Université de Sherbrooke

Traiter la douleur chronique et l’anxiété par l’utilisation d’analogues

neurotensinergiques sélectifs pour le récepteur NTS2

Par
Mélanie Vivancos
Programme de Pharmacologie

Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé

en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.)
en Pharmacologie

Sherbrooke, Québec, Canada

Septembre, 2020

Membres du jury d’évaluation

Philippe Sarret, Pharmacologie et Physiologie (Directeur de thèse)

Guylain Boulay, Pharmacologie et Physiologie (Président du jury)
Dimitri Ryczko, Pharmacologie et Physiologie (Évaluateur externe au programme)
David Chatenet, Pharmacochimie (Évaluateur externe à l’université)

© Mélanie Vivancos, 2020

 À ma maman.
À ma plus belle étoile.
 ii

Efface le gris de la vie et allume les couleurs que tu possèdes à l'intérieur,

Pablo Picasso
 iii

RÉSUMÉ
Traiter la douleur chronique et l’anxiété par l’utilisation d’analogues
neurotensinergiques sélectifs pour le récepteur NTS2

Par
Mélanie Vivancos
Programme de Pharmacologie

Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention

du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en Pharmacologie, Faculté de médecine et des
sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4

La douleur chronique est un véritable problème de santé publique, puisque 20% de la

population mondiale en souffrent. En plus de sa forte prévalence, les répercussions
économiques sur la société sont importantes. Les patients souffrant de douleur chronique
observent généralement une dégradation de leur qualité de vie avec l’apparition de
comorbidités telles que l’anxiété et la dépression. Les opioïdes sont les antalgiques les plus
prescrits malgré leurs effets secondaires (constipation, dépression respiratoire, dépendance)
et le développement de tolérance qui limite leurs utilisations à long terme. D’autres
alternatives sont également suggérées comme l’utilisation d’anti-inflammatoires non
stéroïdiens, d’antidépresseurs, d’anticonvulsivants et d’antipsychotiques, mais la plupart du
temps cela ne suffit pas pour soulager la douleur des patients. Notre laboratoire tente de
développer de nouveaux antalgiques qui agissent de façon indépendante du système
opioïdergique pour traiter plus efficacement la douleur chronique tout en limitant les effets
indésirables. Dans cette optique, nous nous sommes intéressés au système
neurotensinergique (NT). Au niveau du système nerveux central, l’activation des récepteurs
NTS1 et NTS2 par la neurotensine ou un de ses analogues induit de l’analgésie et diminue
l’anxiété. Or, l’activation de NTS1 provoque en plus de l’hypotension et de l’hypothermie.
L’objectif de ce projet de doctorat visait donc à développer des analogues de la NT ciblant
principalement les récepteurs NTS2 pour traiter à la fois la douleur et l’anxiété qui y est
associée, sans pour autant induire d’effets secondaires. Nous avons ainsi développé
différentes stratégies afin d’améliorer les propriétés pharmacologiques de la NT et d’obtenir
des composés NTS2 à la fois sélectifs et métaboliquement stables. L’affinité de chaque
nouvel analogue pour NTS1 et NTS2 ainsi que leur stabilité plasmatique ont été déterminées
in vitro. Par la suite, uniquement les composés les plus stables et NTS2-sélectifs ont été testés
in vivo dans différents types de douleur (aiguë, tonique et chronique inflammatoire et
neuropathique), tout en vérifiant qu’ils n’affectaient pas la température corporelle et la
pression artérielle. Pour finir, nous avons testé si un agoniste NTS2-sélectif peut également
diminuer le comportement anxieux induit par la présence d’une douleur chronique.
L’effet hypothermiant du système neurotensinergique (de -1 à -3°C) pourrait être utilisé pour
ses effets neuroprotecteurs lors d’ischémie globale. Pour cela, nous avons également évalué
les propriétés hypothermiantes de tous nos composés NTS1-sélectifs.

Mots clés: neurotensine, composés NTS2-sélectifs, douleur chronique, anxiété, hypothermie

 iv

SUMMARY
Treating pain and anxiety with NTS2-receptor selective neurotensin analogs

By
Mélanie Vivancos
Pharmacology Program

Thesis presented at the Faculty of medicine and health sciences for the obtention of Doctor
degree diploma philosophiae doctor (Ph.D.) in Pharmacology, Faculty of medicine and
health sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4

Chronic pain is a major public health problem which affects 20% of the population
worldwide. In addition to the high prevalence, chronic pain has enormous clinical, social and
economic burdens. Chronic pain also seriously affects the patient’s daily activities and
quality of life and often causes the development of comorbidities, such as anxiety and
depression. Opioids are still the gold standard for treating chronic pain, despite their adverse
effects (constipation, respiratory depression, dependence) and the development of tolerance,
which further limits their use during long periods. Other pharmacological therapeutic options
are also used, such as non-steroidal anti-inflammatory, antidepressants, anticonvulsants, and
antipsychotic drugs, but the patients still live with unrelieved pain. The goal of our laboratory
is to develop new analgesics that act independently of the opioïdergic system to effectively
treat chronic pain without inducing adverse effects. The neurotensinergic system represents
an interesting target considering its localization within the brain structures involved in pain
control. Indeed, activation of NTS1 and NTS2 receptors by neurotensin and its analogs
participates in the modulation of pain transmission and regulates anxiety. However,
activation of NTS1 receptors is also associated with undesirable effects, such as hypotension
and hypothermia. The goal of this PhD project aimed at developing NT analogs targeting
NTS2 receptors to treat chronic pain and anxiety-like behaviors associated to pain, without
inducing adverse effects. We have therefore implemented different strategies to improve the
pharmacological properties of NT(8-13) peptides and engineer metabolically stable NTS2-
selective analogs. We first determined the binding affinity of each new analog for both NTS1
and NTS2 and their in vitro plasma stability. Next, the analgesic potency of the most stable
and NTS2-selective compounds was tested in vivo in different rodent models of pain (acute,
tonic, inflammatory and neuropathic chronic pain). Then, we also studied if these NTS2-
selective compounds induced changes in body temperature and blood pressure. Finally, we
assessed the anxiolytic potential of our best NTS2-selective agonist to reduce the anxiety-
like behaviors associated to the development of chronic inflammatory pain.
The hypothermic effect of the neurotensinergic system (-1°C to -3°C) could be used for its
neuroprotective effect during global ischemia. For this, we have also evaluated the
hypothermic properties of all our NTS1-selective compounds.

Keywords: neurotensin, NTS2-selective analogs, chronic pain, anxiety, hypothermia

 v

TABLE DES MATIÈRES

Résumé ................................................................................................................................. iii

Summary ............................................................................................................................. iv

Table des matières ............................................................................................................... v

Liste des figures................................................................................................................. viii

Liste des tableaux ................................................................................................................ ix

Liste des abréviations .......................................................................................................... x

Introduction.......................................................................................................................... 1

1. La douleur ................................................................................................................ 1
Qu’est-ce que la douleur ? ......................................................................................... 1
1.1.1. La douleur aiguë ................................................................................................. 1
1.1.2. La douleur chronique.......................................................................................... 4
La douleur chronique : un véritable problème de santé publique .............................. 5
1.2.1. Une forte prévalence .......................................................................................... 5
1.2.2. Un impact économique important ...................................................................... 6
1.2.3. Le cercle vicieux de la douleur chronique.......................................................... 6
Un lien étroit entre douleur chronique et troubles psychologiques ........................... 8
Les traitements actuels pour traiter la douleur chronique ........................................ 10

2. Le système neurotensinergique............................................................................. 13
La neurotensine ........................................................................................................ 13
Les récepteurs neurotensinergiques ......................................................................... 14
2.2.1. NTS1 et NTS2 : deux récepteurs couplés aux protéines G .............................. 14
2.2.1.1. Le récepteur NTS1 ................................................................................. 14
2.2.1.2. Le récepteur NTS2 ................................................................................. 22
2.2.2. Les récepteurs NTS3 ........................................................................................ 28
Les effets physiologiques de la neurotensine........................................................... 31
2.3.1. L’effet analgésique de la NT ............................................................................ 32
2.3.2. L’implication du système neurotensinergique dans l’anxiété .......................... 37
2.3.3. Autres effets physiologiques médiés par NTS1 ............................................... 44
2.3.3.1. Hypothermie .......................................................................................... 45
 vi

2.3.3.2. Hypotension ........................................................................................... 45

2.3.3.3. Motilité gastro-intestinale ...................................................................... 46

3. Le développement de composés neurotensinergiques ........................................ 47

Relation structure/activité de la neurotensine .......................................................... 47
Les analogues neurotensinergiques.......................................................................... 50
3.2.1. Les composés peptidiques linéaires ................................................................. 51
3.2.2. Les composés macrocycliques ......................................................................... 55
3.2.3. Les composés non peptidiques ......................................................................... 59
3.2.4. Les composés allostériques .............................................................................. 62
Les limites du système neurotensinergique ............................................................. 64
3.3.1. Une faible stabilité plasmatique ....................................................................... 64
3.3.2. Passage de la barrière hématoencéphalique ..................................................... 66

4. Problématique de recherche ................................................................................. 69

5. Hypothèse et objectifs de recherche ..................................................................... 71

Articles ................................................................................................................................ 74

Article 1........................................................................................................................... 74
Metabolically Stable Neurotensin Analogs Exert Potent and Long-Acting Analgesia
Without Hypothermia ........................................................................................................... 74

Article 2...................................................................................... Erreur! Signet non défini.

Antinociceptive and anxiolytic-like effects of a NTS2-selective neurotensin analog Erreur!
Signet non défini.

Article 3......................................................................................................................... 109

Insightful backbone modifications preventing proteolytic degradation of neurotensin
analogues improve NTS1-induced protective hypothermia ............................................... 109

Discussion ......................................................................................................................... 172

1. Optimisation des propriétés pharmacologiques de la NT(8-13) : une avancée

vers le développement d’analogues neurotensinergiques à visée thérapeutique. .. 172
Sélectivité envers NTS2 ......................................................................................... 178
Augmentation de la stabilité plasmatique .............................................................. 181
Des composés plus lipophiles pour passer la BHE ................................................ 182
 vii

2. Une molécule et une cible pour soulager douleur chronique et anxiété. ........ 187
Douleur chronique ................................................................................................. 187
Anxiété ................................................................................................................... 194

3. Hypotension, hypothermie, des effets physiologiques intéressants pour traiter

d’autres pathologies. .................................................................................................... 198
Hypothermie .......................................................................................................... 198
Hypotension ........................................................................................................... 201

Conclusion ........................................................................................................................ 206

Remerciements ................................................................................................................. 207

Références ......................................................................................................................... 211

Annexes ............................................................................................................................. 247

Annexe 1 : Article n°4 ................................................................................................. 247

Structural Optimization and Characterization of Potent Analgesic Macrocyclic Analogues
of Neurotensin (8–13) ......................................................................................................... 247

Annexe 2 : Article n°5 ................................................................................................. 248

Identification of 2‐({[1-(4-Fluorophenyl)-5-(2- methoxyphenyl)‐1H‐pyrazol-3-
yl]carbonyl}amino)tricyclo[3.3.1.13,7]decane-2-carboxylic Acid (NTRC-844) as a
Selective Antagonist for the Rat Neurotensin Receptor Type 2 ......................................... 248
 viii

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Les voies nociceptives de la douleur. ..................................................................... 3

Figure 2. Le cercle vicieux de la douleur chronique. ............................................................ 7
Figure 3. Études épidémiologiques des risques de développer des troubles de dépression et
d’anxiété chez des personnes souffrant de douleur chronique. ............................................. 9
Figure 4. Échelle visuelle analogique et traitements antalgiques utilisés pour les différents
paliers de douleur. ................................................................................................................ 10
Figure 5. Voies de signalisation du récepteur NTS1. .......................................................... 18
Figure 6. Localisation des récepteurs NTS1 dans le SN et dans différents organes. .…….. 22
Figure 7. Représentation schématique des récepteurs NTS1 et NTS2 de rat. ..................... 23
Figure 8. Répartition des récepteurs NTS2 dans les voies spinale et supraspinale de la
douleur. ................................................................................................................................ 27
Figure 9. Structure du récepteur NTS3. ............................................................................... 29
Figure 10. Effets physiologiques de la NT. ......................................................................... 31
Figure 11. Localisation de la NT et de ses récepteurs dans des zones contrôlant la douleur
chez le rat. ............................................................................................................................ 32
Figure 12. Effet de la NT sur la voie descendante de la douleur. ........................................ 36
Figure 13. Co-localisation entre les régions impliquées dans le circuit neuronal de l’anxiété
et le système neurotensinergique. ........................................................................................ 40
Figure 14. Rôles des différents acides aminés de la NT(8-13) dans la liaison et/ou l’activation
fonctionnelle des récepteurs. ............................................................................................... 49
Figure 15. Interaction de la NT(8-13) avec le récepteur NTS1 de rat. ................................ 50
Figure 16. Les zones de clivage de la neurotensine............................................................. 65
Figure 17. Structure chimique de l’AN2 et de l’ANG2002................................................. 68
Figure 18. Structures chimiques des différentes modifications. ........................................ 178
 ix

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Profil signalétique des récepteurs NTS2. ........................................................... 25

Tableau 2. Liste non exhaustive des traitements actuels pour diminuer l’anxiété. ............. 39
Tableau 3. Effets anxiolytique ou anxiogène de la NT et de ses analogues. ....................... 42
Tableau 4. Liste non exhaustive des modifications en position 11 qui favorisent la liaison
aux récepteurs NTS2............................................................................................................ 55
Tableau 5. Structures des différents macrocycles neurotensinergiques. ............................ 58
Tableau 6. Composés neurotensinergiques non peptidiques ............................................... 61
Tableau 7. Effet des différentes modifications sur l’affinité, la sélectivité, la stabilité
plasmatique et la lipophilicité. ........................................................................................... 176
Tableau 8. Effet analgésique des composés NTS2-sélectifs dans différents types de douleur.
........................................................................................................................................... 189
Tableau 9. Effet des composés sur la pression artérielle. .................................................. 203
 x

LISTE DES ABRÉVIATIONS

AA : Acide Aminé
AC : Adénylate cyclase
Acc : Cortex cingulaire antérieur
Aib : Acide 2-aminoisobutyrique
AINS : Anti-inflammatoire non stéroïdien
Amy : Amygdale
AMPc : Adénosine monophosphate cyclique
AQDC : Association Québécoise de la Douleur Chronique
ATP : Adénosine triphosphate
ATV : Aire tegmentale ventrale
BDNF : Facteur neurotrophique dérivé du cerveau
BHE : Barrière hématoencéphalique
BLA : Amygdale basolatérale
BNST : Noyau de la strie terminale
BRET : Essai de transfert d’énergie de bioluminescence par résonance
CCK : Cholecystokinine
CeA : Noyau central de l’amygdale
CFA : Adjuvant complet de Freund
CIM : Classification internationale des maladies
cLog(P): Coefficient de partage calculé
CycloF : Cyclopropyl substitué par un groupement fluoroisopropyl
DAG : Diacylglycérol
DRG : Ganglion de la racine dorsale
D-Trp : D-Tryptophane
ECA : Enzyme de conversion de l’angiotensine
EGFR : Récepteur du facteur de croissance épidermique
EVA : Échelle visuelle analogique
FPTyr : Fluorophenyltyrosine
FRET : Essais de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes
GABA : Acide γ-aminobutyrique
hNTS1: Récepteur NTS1 humain
hNTS2: Récepteur NTS2 humain
HHS : Axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien
IASP : International Association for the Study of Pain
I.c.v. : Injection intracérébroventriculaire
I.p. : Injection intrapéritonéale
I.t. : Injection intrathécale
I.v. : Injection intraveineuse
IP3: Inositol trisphosphate
IP3R: Récepteur de l’inositol trisphosphate
IRS : Inhibiteur de la recapture de la sérotonine
IRSNA : Inhibiteur de la recapture de la sérotonine et de la noradréanline
KCC2 : Co-transporteur de chlorure de potassium
 xi

Kin : Coefficient de transport

LC : Locus cœruleus
LCR : Liquide céphalorachidien
LpL : Lipoprotéine lipase
Log(P) : Coefficient de partage
LRP1 : Low-density lipoprotein receptor-related protein 1
ME : Moelle épinière
M6G : Morphine-6-glucuronide
NA : Noradrénaline
Nac : Noyau accumbens
Nal : Naphtylalanine
NGF : Facteur de croissance nerveuse
N-hTyr : N-homo-tyramine
N-hTrp : N-homo-tryptamine
NN : Neuromédine N
NRM : Noyau du raphé magnus
NT : Neurotensine
NT(8-13) : Fragment de la neurotensine contenant les acides aminés 8 à 13
NTS1 : Récepteur neurotensinergique 1
NTS2 : Récepteur neurotensinergique 2
NTS3 : Récepteur neurotensinergique 3
OMS : Organisation mondiale de la santé
ovBNST : Noyau ovale de la strie terminale
PAG : Substance grise périaqueducale
PB : Noyau Parabrachial
PFC : Cortex préfrontal
PIP2 : Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
PI3K : Phosphoinositide 3-kinase
PKA : Protéine kinase A
PKC : Protéine kinase C
PLA2 : Phospholipase A2
PLC : Phospholipase C
PV : Pallidum ventral
RAP : Receptor associated protein
RCPG : Récepteur couplé au protéine G
rNTS1 : Récepteur NTS1 de rat
rNTS2 : Récepteur NTS2 de rat
RVM : Région bulbaire rostro-ventrale
SAR : Relation structure/activité
S.c : Injection sous-cutanée
SI : Cortex sensoriel I
SII : Cortex sensoriel II
Sip : Silaproline
SL : Septum latéral
SMA : Aire motrice supplémentaire
SNC : Système nerveux central
 xii

SNP : Système nerveux périphérique

TAA(OH) : Tétrahydrofurane
TEP : Tomographie par émission de positrons
Thal : Thalamus
TMSAla : (L)‐(Trimethylsilyl)alanine
TrkB : Récepteur kinase B de la tropomyosine
T1/2 : Temps de demi-vie
Vd : Volume de distribution
vHPC : Hippocampe ventral
5-HT : Sérotonine
 1

INTRODUCTION

1. La douleur

Qu’est-ce que la douleur ?

