CONCOURS D’ASSISTANAT SESSION 2008

Amani Mankaï

Thèse en cotutelle entre

Université de Monastir
(Faculté de pharmacie)

et
Université de Bretagne Occidentale
(École Doctorale des Sciences de la Matière, de l'Information
et du Vivant, Brest, France)
Doctorat en Immunologie
Tunisie France
Soutenance prévu en
Octobre 2008
Maîtrise en Sciences Biologiques
Faculté des Sciences de Monastir
Mention : Assez bien
(2001)
DEA en Biotechnologie et Immunologie
appliquées aux maladies transmissibles
Faculté de Pharmacie de Monastir
Mention : Très bien
(2003)
Diplômes
Baccalauréat Sciences
Expérimentales
Mention : Assez bien
(1997)
 Unité de recherche
« Auto-immunité et Allergie »
03UR/07.02
Faculté de pharmacie

Les maladies
auto-immunes La leucémie lymphoïde
Maladie coeliaque
chronique

Laboratoire d’Immunologie
CHU Farhat Hached, Sousse

Laboratoire d’Auto-Immunité Laboratoire de Thérapie Cellulaire

Hôpital Lyon-Sud, Hospices et d’Immuno-Biologie du Cancer
civils de Lyon (HCL), France EA2216, Brest, France
 DEA
Apport de la recherche des anticorps anti-
transglutaminase tissulaire dans le diagnostic
de la maladie coeliaque

Laboratoire d’Immunologie
CHU. F. Hached, Sousse (Ibtissem GHEDIRA)

Laboratoire d’auto-immunité
Hôpital Lyon sud (Nicole FABIEN)
 Maladie cœliaque

La maladie coeliaque (MC)

- Syndrome de malabsorption
- Entéropathie auto-immune due à une intolérance au gluten chez les sujets
génétiquement prédisposés
- Atrophie villositaire totale, subtotale ou partielle

- Marqueurs sérologiques

- Anticorps anti-gliadine (AAG)

- Anti-réticuline (AAR)
- Anti-endomysium (AAE)
- Anti-transgluaminase tissulaire (AtTG)

Objectifs:

– Optimisation : ELISA , dot blot et immunoblot (AAtTG-IgA)

– Sensibilité et spécificité :ELISA et dot blot (AAtTG-IgA)
– Comparaison AAtTG / AAE, AAR et AAG
 Maladie cœliaque
Patients
Patients non traités:
97 enfants
46 adultes
Patients sous régime sans gluten
57 enfants
18 adultes
Groupe contrôle: 88

Méthodes
ELISA Dot blot Western blot
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7
 Maladie cœliaque

Résultats

IF: 0,67
Travaux réalisés sur la maladie coeliaque
Maladie cœliaque

IF: 0,67

IF: 1,07
 Maladie cœliaque
Maladie cœliaque et endocrinopathies auto-immunes

IF: 1,74

IF: 1,75
 Maladie cœliaque
Association maladie cœliaque et autres maladies auto-immunes

IF: 1,74

IF: 1,87
Autres travaux

IF:1,91

IF: 0,67

IF: 0,67
 Thèse
Université de Monastir
Faculté de Pharmacie

Université de Bretagne Occidentale

École Doctorale des Sciences de la Matière
de l'Information et du Vivant

Augmentation de l’efficacité du Rituximab

dans la leucémie lymphoïde chronique par
l’étude de la molécule CD20 et sa régulation
 La leucémie lymphoïde chronique (LLC):

Forme la plus fréquente de leucémie dans les pays occidentaux.

Accumulation lente et progressive de petits lymphocytes B matures ayant une

origine clonale commune et dont la survie est prolongée par un défaut d'apoptose.

