugh, C. R. (2001). Formulation and
characterization of amphotericin P-polyethylenimine-dextran sulfate nanoparticles. Journal
Pharmaceutical Sciences, 90, 902-914.
Todd, R. D. (1970). Microencapsulation and flavour industry. Theflavour Industry, 1, 768-
771.
Tolstoguzov, V. B. (1986). Functional properties of protein-polysaccharide mixtures. In J.
R. Mitchell & D. A. Ledward, Functional properties of macromolecules (pp. 385-415).
Elsevier Applied Science.
Tolstoguzov, V.B. (1991). Functional properties of food proteins and rôle of protein-
polysaccharide interaction. Food Hydrocolloids, 4,429-468.

158
Tolstoguzov, V. B. (1997). Protein-polysaccharide interactions. In S. Damodaran & A.
Paraf, Food Proteins and Their Applications (pp. 171-198). Marcel Dekker, Inc.
Turker, N., Aksay, S., & Ekiz, H. I. (2004). Effect of storage température on the stability of
anthocyanins of a fermented black carrot (Daucus carota var. L.) beverage: shalgam.
Journal of Agriculture and Food Chemistry, 52, 3807-3813.
Vandegaer, J. E. (1973). Encapsulation by coacervation. In J. E. Vandegaer,
Microencapsulation: Processes and Applications, (pp 21-37). Penum Press.
Varunsatian, S., Watanabe, K., Hayakawa, S., & Nakamura, R. (1983). Effects of Ca**,
Mg**, and Na+ on heat aggregation of whey protein concentrâtes. Journal ofFood Science,
48,42-46.
Verheul M., Roefs S.P.F.M., Mellema J. & de Kruif K.G. (1998). Kinetics of heat-induced
aggregation of P-lactoglobulin. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 46, 896-903.
Versic, R. J. (1988). Flavor encapsulation. ACS Symposium Séries, 370,1-6.
Verwei, M., Arkbâge, K., Havenaar, R., van den Berg, H., Witthoft, C , & Schaafsma, G.
(2003). Folie acid and 5-methyltetrahydrofolate in fortified milk are bioaccessible as

159
determined in a dynamic in vitro gastrointestinal model. Journal of Nutrition, 133, 2377-
2383.
Verwei, M., Arkbâge, K., Mocking, H., Havenaar, R. & Groten, J. (2004). The binding of
folie acid and 5-methyltetrahydrofolate to folate-binding proteins during gastric passage
differs in a dynamic in vitro gastrointestinal model. Journal of Nutrition, 134, 31-37,2004.
Vincken, J. P., Schols, H. A., Oomen, R. J. F. J., McCann, M. C , Ulvskov, P., Voragen, G.
J., & Visser, R. G. F. (2003). If homogalacturonan were a side chain of hamnogalacturonan
I. Implications for cell wall architecture. Plant Physiology, 132, 1781-1789.
Voragen, A. G. J., Pilnik, W., Thibault, J.-F., Axelos, M. A. V., & Renard, C. M. G. C.
(1995). Pectins. In: A. M. Stephen, Food polysaccharides and their applications (pp. 287-
339). CRC Press Inc..
Walkinshaw, M. I. & Arnott, S. (1981). Conformations and interactions of pectins
II. Models for junction zones in pectinic acid and calcium pectate gels. Journal of
Molecular Biology, 153, 1075-1085.

<
Wang, Y.-F., Gao J. Y. and Dubin P. L. (1996). Protein séparation via polyelectrolyte
coacervation: selectivity and efficiency. Biotechnology Progress. 12: 356-362.

160
Weinbreck, F., de Vries, R., Schrooyen, P., & de Kruif, C. G. (2003). Complex
coacervation of whey proteins and gum arabic. Biomacromolecules. 4, 293-303.
Weinbreck, F., Nieuwenhuijse, H., Robijn, G. W., & de Kruif, C. G. (2004). Complexation
of whey proteins with carrageenan. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3550-
3555.
Weinert, I. A. G., Solms, J., & Escher, F. (1990). Diffusion of anthocyanins during
processing and storage of canned plums. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 23,
396-399.
Weiss, J., Scherze, L, & Muschiolik, G. (2005). Polysaccharide gel with multiple emulsion.
Food Hydrocolloids, 19, 605-615.
Wen, Y.-P. & Dubin, P. L. (1997). Potentiometric studies of the interactions of bovine
sérum albumin and poly(dimethyldiallylammonium chloride). Macromolecules, 30, 7856-
7861.
Willats, W. G. T., Knox, J. P., & Mikkelson, J. D. (2006). Pectin: new insights into an old
polymer are starting to gel. Trends in Food Science & Technology, 17, 97-104.
161
Wong, V. K. (1998). Microencapsulation of amino acids for prawn feed additives.
Undergraduate Thesis, Department of Chemical Engineering of the University of
Queensland, Australia.
Wong, D. W. S., Camirand W.M. & Pavlath A.E. (1996). Structures and functionalities of
milk proteins. CRC Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 36, 807-844.
Woollard, D. C. & Indyk, H. E. (2002). Rapid détermination of thiamine, riboflavin,
pyridoxine, and niacinamide in infant formulas by liquid chromatography. Journal of
AOAC International, 85, 945-951.
Xia, J.; Dubin, P.L. (1993). Dynamic and electrophoretic light scattering of a water-soluble
complex formed between pepsin and poly(ethylene glycol). Macromolecules, 26, 6688-
6690.
Xiong, S., Melton, L. D., Easteal, A. J., & Siew, D. (2006). Stability and antioxidant
activity of black currant anthocyanins in solution and encapsulated in glucan gel. Journal of
Agricultural Food and Chemistry, 54, 6201-6208.
Xu, X., Fu, Y., Hu, H., Duan, Y. & Zhang, Z. (2006). Quantitative détermination of insulin
entrapment efficiency in triblock copolymeric nanoparticles by high-performance liquid
chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomédical Analysis, 41,266-273.