Selon la définition officielle de l’Association Internationale pour l’étude de la douleur

(IASP) en 1979, la douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable,
associée à une lésion tissulaire réelle ou potentielle, ou décrite dans ces termes (Pain terms:
a list with definitions and notes on usage. Recommended by the IASP Subcommittee on
Taxonomy., 1979). La douleur joue le rôle d’un système d’alarme qui permet à l’organisme
de réagir et de se protéger face à des stimulations qui peuvent endommager son intégrité. En
fonction de sa durée d’action et de son intensité, la douleur peut être divisée en deux
catégories : la douleur aiguë et la douleur chronique.

1.1.1. La douleur aiguë

La douleur aiguë, aussi appelée douleur nociceptive, est un signal d’alarme indiquant
la présence d’une lésion tissulaire. Ce type de douleur est généralement ressenti après une
coupure, une piqûre, une brûlure ou à la suite d’une chirurgie. Elle est caractérisée comme
étant brève, localisée et intense. Généralement, cette douleur disparaît rapidement après
quelques jours de traitement.

Dans la physiologie de la douleur, il est important de bien dissocier la notion de

nociception et de douleur. La nociception correspond au processus sensoriel qui permet de
détecter un dommage tissulaire par l’activation des nocicepteurs. Les nocicepteurs, aussi
appelés récepteurs nociceptifs, sont présents au niveau de la peau, des muqueuses et de
certains organes internes, et permettent de détecter des stimuli potentiellement nocifs. Il
existe différents types de nocicepteurs qui peuvent être activés par des stimuli de types
chimiques, mécaniques ou thermiques. Ces nocicepteurs sont présents sur les terminaisons
des fibres nerveuses pronociceptives Aδ (peu myélinisées ; petit diamètre ; conductance : 2
 2

– 30 m/s) et C (non myélinisées ; petit diamètre ; conductance < 2 m/s). Les fibres de ces
protoneurones pénètrent dans la moelle épinière (ME) par la racine dorsale et leur corps
cellulaire se situe dans les ganglions spinaux de la racine dorsale de la ME (DRG). Les fibres
Aβ du toucher et de la pression (myélinisées ; gros diamètre ; conductance > 30 m/s) sont
responsables des sensations tactiles non douloureuses, contrairement aux fibres nociceptives
Aδ et C impliquées dans les sensations douloureuses. Lors d’une blessure, les fibres
sensorielles Aδ et C détectent les stimuli et véhiculent l’influx nociceptif vers la ME. Ces
fibres font synapse avec des neurones de 2e ordre situés principalement dans la lamina I, II
et V de la ME. Ce premier relais synaptique au niveau de la moelle épinière permet une
première modulation et intégration du message nociceptif. Il s’agit de la théorie du
« portillon » proposée par R Melzack et P Wall en 1965. D’après cette théorie, les influx en
provenance des grosses fibres (fibres Aβ) exerceraient un effet inhibiteur par l’activation
d’un interneurone enképhalinergique situé dans la substance gélatineuse de la ME (fermeture
du portillon). En revanche, l’arrivée d’informations nociceptives par les petites fibres
nociceptives Aδ et C diminuerait cet effet inhibiteur ce qui permettrait l’ouverture du
portillon et l’acheminement de l’information nociceptive vers le cerveau (Figure 1).

Par la suite, des neurones de 2e ordre empruntent la voie ascendante de la douleur

pour arriver jusqu’au tronc cérébral et au thalamus. Des neurones de 3e ordre acheminent
ensuite l’information sensorielle vers différentes régions du cerveau impliquées dans les
aspects sensori-discriminatif (cortex sensoriel S1 et S2 et cervelet) et sensori-émotionnel
(cortex préfrontal (PFC), amygdale (Amy), noyau accumbens (Nac), noyau
parabrachial (PB), substance grise périaqueducale (PAG), cortex cingulaire antérieur (Acc),
et insula) de la douleur (Figure 1). La composante sensori-discriminative permet de
déterminer les caractéristiques physiques de la douleur, à savoir son type (p. ex. brûlure,
piqûre), sa localisation, sa durée et son intensité, contrairement à l’aspect sensori-émotionnel
qui correspond au côté affectif et émotionnel de la douleur. Après intégration du message
nociceptif au niveau central, c’est alors qu’est perçue la douleur.

La voie descendante de la douleur permet de moduler la douleur. Elle commence au

niveau de la PAG et projette dans la ME (laminas I et IV) via la région bulbaire rostro-
ventrale (RVM) (Figure 1). L’activation de cette voie permet de faciliter la transmission
 3

nociceptive par la libération de cholécystokinine (CCK) au niveau de la ME ou de l’inhiber

en libérant de la noradrénaline (NA) et de la sérotonine (5-HT) (Bingham et al., 2009;
D'Mello and Dickenson, 2008; Millan, 2002; Peirs and Seal, 2016; Sol et al; Site internet
Chapitre 2 sur la douleur).

Figure 1. Les voies nociceptives de la douleur.

Acc, Cortex cingulaire antérieur ; BG, Ganglions de la base; DRG : Ganglions de la racine
dorsale de la moelle épinière; Nac, Noyau accumbens; PAG, Substance grise périaqueducale;
PB, Noyau Parabrachial; PCC, Cortex cingulaire postérieur; PFC, Cortex préfrontal; S1,
Cortex sensoriel I; S2, Cortex sensoriel II; SMA, Aire motrice supplémentaire; RVM,
Région bulbaire rostro-ventrale; (+), activation; (-), inhibition. Image issue de l’article
(Kuner and Flor, 2016) et traduite et modifiée avec autorisation sur le site Biorender.com.

La perception de la douleur reste propre à chacun, puisque des prédispositions

individuelles d’origine génétique par exemple, ou des facteurs psychologiques,
environnementaux et sociaux peuvent interagir avec le système nerveux et influencer de
façon positive ou négative le développement de douleur. Néanmoins, la douleur peut devenir
 4

persistante et pathologique s’il y a des dysfonctionnements au niveau de la transmission de

l’information nociceptive.

1.1.2. La douleur chronique

La douleur chronique se caractérise par sa persistance dans le temps et son intensité.

Selon la classification internationale des maladies (CIM) réalisée en 2019 par l’Organisation
mondiale de la Santé (OMS), la douleur chronique primaire est définie comme une douleur
présente dans une ou plusieurs régions anatomiques :
- qui persiste depuis plus de trois mois ;
- qui est associée à une détresse émotionnelle importante (anxiété, dépression,
colère), ainsi qu’à une incapacité fonctionnelle importante induisant une altération du
déroulement des activités de la vie quotidienne ;
- et dont l’origine apparente des symptômes n’est pas nécessairement définie.
Il existe de nombreux types de douleurs chroniques primaires que l’on peut classifier selon
les symptômes et la localisation : la douleur chronique cancéreuse, post-traumatique,
neuropathique, orofaciale, viscérale et musculo-squelettique et les maux de tête (Nicholas et
al., 2019; Treede et al., 2015).

Du point de vue physiologique, des réponses neuronales anormales au niveau des

voies nociceptives seraient à l’origine du développement de la douleur chronique. En effet,
la transmission et l’intégration constante d’influx nociceptifs peuvent entrainer des
changements (neuroplasticité) fonctionnels et anatomiques des zones impliquées dans
l’intégration du message nociceptif et augmenter la sensibilisation périphérique et/ou
centrale.
La sensibilisation périphérique se produit lorsqu’une lésion tissulaire ou une inflammation
induit une libération accrue de plusieurs médiateurs inflammatoires (bradykinine,
prostaglandines, H+, adénosine triphosphate (ATP), cytokines et chimiokines). Ce
changement d’environnement chimique augmente l’excitabilité des nocicepteurs en
abaissant leur seuil de dépolarisation, ce qui entraine une hausse de la réponse nociceptive
au site de la blessure (hyperalgésie primaire). La stimulation intense et constante au niveau
 5

périphérique induit également une hyperexcitabilité des neurones de 2e ordre. On parle alors
de sensibilisation centrale. Ces deux phénomènes de sensibilisation peuvent amener à une
interprétation excessive du signal douloureux (hyperalgésie secondaire), ou à des réactions
nociceptives suite à des stimuli non nociceptifs (allodynie).
La plasticité neuronale se produit aussi au niveau structurel. En effet, la présence d’une
douleur chronique peut moduler la densité des épines synaptiques et provoquer la
dégénérescence ou la régénération de certains axones et neurones. Ces changements
anatomiques entrainent ainsi des connectivités anormales entre les différentes zones
cérébrales. Par exemple, chez des patients souffrant de fibromyalgie, les connexions
neuronales entre l’Acc et l’amygdale et l’hippocampe sont plus faibles comparativement à
des individus sains (Jensen et al., 2012). De plus, une prolifération et des changements
structurels de la microglie et des astrocytes peuvent également être observés au niveau de la
ME et du cerveau. Ces cellules gliales libèrent notamment des cytokines pro-inflammatoires
et des chimiokines qui induisent une hypersensibilité nociceptive (allodynie et hyperalgésie)
(Ji et al., 2014; Kuner and Flor, 2016).

Le sexe et l’âge sont des facteurs de prédisposition pour développer des douleurs
chroniques. En effet, la répartition hommes/femmes montre que les femmes âgées de 56 ans
et plus sont plus susceptibles de développer des douleurs chroniques (28.8 % de 56 à 65 ans
et 31.5% > 66 ans) que les hommes (> 56 ans ≃ 22%) (Schopflocher et al., 2011). Ces
facteurs de risque (âge et sexe), sa forte prévalence, et son impact économique important
font de la douleur chronique un véritable problème de santé publique.

La douleur chronique : un véritable problème de santé publique

1.2.1. Une forte prévalence

La douleur chronique touche 20% de la population mondiale (Goldberg and McGee,

2011). D’après la dernière étude datant de 2011, 18.9% des Canadiens de plus de dix-huit
ans présentaient des douleurs chroniques, ce qui est comparable à la moyenne mondiale
(Schopflocher et al., 2011). Cette étude a également analysé la répartition des sujets atteints
 6

dans les différentes régions du Canada de 2007 à 2008. Même si la plupart des régions restent
autour de 20%, le Québec arrive en dernière position avec une prévalence de 15.7%.

1.2.2. Un impact économique important

La forte prévalence mondiale de la douleur chronique engendre des coûts colossaux

à la société et aux patients. D’après une étude réalisée en 2016 au Canada, le coût annuel
associé à la douleur chronique a été estimé à 7.2 milliards de dollars. Le coût annuel
individuel a été estimé à 1600 dollars pour les patients souffrant de douleur chronique
modérés et à 3900 dollars pour les douleurs sévères. Les Canadiens adultes (18 à 64 ans)
représentent 70% de ces coûts, contrairement aux personnes âgées (> 65 ans) et aux
adolescents (12 à 17 ans) qui ne représentent que 28% et 2%, respectivement (Hogan et al.,
2016).

Aux États-Unis, une étude réalisée en 2012 a estimé que pour traiter les 100 millions
d’Américains souffrant de douleur chronique, le coût annuel représenterait entre 560 et 635
milliards de dollars. La douleur chronique se situe donc à la première place devant les
maladies cardiovasculaires (309 milliards $), le cancer (243 milliards $), les opérations (205
milliards $), les maladies endocrine, métabolique et nutritionnelle (127 milliards $) ainsi que
les maladies du système digestif (112 milliards $) et respiratoire (112 milliards $) (Gaskin
and Richard, 2012) .

En plus de sa prévalence élevée et de son impact économique important, la douleur

chronique entraine également une dégradation de la qualité de vie du patient avec l’apparition
de comorbidités.

1.2.3. Le cercle vicieux de la douleur chronique

Les personnes souffrant de douleur chronique observent généralement une

diminution de leur qualité de vie et de leur santé générale. En effet, la douleur chronique
entraine le développement d’hyperalgésie et d’allodynie qui affecte les composantes
 7

affectives et émotionnelles des patients, et qui conduit à une diminution de leur seuil de
sensation à la douleur. Cette sensation de douleur plus intense entraine une augmentation des
atteintes physiques (p. ex. diminution de l’activité) et psychologiques (p. ex. déclin de la
santé mentale, retrait social). C’est ainsi que la spirale de la douleur chronique s’installe et
empire au cours du temps : on parle du cercle vicieux de la douleur chronique (Figure 2).

Figure 2. Le cercle vicieux de la douleur chronique.

Schéma inspiré et adapté du site internet de l’Association Québécoise de la Douleur
Chronique (AQDC).

La douleur chronique trop intense et la mise en place de ce cercle vicieux peuvent

devenir pathologiques et empêcher les patients d’aller travailler. D’après une étude réalisée
au Canada en 2002, 50% des patients encore en activité professionnelle ont estimé avoir
manqué entre 9 à 16 jours de travail durant l’année à cause de leur douleur chronique (Moulin
et al., 2002). Ces patients sont également amenés à développer des problèmes
psychologiques, tels que l’anxiété et la dépression. De plus, l’équipe de Tang et
collaborateurs a constaté que ces patients étaient deux à trois fois plus à risque de développer
des pensées suicidaires ou à se suicider (Tang and Crane, 2006). Des études
épidémiologiques ont d’ailleurs montré qu’il y avait un lien bidirectionnel entre la douleur
chronique et le développement de troubles de santé mentale (Hooten, 2016).
 8

Un lien étroit entre douleur chronique et troubles psychologiques

Selon l’OMS, la santé mentale est définie comme « un état de bien-être dans lequel
une personne peut se réaliser, surmonter les tensions normales de la vie, accomplir un travail
productif et contribuer à la vie de sa communauté. Dans ce sens positif, la santé mentale est
le fondement du bien-être d’un individu et du bon fonctionnement d’une communauté ». En
revanche, des perturbations de la pensée, de l’émotion et/ou du comportement peuvent
subvenir et mener au développement de troubles mentaux (psychiatriques ou
psychologiques) (Site internet OMS). Les troubles mentaux regroupent des affections
courantes comme la dépression, les troubles anxieux, les troubles de la dépendance, ainsi
que des troubles plus sévères comme la schizophrénie et les troubles bipolaires, et touchent
de 17 à 29 % de la population mondiale (Hooten, 2016).

D’après des études épidémiologiques, les personnes souffrant de douleur chronique

sont plus portées à développer des troubles mentaux (anxiété, dépression) comparativement
à des individus sains. En 2007, l’équipe de Demytteraere et collaborateurs a publié les
résultats d’une enquête internationale (18 pays) sur la santé mentale visant à déterminer la
prévalence des troubles mentaux tels que l'anxiété et la dépression chez des patients souffrant
de douleur chronique lombaire ou cervicale (Demyttenaere et al., 2007). Les résultats de
cette étude, représentés dans le graphe A de la Figure 3, montrent que la prévalence des
troubles dépressifs et/ou d’anxiété est deux fois plus élevée chez des patients atteints de
douleur chronique par rapport aux individus sains.
Une revue de littérature publiée en 2016 par l’équipe de Hooten et collaborateurs a estimé
les risques de développer des troubles mentaux en fonction du type de douleur chronique
(Hooten, 2016). Les résultats de cette étude sont présentés dans le graphe B de la Figure 3,
et montrent que la prévalence de développer de la dépression et de l’anxiété dépend du type
de douleur chronique. Par exemple, environ 40% des personnes souffrant de trouble
articulaire développent de l’anxiété et/ou de la dépression. En revanche, moins de 20% des
patients atteints de douleur neuropathique développent ces mêmes troubles mentaux.
 9

Figure 3. Études épidémiologiques des risques de développer des troubles de dépression

et d’anxiété chez des personnes souffrant de douleur chronique.
(A) Prévalence chez des patients sains ou souffrant de douleur chronique (dos ou cou). (B)
Prévalence des troubles mentaux en fonction des différents types de douleur chronique. Ces
figures ont été réalisées à partir de données issues de l’article de (Demyttenaere et al., 2007)
(A), et de la revue scientifique de l’équipe de (Hooten, 2016) (B). © Mélanie Vivancos.