Production d’auto anticorps

Expression de la molécule CD5

 Classification
Stades A, B et C

La classification de Binet classe la maladie en trois stades, selon le degré de

développement tumoral et les signes de cytopénie sanguine

Stade Clinique Hémogramme

A < 3 aires palpables Hémoglobine ≥ 10 g/dl et

Plaquettes > 100 000 /mm3

B ≥ 3 aires palpables Plaquettes ≥ 100 000/mm3

C Indifférentes Hémoglobine < 10 g/dl et/ou

plaquettes < 100 000/mm3

 LLC : maladie incurable, malgré l’utilisation du
Rituximab

Rituximab : Anticorps monoclonal

Fab
anti-CD20
1er anticorps à visée thérapeutique
en oncologie
Fc

CD20 CD20

LNH CD20 LNH CD20

CD20 CD20

CD20 CD20

IF:3,4
 Signaux intracellulaires suite à
la fixation du Rituximab à la
molécule CD20

CD20 CD20
BCR BCR

PLCγγ 2
PLCγγ 2
c-Cbl c-Cbl PKC
Erk
GSK3
NF-KB BETA Caténine

c-Cbl
Apoptose du LB normal Survie du LB de LLC

Apoptose
Survie

LB
 Ontogénèse du lymphocyte B

Pro-B Pré-B LB immature LB mature Plasmocytes

CD20

PU.1/Pip
Facteurs de
Oct 2/BOB
transcription

Gène CD20
Promoteur de CD20
 Objectif

Comprendre pourquoi le Rituximab est inefficace dans la

LLC

1. c-Cbl peut-il influencer la transmission du signal médié par le

Rituximab?

2. Implication de la molécule CD20 sur l’efficacité du Rituximab

 Partie I:
Effet de c-Cbl sur la transmission du signal médié par le Rituximab

13 LLC stade A
7 LLC stade B

Western Blot Cytométrie en flux PCR

c-Cbl est fortement exprimé dans les LB de LLC par rapport aux contrôles
 Expression de la forme active phosphorylée de c-Cbl

c-Cbl est fortement exprimé dans la LLC mais la forme active de cette
protéine est diminué et plus particulièrement dans les stades B
 CONCLUSION

La protéine c-Cbl est impliquée dans la LLC et pourrait

inhiber le signal intracellulaire médié par le rituximab

IF: 1,97
Partie II : fonctionnalité quantitative de la molécule CD20

CD20 ?

LB de LLC

36 patients:
25 LLC stade A
11 LLC stade B
 1- Expression de la molécule CD20 dans les cellules de LLC

Western Blot
Cytométrie en flux CD20
actine

Contrôle 1 Contrôle 2 LLC1 LLC 2

Nombre de cellules

LB de LLC

LB du sang périphérique

LB d’amygdales PCR
LB de lymphome
CD20

18S
CD20

Contrôle 1 Contrôle 2 LLC1 LLC 2

Pourquoi l’expression de la molécule CD20 est diminuée dans la LLC?

 2- Expression des facteurs de transcription dans les cellules de LLC

PCR en temps réel Western Blot

PU.1 Oct-2

Pip
patients

PU.1

BOB

0 0,5 1 1,5 2
CTL1 CTL2 LLC 1 LLC 2

Niveau d’expression des ARNm

Seul PU.1 est faiblement exprimé dans le LB de LLC

Corrélation entre PU.1 et CD20 dans le LB de LLC

3- Expression de la molécule CD20 sur les cellules transfectées

OU

Plasmide
PU.1

LB de LLC

CD20
16
Nombre de cellules

12

IMF de CD20
8

0
LLC1 LLC 2 LLC 3 LLC 4 LLC 5 LLC 6
3- Expression de la molécule CD20 sur les cellules transfectées

OU

Plasmide
PU.1

LB de LLC

CD20 CD5 CD72

Nombre de cellules

PU.1 semble être le facteur limitant dans l’expression du gène CD20

dans la LLC
 4- Efficacité du Rituximab sur les cellules transfectées

Apoptose

ADCC CDC
FcγγR

Cytotoxicité cellulaire Cytotoxicité cellulaire dépendante

dépendante de l’anticorps du complément
LB de LLC

MAC

60 16
Pourcentage de

Pourcentage de
lyse cellulaire

lyse cellulaire
12
40
8
20 4
0 0
Plasmide Plasmide Plasmide Plasmide
contrôle PU.1 contrôle PU.1
 Pourquoi PU.1 est si mal exprimé dans la LLC ?