162
Yamada, T., Komiya, T. & Akaki, M. (1980). Formation of an inclusion complex of
anthocyanin with cyclodextrin. Agricultural andBiological Chemistry, 44, 1411-1413.
Young, S. L., Sarda, X., & Rosenberg, M. (1993). Microencapsulating properties of whey
proteins.2. Combination of whey proteins with carbohydrates. Journal of Dairy Science,
76,2878-2885.
Yuliani, S., Bhandari R., Rutgers, R., & D'Arcy B. (2004). Application of
microencapsulatedflavorto extrusion product. Food Reviews International, 20,163-185.

163
ANNEXES
164
ANNEXE A
Étude de la stabilité des complexes IPL/PFM dans un système
gastro-intestinal modèle.
1. INTRODUCTION
La microencapsulation est largement utilisée dans l'industrie alimentaire. Le but principal
de la microencapsulation, dans ce domaine, est la protection des ingrédients encapsulés
contre les effets dommageables de leur environnement immédiat ainsi que la libération de
ces ingrédients dans un système cible. Les dommages affectant les ingrédients directement
ajoutés aux aliments incluent la perte d'activité des ingrédients, les réactions entre les
ingrédients et les composantes de l'aliment, les réactions d'oxydation et le changement de
couleur ou de goût de l'aliment (Schrooyen, van der Meer, & De Kruif, 2001). Ces effets
négatifs contribuent à la limitation de la biodisponibilité des ingrédients. Plusieurs travaux
ont été faits sur la microencapsulation d'ingrédients hydrosolubles par des complexes
protéines/polysaccharides (Chilvers, Gunning, & Morris, 1988; Tirkkonen, Turakka, &
Paronen, 1994; Tiyaboonchai, Woiszwillo, & Middaugh, 2001). Précédemment, une étude
(Bédié, Turgeon, & Makhlouf, 2007, Chapter 5) portant sur la microencapsulation de la
thiamine par les complexes d'isolât de protéines de lactosérum (IPL)/pectine faiblement
méthylée (PFM) a résulté en un maximum de l'efficacité d'encapsulation au ratio P:Ps de