Parallèlement, différentes études ont démontré que les personnes souffrant d’anxiété
ou de dépression avaient tendance à développer plus facilement des douleurs chroniques. En
2015, Bruffaerts et collaborateurs ont montré que la présence de troubles anxieux (humeur,
anxiété, troubles de contrôle des impulsions) augmente de 40% les chances de développer
des maux de tête sévères (Bruffaerts et al., 2015). De plus, les patients souffrant de
dépression ont deux fois plus de risque de développer des douleurs chroniques du dos
comparé à des individus sains (Currie and Wang, 2005).

Il est donc clair que la douleur chronique peut entrainer le développement de troubles
mentaux, et inversement. Le lien bidirectionnel entre la douleur chronique et les troubles
mentaux (anxiété et la dépression) est à prendre en compte pour traiter ces deux pathologies.
 10

Les traitements actuels pour traiter la douleur chronique

Les différences interindividuelles ainsi que les facteurs biologiques et

psychologiques rendent la prise en charge de la douleur complexe. Avant de prescrire un
traitement, il faut tout d’abord déterminer l’origine, la localisation, la durée et surtout
l’intensité de la douleur. L’intensité douloureuse est déterminée à l’aide d’une échelle
visuelle analogique (EVA) qui permet de chiffrer la douleur de 0 à 10. Selon l’EVA, 0 est
considéré comme une absence de douleur, alors que 10 correspond à une douleur extrême.
L’OMS a défini des protocoles thérapeutiques précis en fonction des différents paliers de
douleur obtenus avec l'EVA: Palier I : EVA < 3 ; Palier II : 3 < EVA < 6 et Palier III : 6 <
EVA (Figure 4).

Figure 4. Échelle visuelle analogique et traitements antalgiques utilisés pour les

différents paliers de douleur. © Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le site
Biorender.com).
 11

Il est intéressant de noter qu’à partir d’une douleur moyenne (EVA > 3), l’OMS
préconise l’utilisation d’opioïdes faibles ou puissants (Figure 4). En revanche, l’usage de ce
type d’antalgique peut induire des effets secondaires importants à ne pas sous-estimer, tels
que des étourdissements, des nausées, des vomissements, de la constipation, de la dépression
respiratoire, mais surtout de la tolérance et de la dépendance physique et psychologique
(Benyamin et al., 2008). La tolérance aux opioïdes apparaît lorsqu’on les utilise
quotidiennement et que l’organisme s’adapte à leur présence continue. C’est un problème
majeur, car pour soulager efficacement la douleur, les doses doivent être régulièrement
revues à la hausse, entraînant davantage d'effets secondaires. Au cours des 15 dernières
années, la prescription d’opioïdes a considérablement augmenté, et leur utilisation est
devenue un véritable problème de santé publique (Munzing, 2017). La surprescription de ces
antalgiques et le développement de dépendance ont conduit à la crise des opioïdes. Cette
crise est également liée à l’apparition de drogues de synthèse opioïdergiques vendues dans
les rues (p. ex. le fentanyl et le carfentanyl) qui causent un nombre élevé de surdoses et de
décès (Schiller et al., 2020; Singh et al., 2020). Selon l’Agence de la Santé du Canada, 76%
des décès accidentels survenus en 2018 seraient liés à la consommation de fentanyl ou de ses
analogues.

Depuis les années 1980, les prescriptions d’opioïdes ont augmenté de 3000% au
Canada. En 2016, 20 millions d’ordonnances d’opioïdes ont été dispensées au Canada, ce
qui équivaut à environ une prescription par Canadien (> 18 ans) (Belzak and Halverson,
2018). Le Canada est donc le deuxième consommateur mondial d’opioïde derrière les États-
Unis. L’Agence de la Santé du Canada a estimé qu’entre janvier 2016 et septembre 2019,
plus de 14 700 personnes sont décédées à la suite d’une overdose d’opioïdes. Cette crise
sanitaire est un phénomène mondial qui n’est pas près de s’arrêter, car le nombre de décès
relatif à la surconsommation d’opioïdes ne cesse d’augmenter au fil des années.

Face à l’impact négatif des opioïdes sur la santé publique, des alternatives sont
nécessaires pour soulager les patients. Le lien étroit entre la douleur et les maladies mentales
permet d’augmenter les possibilités de traitement en administrant des antidépresseurs
(antidépresseurs tricycliques, inhibiteurs sélectifs de la recapture de sérotonine et
 12

noradrénaline), des anxiolytiques (Benzodiazépine) et des anticonvulsivants (Gabapentine,

Prégabaline) (Figure 4). De plus, l’utilisation des cannabinoïdes pour traiter la douleur
chronique a fait l’objet d’un grand nombre d’études cliniques, et les résultats actuels
s’avèrent positifs (Fitzcharles et al., 2016; Hill, 2015; Mücke et al., 2018). Des alternatives
non pharmacologiques peuvent également être envisagées pour soulager la douleur telles que
l’hypnose, l’acupuncture, la neurostimulation électrique transcutanée, la kinésithérapie, la
cryothérapie et la thermothérapie (application locale de chaud ou de froid). Cependant,
aucune de ces actions pharmacologiques et/ou non pharmacologiques n'arrive à enrayer
complètement la douleur chez les patients.

Il y a donc nécessité, voire même urgence, de développer de nouveaux composés

analgésiques capables de s’affranchir du système opioïdergique. Tout comme les opioïdes,
de plus en plus de nouveaux médicaments mis sur le marché ciblent les récepteurs à sept
domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG). D’après une étude réalisée
en 2017, 34% des médicaments commercialisés visent cette famille de récepteurs (Hauser et
al., 2018). Les RCPG sont très intéressants, car ils ont un impact majeur dans beaucoup de
processus physiologiques et pathophysiologiques. Le génome humain compte environ 800
RCPG répartis selon cinq classes différentes (Fredriksson et al., 2003). Au niveau de la classe
A (récepteur de type Rhodopsine), il existe 61 familles de RCPG différentes et plus de 70%
de ces familles ont un rôle dans la douleur ou dans les phénotypes associés (Oladosu et al.,
2015; Stone and Molliver, 2009). Mis à part le système opioïdergique, d’autres systèmes
impliqués dans le mécanisme de la douleur agissent également sur des RCPG, tels que les
endocannabinoïdes, la bradykinine, les chimiokines et la neurotensine (Pérez de Vega et al.,
2018). Ces cibles potentielles représentent un véritable espoir dans le développement de
nouveaux médicaments antalgiques.
 13

2. Le système neurotensinergique

La neurotensine

La neurotensine (NT) a été isolée pour la première fois en 1973 à partir de

l’hypothalamus bovin par l’équipe de recherche de Carraway et Leeman. Suite à sa
découverte, ils ont observé que l’injection intraveineuse (i.v.) de ce peptide induisait une
vasodilatation et de l’hypotension chez le rat (Carraway and Leeman, 1973). Son nom vient
d'ailleurs de la fusion entre « Neuro » pour sa présence dans le système nerveux et
« Tensine » pour son effet hypotenseur. Entre 1976 et 1980, la NT fut isolée à partir de tissus
d’intestin bovin et humain (Hammer et al., 1980; Kitabgi et al., 1976), puis sa séquence
peptidique complète a été obtenue en 1975 (Carraway and Leeman, 1975a). La NT est
composée de 13 acides aminés (AA) dont la séquence est la suivante : pyroGlu-Leu-Tyr-
Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH. Carraway et Leeman ont par la suite
produit de la NT synthétique (Carraway and Leeman, 1975b), ce qui dès lors, a permis
d'étudier en profondeur le système neurotensinergique et d’en déterminer ses rôles
physiologiques.

Le gène codant pour la NT a été isolé et séquencé pour la première fois chez le chien
en 1987, puis chez le rat en 1988 et chez l’humain en 1992 (Bean et al., 1992; Dobner et al.,
1987; Kislauskis et al., 1988). Chez l’Homme, ce gène est présent au niveau du chromosome
12 et du locus 12q21.31. Le précurseur de la NT code également pour un autre peptide, la
neuromédine N (NN). Ce précurseur commun proneurotensine/neuromédine N possède
quatre zones qui peuvent être clivées par différentes pro-protéines convertases (PC1, PC2 et
PC5A), et induire ainsi à la libération de NT et de NN (Sarret and Kitabgi, 2009). La NN est
un petit peptide de six acides aminés, Lys-Ile-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH, dont la séquence est très
similaire à la partie C-terminale de la NT (Kitabgi et al., 1992).

La synthèse de la NT se fait de façon continue au niveau des neurones. Une fois

synthétisée, la NT est stockée dans des vésicules et est relâchée de façon calcium-dépendant.
Les neurones neurotensinergiques sont très nombreux et leurs différentes projections
 14

assurent une large distribution de la NT dans le SNC. En effet, elle est présente en forte
concentration dans l’hypothalamus, l’amygdale, la PAG, le noyau raphé dorsal, le cortex
frontal, le globus pallidus, le Nac, la substance noire, l’aire tegmentale ventrale (ATV), la
RVM ainsi que dans la corne dorsale de la moelle épinière (Dobner, 2006; Sarret and Kitabgi,
2009). Il est intéressant d’observer que la plupart de ces régions sont impliquées dans le
contrôle de la douleur. Plus largement, la NT est également présente dans les systèmes
cardiovasculaire et gastro-intestinal, ainsi que dans le foie et le pancréas (Méndez et al.,
1997; Osadchii, 2015; Zhao and Pothoulakis, 2006).

Les récepteurs neurotensinergiques

Durant les années 1990, trois récepteurs de la NT ont été découverts. Les deux
premiers, NTS1 et NTS2 sont des RCPG qui appartiennent à la famille de la rhodopsine
(classe A) alors que le troisième, NTS3, est un récepteur à un seul domaine transmembranaire
qui comporte 100% d'homologie avec le récepteur humain gp95/sortiline.

2.2.1. NTS1 et NTS2 : deux récepteurs couplés aux protéines G

Les RCPG sont composés de sept domaines transmembranaires, d’une queue

extracellulaire et d’une queue intracellulaire qui interagit avec différentes protéines G. Ils
ont pour rôle de traduire des stimuli extracellulaires en signal intracellulaire. Les hormones,
les chimiokines, les neurotransmetteurs, les ions ainsi que les vitamines peuvent se lier aux
RCPG. Lorsqu’un ligand se fixe sur son récepteur, cela induit une cascade de réponse
intracellulaire via les protéines G, les arrestines, les kinases et les canaux ioniques
(Christopoulos and Kenakin, 2002; Wacker et al., 2017).

2.2.1.1. Le récepteur NTS1

Les récepteurs NTS1 de rat et d’humain ont été clonés pour la première fois en 1990
et 1993, respectivement (Tanaka et al., 1990; Vita et al., 1993). Chez le rat, il contient 424
AA alors que le chez l'humain, il n’en compte que 418. Malgré un nombre d’AA différents,
 15

ces deux récepteurs ont 84% d’homologie (Tanaka et al., 1990; Tyler-McMahon et al., 2000).
Le gène humain codant pour ce récepteur est localisé sur le long bras du chromosome 20, au
niveau du locus 20q13 (Vincent et al., 1999).

La NT est très affine pour les récepteurs NTS1 (Kd : 0.1 à 0.3 nM), et sa liaison induit
une cascade de signalisation intracellulaire principalement liée aux protéines G (Kitabgi et
al., 1987; Pelaprat, 2006; Skrzydelski, 2003).

• La signalisation de NTS1

Dans la littérature, la signalisation de NTS1 est bien décrite. Différentes études ont
montré que la liaison de la NT aux récepteurs NTS1 provoquait l’activation de plusieurs
protéines G, tels que Gαq/11, Gαi/o, Gαs et Gα13 (Besserer-Offroy et al., 2017; Gailly et al.,
2000; Najimi et al., 2002; Pelaprat, 2006; Skrzydelski, 2003). En effet, l’activation du
récepteur NTS1 par la NT entraîne la production d’adénosine monophosphate cyclique
(AMPc) ou encore sa diminution en fonction du type cellulaire, d’inositol trisphosphate
(IP3), et d’acide arachidonique, l’activation/inhibition des protéines kinases ERK1/2, ainsi
que l’activation de la protéine kinase A (PKA), de la protéine kinase serine/thréonine AKT
et des protéines Rho/Rock (Besserer-Offroy et al., 2017; Gailly et al., 2000; Liu et al., 2004;
Müller et al., 2011). En revanche, il semble interagir préférentiellement avec la protéine
Gαq/11 (Najimi et al., 2002; Vincent et al., 1999). Cette protéine Gαq/11 interagit avec la 3e
boucle intracellulaire contrairement aux protéines Gαi/o et Gαs qui interagissent au niveau de
la queue C-terminale du récepteur (Kitabgi, 2006a; Pelaprat, 2006). La localisation de la
protéine Gα13 n’a pas été étudiée dans la littérature. Les différentes voies de signalisation des
récepteurs NTS1 sont schématisées dans la Figure 5A.

Par son couplage à la protéine Gαq/11, la liaison de la NT à NTS1 active la

phospholipase C (PLC) qui induit la production d’IP3 et de diacylglycérol (DAG). L’IP3
favorise la mobilisation calcique en ouvrant les canaux IP3R présents au niveau du réticulum
endoplasmique. L’augmentation de Ca2+ intracellulaire permet l’activation de la
phospholipase A2 qui transforme les phospholipides membranaires en acide arachidonique
 16

(Gailly et al., 2000; Najimi et al., 2002). Le DAG, quant à lui, active la protéine Kinase C
(PKC) qui active la voie des MAPKinases via la phosphorylation des protéines Ras/Raf
(Ehlers et al., 2000; Todisco et al., 1997). Les MAPKinases ont un rôle cellulaire important
puisqu’elles régulent la prolifération, l’expression génique, la différenciation, la mitose, la
survie cellulaire et l’apoptose (Pearson et al., 2001).

Le couplage aux protéines Gαi/o et Gαs régule la production d’AMPc. La protéine Gαs
active l’adénylate cyclase (AC) pour permettre la transformation d’ATP en AMPc.
L’élévation du taux d’AMPc est responsable de l’activation de la PKA et de l’inhibition de
la voie des MAPKinases. En revanche, la protéine Gαi/o inhibe l’AC, mais active la voie des
MAPKinases via la tyrosine Kinase s-Src. La protéine s-Src active également le récepteur
du facteur de croissance épidermique (EGFR) présent sur les cellules cancéreuses. La
phosphorylation d’EGFR par la s-Src enclenche la voie de signalisation PI3K/AKT qui
permet la survie cellulaire (Amorino et al., 2007; Moody et al., 2019; Müller et al., 2011;
Piiper and Zeuzem, 2004).

Le récepteur NTS1 est également couplé à la protéine Gα13 qui active la voie de
signalisation des GTPases Rho/Rock. Cette voie est importante pour la migration cellulaire
(Besserer-Offroy et al., 2017; Kozasa et al., 2011; Servotte et al., 2006).

Enfin, la signalisation de NTS1 mène également à la production d’acide

arachidonique. Comme mentionné précédemment, cette production peut être médiée par
l’activation des protéines Gαq/11. Les protéines Gαi peuvent également activer la
phospholipase A2 (PLA2), soit par leur sous-unité αi via l’activation des MAPkinases, ou
soit par la libération de leur sous-unité βγ (Gailly et al., 2000; Jelsema and Axelrod, 1987).
L’acide arachidonique est ensuite transformé en prostaglandines.

Il existe également un phénomène de désensibilisation des récepteurs NTS1 liés à

une stimulation prolongée des récepteurs. Après l’activation du récepteur, la thréonine422 et
la tyrosine424, présentes au niveau de la partie C-terminale du récepteur de rat, sont
phosphorylées (Chabry et al., 1995). Cette subtile modification chimique permet le
 17

recrutement des β-arrestines 1 et 2 (Besserer-Offroy et al., 2017; Huang et al., 2020; Hübner
et al., 2016; Souazé and Forgez, 2006). Une fois liées, les β-arrestines induisent
l'internalisation des récepteurs dans des vésicules de clathrine. La libération de ces vésicules
au niveau intracellulaire est dépendante de la dynamine (Savdie et al., 2006; Vandenbulcke
et al., 2000) (Figure 5B).
Le temps d’exposition des récepteurs NTS1 à la NT est un facteur important pour leur
devenir (Figure 5B). Lors d’une courte exposition à la NT, les récepteurs NTS1 sont dirigés
vers les endosomes précoces et tardifs pour ensuite être envoyés dans les lysosomes où ils
seront dégradés (Mazella and Vincent, 2006b; Sarret and Kitabgi, 2009; Vandenbulcke et
al., 2000). Néanmoins, la synthèse protéique de novo des récepteurs NTS1 permet une
resensibilisation à la surface cellulaire (Hermans et al., 1997; Souazé and Forgez, 2006).
Lors d’une exposition prolongée (6 heures) avec une concentration saturante d’agoniste, les
récepteurs NTS1 sont recyclés à la membrane plasmique au lieu d’être dégradés. Suite à leur
endocytose, les récepteurs NTS1 et la NT sont accumulés dans le compartiment de recyclage
périnuclaire de l’appareil de Golgi. Alors que la NT y est dégradée, les récepteurs sont
dispersés dans des vésicules pour être transportés à la surface cellulaire. Le recyclage et la
présence d’une forte concentration de NT induisent une sensibilisation cellulaire constante
qui conduit à une activation chronique des MAPKinases, et qui génère ainsi une régulation
oncogénique (Souazé and Forgez, 2006; Toy-Miou-Leong et al., 2004).
 18

Figure 5. Voies de signalisation du récepteur NTS1.