Flt3 Ligand
1 Flt3
3

Flt3
2

PU.1
Flt3
(fms-like tyrosine kinase)

Survie et prolifération
 1- Flt3 (ARNm et protéine)

PCR quantitative Cytométrie en flux ELISA

40
0,20

Nombre de cellules
30
0,16
Flt3 mRNA

20 0,12

0,08
10
0,04
0
0,00
.1 1 10 100 1000
Contrôle Patients Contrôles LLC
Flt3

Technique
d’immunoprécipitation

Flt3 est fortement présent dans le LB de LLC et il est fonctionnel

 2- Flt3-ITD

Dans la LLC, Flt3 ne présente pas une anomalie mutationnelle

 3-Flt3 Ligand

Flt3 Ligand soluble Flt3 Ligand soluble

(technique ELISA) (PCR)

Flt3 ligand est retrouvé en quantité très Les ARNm de Flt3 ligand sont plus
importante dans le sérum des patients présents dans les LB de LLC que les LB
leucémiques contrôles
Flt3 Ligand

CD20

Flt3 P P P P

RAS PI3K

Stat5
Diminution de
ERK AKT la densité de
CD20 CD20
CD20
PU.1
IF: 7,65
 Communications Scientifiques

The 15th European Immunology Congress, 8-12 Juin 2003, Rhodes.

The 11th International Symposium on coeliac disease, 28-30 Avril 2004, Belfast.

The 10th Arab Congress of Clinical Biology, 17-21 Mai 2004, Monastir.

15ème journées biologiques de l’Association Tunisienne des Sciences Biologiques, 18-21

Mars 2004, Sousse.

4th International Congress on Autoimmunity, 3-7 Novembre 2004, Budapest.

6th European Lupus Meeting, 3-5 Mars 2005, Londres.

24ème Congrès Magrébin de Pédiatrie, 8-10 Avril 2005, Hammamet.

Séminaire d’Endocrinologie Pédiatrique, 29-30 Avril 2005, Sfax.

19 ème Journées Nationales de Biologie Clinique, 20-21 Mai 2005, Hammamet.

20 ème Journées Nationales de Biologie Clinique, 26-27 Mai 2006, Hammamet.

16th European Congress Of Immunology, 6-9 September 2006. Paris

 Encadrement
Octobre 2002- juin 2003 :
DEA en Biotechnologie et Immunologie appliquées aux maladies
transmissibles à la faculté de Pharmacie de Monastir

Anticorps anti-mitochondrie au cours de la cirrhose biliaire primitive

Juillet- Août 2006 :

Projet de fin d’étude de l’Ecole Normale Supérieure de Cachan (Paris)

Amplification de l’activité d’un anticorps monoclonal thérapeutique

: le Rituximab, dans le traitement de la leucémie lymphoïde chronique
 Stages et Formation pré-doctorale

Stage dans le cadre du projet de fin d’études

Laboratoire de Pharmacologie, Faculté de Pharmacie de Monastir

5 mois (1/10/2000 aout 28 février 2001)
Expérimentation animale chez la souris (injection intra péritonéale, injection cutanée, évaluation de
l’efficacité de certaines drogues….)

Stage dans le cadre d’un programme de recherche CMCU

(Comité mixte de coopération universitaire) (n°02F0 913)
Laboratoire d’Imunologie, unité d’Auto-Immunité, Hôpital Lyon-Sud,
Hospices civils de Lyon (HCL), France

2 mois (01/06/2003 au 31/07/2003)
ELISA et « western blot »: Apport des AtTG dans le dépistage de la MC

Stage dans le cadre du DEA

Laboratoire d’Immunologie, Hôpital Farhat Hached, Sousse.

16 mois (Juin 2001- Octobre 2003)

Immunofluorescence indirecte, ELISA, Dot blot et Western blot
 Stages et Formation doctorale
Stages dans
EA2216 « IMMUNOLOGIE ET PATHOLOGIE »

•Cultures cellulaires
- Culture de lignées immortelles et primocultures de cellules adhérentes et non adhérentes
- Purification des différentes cellules sanguines (lymphocytes B et T, natural killer, monocytes)
- Mise au point : apoptose cellulaire, CDC et ADCC

•Biologie moléculaire
Extraction d’ARN et d’ADN génomique,
RT-PCR, production de plasmide,
transfection de plasmides dans des cellules primaires de leucémie humaine et dans
des lignées cellulaires.

•Cytométrie de flux
Visualisation de l’apoptose
Détection d’antigènes membranaires et intracellulaires.

•Microscopie
Utilisation de la microscopie à fluorescence et confocale.
 MERCI

Bretagne