165
2 :1. Des études ont porté sur la stabilité d'un système à base de lait et contenant des
ingrédients hydrosolubles dans un système gastro-intestinal modèle (Verwei, Arkbâge,
Mocking, Havenaar, & Groten, 2004; Verwei, Arkbâge, Havenaar, van den Berg, Witthôft,
& Schaafsma, 2003) tandis que dans d'autres l'utilisation du système gastro-intestinal a
porté sur la biodisponibilité de l'acide folique (Arkbâge, Verwei, Havenaar, & Witthôft,
2003), de gras et de cholestérol (Minekus et al, 2005), ainsi que des composés
phénoliques, des anthocyanes et de la vitamine C (Perez-Vicente, Gil-Izquierdo, & Garcia-
Viguera, 2002). Certaines autres se sont penchées sur le processus de libération de
l'isoflavone et de la p-galactosidase encapsulés (Kim, Jeon, Ahn, & Kwak, 2006; Rao,
Chawan, & Veeramachaneni, 1995) ainsi que celle de bifidobactéries (Picot & Lacroix,
2004).
Bien que plusieurs études aient été effectuées sur certains aspects tels que la libération ou la
bioaccessibilité d'ingrédients encapsulés dans un système gastro-intestinal in vitro, il n'y a
aucune étude traitant de la stabilité des complexes protéines/polysaccharides contenant des
ingrédients hydrosolubles dans un système gastro-intestinal modèle.
Dans ce projet, la stabilité des complexes IPL/PFM contenant de la thiamine a été évaluée
dans un système gastro-intestinal modèle. La stabilité de la thiamine par rapport aux
températures élevées et à la lumière fait d'elle un ingrédient de choix pour cette étude.
166
2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1. Matériel
L'isolât de protéines de lactosérum (BiPRO®) contenant 64.47% de pMactoglobuline,
23.02%) d'a-lactalbumine, 2.36% de Sérum Albumine Bovine et 2.67% d'Immune
Globuline G, pour un total de protéines de 91%) provient de Davisco Foods International
Inc. (Le Sueur, MN, USA). La pectine faiblement méthylée (36% estérifié, masse molaire
de 100 kDa) a été offerte par CP Kelco (Copenhagen, Denmark).
2.2. Réactifs
Le Dioctylsulfosuccinate de sodium, l'acide formique (99%), l'hydroxyde de potassium et
l'acide trichloracétique (TCA) ont été achetés chez Fisher Scientifique (Nepean, ON, CA)
alors que le méthanol de grade HPLC provient de VWR international (West Chester, PA,
USA).
2.3. Stabilité des complexes IPL/PFM dans le TIM
Un mélange de IPL-PFM (ratio P:Ps de 2:1) contenant 0.27% d'IPL, 0.13% de PFM et
0.1% de thiamine a été préparé en ajoutant une solution de 0.26% de PFM contenant de la
thiamine (0.05%) à une solution de 0.54% d'IPL. Le pH a été ajusté à 7.0 et graduellement
baissé à 3.5 par ajout de NaOH et HC1. Après 3 min d'agitation, 200 ml du mélange ont été
centrifugés (8000 g/30 min à 22°C) et le culot obtenu a été lyophilisé. Le culot lyophilisé a
été dissout dans 300 ml d'eau de qualité HPLC à pH 3.5 sous agitation modérée. 300 ml de
la solution témoin de thiamine (0.1%) ont aussi été préparées. Le système gastro-intestinal
167
modèle, le TNO gastro-intestinal tract Model (TIM), comme présenté par Larsson,
Minekus, & Havenaar (1997), représente quatre compartiments successifs simulant
l'estomac (production de la pepsine pour la digestion des protéines), le duodénum
(production de trypsine et de chymotrypsine, de. lipases pour la digestion des protéines,
lipides et carbohydrates dans l'intestin grêle), le jéjunum (digestion et absorption de la
majorité des nutriments) et l'iléon (absorption de la vitamine B12 et des sels biliaires). La
connection entre ces différents compartiments ainsi que la sécrétion des sucs gastriques
sont contrôlées par ordinateur. 300 ml de solution témoin de thiamine et 300 ml de
mélange IPL/PFM contenant de la thiamine ont été ajoutés séparément dans le TIM et des
échantillons ont été collectés toutes les heures pendant quatre heures.
2.4. Détermination de la thiamine
Des échantillons de thiamine témoin et ceux de thiamine encapsulée ont été collectés et
analysés au HPLC comme décrit précédemment (Bedie, Turgeon, & Makhlouf, 2007,
chapter 4, section 4.4.10.) en se basant sur la méthode de Woollard & Indyk (2002).
2.5. Analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été effectuées avec le système SAS (SAS Institute Inc. Cary,
NC, USA). Les statistiques descriptives ont été appliquées aux données recueillies du TIM
compte tenu du fait qu'une seule répétition a été effectuée.