A. Les différentes voies de signalisation liées au couplage de NTS1 à plusieurs protéines G.
B. La voie des β-arrestines mène à la dégradation du récepteur ou à son recyclage en fonction
du temps d’exposition à la NT. IP3R : récepteur de l’inositol trisphosphate; PKA : protéine
kinase A; PKC : protéine kinase C; PIP2 : phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PI3K :
 19

Phosphoinositide 3-kinase. © Mélanie Vivancos (Images réalisées sur le site

Biorender.com).

Les récepteurs NTS1 ont également la capacité d’interagir directement avec d’autres
récepteurs du système neurotensinergique (NTS2 et NTS3), mais aussi avec d’autres RCPG
tels que les récepteurs apélinergiques APJ, opioïdergiques Kappa et dopaminergiques D2
(Bai et al., 2014; Fuxe et al., 2014; Liu et al., 2016; Martin et al., 2002a; Perron et al., 2007).
Cette hétérodimérisation peut affecter sa propre signalisation, ou inversement, modifier celle
du récepteur avec lequel il interagit.

• La localisation de NTS1

La localisation des récepteurs NTS1 fut déterminée par autoradiographie, hybridation

in situ et immunohistochimie. D’après ces expériences, les récepteurs NTS1 sont
majoritairement présents au niveau du système nerveux central (SNC), mais également dans
le système nerveux périphérique (SNP) et dans certains organes (Figure 6) (Fassio et al.,
2000; Méndez et al., 1997; Quirion et al., 1982; Sarret and Beaudet, 2003).

Dans le SNC, les récepteurs NTS1 sont exprimés dans des zones impliquées dans le
contrôle supraspinal de la douleur telles que le thalamus, l’hypothalamus, l’amygdale, la
PAG, et la RVM (Figure 1) (Buhler et al., 2005; Sarret and Beaudet, 2003). Ils sont
également présents au niveau spinal dans la corne dorsale de la ME, plus précisément dans
les couches impliquées dans le traitement des stimuli nociceptifs (lamina I et II), et dans
celles où se trouvent les terminaisons des fibres myélinisées primaires (lamina III à VI)
(Roussy et al., 2008). Dans le SNP, ils sont exprimés au niveau des fibres nociceptives C
(petits DRG) et des fibres nociceptives Aδ (moyens DRG) (Roussy et al., 2008; Zhang et al.,
1995) (Figure 6). La distribution des récepteurs NTS1 suggère qu’ils pourraient être
impliqués dans la régulation spinale et supraspinale de la douleur.

Les récepteurs NTS1 sont également localisés au niveau du système dopaminergique,

plus précisément dans les régions mésencéphaliques de la substance noire et de l’ATV (St-
Gelais et al., 2006). Ils sont aussi exprimés sur des neurones mésencéphaliques
 20

dopaminergiques tels que le septum latéral (SL), le noyau de la strie terminale (BNST),
l’amygdale, les tubercules olfactifs, le putamen et le noyau caudé, et plus de 80% des
neurones dopaminergiques expriment ces récepteurs (Boules et al., 2014; Fassio et al., 2000;
Nicot et al., 1994; Quirion et al., 1982; Sarret and Beaudet, 2003) (Figure 6). Cette étroite
association entre les systèmes neurotensinergique et dopaminergique laisse supposer que la
NT est impliquée dans la physiopathologie de plusieurs troubles du SNC reliés aux circuits
DA tels que la schizophrénie, la maladie de Parkinson, les déficits moteurs ou encore l’abus
de psychostimulants (Boules et al., 2006). Pour la schizophrénie, des études cliniques ont
révélé une corrélation négative entre le taux de NT dans le liquide céphalorachidien (LCR)
de patients et la sévérité de leurs symptômes (Breslin et al., 1994; Lindström et al., 1988;
Sharma et al., 1997). Pour traiter ces patients, des antipsychotiques de 1re (typique) ou de 2e
génération (atypique) sont généralement administrés, et augmentent le taux de NT au niveau
cérébral (Kinkead et al., 2000; Radke et al., 1998; Tyler-McMahon et al., 2000). La NT ou
un agoniste NTS1 (PD149163) agissent également comme des antipsychotiques atypiques
(Boules et al., 2014; Feifel et al., 2016; Hillhouse and Prus, 2013; Holly et al., 2011; Jolicoeur
et al., 1993; Li et al., 2010; Vadnie et al., 2016). Pour la maladie de Parkinson,
l’administration d’analogues NT diminue les symptômes neurodégénératifs de la maladie
(perte d’équilibre et de mémoire) et semble avoir des effets neuroprotecteurs sur les neurones
DA (Boules et al., 2001; Lazarova et al., 2018).

Les récepteurs NTS1 sont également présents au niveau des neurones cholinergiques
(cerveau antérieur basal), dans l’hypothalamus ainsi que dans des régions clés impliquées
dans les troubles émotionnels (PFC, Nac, amygdale, thalamus, BNST, ATV, PAG) (Calhoon
and Tye, 2015; Fassio et al., 2000; Nicot et al., 1994; Sarret and Beaudet, 2003) (Figure 6).
Leur localisation concorde avec leurs différents effets physiologiques puisque
l’administration de NT ou d’analogues NTS1-sélectifs induit une hypolocomotion, une
diminution de l’anxiété et de la dépression, de l’hypothermie, régule la prise alimentaire et
augmente le stress en stimulant l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS) (Carey et
al., 2017; László et al., 2010; Pettibone et al., 2002; Remaury et al., 2002; Rowe et al., 1995).
 21

Au niveau cellulaire, les récepteurs NTS1 sont principalement exprimés dans le soma
des neurones. Dans certaines régions du cerveau, ils sont plutôt localisés sur les dendrites
(cerveau antérieur basal, mésencéphale basal et médulla rostrale), ou sur les axones et les
terminaisons axonales (SL, BNST, thalamus) (Boudin et al., 1996; 1998; Fassio et al., 2000;
Sarret and Kitabgi, 2009). La localisation cellulaire de NTS1 suggère que la NT agit sur ses
récepteurs aussi bien au niveau présynaptique que postsynaptique. Au niveau subcellulaire,
les récepteurs NTS1 sont le plus souvent exprimés à la membrane plasmatique des neurones.
En revanche, les dendrites ont une forte concentration de récepteur au niveau intracellulaire,
ce qui suggère que les neurones exprimant NTS1 ont une grande quantité de récepteurs de
réserve (Boudin et al., 1998; Sarret and Kitabgi, 2009).

En plus d’être largement distribués dans le SNC, les récepteurs NTS1 se retrouvent
également dans différents organes (Figure 6). Leur localisation est similaire à celle de la NT
soit au niveau du système cardiovasculaire, du système gastro-intestinal, ainsi que dans le
foie et le pancréas (Méndez et al., 1997; Osadchii, 2015; Tanaka et al., 1990; Zhao and
Pothoulakis, 2006). Chez le rat, l’activation de NTS1 provoque de l’hypotension, une
vasoconstriction coronaire, augmente la contractilité myocardique et régule la fréquence
cardiaque (Kaczyńska and Szereda-Przestaszewska, 2012; Osadchii, 2015). Au niveau du
système gastro-intestinal, l’activation de NTS1 peut induire une relaxation ou une
contraction dépendamment de l’espèce (rat, cobaye) et de la partie de l’intestin (iléon, colon,
estomac) étudié (Kitabgi and Freychet, 1979; Kitabgi et al., 1984; Labbé-Jullié et al., 1994;
Pettibone et al., 2002). De plus, ces récepteurs sont également surexprimés dans certains
types de cancer (prostate, colon, pancréas, sein et gliomes) où ils ont un effet oncogénique
(Ouyang et al., 2016).
 22

Figure 6. Localisation des récepteurs NTS1 dans le SN et dans différents organes.

Zones vertes de la moelle épinière : localisation des récepteurs NTS1. BNST : noyau de la
strie terminale; PAG : Substance grise périaqueducale; PFC : cortex préfrontal; RVM :
Région bulbaire rostro-ventrale; vHPC : Hippocampe ventral; ATV : Aire tegmentale
ventrale. © Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le site Biorender.com).

2.2.1.2. Le récepteur NTS2

Le récepteur NTS2 humain (hNTS2) est constitué de 410 acides aminés, alors que
celui de rat (rNTS2) en contient 416. Chez l’homme, le gène qui code pour ce récepteur se
situe sur le chromosome 2, au niveau du locus 2p25.1 (Sarret and Kitabgi, 2009; Vincent et
al., 1999). Chez le rat, les récepteurs NTS1 et NTS2 présentent 43% d’identité (similarité
des AA) et 64% d’homologie (séquence d’AA partageant une origine évolutive commune)
(Chalon et al., 1996; Vincent et al., 1999). Parmi les différences structurelles existantes entre
NTS1 et NTS2 de rat, notons que la troisième boucle intracellulaire de NTS2 est plus longue
et que la queue N-terminale extracellulaire de NTS2 est plus courte et dépourvue de sites de
N-glycosylation (Figure 7) (Tyler-McMahon et al., 2000). Généralement, l’acide aspartique
113 au niveau du second domaine transmembranaire des RCPG est très conservé. Pour
NTS2, cet AA est remplacé par une alanine ou une glycine, ce qui le rend insensible aux ions
sodium (Vincent et al., 1999). Outre des différences structurelles, le récepteur NTS2 se
 23

différencie de NTS1 par son affinité pour la NT. La NT est 10 fois moins affine pour les
récepteurs NTS2 comparativement à NTS1 (Kd : 0.1 à 0.3 nM pour NTS1 et Kd : 3 à 10 nM
pour NTS2) (Kleczkowska and Lipkowski, 2013). La particularité des récepteurs NTS2 est
que la lévocabastine, un antagoniste des récepteurs H1 de l’histamine, est très affine pour
ces récepteurs contrairement à NTS1 (IC50 > 10 000 nM pour NTS1 de rat (rNTS1) ; IC50 ≃
3 nM pour NTS2 de rat (rNTS2)) (Roussy et al., 2009).

Figure 7. Représentation schématique des récepteurs NTS1 et NTS2 de rat.

Bleu : AA spécifiques de NTS1. Jaune : AA spécifiques de NTS2. Vert : AA communs aux
deux récepteurs. Rose : sites indispensables pour la liaison de la NT. Orange : sites
indispensables pour la liaison du SR48692. Rouge : sites de liaison communs entre la NT et
le SR48692. Violet : AA indispensables pour l’internalisation de NTS1 (queue C-terminale).
Gris : AA indispensables pour le couplage à la phospholipase C (NTS1). Noir : acide
aspartique 113 responsable de la liaison du sodium (2e domaine transmembranaire). Y : sites
de N-glycosylation. Image tirée de l’article de (Vincent et al., 1999) et reproduit avec
autorisation.
 24

• La signalisation des récepteurs NTS2

Le clonage des récepteurs NTS2 de rat, de souris et d’humain par homologie de

séquence avec le récepteur NTS1 a permis d’étudier le profil signalétique de NTS2.
Contrairement à NTS1, la signalisation de NTS2 est beaucoup plus controversée. La
première étude a été réalisée en 1996 sur des oocytes de Xenopus. Lors de cette étude, les
chercheurs ont observé que l’activation des récepteurs NTS2 de souris induisait un courant
chlore calcium-dépendant (Mazella et al., 1996). Par la suite, les quelques études portant sur
le profil signalétique de NTS2 ont obtenu des résultats très différents en fonction du type
cellulaire, de l’espèce du récepteur (rat, souris, humain) et du ligand utilisé. Ces résultats
sont répertoriés dans le Tableau 1. Les différences observées entre les études peuvent
s’expliquer par l’utilisation d’un système cellulaire hétérologue dans lequel les récepteurs
NTS2 sont surexprimés à des niveaux bien plus élevés que leur niveau d’expression
endogène, qui est généralement très faible (Mazella and Vincent, 2006a). Pour se rapprocher
d’un modèle endogène, notre équipe a étudié la signalisation des récepteurs NTS2 sur une
culture primaire de cellules granulaires de cervelet de rat. Lors de cette étude, il a été observé
que la NT ne produisait aucune mobilisation calcique et aucune production d’IP. En
revanche, la liaison de la NT induisait l’activation des protéines kinase p42/44 ainsi que
l’internalisation du complexe NT/NTS2 via un processus clathrine-dépendant (Sarret et al.,
2002). Ces résultats ont été confirmés par Gendron et collaborateurs, à l'aide de cellules CHO
(lignée cellulaire issue d'ovaires de hamster de Chine) transfectées avec le récepteur NTS2
de rat. Lors de leurs essais, ils ont observé que la NT n’induisait aucune mobilisation
calcique, mais que l’activation des MAPKinases p42/p44 était dépendante de
l’internalisation des récepteurs (Gendron et al., 2004). Suite à ces divers résultats, les
récepteurs NTS2 n’ont pas été associés à une protéine G précise, mais l’activation des
MAPKinases semble être la voie de signalisation la plus régulièrement observée (Pelaprat,
2006). Des études plus approfondies du profil signalétique du récepteur NTS2 sont
nécessaires pour déterminer ses voies de signalisation et avec quelles protéines G il interagit.
La principale difficulté pour réaliser des essais in vitro avec ce récepteur est qu’il s’exprime
très mal à la surface cellulaire. Cette mauvaise expression pourrait s’expliquer en partie par
l’absence de sites de glycosylation au niveau de la queue N-terminale du récepteur.
 25

Activation des Formation IP Internalisation

Espèce Système Augmentation du
voies des du récepteur
d’expression Ca2+ cytosolique
MAPKinases
Xenopus oocyte NT (+)
(Mazella et al., NN (+)
Souris 1996) Lévocabastine (+)
Cellules HEK293 NT (∅) NT (+)
(Botto et al., 1998)
NT (+) , faible
Cellules CHO
JMV449 (+) , faible
(Yamada et al.,
SR48692 (+)
1998)
Lévocabastine (+)
NT (∅) NT (+) NT (+)
Cellules CHO
NN (∅) NN (+) NN (+)
(Gendron et al.,
Lévocabastine (∅) Lévocabastine (+) Lévocabastine (+)
2004)
Rat SR48692 (+) SR48692 (+) SR48692 (+)
NT (-)
Cellules CHO
Lévocabastine (+)
(Thomas et al.,
SR48692 (+)
2015b)
SR142948A (+)
Culture primaire de NT (∅) NT (+) NT (∅) NT (+)
cellules granulaires Lévocabastine (∅) Lévocabastine (+) Lévocabastine (∅)
de cervelet SR48692 (+) SR48692 (-) SR48692 (∅)
(Sarret et al., 2002)
NT (-) NT (-) NT (-)
Cellules CHO Lévocabastine (-) Lévocabastine (-) Lévocabastine (-)
(Vita et al., 1998) SR48692 (+) SR48692 (+) SR48692 (+)
SR142948A (+) SR142948A (+) SR142948A (+)
Cellules CHO NT (+)
Humain (Gendron et al., Lévocabastine (+)
2004) SR48692 (+)
NT (-)
Cellules COS
Lévocabastine (*)
(Richard et al.,
JMV431 (*)
2001)
SR48692 (+)
(+) effet agoniste ; (-) effet antagoniste ; (∅) pas d’effet ; (*) Agoniste inverse

Tableau 1. Profil signalétique des récepteurs NTS2.

La signalisation de NTS2 dépend de l’espèce, du système d’expression et du ligand utilisés.
Tableau inspiré de l’article (Mazella and Vincent, 2006a).

Contrairement à NTS1 qui subit une dégradation lysosomale, le récepteur NTS2

murin est recyclé à la membrane après son internalisation (Mazella and Vincent, 2006a;
Perron et al., 2006). Chez la souris, ce recyclage dépend de la phosphorylation de la tyrosine
en position 237 située au niveau de la troisième boucle intracellulaire du récepteur (Martin
et al., 2002b). Chez le rat, la présence d’une tyrosine à cette position laisse supposer qu’il est
également recyclé à la membrane. Chez l’homme, c’est une cystéine qui est présente à cette
position et les récepteurs NTS2 humains sont dégradés après leur internalisation. En
revanche, la substitution de cette cystéine par une tyrosine restaure leur recyclage à la
membrane (Martin et al., 2002b).
 26

Perron et al ont observé que malgré son internalisation, la quantité de récepteurs

NTS2 de rat présent à la membrane restait relativement constante. En condition normale, les
récepteurs NTS2 sont faiblement exprimés à la surface cellulaire et 84.7% des protéines de
NTS2 sont retrouvées au niveau intracellulaire. Après leur activation, les auteurs ont observé
une diminution de la densité de rNTS2 présent à la surface membranaire due à leur
internalisation. En revanche, lors d’une exposition prolongée à un ligand, l’activation
constante des récepteurs NTS2 permet le recrutement des récepteurs intracellulaires et
maintient un taux constant de récepteurs à la surface membranaire (Perron et al., 2006).