168
3. RÉSULTATS ET DISCUSSION
3.1. Libération de la thiamine par les complexes IPL/PFM
La détermination de la thiamine dans les échantillons avant leur ajout dans le TIM a révélé
une concentration de 1000 mg/1 de thiamine dans les échantillons témoin et 37 mg/1 de
thiamine dans les complexes correspondant à ~ 4% d'efficacité d'encapsulation. Après
ajout des échantillons dans le TIM, la détermination de la concentration de thiamine s'est
effectuée automatiquement par le système gastro-intestinal. Ainsi, en 120 minutes où la
concentration est la plus élevée dans tous les compartiments, nous avons obtenu 142.7, 45.7
et 84.8 mg/1 de thiamine dans le compartiment stomacal, dans le dialysat de l'iléon et à la
sortie de l'iléon, respectivement, pour l'échantillon témoin. Au niveau de l'échantillon de
thiamine encapsulée, la détermination de thiamine a révélé 0.7, 0.3 et 0.5 mg/1 de thiamine
dans les mêmes compartiments et dans le même temps. Ces bas niveaux de thiamine par
rapport aux niveaux ajoutés s'expliqueraient par l'utilisation d'une grande quantité
(plusieurs litres) de solutions tampon nécessaires à l'obtention des dialysats, qui viennent
diluer les 300 ml initialement ajoutés. Il pourrait s'y ajouter la faible sensibilité du TIM
pour les faibles quantités de thiamine utilisées par comparaison à des études précédents sur
le TIM qui ont utilisé des quantités élevées d'échantillon tel que 500 mg de paracétamol
dans 300g de liquide (Blanquet et al, 2004) ou de la P-galactosidase encapsulée à 91%
(Kim et al, 2006). Les résultats montrent que toutes les concentrations de thiamine dans les
différents compartiments baissent avec le temps. Cependant on observe le même profil
(augmentation et baisse) de la variation de la concentration de thiamine dans tous les
compartiments avec un maximum à 120 min, suivie d'une baisse jusqu'à 300 min pour le
169
témoin et 240 min pour la thiamine encapsulée (Fig. 1 et 2). Ce maximum de thiamine à
120 min dans les échantillons encapsulés résulterait de la dissociation des complexes
(formés à pH 3.5), due au très bas pH (< 2.0) du compartiment stomacal, entraînant la
libération totale de leur contenu. En effet, à pH 2.5, déjà les complexes IPL/PFM sont
chargés positivement avec les protéines chargées positivement et la pectine étant neutre
(Chapitre 4, Fig. 4.3). À pH 2.0 dans le compartiment stomacal, la thiamine (positive) n'est
plus retenue par les complexes et elle est totalement libérée. Ces résultats sont soutenus par
l'étude de la bioaccessibilté de l'acide folique contenu dans du yogourt et ajouté à un
système gastro-intestinal modèle et libéré en deux heures (Arkbâge et al. 2003). La
libération totale de thiamine en 240 min par les complexes par rapport à 300 min par la
solution témoin s'expliquerait par la faible concentration de thiamine dans les complexes.
La faible sensibilité du TIM ajouté au coût élevé d'une analyse ne nous ont pas permis
d'effectuer une deuxième répétition. Par conséquent il nous était impossible d'ajuster les
concentrations de thiamine de la solution témoin à celle des complexes avant analyse. En
fait les complexes IPL/PFM au ratio 2 :1 ne pouvant pas encapsuler plus que 4.5% de
thiamine (chapitre 4, section 4.5.6.) il serait très difficile d'augmenter la concentration de
thiamine dans ces complexes pour atteindre un niveau facilement détectable par le TIM. De
plus, comme mentionné plus haut, l'utilisation de plusieurs litres de solution tampon aurait
grandement dilué la concentration de thiamine (37 mg/1), la rendant difficile à détecter par
HPLC.
170
4. CONCLUSION
L'étude de la stabilité des complexes IPL/PFM contenant de la thiamine dans un modèle de
système digestif humain composé de compartiments stomacal et intestinaux a démontré
que la libération de la thiamine encapsulée a lieu en deux heures, correspondant à une
dissociation complète des complexes et la libération de la vitamine dans le compartiment
stomacal. Plusieurs obstacles ont contribué à créer des limites à l'utilisation du TIM. Des
essais préliminaires d'ajustement des concentrations échantillons contrôles et de thiamine
encapsulée auraient permis d'utiliser une seule concentration dans le but d'une
comparaison. Il aurait fallu au moins deux répétitions pour renforcer les résultats obtenus.
Les analyses n'ont pas été complétées dû au coût d'utilisation du TIM et au temps
nécessaire aux expérimentations. D'autres travaux seront nécessaires pour établir les
vitesses de libération lors de l'ingestion de tels composés encapsulés dans des complexes
protéines/polysaccharides.
171
160 -i
140
120
J, 100
Thiamine
80
60
40 -
20
0
60 120 180 240 300
Temps (min)
Figure 1. Thiamine libérée (moyenne de deux mesures de la concentration de thiamine dans

la solution témoin) dans le système gastro-intestinale Dialysat du Jéjunum, ■ Dialysat de
l'iléon, A Sortie de l'iléon. Les bars verticales représentent l'écart-type de deux mesures
d'une répétition (N = 2).
172
0,8
0,7
çM) 0,6
a 0,5
ine
0,4
gos
0,3
M
H 0,2
0,1
0,0
60 120 180 240 300
Temps (min)
Figure 2. Thiamine libérée (moyenne de deux mesures de la concentration de thiamine dans

les complexes) dans le système gastro-intestinal. ▼ Dialysat du Jéjunum, ■ Dialysat de
l'iléon, A Sortie de l'iléon. Les bars verticales représentent l'écart-type de deux mesures
d'une répétition (N = 2)
173
ANNEXE B
Détails de l'équation de la cinétique de dégradation des
anthocyanes (relatif au chapitre 6)
. .At. , ln(2)
ln(—) = -kt ; tm = ——
Ao k
Où Ao est la concentration initiale d'anthocyanes des échantillons au jour 0, At est la
concentration des anthocyanes après t jours d'entreposage.
Tableau 1. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (témoin)
Jour Control (mg/1) log control k tl/2

0 427,48 6,06
6 310,88 5,74 0,05 13,1
8 311,02 5,74 0,04 17,4
10 260,69 5,56 0,05 14,0
12 239,92 5,48 0,05 14,4
14 220,46 5,40 0,05 14,7
Tableau 2. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (total du culot + le

surnageant)
Jour Complexes (mg/1) log complexes k tl/2
0 406,72 6,01
6 308,62 5,73 0,05 15,1
8 285,34 5,65 0,04 15,6
10 262,54 5,57 0,04 15,8
12 241,84 5,49 0,04 16,0
14 232,4 5,45 0,04 17,3
Tableau 3. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (surnageant)
Jour Diffusion (mg/1) log surnageant k tl/2