• La localisation des récepteurs NTS2

D’après de nombreuses études d’autoradiographie basées sur la liaison spécifique de

radioligands tels que [3H]NT, [125I]NT, [3H]SR142948A et [3H]lévocabastine, les récepteurs
NTS2 sont largement distribués dans le système nerveux central chez le rat (Asselin et al.,
2001; Betancur et al., 1998; Kitabgi et al., 1987; Schotte et al., 1986). Ces résultats ont été
confirmés par des essais d’immunohistochimie utilisant des anticorps dirigés contre la
protéine NTS2 et par des études d’hybridation in situ pour détecter l’ARNm codant pour ce
récepteur (Sarret et al., 1998; 2003b; Walker et al., 1998). Au niveau cellulaire, les récepteurs
NTS2 sont principalement exprimés au niveau dendritique. Leur localisation neuronale
diffère de NTS1 qui est présent au niveau des corps cellulaires, des dendrites et des axones
des neurones (Sarret and Kitabgi, 2009).

Au niveau du SNC, les récepteurs NTS2 sont très exprimés dans les zones impliquées
dans le contrôle de la douleur telles que le thalamus, l’hypothalamus, le cortex
somatosensoriel, le cortex frontal, l’amygdale, l’insula, le PAG et la RVM, ainsi que dans
les couches superficielles de la corne dorsale de la moelle épinière (lamina I à V) (Asselin et
al., 2001; Sarret et al., 2003b). Dans le SNP, ils sont exprimés au niveau des fibres
nociceptives C (petits DRG) et des fibres non nociceptives Aβ (gros DRG) (Figure 8). La
localisation de ces récepteurs suggère qu’ils pourraient également être impliqués dans la
régulation spinale et supraspinale de la douleur (Sarret et al., 2005). Contrairement à NTS1,
les récepteurs NTS2 sont également exprimés dans la glie, notamment au niveau des
 27

astrocytes. Lors d’une inflammation liée à un dommage tissulaire, l’équipe de Nouel et

collaborateurs a montré que les récepteurs NTS2 sont surexprimés dans les astrocytes
présents autour de la blessure (Nouel et al., 1999). Ces observations indiquent que les
récepteurs NTS2 semblent également participer à la réponse neuroinflammatoire.

Figure 8. Répartition des récepteurs NTS2 dans les voies spinale et supraspinale de la
douleur.
Nac, Noyau accumbens; PAG, Substance grise périqueaducale; RVM, région bulbaire
rostro-ventrale; SNC : Système nerveux central. © Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le
site Biorender.com).

Tout comme NTS1, le récepteur NTS2 est également exprimé dans des régions
cérébrales impliquées dans les troubles anxieux tels que l’amygdale, le BNST, l’hippocampe
ventral et le cortex préfrontal, la PAG, le ATV, l’hypothalamus, le thalamus, le locus
cœruleus (LC), le Nac et le SL (Asselin et al., 2001; Calhoon and Tye, 2015; Sarret et al.,
2003b). Ces observations suggèrent qu’ils doivent également avoir un rôle dans les troubles
émotionnels tels que l’anxiété.
 28

2.2.2. Les récepteurs NTS3

Le récepteur NTS3 a été purifié à partir de cerveau humain en 1994 et a été cloné
pour la première fois en 1998 (Mazella et al., 1998). Il contient un seul domaine
transmembranaire et comporte 100% d’homologie avec le récepteur humain gp95/sortiline
(Mazella et al., 1998; Petersen et al., 1997). Le récepteur NTS3 humain contient 833 acides
aminés et possède une zone de clivage par la furine au niveau N-terminal, une région
extracellulaire riche en cystéine et une courte queue intracellulaire responsable de
l’internalisation (Figure 9). Ce récepteur est libéré sous forme inactive. Pour être activé, la
partie extracellulaire de NTS3 doit être clivée par une furine au niveau de l’appareil de Golgi
(Petersen et al., 1999). La structure du récepteur NTS3 à l’état inactif et actif est représentée
en Figure 9. Une fois activé, la NT peut s'y lier avec une affinité similaire à celle pour NTS1
(Kd : 0.3 nM) (Vincent et al., 1999). En fonction de la localisation des récepteurs NTS3,
d’autres ligands peuvent également s’y lier tels que la lipoprotéine lipase (LpL), son
propeptide de 44 AA libéré lors du clivage par la furine, la RAP (receptor associated protein)
et le proNGF (précurseur du facteur de croissance nerveuse (NGF)) (Malik et al., 2017;
Mazella and Vincent, 2006a; Petersen et al., 1999).
 29

Figure 9. Structure du récepteur NTS3.

Suite à sa synthèse, le récepteur NTS3 est sous une forme inactive (A). Il devient actif après
un clivage par la furine au niveau N-terminal (B). Image inspirée de l’article (Sarret and
Beaudet, 2003) et réalisée sur le site Biorender.com.

Le récepteur NTS3 est très présent au niveau du cerveau, plus particulièrement dans
les zones qui contiennent de fortes concentrations de NT telles que l’amygdale,
l’hypothalamus, la PAG et le BNST (Sarret et al., 2003a). Néanmoins, ils sont
majoritairement localisés au niveau intracellulaire, puisque 90% des récepteurs sont
retrouvés dans l’appareil de Golgi, dans le réticulum endoplasmique et dans des vésicules
intracellulaires, alors que 10% sont exprimés à la surface membranaire (Sarret et al., 2003a).
Le rôle majeur des récepteurs NTS3 est de diminuer le taux de NT extracellulaire (Mazella,
2001). Suite à la liaison de la NT aux récepteurs NTS3, le complexe NT/NTS3 est internalisé.
Après dissociation de la NT au niveau intracellulaire, le récepteur est recyclé à la membrane
plasmique alors que la NT subit une dégradation lysosomale (Mazella and Vincent, 2006a;
Morinville et al., 2004; Navarro et al., 2001).

Au niveau central, les récepteurs NTS3 sont impliqués dans la dépression en

interagissant avec les canaux potassiques TREK-1. Depuis quelques années, ces canaux
représentent une nouvelle cible thérapeutique pour traiter la dépression (Borsotto et al., 2015;
 30

Kim et al., 2017). En effet, leur inhibition ou la déplétion du gène codant pour ces canaux
(souris TREK-1-/-) induit un effet antidépresseur (Borsotto et al., 2015; Heurteaux et al.,
2006). D’après des études d’immunoprécipitation, le récepteur NTS3 colocaliserait avec ce
canal au niveau des neurones corticaux de souris. De plus, l'expression du canal TREK-1 au
niveau de la membrane plasmique des cellules COS-7 est fortement augmentée lorsque le
canal est co-exprimé avec la sortiline (Mazella et al., 2010). L'importance du complexe
sortiline/TREK-1 dans la dépression a été confirmée en générant des souris dont le gène
codant pour le récepteur sortiline a été inactivé (souris Sort1-/-). En effet, ces souris
présentaient une fonction TREK-1 altérée, essentiellement due à une expression
membranaire plus faible. Le dysfonctionnement de TREK-1 se traduit alors par une
augmentation de l'activité neuronale du noyau du raphé dorsal et une diminution du
comportement dépressif chez ces souris (Moréno et al., 2018). Ces résultats montrent que la
présence de NTS3 est cruciale pour l’adressage membranaire et le bon fonctionnement des
canaux TREK-1 (Mazella et al., 2018).
De plus, la maturation des récepteurs NTS3 génère la libération d’un propeptide de 44 AA
(Figure 9). Or, il est intéressant de constater que chez les patients atteints de trouble dépressif
majeur, les concentrations plasmatiques de ce propetide sont diminuées, mais ce taux est
restauré après un traitement avec des antidépresseurs (Devader et al., 2017). Ce peptide
contient 44 AA mais uniquement les AA 1 à 28 sont nécessaires pour la liaison aux
récepteurs. Face à ces résultats, l’équipe de Mazella et collaborateur a synthétisé un composé,
appelé Spadine, qui contient uniquement les AA 12 à 28 de ce propeptide. D’après leurs
résultats, cette molécule serait capable de bloquer les canaux potassiques TREK-1 et de
diminuer la dépression. De plus, la Spadine augmenterait également la neurogenèse et la
transmission sérotoninergique (Mazella et al., 2010).

En périphérie, NTS3 se retrouve dans les adipocytes où il colocalise avec le

transporteur de glucose Glut4 dans des vésicules intracellulaires (Morris et al., 1998). La
présence de NTS3 permet de stimuler l’absorption du glucose en réponse à l’insuline (Shi
and Kandror, 2005). De plus, NTS3 est fortement exprimé dans différents cancers comme le
cancer du côlon, de la prostate et du pancréas (Béraud-Dufour et al., 2016; Dal Farra et al.,
2001; Swift et al., 2010).
 31

Les effets physiologiques de la neurotensine

La NT agit comme un neurotransmetteur/neuromodulateur au niveau du SNC, et

comme une hormone circulante ayant une action paracrine en périphérie (Kitabgi, 2002;
Vincent, 1995). Les récepteurs NTS1 et NTS2 sont tous deux très présents au niveau du
SNC, mais leur activation peut engendrer des effets physiologiques différents. Le rôle
physiologique de chaque récepteur a été déterminé grâce à l’utilisation
d’agonistes/antagonistes sélectifs ainsi que par l’utilisation de différents outils de déplétion
de récepteurs (oligonucléotides antisens et souris transgéniques dont les gènes codant pour
NTS1 ou NTS2 ont été invalidés). Les différents effets physiologiques médiés par
l’activation de NTS1 et NTS2 sont reportés dans la Figure 10.

Figure 10. Effets physiologiques de la NT.

Les différents effets physiologiques de la NT sont classés en fonction de l’implication des
récepteurs NTS1 et/ou NTS2. Les effets à l'étude dans cet ouvrage sont indiqués en rouge et
seront détaillés dans les prochaines sections (Boules et al., 2013; Kaczyńska and Szereda-
 32

Przestaszewska, 2012; Ouyang et al., 2017; Pettibone et al., 2002; St-Gelais et al., 2006;
Steele et al., 2017; Zhao and Pothoulakis, 2006). © Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le
site Biorender.com).

2.3.1. L’effet analgésique de la NT

Les récepteurs NTS1 et NTS2 sont exprimés dans la plupart des zones cérébrales
impliquées dans la perception sensori-discriminative (caractéristiques physiques de la
douleur ; cortex SI et SII et thalamus), dans la perception sensori-émotionnel (composante
affective et émotionnelle de la douleur ; PFC, Nac, amygdale, PAG) ainsi que dans la voie
descendante de la douleur (PAG et RVM) (Figure 11). De plus, ils sont également localisés
au niveau spinal dans la corne dorsale de la ME et dans les DRG (Figure 6 et 8). Une forte
concentration de NT est présente dans certaines de ces régions telles que l’amygdale, le
Thalamus, le Nac, l’hypothalamus, la PAG et la RVM (Asselin et al., 2001; Sarret and
Beaudet, 2003; Sarret and Kitabgi, 2009; Sarret et al., 2003b) (Figure 11). La localisation
anatomique de la NT et de ces récepteurs suggère l’implication du système
neurotensinergique dans le contrôle spinal et supraspinal de la douleur.

Figure 11. Localisation de la NT et de ses récepteurs dans des zones contrôlant la

douleur chez le rat.
Les récepteurs NTS1 et NTS2 sont présents dans des zones cérébrales impliquées dans le
contrôle ascendant et descendant de la douleur. Acc, Cortex cingulaire antérieur ; Amy,
 33

Amygdale; Hyp, Hypothalamus; mPFC, cortex préfrontal; Nac, Noyau accumbens; PAG,
substance grise périaqueducale ; PB, Noyau parabrachial; RVM, région bulbaire rostro-
ventrale ; SI, cortex somatosensoriel I; SII, cortex somatosensoriel II; Thal, Thalamus. ©
Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le site Biorender.com).

Pour évaluer son potentiel analgésique, la NT a été administrée chez des rongeurs
directement au niveau de la moelle épinière (injection intrathécale (i.t.)), dans le cerveau par
des injections intracisternale, intracérébroventriculaire (i.c.v.) ou par des micro-injections
dans différentes parties du cerveau (RVM, PAG, noyau du raphé magnus et l’amygdale
centrale). Suite à ces injections spinales ou supraspinales, la NT induit de l’analgésie en
douleur aiguë thermique (test de retrait de la queue ou le test de la surface chaude) et viscérale
(injection d’acide acétique dans l’abdomen de l’animal) (Al-Rodhan et al., 1991; Buhler et
al., 2008; Fang et al., 1987; Furuta et al., 1984; Gui et al., 2004; Hylden and Wilcox, 1983;
Kalivas et al., 1982; Osbahr et al., 1981; Pazos et al., 1984; Urban and Gebhart, 1997; Urban
and Smith, 1993).

À dose équimolaire, l'effet analgésique de la NT est plus puissant que celui de la

morphine (Al-Rodhan et al., 1991; Nemeroff et al., 1979). D’après certaines études, l’effet
analgésique du système neurotensinergique semble être indépendant du système
opioïdergique. En effet, la co-injection de la NT avec la naloxone, un antagoniste des
récepteurs opioïdes, n’affecte pas son effet analgésique (Behbehani and Pert, 1984;
Bredeloux et al., 2006; Clineschmidt et al., 1979; Osbahr et al., 1981). De plus, l’effet
analgésique de la NT n’est pas affecté chez des rats dont les récepteurs Mu ont été déplétés
(McMahon et al., 2001). Or, la présence des récepteurs NT et opioïdergiques (mu, delta et
kappa) dans des zones cérébrales communes suggère tout de même de possibles interactions
entre ces deux systèmes (Sarret and Kitabgi, 2009; Wang, 2019). En effet, il a été montré
qu’une perfusion de morphine dans la PAG augmentait la quantité de NT extracellulaire, et
que l’effet analgésique d’un agoniste pour les récepteurs Mu (CTAP) injecté au niveau du
noyau basolatéral de l’amygdale était médié par la relâche de NT et d’opioïdes endogène au
niveau du PAG (Stiller et al., 1997; Tershner and Helmstetter, 2000). Au niveau des
récepteurs neurotensinergiques, l’équipe de Roussy et collaborateurs a observé que l’effet
analgésique de la morphine était plus faible chez des souris transgéniques invalidées pour le
 34

récepteur NTS1 (Roussy et al., 2010; Stiller et al., 1997). Or, chez des souris ayant reçu des
injections chroniques d’agoniste NTS2-sélectif (NT1 : N-Methyl-Arg-Lys-Pro-Trp-Tle-
Leu), l’analgésie de la morphine n’est pas affectée, alors qu’une diminution de l’effet
analgésique du NT1 est observée chez des souris tolérantes à la morphine (Bredeloux et al.,
2006). D’après ces études, le récepteur NTS1 semble agir en aval des récepteurs
opioidergiques Mu, contrairement au NTS2 qui agirait en amont. De plus, différentes études
ont également montré que la co-injection de morphine et de dérivés NT (NT79, NT69L,
AN2-NT(8-13)) produisait un effet synergique ou additif au niveau de l’analgésie en douleur
aiguë et tonique (Boules et al., 2009; 2011; Eiselt et al., 2019a). Ces différentes études
montrent que des liens entre ces deux systèmes ne sont pas à exclure, mais à l’heure actuelle,
il est encore difficile de définir précisément ces interactions.

La modulation de la douleur se fait par la voie descendante de la douleur. Cette voie

est constituée de fibres nerveuses qui projettent de la PAG vers la moelle épinière afin de
réduire le signal nociceptif. La PAG reçoit des afférences neurotensinergiques de l’amygdale
et du thalamus et projette, également via des neurones neurotensinergiques, dans la RVM
(Gray and Magnuson, 1992; Li et al., 2001; Tershner and Helmstetter, 2000). D’après
plusieurs études, le noyau raphé magnus (NRM), qui est un noyau du RVM, reçoit également
des afférences neurotensinergiques issues de la PAG (Beitz, 1982; Beitz et al., 1983;
Williams and Beitz, 1993). Les neurones du RVM projettent ensuite dans la moelle épinière.
Behbehani et collaborateurs ont observé que la lésion du NRM abolissait l’effet analgésique
de la NT injectée dans la PAG (Behbehani and Pert, 1984). L’effet analgésique de la NT
semble donc être dépendant du circuit PAG/RVM/ME.

Le NRM possède des neurones sérotoninergiques qui projettent dans la moelle

épinière (Li et al., 2001). Différents chercheurs ont observé que l’injection de NT dans le
NRM induisait de l’analgésie (Fang et al., 1987; Urban and Gebhart, 1997; Urban and Smith,
1993). Ces résultats peuvent être corrélés avec une étude réalisée par Li et collaborateurs en
2001, qui ont montré que la NT dépolarisait et activait les neurones 5-HT du NRM (Li et al.,
2001). Ces observations suggèrent que l’analgésie de la NT via le NRM est médiée par
 35

l’excitation des projections spinales sérotoninergiques et la libération de 5-HT au niveau de

la corne dorsale de la ME (Figure 12).

Dans le RVM, il existe trois types de neurones nociceptifs, désignés par cellules
« On », « Off » et « Neutre ». Les cellules « On » et « Off » projettent dans la ME et leurs
activations induit des effets opposés en augmentant ou en diminuant, respectivement, la
transmission du message douloureux (Dobner, 2006). L’injection de NT dans la RVM
semble avoir des effets analgésiques différents en fonction de la concentration administrée.
En utilisant des enregistrements électrophysiologiques et des tests comportementaux,
l’équipe de Neubert et collaborateurs a observé que l’injection intra-RVM d’une faible dose
(picomolaire) de NT active les cellules « On » ce qui facilite la nociception (Neubert et al.,
2004). Cette facilitation nociceptive est médiée par la relâche de CCK dans la moelle épinière
(Holmes et al., 1999; Urban et al., 1996). En revanche, l’injection d’une forte dose de NT
(nanomolaire) active les deux types de cellules ce qui en somme, inhibe le message
douloureux (Buhler et al., 2008; Gui et al., 2004; Neubert et al., 2004; Smith et al., 1997).
Or, il s’avère que l’effet inhibiteur des cellules « Off » sur la transmission nociceptive spinale
est suffisamment puissant pour masquer l’effet facilitateur médié par l’activation des cellules
« On » (Neubert et al., 2004). L’équipe de Buhler et collaborateurs a ensuite observé que
l’effet analgésique de la NT est médié par la libération de noradrénaline et de sérotonine dans
la ME. Néanmoins, la libération de ces neurotransmetteurs semble dépendre du type de
récepteur neurotensinergique activé. L’activation des récepteurs NTS1 entraine la relâche de
5-HT et de NA alors que l’activation des récepteurs NTS2 induit exclusivement une
libération de NA (Figure 12) (Buhler et al., 2008). Ces résultats sont cohérents avec la
localisation des récepteurs neurotensinergiques, puisque les neurones sérotoninergiques qui
projettent du RVM vers la moelle épinière contiennent uniquement des récepteurs NTS1.
L’équipe de Naranjo et collaborateurs a observé que la déplétion de 5-HT bloquait
partiellement l’effet analgésique de la NT chez la souris, alors que l’inhibition de sa
biosynthèse ne modifiait pas son action (Naranjo et al., 1989). Ces résultats suggèrent que
l’effet analgésique de la NT semble plus dépendant de l’activation des neurones
noradrénergiques que des neurones sérotoninergiques.
 36

Figure 12. Effet de la NT sur la voie descendante de la douleur.

Bleu : Neurones neurotensinergiques ; Rose : Neurones adrénergiques ; Violet : Neurones
sérotoninergiques. CCK : cholecystokinine ; 5-HT : sérotonine; NA : noradrénaline
© Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le site Biorender.com).

Quelques études ont décrit l’implication des récepteurs NTS1 et NTS2 dans la
modulation de la douleur en générant des souris transgéniques (NTS1-/- et NTS2-/-), en
injectant des oligonucléotides antisens, ou en injectant des agonistes NTS1 ou NTS2-
sélectifs. L’absence de ces récepteurs provoquait une diminution ou une perte complète de
l’effet analgésique de la NT ou de ses analogues (Doré-Savard et al., 2008; Dubuc et al.,
1999; Mechanic et al., 2009; Pettibone et al., 2002; Smith et al., 2012). En revanche,
l’injection d’agonistes sélectifs permet d’induire un effet analgésique en douleur aiguë
thermique (Bredeloux et al., 2006; Buhler et al., 2008; Sarret et al., 2005; Smith et al., 2012;
Tyler-McMahon et al., 2000) et viscérale (Boules et al., 2010; Dubuc et al., 1999; Gui et al.,
 37

2004), ainsi qu’en douleur tonique (Boules et al., 2011; Roussy et al., 2008; 2009) et en
douleur chronique neuropathique (Guillemette et al., 2012; Tétreault et al., 2013).

D’après une récente étude de l’équipe de recherche de Richner et al, il semblerait que
les récepteurs NTS3 soient impliqués dans la régulation de la douleur en modulant la
signalisation de NTS2. Lors de douleur neuropathique, le facteur neurotrophique dérivé du
cerveau (BDNF) se lie aux récepteurs kinase B de la tropomyosine (TrkB) et induit une
régulation négative du co-transporteur de chlorure de potassium (KCC2) au niveau de la
corne dorsale de la ME. La diminution d’expression de KCC2 induit une hyperexcitabilité
des neurones à l’origine du développement d’allodynie. Néanmoins, ils ont observé que
l’activation des récepteurs NTS2 par la lévocabastine altérait la régulation négative de KCC2
et soulageait la douleur neuropathique. Néanmoins, la déplétion des gènes codant pour NTS3
(souris Sort1-/-) ou le blocage de ces récepteurs par des anticorps bloque complètement la
douleur induite par le BDNF et soulage la douleur neuropathique. Les récepteurs NTS3
joueraient donc un rôle indirect dans la douleur en empêchant la NT de se lier aux récepteurs
NTS2 ce qui favoriserait la signalisation pronociceptive du BDNF/TrkB (Richner et al.,
2019). De plus, le système neurotensinergique, et plus particulièrement les récepteurs NTS2,
est également impliqué dans le mécanisme physiologique dans lequel le stress peut affecter
la perception douloureuse et induire de l’analgésie (Gui et al., 2004; Lafrance et al., 2010).

2.3.2. L’implication du système neurotensinergique dans l’anxiété

Le mot anxiété est issus du mot latin « anxietas » qui signifie la disposition naturelle
à l'inquiétude. Chez l’Homme, l’anxiété est une sensation normale d'inquiétude et
d'angoisse ressentie chez tous les êtres humains. C’est une réaction émotionnelle normale
qui permet à un individu de faire face à une menace éventuelle. Dans certains cas, l’anxiété
peut devenir chronique et excessive par rapport aux situations auxquelles l’individu est
confronté. On parle alors de pathologies anxieuses ou de troubles anxieux. D’après la
classification « Diagnostic and Statistical Manuel of Mental Disorders », 5th édition (DSM-
V), les troubles d’anxiété peuvent être classés selon quatre catégories à savoir l’anxiété
 38

généralisée, les troubles de panique, les troubles d’anxiété sociale et l’agoraphobie

(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 2014).

Pour déterminer l’effet d’une molécule sur l’anxiété, des modèles animaux sont
généralement utilisés. Les seules variables observables et mesurables chez les animaux
lorsqu'ils sont exposés à des situations stressantes, voir potentiellement anxiogènes, sont les
réponses comportementales (évitement, fuite ou immobilité) et physiologiques (pression
artérielle, rythme cardiaque, sécrétions endocrines). Dans la littérature, il existe plusieurs
tests comportementaux classés selon deux catégories différentes : les tests de réponse non
conditionnés (qui ne nécessitent aucune acclimatation ; p. ex. test de la croix surélevée, test
de la boite éclairée/sombre et test de l’espace ouvert (« open-field »), test de vocalisation
ultrasonique) et les tests de réponse conditionnés (qui nécessitent souvent des
acclimatations ; p. ex. test du sursaut (bruit et bruit + lumière) (Bourin et al., 2007; Harro,
2018; Steimer, 2011).

L’anxiété est un phénomène complexe puisqu’elle implique plusieurs zones du

cerveau. Les zones cérébrales responsables de sa régulation sont l’amygdale, le PFC, le
BNST, l’hippocampe ventral et l’Acc, l’insula, le thalamus, le ATV, le Nac, le pallidum
ventral (PV), le LC, le septum latéral, le PB et l’hypothalamus (Calhoon and Tye, 2015;
Jarrin and Finn, 2019; Ji and Neugebauer, 2012; Tovote et al., 2015). Toutes ces zones sont
interconnectées entre elles, et forment ainsi le circuit neuronal de l’anxiété (Figure 13). De
plus, de nombreux neurotransmetteurs tels que le GABA, le glutamate, la dopamine, la
noradrénaline et la sérotonine sont impliqués (Calhoon and Tye, 2015; Charney, 2003;
Cortese and Phan, 2005; Durant et al., 2010). Pour traiter les troubles anxieux, des
anxiolytiques (benzodiazépines, buspirone et hydroxyzine) sont généralement prescrits. Des
antidépresseurs tricycliques, des inhibiteurs de la recapture de la sérotonine (IRS) et de la
noradrénaline (IRSNA) ou des antiépileptiques (prégabaline) peuvent également être
administrés. Les modes d’action de ces composés sont résumés dans le Tableau 2.
 39

Type de Nom des

Mode d’action
molécule molécules
Alprazolam
Benzodiazépines Bromozépam Modulateur allostérique des récepteurs GABAA
Diazépam
Agoniste des récepteurs 5-HT1A présynaptiques

Buspirone Buspirone Agoniste partiel des récepteurs 5-HT1A

Anxiolytiques

postsynaptiques
Modulateur allostérique des récepteurs GABAA

Etifoxine Stresam Augmente la production cérébrale de neurostéroïdes

(p. ex. alloprégnanolone : modulateur allostérique des
récepteurs GABAA)
Antihistaminique antagoniste des récepteurs H1
Hydroxyzine Atarax
centraux et périphériques
Antidépresseurs Amitriptyline
Imipramine
Antidépresseurs

tricycliques
Deroxat Inhibition de la recapture de la 5-HT et de la NA au
IRS
Seroplex niveau synaptique.
Effexor
IRSNA
Venlafaxine
Antiépileptiques

Prégabaline Lyrica Analogue du GABA

Tableau 2. Liste non exhaustive des traitements actuels pour diminuer l’anxiété.
5-HT : Sérotonine ; GABA : Acide γ-aminobutyrique ; NA : Noradrénaline. Informations
issues du site de santé français : Vidal (www.vidal.fr).

La majeure partie des zones du circuit de l’anxiété expriment les récepteurs NTS1 et
NTS2, et contiennent de fortes concentrations de NT (Figure 13). Néanmoins, l’insula et
l’hippocampe ventral expriment uniquement les récepteurs NTS2, alors qu’au niveau de
l’Acc, du PB et du LC, les deux récepteurs sont absents (Asselin et al., 2001; Fassio et al.,
2000; Sarret and Kitabgi, 2009; Sarret et al., 2003b; Uhl et al., 1979).
 40

Figure 13. Co-localisation entre les régions impliquées dans le circuit neuronal de
l’anxiété et le système neurotensinergique.
Toutes les zones cérébrales présentent sur le schéma sont impliquées dans le circuit de
l’anxiété. Plus de la moitié de ces régions présente de fortes concentrations de NT et
expriment les récepteurs NTS1 et NTS2. Les connexions neuronales représentées sur la
figure ne prennent pas en considération les différents systèmes impliqués dans ce circuit (p.
ex. système dopaminergique, sérotoninergique, GABAergique, noradrénergique). Acc,
Cortex cingulaire antérieur; Amy, Amygdale; ATV, Aire tegmentale ventrale; BLA,
Amygdale basolatérale; BNST, noyau de la strie terminale; CeA, Amygdale centrale; Hyp,
Hypothalamus; LC, Locus coeruleus; mPFC, cortex préfrontal médial; Nac, Noyau
accumbens; PAG, Substance grise périaqueducale; PB, Noyau parabrachial; PV, pallidum
ventral; SL, Septum latéral; Thal, Thalamus; vHPC, Hippocampe ventral. © Mélanie
Vivancos (Image réalisée sur le site Biorender.com).

Il existe actuellement au sein de la littérature une divergence quant aux effets de la

NT sur l’anxiété. Les différents effets de la NT sur la régulation de l’anxiété en fonction de
son site d’injection sont répertoriés dans le Tableau 3 (László et al., 2010; Normandeau et
al., 2018; Ollmann et al., 2015; Shugalev et al., 2012; Steele et al., 2017). Par exemple,
l’injection de NT dans le Nac ou dans l’aire prélimbique du cortex préfrontal induit un effet
anxiogène contrairement à une injection dans le PV qui produit un effet anxiolytique
(Ollmann et al., 2015; Shugalev et al., 2012). En revanche, l’administration s.c., i.p. ou i.c.v.
 41

d’agoniste NTS1 (PD149163) ou NTS2-sélectif (JMV-431 et β-lactotensine) induit

systématiquement un effet anxiolytique (Tableau 3) (Hou et al., 2011; Ollmann et al., 2015;
Steele et al., 2017). De plus, l’équipe de Fitzpatrick a observé que les souris invalidées pour
le récepteur NTS1 étaient plus anxieuses (test de la croix surélevée, test de l’espace ouvert
(« open-field »)) que les souris contrôles (Fitzpatrick et al., 2012).
 42

Composés Site Effet observé Référence

d’administration Tests in vivo réalisés
Injection dans Nac Anxiogène (Shugalev et
NT
(Rat) Test de la croix surélevée al., 2012)
Injection dans Anxiogène
NT
l’aire prélimbique Test de la croix surélevée (Li et al.,
PD149163
du cortex Test de la boite éclairée/sombre 2020)
SR48692 + NT
préfrontal (Rat) Test de l’espace ouvert (« open-field »)

Injection dans
Blocage des récepteurs : Effet anxiolytique (Normandeau
SR48692 ovBNST
Test de la croix surélevée et al., 2018)
(Rat stressé)
NT Injection bilatérale Pas d’effet observé (László et al.,
SR48692 dans CeA (Rat) Test de la croix surélevée 2010)
Anxiolytique (Shilling and
PD149163 s.c (Rat)
Test du sursaut (bruit et bruit + lumière) Feifel, 2008)
Anxiolytique
Souris NTS2-/- : Pas d’effet (Hou et al.,
β-Lactotensine i.p. (Souris)
Test de la croix surélevée 2011)
Test de l’espace ouvert (« open-field »)
Anxiolytique (Prus et al.,
PD149163 s.c (Rat)
Test de vocalisation ultrasonique 2014)
NT : Effet anxiolytique
Injection dans PV
NT SR48692 : aucun effet (Ollmann et
(Rat)
SR48692 SR + NT : aucun effet al., 2015)
Test de la croix surélevée
NT;
Anxiolytique (Steele et al.,
PD149163; i.c.v. (Rat)
Test de vocalisation ultrasonique 2017)
JMV-431
Tableau 3. Effets anxiolytique ou anxiogène de la NT et de ses analogues.
L’effet de la NT et de ses analogues sur l’anxiété dépend de leur site d’injection.
CeA : noyau central de l’amygdale; i.p. : injection intrapéritonéale; i.c.v. : injection
intracérébroventriculaire; Nac : Noyau accumbens ; ovBNST : noyau ovale de la strie
terminale; s.c. : Injection sous-cutanée; ATV : Aire tegmentale ventrale; PV : Pallidus
ventral.
 43

Ces résultats confirment l’implication des récepteurs NTS1 et NTS2 dans le circuit
de l’anxiété. À l’heure actuelle, le mécanisme d’action du système neurotensinergique dans
les troubles anxieux n’a pas encore été entièrement élucidé, mais différentes études laissent
supposer des interactions avec le système dopaminergique, GABAergique, sérotoninergique
et noradrénergique (Binder et al., 2001; Boules et al., 2013; Jolas and Aghajanian, 1997).

La dopamine est impliquée dans la modulation du comportement anxieux (Durant et

al., 2010; Liu et al., 2018; Salamone et al., 2007; Taylor et al., 1982), et des études
fonctionnelles et anatomiques ont montré une interaction entre le système
neurotensinergique et dopaminergique (Binder et al., 2001; Cáceda et al., 2006; St-Gelais et
al., 2006). D’après les résultats de l’équipe de Hou, les propriétés anxiolytiques de la NT
pourraient être médiées par une interaction entre ces deux systèmes. L’injection i.p. de
β-lactotensine, un agoniste NTS2-sélectif diminue l’anxiété chez les souris. En étudiant plus
en détail son mécanisme d’action, ils ont observé que l’administration d’un antagoniste des
récepteurs dopaminergiques D1 (SCH23390) bloquait l’effet anxiolytique de la β-
lactotensine. La β-lactotensine n’ayant aucune affinité pour les récepteurs dopaminergiques,
les auteurs ont donc supposé que l’administration i.p. de ce composé devait induire une
relâche de dopamine au niveau cérébral à l’origine de l’activation des récepteurs D1 et de la
diminution du comportement anxieux des souris (Hou et al., 2011).

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est également un neurotransmetteur impliqué

dans l’anxiété (Kalueff and Nutt, 2007; Lydiard, 2003; Möhler, 2012). Chez des patients
anxieux, une baisse du taux de GABA est généralement observée dans le LCR (Mann et al.,
2014; Möhler, 2012). D’après le Tableau 2, nous constatons qu’un grand nombre de
molécules utilisées pour traiter l’anxiété agissent au niveau du GABA pour restaurer la
transmission GABAergique (Altamura et al., 2013). D’après l’étude de Petkova-Kirova et
collaborateurs, l’administration de NT dans le PFC, une zone clé du circuit de l’anxiété,
augmente le taux de GABA extracellulaire (Petkova-Kirova et al., 2008). Cependant,
l’équipe de Li et collaborateurs a récemment observé que l’injection de NT ou du PD149163
dans l’aire prélimbique du cortex préfrontal avait un effet anxiogène (Li et al., 2020). Face à
 44

ces résultats opposés, il se pourrait que la NT interagisse indépendamment du système

GABAergique pour réguler les troubles anxieux.