0 346,37 5,85
6 256,56 5,55 0,05 13,9
8 237,53 5,47 0,05 14,7
10 216,3 5,38 0,05 14,7
12 197,03 5,28 0,05 14,7
14 186,81 5,23 0,04 15,7
Tableau 4. Détails de la cinétique de dégradation des anthocyanes (culot)
Jour Culot (mg/1) log culot k tl/2

0 60,35 4,10
6 52,07 3,95 0,03 28,2
8 47,81 3,87 0,03 23,8
10 46,24 3,83 0,03 26,0
12 44,81 3,80 0,02 27,9
14 45,6 3,82 0,02 34,6
175
ANNEXE C
Résultats des analyses de variance

176
Effects of pro teins :polysaccharide ratio on the caracteristics of post-blending

acidified complexes as a function of pH (chapitre 4)
Table 1: Mixed procédure of the turbidity of post-blending

acidified complexes mixture at différent pH values for post-
blending acidification
Effects DF F Value Fit statistics
Bloc 2 0.32
Ratio 2 148.20***
pH 3 75.42***
ratio*pH 6 26.61***
Linear effects
pHlin 1 150.61***
Quadratic effects
pHquad 1 73.91***
Cubic effects
pHcub 1 7.82*
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 7.10**
Ratio*Ph-quad 2 70.62***
Ratio*Ph-cub 2 2.82
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood 234.8
AIC (smaller is better) 238.8
AICC (smaller is better) 239.4
BIC (smaller is better) 239.1
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; F = Fisher

ratio; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic effects of
pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio is a discrète variable.
Ratio = discrète variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05;
(**) = p < 0.01; (***) - p < 0.001.
Table 2: Mixed procédure of the sizes of post-blending acidified
complexes mixture at différent pH values for post-blending
acidification
Bloc 2 2.23
Ratio 2 18.39**
pH 3 4.79*
ratio *pH 6 1.14
Linear effects
pHlin 1 2.24
Quadratic effects
pHquad 1 0.01
Cubic effects
pHcub 1 11.16*
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 0.31
Ratio *Ph-quad 2 0.19
Ratio*Ph-cub 2 2.82
Mixed Procédure
Abréviations and symbols: DF ■ degree of freedom; F = Fisher
pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio is a discrète variable.
(**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001.
Table 3: Mixed procédure of the charges of post-blending
acidified complexes at différent pH values for post-blending
acidification

Bloc 2 0.84
Ratio 2 47.69**
pH 3 358.47***
ratio*pH 6 17.54***
Linear effects
pHlin 1 1040.30***
Quadratic effects
pHquad 1 20.23***
Cubic effects
pHcub 1 0.77
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 6.85**
Ratio *Ph-quad 2 42.25***
Ratio*Ph-cub 2 4.64*
Mixed Procédure
pH; pHcub == cubic effects of pH. Ratio is a discrète variable.
(**) = p< 0.01; (***) = p< 0.001.
Table 4: Mixed procédure of sedimentable complexes yield of
post-blending acidified complexes mixture at différent pH values
for post-blending acidification

Bloc 2 0.96
Ratio 2 231.89***
pH 3 670.27***
ratio*pH 6 109.58***
Linear effects
pHlin 1 1903.09***
Quadratic effects
pHquad 1 36.61***
Cubic effects
pHcub 1 3.62
Contrasts
Ratio*Ph-lin 2 54.45***
Ratio *Ph-quad 2 222.67***
Ratio*Ph-cub 2 59.14***
Mixed Procédure
-2 Res Log Likelihood -30.3
AIC (smaller is better) -26.3
AICC (smaller is better) -25.6
BIC (smaller is better) -25.9

ratio; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic effects
of pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio = discrète variable.
Levelsof significance: (*) = p<0.05; (**) = p<0.01; (***) = p
< 0.001.
180
Effects of pro teins :polysaccharide ratio on the caracteristics of pre-blending acidified

complexes as a function of pH (chapitre 4)
Table 5: Analysis of variance of the turbidity of pre-

blending acidified complexes mixture at différent pH
values (R-squart = 0.953210; Root MSE =123.8069)
Source of variation DF SS F Value

Model 13 29352792.39 147.30***
Bloc 2 285685.170 9.32***

Ratio 2 12301783.72 401.28***
pH 3 11763794.48 255.82***
Ratio*pH 6 5001529.020 54.38***
Linear effects
pHlin 1 1220275.741 79.61***
Quadratic effects
pHqua 1 9962696.333 649.96***
Cubic effects
pHcub 1 580822.407 37.89***
Contrasts
Ratio*pHlin 2 2988520.026 97.48***
Ratio*pHquad 2 1150473.722 37.53***
Ratio*pHcub 2 862535.270 28.14***
Error 94 1440846.610
Total 107 0793639.000
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS =

sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of
détermination; Root MSE = root squart of mean squart
error; pHlin = linear effects of pH; pHquad = quadratic
effects of pH; pHcub = cubic effects of pH. Ratio = discrète
variable. Levels of signifïcance: (*) = p < 0.05; (**) = p <
0.01; (***) = p< 0.001.
Table 6: Analysis of variance of the sizes of pre-blending
acidified complexes at différent pH values (R-squart =
0.823607; Root MSE - 41.38395)

Model 13 751676.708 33.76***
Bloc 2 13745.151 4.01*

Ratio 2 21824.758 6.37**
pH 3 699793.046 136.20***
Ratio*pH 6 16313.752 1.59
Linear effects
pHlin 1 623231.560 363.90***
Quadratic effects
pHqua 1 22264.319 13.00***
Cubic effects
pHcub 1 54297.168 31.70***
Contrasts
Ratio*pHlin 2 8520.9505 363.90***
Ratio*pHquad 2 22264.319 13.00***
Ratio*pHcub 2 54297.168 31.70***
Error 94 160987.350
Total 107 912664.058
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; S S =

variable. Levels of significance: (*) = p < 0.05; (**) = p <
0.01; ( * * * ) < 0.001.
Table 7: Analysis of variance of the charges of pre-
blending acidified complexes at différent pH values (R-
squart = 0.977040; Root MSE = 3.154150)

Model 13 39794.613 307.69***
Bloc 2 63.570 3.19*

Ratio 2 1513.145 76.05***
pH 3 37846.872 1268.07***
Ratio*pH 6 371.026 6.22***
Linear effects
pHlin 1 34545.602 3472.39***
Quadratic effects
pHqua 1 3276.908 329.38***
Cubic effects
pHcub 1 24.363 2.45
Contrasts
Ratio*pHlin 2 45.435 2.28
Ratio*pHquad 2 206.511 10.38***
Ratio*pHcub 2 119.080 5.98**
Error 94 935.174
Total 107 40729.788

0.01;(***) = p<0.001.
Table 8: Analysis of variance of the sedimentable complex
yield of pre-blending acidified complexes at différent pH
values (R-squart = 0.860216; Root MSE = 10.92391)
Model 13 69029.15857 44.50***
Bloc 2 307.172 1.29

Ratio 2 16468.278 69.00***
pH 3 46421.800 129.67***
Ratio*pH 6 5831.909 8.15***
Linear effects
pHlin 1 37635.723 315.39***
Quadratic effects
pHqua 1 7676.729 64.33***
Cubic effects
pHcub 1 1109.348 9.30**
Contrasts
Ratio*pHlin 2 4.25*
Ratio*pHquad 2 15.12***
Ratio*pHcub 2 5.06**
Error 94 11217.180
Total 107 80246.339
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; S S =

sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart - coefficient of
0.01; (***) = p < 0.001.
Effects of added thiamine concentration on thiamine entrapment
proteins:polysaccharide ratio 2:1 with post-blending acidification (chapitre 5)
Table 9: Analysis of variance of encapsulated thiamine

concentration at différent pH values for post-blending
acidification with différent concentrations of added thiamine
(R-squart = 0.988192; Root MSE =0.001762)

Model 15 0.021 446.34***
Linear effects
Nivbllin 0.017 5556.15***
pHlin 0.000 120.01***
Quadratic effects
Nivblquad 0.000 17.17***
pHquad 0.001 437.03***
Cubic effects
Nivblcub 0.000 2.65
pHcub 0.000 52.96***
Cross effects
Nivbl*pH 9 0.002 56.92***
Error 80 0.000
Total 95 0.021
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS = sum of

squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient of détermination;
Root MSE - root squart of mean squart error; Nivbllin, pHlin =
linear effects of thiamine level and pH; Nivblquad, pHquad =
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub =
cubic effects of thiamine levels and pH. Levels of significance:
(*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) - p < 0.001.
Table 10: Mixed procédure of sedimentable complexes yield at
différent pH values for post-blending acidification with différent
concentrations of added thiamine (R-squart = 0.988192; Root
MSE =0.001762)

Bloc 2 5.01*
Nivbl 4 2.64
PH 3 491.29***
ratio*pH 12 7 49***
Linear effects
Nivbl lin 2.55
pHlin 788.64***
Quadratic effects
Nivblquad 2.34
pHquad 667.38***
Cubic effects
Nivblcub 3.15
pHcub 1.00
Mixed Procédure
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS - sum of