La 5-HT et la NA sont également des neurotransmetteurs importants dans le circuit

de l’anxiété, et une altération de ces deux systèmes (p. ex. une diminution de la relâche de
ces neurotransmetteurs par les neurones présynaptiques) est généralement observé chez des
patients anxieux (Liu et al., 2018; 2019; Ressler and Nemeroff, 2000). Les traitements
pharmacologiques les plus reconnus pour diminuer les troubles anxieux sont les
antidépresseurs tricycliques, les IRS et les IRSN qui permettent de restaurer le taux cérébral
de ces deux neurotransmetteurs (Tableau 2). Dans la modulation descendante de la douleur,
les récepteurs NTS1 et NTS2 sont présents sur des neurones sérotoninergiques et/ou
noradrénergiques au niveau du RVM, et leur activation induit la relâche de 5-HT et/ou de
NA dans la ME. Donc, il serait probable que l’effet anxiolytique de la NT soit médié par la
présence de récepteurs neurotensinergiques sur des neurones sérotoninergiques et/ou
noradrénergiques au niveau cérébral. L’activation de ces neurones entrainerait alors la
libération de ces deux neurotransmetteurs et diminuerait ainsi l’anxiété.

Des études plus approfondies seront donc nécessaires pour déterminer comment la
NT peut avoir un effet anxiolytique ou anxiogène en fonction de son site d’injection.

2.3.3. Autres effets physiologiques médiés par NTS1

L’activation des récepteurs NTS1 est responsable d’autres effets physiologiques

centraux (hypothermie, hypolocomotion, régulation de la prise alimentaire) et périphériques
(hypotension, effet sur la motilité gastro-intestinale, effet oncogène) (Figure 10). Dans cette
étude, nous avons évalué l'impact de nos nouveaux composés analgésiques sur la température
corporelle, la pression artérielle et la contractilité musculaire de l’iléon.
 45

2.3.3.1. Hypothermie

L’injection intracisternale ou i.c.v. de NT provoque une baisse de température

corporelle chez les rongeurs (Bissette et al., 1976; Martin et al., 1980; Nemeroff et al., 1977;
Pettibone et al., 2002). L’hypothalamus est la région du SNC impliquée dans le contrôle de
la température corporelle et la NT s’y retrouve très concentrée (Morrison, 2016; Sarret and
Kitabgi, 2009). L’injection de NT dans des régions plus spécifiques de l’hypothalamus, telles
que l’hypothalamus antérieur et l’aire préoptique médiane, conduit également à une baisse
de température corporelle de façon dose-dépendante (Kalivas et al., 1985; Martin et al.,
1980).

Les récepteurs NTS1 et NTS2 sont fortement exprimés au niveau de l’hypothalamus

(Sarret and Kitabgi, 2009). L’utilisation d’agonistes NTS1 ou NTS2-sélectifs a permis de
démontrer que l’effet hypothermiant est médié uniquement par l’activation de NTS1. En
effet, l’injection centrale (i.t.) ou systémique (i.v. ou i.p.) d’agonistes NTS1-sélectifs induit
une hypothermie modérée (environ -2 à -4°C), contrairement aux agonistes NTS2-sélectifs
(injectés i.t.) qui n’ont aucun effet (Boules et al., 2010; Dubuc et al., 1999; Eiselt et al.,
2019b; Feifel et al., 2010; Katz et al., 2001; Mechanic et al., 2009; Tyler-McMahon et al.,
2000). L'implication des récepteurs NTS1 a également été validée lors de leur déplétion
(souris NTS1-/- ; oligonucléotides antisens), où l’injection centrale de NT ne provoque
aucune hypothermie (Dubuc et al., 1999; Mechanic et al., 2009; Pettibone et al., 2002;
Remaury et al., 2002).

2.3.3.2. Hypotension

D’après l’étymologie du nom neurotensine, la terminologie « tensine » vient de son

effet hypotenseur suite à une injection i.v. (Carraway and Leeman, 1973). Selon une étude
clinique récente, les patients souffrant d’hypertension artérielle résistante aux
antihypertenseurs ont un taux de NT plasmatique presque deux fois plus faible (0.380 ng/ml)
que des individus sains (0.638 ng/ml) (Bolat et al., 2020). L’injection i.t., i.c.v. ou i.v. de NT
induit de l’hypotension (Quirion et al., 1980b; Rioux et al., 1981; Zhang et al., 1999; Zogovic
 46

and Pilowsky, 2012). En revanche, l’injection i.v. d’une faible dose de NT provoque un effet
biphasique (hypotension – retour à des valeurs basales) sur la pression artérielle,
contrairement à une injection à forte dose qui induit un effet triphasique (hypotension –
retour à des valeurs basales – hypotension maintenue) (Di Paola and Richelson, 1990; Gully
et al., 1996; Quirion et al., 1980b). La première phase hypotensive suite à une injection i.v.
de NT serait due à une action sur les cellules mastocytaires entrainant leur dégranulation, et
donc, une libération d’histamine à l’origine d’une vasodilatation (Gully et al., 1996; Kérouac
et al., 1982; 1983; Oishi et al., 1984; Rioux et al., 1983). La seconde phase qui permet un
retour de la pression artérielle à des valeurs basales serait induite par la relâche de
catécholamines par les glandes surrénales, lors d’un effet baroréflexe rapide visant à rétablir
l'homéostasie artérielle (Rioux et al., 1982). La troisième phase hypotensive serait également
liée à la libération d’histamine (Di Paola and Richelson, 1990). L’utilisation d’agoniste
NTS1 et NTS2-sélectifs a montré que cet effet hypotenseur est exclusivement médié par
l’activation des récepteurs NTS1 (Eiselt et al., 2019b; Fantegrossi et al., 2005; Hapău et al.,
2016).

2.3.3.3. Motilité gastro-intestinale

La NT est également impliquée dans la motilité intestinale. Chez l’Homme et les

animaux, les taux de NT plasmatique sont faibles avant les repas. Or, ces taux augmentent à
la suite d’un repas riche en graisses, en acides aminés et en glucose (Rosell and Rökaeus,
1979). Néanmoins, chez des patients souffrant de constipation (transit normal ou ralenti), le
taux de NT plasmatique est deux fois plus faible à 60 et 90 minutes après un repas (individus
sains : environ 280 – 300 pg/ml versus patients : environ 150 à 190 pg/ml) (Riezzo et al.,
2017).

En revanche, l’effet de la NT diffère en fonction des différentes parties de l’appareil

digestif et de l’espèce étudiée. Chez le cobaye, la NT a un effet contractile au niveau de
l’intestin (iléon) alors qu’elle a un effet relaxant au niveau du gros intestin (colon) (Kitabgi
and Freychet, 1979; Kitabgi et al., 1984; Labbé-Jullié et al., 1994). Or, dans un modèle
murin, la NT contracte le côlon et relaxe l’iléon (Kitabgi et al., 1984; Pettibone et al., 2002).
 47

L’administration s.c. de NT ou d’un agoniste non sélectif (JMV2009 : H-Lys-Lys-Sip-Tyr-

Ile-Leu-OH) ou l’injection i.v. d’une faible dose d’AN2-NT(8-13) chez le rat ne semble pas
ralentir le transit gastro-intestinal contrairement à la morphine (Eiselt et al., 2019a; Tétreault
et al., 2020).

L’utilisation d’agonistes sélectifs et la déplétion des récepteurs NTS1 montrent que

l’action de la NT sur la motilité intestinale est issue de leur activation (Fanelli et al., 2015;
Pettibone et al., 2002). Dans notre étude, nous profiterons de cet effet exclusif à NTS1 pour
évaluer l'efficacité fonctionnelle de nos analogues de la NT dans un essai de contractilité de
l'iléon de rat en bains d'organes isolés. Dans ce contexte, un composé NTS2-sélectif ne
devrait pas entraîner d'effets relaxants.

La dernière partie de cette introduction sera consacrée au développement de

composés neurotensinergiques. Nous nous intéresserons à la relation structure/activité (SAR)
de la NT avec ses récepteurs, aux différents types de composés déjà synthétisés ainsi qu’aux
limites du système neurotensinergique. Toutes ces informations sont primordiales pour
mettre en œuvre de nouvelles stratégies pour développer des analogues neurotensinergiques.

3. Le développement de composés neurotensinergiques

Relation structure/activité de la neurotensine

Peu de temps après sa découverte, plusieurs équipes de recherche ont observé

qu’uniquement les acides aminés 8 à 13 de la NT (NT(8-13)) étaient responsables de la
liaison aux récepteurs et de l’activité biologique de la NT (Granier et al., 1982; Kitabgi et
al., 1980; Lambert et al., 1995). Par la suite, le rôle de chaque AA de ce fragment a été
déterminé pour établir la relation structure/activité de la NT(8-13) avec les récepteurs.
L’implication des différents AA est décrite ci-dessous et leurs effets sont résumés dans la
Figure 14.
 48

Les deux arginines en positions 8 et 9, chargées positivement, sont essentielles pour

la liaison aux récepteurs et l’activité biologique de la NT(8-13) (Kitabgi et al., 1980).
Néanmoins, l’Arg8 contribue davantage à l’activation des récepteurs alors que l'Arg9 est plus
impliquée dans la liaison (Hong et al., 1997; Kitabgi et al., 1980; Quirion et al., 1980a).
La proline en position 10 est responsable de la conformation rigide de la molécule.
Elle est essentielle pour assurer la bonne orientation des AA en position C-terminal qui sont
impliqués dans l’activation fonctionnelle du récepteur (Hong et al., 1997; Quirion et al.,
1980a). D’après les travaux de Held et collaborateurs, la proline jouerait également un rôle
dans la sélectivité des composés envers les récepteurs NTS2. En effet, combiné avec une N-
homo-Tyramine (N-hTyr) en position 11, la substitution de la proline par un acide
thiazolidine-2-carboxylique a presque doublé la sélectivité du composé pour NTS2
(sélectivité NTS1/NTS2 : 6600 versus 3900 en présence uniquement de N-hTyr) (Held et al.,
2013).
La tyrosine en position 11 contient un cycle aromatique et est responsable de
l’activation fonctionnelle du récepteur (Quirion et al., 1980a). Cet AA est également
primordial pour la liaison à NTS1. Lors de la réalisation d’un alanine-scan (on remplace
successivement chaque AA par une alanine) de la NT(8-13), la substitution de la tyrosine en
position 11 par une alanine induit une perte d’affinité (≃ 1000 fois) pour NTS1, sans affecter
l’affinité pour NTS2 (Barroso et al., 2000; Einsiedel et al., 2011). Plusieurs équipes de
recherche ont également observé que la substitution de la tyrosine par des AA naturels ou
non naturels induisait une perte d’affinité pour les récepteurs NTS1 (Eiselt et al., 2019b;
Fanelli et al., 2017; Hapău et al., 2016; Held et al., 2012). Cette position est donc très
importante pour cibler préférentiellement les récepteurs NTS2.
Les chaines latérales lipophiles de l’isoleucine et de la leucine en positions 12 et 13,
respectivement, sont impliquées dans l’activation des récepteurs (Kitabgi et al., 1980). Ces
deux AA sont également importants pour la liaison de la NT(8-13) puisqu’ils interagissent
avec la pochette de liaison hydrophobe du récepteur NTS1 (Hong et al., 1997; White et al.,
2012). Lors d’un alanine-scan, la substitution de l’Ile12 et de la Leu13 a provoqué une
importante perte d’affinité pour NTS1 (Barroso et al., 2000). Pour NTS2, c’est uniquement
la substitution de la Leu13 qui induit une perte affinité (Einsiedel et al., 2011). Ces
 49

observations montrent l’importance d’avoir des AA lipophiles en position C-terminale pour

favoriser la liaison des composés aux récepteurs NTS1 et NTS2.

Figure 14. Rôles des différents acides aminés de la NT(8-13) dans la liaison et/ou
l’activation fonctionnelle des récepteurs.
© Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le site Biorender.com).

En 2012, l’équipe de recherche de White et al, a cristallisé pour la première fois le

récepteur NTS1 (résolution de 2.8 Å) de l’espèce Rattus norvegicus en conformation active
en présence de la NT(8-13) (White et al., 2012). Ce fut d'ailleurs le premier RCPG co-
cristallisé dans sa forme active en présence de son ligand « endogène ». Grâce aux résultats
de l’équipe de White et collaborateurs, nous avons modélisé l’interaction de la NT(8-13)
avec le récepteur NTS1 de rat (Figure 15). D’après ces résultats, on peut observer que la
NT(8-13) se lie aux récepteurs NTS1 dans une conformation linéaire, presque
perpendiculaire sur le plan membranaire. De plus, la NT(8-13) interagit principalement avec
des AA du récepteur non polaires et non chargés (Phe331, Leu55, Thr226, Tyr347, Tyr 146)
hormis pour l’Arg8 et Leu13 qui interagissent avec des AA polaires chargés négativement et
positivement, respectivement. Néanmoins, pour les récepteurs NTS1 humain, la tyrosine en
position 11 interagit avec l’Arg212 qui est chargée positivement (Fanelli et al., 2017).
 50

Figure 15. Interaction de la NT(8-13) avec le récepteur NTS1 de rat.

TM : Domaine transmembranaire. Figure réalisée par Michael Desgagné à partir des résultats
de (White et al., 2012).

La connaissance du rôle des AA et des différentes interactions entre la NT(8-13) et

les récepteurs est primordiale pour développer de nouveaux dérivés neurotensinergiques.

Les analogues neurotensinergiques

Dans les années 1980, la découverte que seul les AA 8 à 13 de la NT sont

responsables de sa liaison et de son activité biologique a orienté les chercheurs vers le
développement d’analogues neurotensinergiques basés sur cette séquence. Pour améliorer
l’affinité envers NTS1 et/ou NTS2, la stabilité plasmatique et potentialiser ses effets
physiologiques, différentes modifications ont été réalisées au sein de ce fragment. Dans la
littérature, on retrouve plusieurs types d’analogues neurotensinergiques tels que des
composés peptidiques linéaires et macrocycliques, ainsi que des composés non peptidiques.
La plupart de ces composés sont des ligands orthostériques puisqu’ils se fixent au site de
liaison de la NT. En revanche, certains composés, dits allostériques, peuvent se lier sur des
sites distincts.
 51

3.2.1. Les composés peptidiques linéaires

Un analogue neurotensinergique peptidique et linéaire est un enchainement de

plusieurs AA basé sur la même séquence que la NT(8-13). Pour améliorer les propriétés
pharmacologiques de la NT (p. ex. stabilité plasmatique, passage de la barrière
hématoencéphalique (BHE)), différents AA peuvent être substitués par des AA naturels ou
non naturels.

Dans la littérature, il existe un grand nombre de composés peptidiques. Parmi eux, le

PD149163 et le JMV-431 ont été davantage utilisés. Le PD149163 (H-Lys-[ψCH2NH]-Lys-
Pro-Trp-tert-Leu-Leu-OEt) est un agoniste NTS1-sélectif (Ki NTS1 : 159 nM ; Ki NTS2 >
10 000 nM) (Petrie et al., 2004), et le JMV431(Boc-Arg-Arg-Pro-Tyr-ψ(CH2NH)-Ile-Leu-
OH) est un agoniste NTS2-sélectif (Ki NTS1 : 3315 nM ; Ki NTS2 : 38 nM) (Dubuc et al.,
1999). Ces deux agonistes sélectifs ont permis d’étudier le rôle des récepteurs NTS1 et NTS2
dans la modulation de la douleur et la régulation des troubles anxieux (Buhler et al., 2008;
Guillemette et al., 2012; Prus et al., 2014; Roussy et al., 2008; 2009; Sarret et al., 2005;
Shilling and Feifel, 2008; Steele et al., 2017; Tétreault et al., 2013). Le PD149163 a
également été utilisé pour discriminer l’implication des récepteurs NTS1 dans la
schizophrénie, la locomotion, la mémoire, la dépression et l’hypothermie (Carey et al., 2017;
Feifel et al., 2016; Keiser et al., 2014; Vadnie et al., 2014; Xue et al., 2017).

Dès les années 1990, différentes équipes de recherche ont observé que le
remplacement des deux arginines en positions 8 et 9 par deux lysines n’affectait pas l’affinité
du composé pour les récepteurs NTS1 et NTS2 (Doulut et al., 1992; Granier et al., 1982;
Lugrin et al., 1991). L’avantage de cette modification est qu’elle facilite la synthèse chimique
des composés sans pour autant modifier les propriétés pharmacologiques de la NT(8-13). De
plus, la présence de ces deux lysines diminue le poids moléculaire du composé de 60 g/mol.
D’après les règles de Lipinski, il est probable qu’une molécule traverse la BHE si son poids
moléculaire est faible (masse moléculaire < 400 g/mol) (Pajouhesh and Lenz, 2005). Même
si cette différence de poids moléculaire est minime, elle peut tout de même favoriser la
distribution des composés au cerveau.
 52

L’équipe de recherche du Pr Martinez, un des collaborateurs du Pr Sarret, a observé

que l’ajout d’une liaison réduite entre les deux lysines en positions 8 et 9 protégeait le
composé de la dégradation enzymatique (Dubuc et al., 1992; Lugrin et al., 1991). De plus,
la présence en position 8 d’une β3-homolysine ou d’une N-Méthyl-Arginine augmente
également la stabilité des composés (T1/2 > 1 heure) (Eiselt et al., 2019b; Schindler et al.,
2019). Par la suite, l’équipe du Pr Cavelier, un second collaborateur du Pr Sarret, a continué
le développement d’analogues neurotensinergiques en modifiant les positions 10, 11 et 13
de la NT(8-13). Au niveau de la position 10, ils ont substitué la proline par une Silaproline
(Sip). Cette modification ne modifie pas la structure du composé, mais le protège de la
dégradation enzymatique et augmente sa lipophilicité (Cavelier et al., 2002; Rémond et al.,
2016). En revanche, cette modification n’induit aucune sélectivité, et ce composé
(JMV2009) est un puissant antalgique dans différents types de douleur (Tétreault et al.,
2020). La substitution de l’isoleucine en position 13 par un (L)‐(Trimethylsilyl)alanine
(TMSAla) améliore l’affinité du composé pour les récepteurs NTS1 et NTS2. Le TMSAla
est un résidu lipophile, donc il favorise l’interaction de la queue C-terminale du composé
avec la pochette de liaison hydrophobe des récepteurs (Fanelli et al., 2015).