Root MSE = root squart of mean squart error; Nivbl lin, pHlin =
linear effects of thiamine level and pH; Nivbl quad, pHquad =
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivbl cub, pHcub -
(*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001. -2 Res Log
Likelihood = restricted log Likewood; AIC = Akaike's
information criterion; AICC = Hurvich and Tsai's criterion; BIC
= Schwarz's Bayesian criterion
Table 11: Analysis of variance of thiamine encapsulation
effïciency at différent pH values for post-blending acidification
with différent concentrations of added thiamine (R-squart -
0.980695; Root MSE = 0.101317)

Model 15 41.717 270.93***
Linear effects
Nivbllin 1 33.206 3234.81***
pHIin 1 4.479 436.35***
Quadratic effects
Nivblquad 1 0.391 38.04***
pHquad 1 0.159 15.50***
Cubic effects
Nivblcub 1 0.001 0.06
pHcub 1 0.212 20.68***
Cross effects
Nivbl*pH 9 3.293 157.51***
Error 80 0.821
Total 95 42.539
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS = sum of

Root MSE = root squart of mean squart error; Nivbllin, pHIin =
linear effects of thiamine level and pH; Nivblquad, pHquad =
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub =
(*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001.
Effects of added thiamine concentration on thiamine entrapment
proteins:polysaccharide ratio 2:1 with pre-blending acidification (chapitre 5)
Table 12: Analysis of variance of encapsulated

thiamine concentration at différent pH values for pre-
blending acidification with différent concentrations
of added thiamine (R-squart = 0.991774; Root MSE
=0.002088)
Model 15 0.042 643.04***
Linear effects
Nivbllin 0.036 8293.23***
pHlin 0.000 6.48***
Quadratic effects
Nivblquad 0.000 37.10***
pHquad 0.002 390.91***
Cubic effects
Nivblcub 0.000 0.04
pHcub 0.001 336.35***
Cross effects
Nivbl*pH 9 0.003 65.00***
Error 80 0.000
Total 95 0.042
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom;

SS = sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart =
coefficient of détermination; Root MSE = root squart
of mean squart error; Nivbllin, pHlin = linear effects
of thiamine level and pH; Nivblquad, pHquad -
quadratic effects of thiamine level and pH; Nivblcub,
pHcub = cubic effects of thiamine levels and pH.
Levels of signifïcance: (*) = p < 0.05; (**) = p < 0.01;
(***) = p< 0.001.
Table 13: Analysis of variance of sedimentable
complexes yield at différent pH values for pre-blending
acidification with différent concentrations of added
thiamine (R-squart - 0.917580; Root MSE = 5.616065)

Model 15 28090.905 59.38***
Linear effects
Nivbllin 1 126.017 4.00*
pHlin 1 8796.650 278.90***
Quadratic effects
Nivblquad 1 1.917 0.06
pHquad 1 18106.081 574.06***
Cubic effects
Nivblcub 1 10.387 0.33
pHcub 1 685.983 21.75***
Cross effects
Nivbl*pH 9 363.377 1.28
Error 80 30614.120
Total 95 2523.215

error; Nivbllin, pHlin = linear effects of thiamine level
and pH; Nivblquad, pHquad = quadratic effects of
thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub = cubic effects
of thiamine levels and pH. Levels of significance: (*) = p
< 0.05; (**) = p < 0.01; (***) - p < 0.001.
Table 14: Analysis of variance of thiamine
encapsulation efficiency at différent pH values for
pre-blending acidification with différent
concentrations of added thiamine (R-squart =
0.995447; Root MSE - 0.046589)

Model 15 37.964 1166.05***
Linear effects
Nivbllin 1 35.972 16573.2***
pHlin 1 0.503 231.85***
Quadratic effects
Nivblquad 1 0.141 64 97***
pHquad 1 0.008 3.90
Cubic effects
Nivblcub 1 0.001 0.59
pHcub 1 0.655 301.93***
Cross effects
Nivbl*pH 9 0.698 35.72
Error 80 38.138
Total 95 0.174
Abréviations and symbols: DF = degree of freedom; SS

= sum of squarts; F = Fisher ratio; R-squart = coefficient
of détermination; Root MSE = root squart of mean
squart error; Nivbllin, pHlin = linear effects of thiamine
level and pH; Nivblquad, pHquad = quadratic effects of
thiamine level and pH; Nivblcub, pHcub = cubic effects
of thiamine levels and pH. Levels of significance: (*) =
p < 0.05; (**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001.
Effects of storage on anthocyanins encapsulation (Chapitre 6)
Table 15: Mixed procédure of the effects of storage on

anthocyanins encapsulation (post-blending acidification)
typ 3 516.96***
Temps 5 159.24***
typ*temps 15 14.75***
Mixed Procédure
ratio; typ, temps = différent types of samples and storage time.
Typ = discrète variable. Levels of significançe: (*) = p < 0.05;
(**) = p < 0.01; (***) = p < 0.001. -2 Res Log Likelihood =
restricted log Likewood; AIC = Akaike's information criterion;
AICC = Hurvich and Tsai's criterion; BIC = Schwarz's
Bayesian criterion

Microencapsulation de Composés Nutraceutiques Dans Des Complexes Protéines-Polysaccharides

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Microencapsulation de Composés Nutraceutiques Dans Des Complexes Protéines-Polysaccharides

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

KOUADIO GERARD BEDIE

Département des Sciences des aliments et de nutrition

© Gérard Kouadio Bédié, 2008

La caractérisation des complexes insolubles d'isolât de protéine de lactosérum/pectine

faiblement méthylée (IPL/PFM), formés aux ratios protéines:polysaccharide (P:Ps) de 2:1,

d'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement méthylée (PFM), a

aux différents pH. La détermination du rendement en complexes après l'incorporation

d'ingrédients hydrosolubles à différentes concentrations suggère une saturation des

rendement en complexes à pH 3.5. L'efficacité d'encapsulation la plus élevée a été

lux/40°C. La pasteurisation a provoqué une diffusion d'une proportion importante des

anthocyanes encapsulés vers l'extérieur des complexes mais la quantité d'anthocyanes

prometteuse pour l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides.

mélange de solutions d'isolât de protéines de lactosérum (IPL) et de pectine faiblement

totaux). La caractérisation des complexes a démontré, qu'au ratio 2:1, la turbidité et le

rendement en complexes étaient optimaux à un pH aux environs de 3.0. De plus, les

petite et constante. L'évaluation de Pencapsulation d'ingrédients hydrosolubles par les

2:1 comparativement au ratio 1:1. La protection d'ingrédients hydrosolubles par les

anthocyanes encapsulés. Le jus a été pasteurisé à 90°C/12 s et entreposé à 11 000 lux/40°C

pendant 14 jours. La chaleur a entraîné la diffusion d'une proportion importante des

anthocyanes encapsulés vers l'extérieur des complexes mais la quantité d'anthocyanes

L'étude de la stabilité des complexes IPL/PFM, contenant de la thiamine, dans un système

thiamine dans le compartiment stomacal. Cet effet serait du au pH très acide du

démontrent que le complexe IPL/PFM constitue une approche prometteuse pour

l'encapsulation d'ingrédients hydrosolubles dans les aliments acides.

optimal around pH 3.0. In addition, complexes obtained by post-blending acidification had

WPI-LMP complexes as a function of ingrédients concentration was achieved at pH 4.0,

optimal at pH 3.5. High concentrations of thiamine induced a decrease of the sedimentable-

The study of the stability of WPI-LMP complexes, containing thiamine, in a

ingrédients encapsulation in acidic foods.

le Conseil de la recherche en sciences naturelles et génie du Canada (CRSNG) et les

Le premier chapitre intitulé «Introduction» décrit très brièvement les connaissances

scientifiques actuelles sur les interactions protéine-polysaccharides et l'encapsulation

méthodes de microencapsulation, les interactions protéine-polysaccharide, les facteurs

influençant la formation de complexes et le système isolât de protéines de lactosérum -

pectine faiblement méthylée.

Le troisième chapitre intitulé «Problématique d'ensemble, hypothèse, but, objectifs»

présente la problématique générale, l'hypothèse, le but et les objectifs de la thèse.

paramètres permettant la formation de complexe isolât de protéine de lactosérum/pectine

faiblement méthylée et l'encapsulation de thiamine comme ingrédient hydrosoluble

modèle. J'ai contribué à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des

manipulations au laboratoire du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la

scientifiques lors des expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.

Le cinquième chapitre intitulé «Evaluation of the ability of whey protein isolate-low

methoxyl pectin complexes to entrap water-soluble ingrédients» porte sur l'évaluation de la

capacité de microencapsulation des complexes WPI-LMP formés avec les paramètres

optimisés et en fonction de la concentration des ingrédients modèles ajoutés. J'ai contribué

à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des manipulations au laboratoire

expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.

thiamine in a dynamic in vitro gastrointestinal model» porte sur l'évaluation de l'effet de

protection des ingrédients hydrosolubles encapsulée dans des conditions d'entreposage

contribué à ce travail en accomplissant la totalité de la planification, des manipulations au

laboratoire du centre STELA de l'Université Laval (Québec) ainsi que la rédaction de

scientifiques lors des expérimentations en laboratoire et lors de la rédaction de l'article.

Finalement, la «Conclusion générale» présentée au chapitre 7 conclut le travail par une

présentation des perspectives de recherche.

Le chapitre 8, intitulé «Bibliographie» à la fin de cette thèse, referme l'ensemble des

références citées dans ce document.

Mes remerciements vont aussi au Conseil de la Recherche en Sciences Naturelles et Génie

du Canada (CRSNG) et aux Industries Lassonde Inc. Pour le financement de ce projet de

manipulations relatives au chapitre 5.

J'aimerais remercier le personnel technique et professionnel des laboratoires du

département des sciences de l'alimentation et de nutrition de l'Université Laval pour leur

aide dans mon apprentissage de l'utilisation de l'équipement du département ainsi que