Depuis plusieurs années, de nombreux laboratoires de recherche se sont également

penchés vers la synthèse de composés linéaires NTS2-sélectifs. Pour cela, ils ont substitué
la Tyr11 par des AA naturels (Lysine) ou non naturels (N-hTyr, Naphtylalanine (Nal), un
substitut cyclique (6-OH)Tic, Tétrahydrofurane (TAA-OH), Fluorophenyltyrosine (FPTyr))
(Dubuc et al., 1999; Eiselt et al., 2019b; Fanelli et al., 2017; Held et al., 2012; Simeth et al.,
2017) (Tableau 4).

L’équipe de Cavelier et collaborateurs a récemment modélisé les récepteurs NTS1 et

NTS2 humains en se basant sur la structure cristalline du récepteur NTS1 de rat et
l’homologie des séquences entre les récepteurs de rat et d’humain. Suite à cette modélisation,
ils ont observé que la tyrosine en position 11 de la NT(8-13) interagissait avec une arginine
(position 212), chargée positivement, pour hNTS1 et avec un acide glutamique (position
179), chargé négativement, pour hNTS2. Étant donné que la position 11 est importante pour
la sélectivité du composé, cette opposition de charge pourrait représenter un véritable
 53

avantage pour cibler préférentiellement les récepteurs NTS2. C’est ainsi qu’ils ont substitué
la Tyr11 par une lysine, chargée positivement, pour créer des interactions attractives entre le
récepteur et la molécule. À travers ces résultats, ils ont observé que la présence d’un AA
chargé positivement à cette position permettait de cibler préférentiellement NTS2 (Fanelli et
al., 2017).

Les autres équipes de recherche ont également substitué la Tyr11 par des AA
synthétiques (Tableau 4). La plupart de ces modifications permettent à elles seules de cibler
NTS2. En revanche, lorsqu’elles sont combinées à d’autres modifications, elles augmentent
la stabilité plasmatique et/ou améliorent encore plus l’affinité pour NTS2. En plus de la
modification en position 11, l’orientation des groupements semble également importante
pour favoriser l’affinité pour NTS2. Dans le Tableau 4, nous avons répertorié tous les
analogues NTS2-sélectifs actuellement présents dans la littérature qui ont modification en
position 11.
 54

Modification Affinité (nM) Sélectivité

Séquence
en position 11 NTS1 NTS2 NTS1/NTS2
NT(8-13) H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 1 6.5 0.15
H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH 5700 262 21.7
Lysine
H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH 662 67 9.9
H-Arg-Arg-Pro-N-hTyr-Ile-Leu-OH 31 000 8.0 > 3 800
N-hTyr H-N-Methyl-Arg-Lys-Pro-N-hTyr-Ile-Leu-
61 000 2.8 > 20 000
OH
H-Arg-Arg-Pro-(R)-Nal-Ile-Leu-OH 4 700 65 72
Boc-Lys-Lys-Pro-(D)-Nal-Ile-Leu-OH 23 000 910 25
Nal H-N-Methyl-Arg-Arg-Pro-(D)-3,1-Nal-tert-
2 100 10 210
Leu-Leu-OH (NT79)
Boc-Lys-Lys-Pro-Nal-Ile-Leu-OH 13 215 0.06
H-Lys-Lys-Pro-TAA(Br)-Ile-Leu-OH 13 000 227 57
TAA(Br) H-Lys-Lys-Pro-TAA(Br)-Gly-Leu-OH 35 000 1 950 18
TAA(OH) H-Arg-Arg-Pro-(S
Trans
)TAA(OH)-Gly-Leu-OH 20 000 700 28
H-Arg-Arg-Pro-(RTrans)TAA(OH)-Gly-Leu-OH 35 000 29 > 1 200
>10
H-Lys-Lys-Pro-(6-OH)Tic-Tle-Leu-OH 21 > 470
(6-OH)Tic11 000
H-β3hLys-Lys-Pro-(6-OH)Tic-Tle-Leu-OH 3 786 2.9 1 324
H-Arg-Arg-Pro-(STrans)-FPTyr-Ile-Leu-OH 39 11 3.5
FPTyr
H-Arg-Arg-Pro-(RTrans)-FPTyr-Ile-Leu-OH 18 000 63 290
 55

Tableau 4. Liste non exhaustive des modifications en position 11 qui favorisent la liaison
aux récepteurs NTS2.
En position 11 : AA souligné : AA naturel; AA non souligné : AA non naturel.
En Gras (noir) : autres modifications réalisées sur la NT(8-13).
FPTyr, Fluorophenyltyrosine; Nal, Naphtylalanine; N-hTyr, N-homo-tyramine; TAA(OH)
ou TAA(Br), Acide aminé tétrahydrofurane (Boules et al., 2010; Dubuc et al., 1999; Eiselt
et al., 2019b; Fanelli et al., 2017; Held et al., 2012; Pratsch et al., 2011; Simeth et al., 2017).
© Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le site Biorender.com).

3.2.2. Les composés macrocycliques

Un macrocycle est une molécule composée d’au moins un large cycle qui contient 12
atomes ou plus (Driggers et al., 2008). Le but de la macrocyclisation des composés
peptidiques ou non peptidiques est d’améliorer leurs propriétés pharmacocinétiques
(absorption, biodisponibilité, stabilité plasmatique) et pharmacodynamiques (Giordanetto
and Kihlberg, 2014; Marsault and Peterson, 2011; Sousbie et al., 2018a).

Les premiers composés macrocycliques neurotensinergiques ont été synthétisés par

l’équipe de recherche du Pr Sefler en 1995. Dans cette étude, ils ont synthétisé un grand
nombre de macrocycles en réalisant différentes cyclisations de la NT(8-13). À travers leurs
travaux, ils ont obtenu trois macrocycles de structures différentes capables de se lier aux
récepteurs NTS1 de souris (Ki : 16 – 410 nM ; Tableau 5A) (Sefler et al., 1995). En 1996,
l’équipe de Akunne a également synthétisé une série de macrocycles présentant différents
types de cyclisation (position 8 ou 9 avec position 12 ou 13) et différentes modifications.
Leurs deux meilleurs macrocycles (n°3 : cyclo[Arg8-Lys-Pro-Trp-Glu-Gly13] et n°11 :
cyclo[Cys-Arg8-Lys-Pro-Trp-Pen]-Leu13) présentent des affinités pour NTS1 comparables
aux composés précédents (Ki : 470 et 690 nM, respectivement) (Akunne et al., 1996). Dans
la même année, l’équipe de recherche de Pr Van Kemmel a réalisé une cyclisation tête-à-
queue de la NT(8-13) et a observé que ce composé était capable de se lier à NTS1 (Ki : 300
nM) (Van Kemmel et al., 1996). Par la suite, Lundquist et collaborateurs ont cyclisé la NT(8-
13) en liant l’Arg9 avec la Tyr11. Cette macrocyclisation semble être moins efficace
puisqu’ils ont observaient une perte d’affinité (Ki : 450 nM) comparé aux autres macrocycles
(Lundquist and Dix, 1999). En 2008, l’équipe de J. Martinez et collaborateurs a dimérisé et
cyclisé la NT(8-13). Ce macrocycle (JMV2012) présente une meilleure affinité pour NTS1
 56

(Ki : 150 nM) que le macrocycle synthétisé par l’équipe de Van Kemmel (Tableau 5A)
(Bredeloux et al., 2008).

Depuis quelques années, le laboratoire du Pr Marsault, un collaborateur du Pr Sarret

de l’Université de Sherbrooke, s’est spécialisé dans le développement de composés
neurotensinergiques macrocycliques. Après plusieurs années de recherche, ils ont obtenu un
macrocycle capable de se lier aux récepteurs NTS1 (IC50 : 400 nM pour hNTS1) et présentant
une excellente stabilité plasmatique (Temps de demi-vie : T1/2 > 12h) (Tableau 5B) (Sousbie
et al., 2018a). Par la suite, ils ont réalisé différentes modifications sur ce macrocycle afin
d’améliorer son affinité envers NTS1 et sa stabilité plasmatique. Ces modifications leur ont
permis d’obtenir un nouveau macrocyclique (composé n°2 ; Tableau 5B) présentant une
meilleure affinité pour NTS1 (Ki : 43 nM) mais étant nettement moins stable que le composé
précédent (T1/2 : 19 min). Des modifications ont alors été réalisées sur ce macrocycle et ils
ont obtenu deux nouveaux composés intéressants (Tableau 5B). Le premier est
moyennement affin pour NTS1 (composé n°3 ; Ki :156 nM) mais très stable (T1/2 ≃ 24h)
contrairement au second qui est très affin pour hNTS1 (composé n°7 ; Ki : 15 nM) mais
instable (T1/2 ≃ 30min). Par la suite, ces deux macrocycles ont été testés in vitro et in vivo
dans notre laboratoire. D’après les essais de signalisation, ils activent la voie de protéines G
(Gαq, Gα13) et recrutent les β-arrestines 1 et 2. Injecté i.t., ces deux composés induisent de
l’analgésie dans différents types de douleur (aiguë et tonique), de l’hypothermie et de
l’hypotension (injection i.v.) (Sousbie et al., 2018b) (Article n°4 en Annexe). Pour
s’affranchir des effets physiologiques médiés par NTS1, ils se sont maintenant orientés vers
le développement de macrocycles NTS2-sélectifs.

A. Premiers macrocycles présents dans la litterature.
Cyclisation tête à queue
c[Arg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu]
Ki : 410 nM (NTS1 souris)
(Sefler et al., 1995)
Cyclisation tête à queue de la NT(8-13)
(JMV1193)
c[Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu]
Ki : 300 nM (NTS1 souris)
(Van Kemmel et al., 1996)
Cyclisation tête à chaîne latérale
c[Arg-Lys-Pro-Trp-Glu]-Leu-OH
Ki : 16 nM (NTS1 souris)
(Sefler et al., 1995)
Cyclisation entre Arginine 9 et Tyrosine 11
Arg-c[Arg-Pro-Tyr]-Ile-Leu
Ki : 450 nM (hNTS1)
(Lundquist and Dix, 1999)
57
Cyclisation chaîne latérale à
chaine latérale
NMeArg-[Cys-Pro-Trp-Pen]-Leu-OH
Ki : 83 nM (NTS1 souris)
(Sefler et al., 1995)
Dimérisation et cyclisation de la
NT(8-13) (JMV2012)
c[Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-Lys-Lys-
Pro-Tyr-Ile-Leu]
Ki : 150 nM (hNTS1)
(Bredeloux et al., 2008)
 58

B. Macrocycles développés et synthétisés par le laboratoire du Pr Marsault.

Première structure macrocyclique obtenue par

l’équipe du Pr Marsault capable de se lier à
NTS1
IC50 : 400 nM (hNTS1)
T1/2 > 12h
(Sousbie et al., 2018a)

Composé macrocyclique n°2

Équipe du Pr Marsault
Ki : 43 nM (hNTS1)
T1/2 = 19 min
(Sousbie et al., 2018b)

Composé macrocyclique n°3 Composé macrocyclique n°7

Équipe du Pr Marsault Équipe du Pr Marsault
Ki : 156 nM (hNTS1) Ki: 15 nM (hNTS1)
T1/2 = 24 h T1/2 = 30 min
(Sousbie et al., 2018b) (Sousbie et al., 2018b)

Tableau 5. Structures des différents macrocycles neurotensinergiques.

A. Structures des macrocycles présents dans la littérature. B. Développement de composés
macrocycliques NTS1-sélectifs par le laboratoire du Pr Marsault. Surligné en Rose : Zone
de cyclisation. En Bleu : Modifications réalisées sur la structure du macrocycle n°1. En
Vert : Modifications réalisées sur la structure du macrocycle n°2.
 59

3.2.3. Les composés non peptidiques

Dans la littérature, on retrouve également des composés non peptidiques qui se lient
aux récepteurs neurotensinergiques. Parmi ces composés, deux sont davantage utilisés : le
SR48692 et le SR142948 (Tableau 6). Ces deux molécules sont des antagonistes, mais le
SR48692 cible préférentiellement NTS1 (rNTS1 : Ki : 20 nM ; rNTS2 Ki : 62 nM) alors que
le SR142948 n’est pas sélectif (rNTS1 : Ki : 1.4 nM ; rNTS2 Ki : 5.8 nM) (Thomas et al.,
2014a; 2014b; 2016). Le groupement adamantyle du SR48692 a été substitué par un
groupement cyclohexyle pour créer deux énantiomères, le SR48527 (configuration S) et le
SR49711 (configuration R) (Tableau 6). Alors que le SR48527 a la même affinité que le
SR48692 pour NTS1, la configuration R du cyclohexyle induit une importante baisse
d’affinité (100 fois) (Labbé-Jullié et al., 1994).

À partir de la structure du SR48692, un criblage virtuel a été réalisé pour identifier

des petites molécules capables de se lier aux récepteurs NTS1. Les résultats virtuels ont
amené l’équipe de Fan et collaborateurs à synthétiser deux molécules similaires (composé
de Wyeth et SR-12062 ; Tableau 6). Ces deux molécules peuvent se lier aux récepteurs NTS1
avec une affinité de l’ordre du micromolaire, et le composé de Wyeth semble agir comme
un agoniste partiel (Fan et al., 2008).

Toujours à partir de la structure du SR48692, l’équipe du Pr Thomas a réalisé

différentes études de relation structure-activité qui l’a menée à développer différents
analogues non peptidiques, mais sélectifs pour NTS2, à savoir le NTRC-739 (Ki rNTS1 : >
10 μM ; Ki rNTS2 : 153 nM) (Thomas et al., 2014a), le NTRC-824 (Ki rNTS1 : > 30 μM ;
Ki rNTS2 : 202 nM) (Thomas et al., 2014b), le NTRC-808 (Ki rNTS1 : > 25 μM ; Ki rNTS2 :
88 nM) (Thomas et al., 2015a) et le NTCR-844 (Ki rNTS1 : 2250 nM ; Ki rNTS2 : 23 nM)
(Tableau 6). Le NTRC-844 a été caractérisé in vivo par notre équipe, et ce fut le tout premier
antagoniste NTS2-sélectif (Thomas et al., 2016) (Article n°5 en Annexe).

Dans la littérature, on recense également trois autres composés non peptidiques, le

ML301, le ML314 et le SBI-553. D’après le Tableau 6, le ML301 présente une structure
 60

chimique similaire à celle du SR48692, alors que le ML314 et le SBI-553 sont totalement
différents (Hershberger et al., 2010; Peddibhotla et al., 2013; Pinkerton et al., 2019).
Contrairement au SR48692, le ML301 est un agoniste des récepteurs NTS1 (Hershberger et
al., 2010). Ces résultats sont intrigants, car ces deux composés ont une structure chimique
très similaire, mais l’un agit comme un agoniste et l’autre comme un antagoniste pour les
récepteurs NTS1 (Tableau 6).
Le ML314 et le SBI-553 présentent une structure chimique proche. En réalité, le SBI-553
résulte de différentes modifications réalisées sur la structure du ML314 afin d’augmenter sa
biodisponibilité orale (SBI-553 ≃ 50% ; ML314 < 5%) (Peddibhotla et al., 2013; Pinkerton
et al., 2019) (Tableau 6).
 61

Composé Structure Affinité Composé Structure Affinité

rNTS1 rNTS1
Ki : 20 nM Ki : 1.4 nM
SR48692 SR142948
rNTS2 rNTS2
Ki : 62 nM Ki : 5.8 nM

NTS1 NTS1
SR48527 IC50 : 85 nM SR49711 IC50 : 6.2 μM

NTS1
NTS1
Composé EC50 : 178 μM
SR-12062 EC50 : 2 μM
de Wyeth Agoniste
partiel

rNTS1 rNTS1
Ki > 10 μM Ki > 30 μM
NTRC-739 NTRC-824
rNTS2 rNTS2
Ki : 153 nM Ki : 202 nM

rNTS1 rNTS1
Ki > 25 μM Ki: 2250 nM
NTRC-808 NTRC-844
rNTS2 rNTS2
Ki : 88 nM Ki : 23 nM

NTS1
EC50 :
ML301
2 – 4.1 μM

NTS1
NTS1
EC50 : 2 μM
ML314 SBI-553 EC50: 0.34 μM
NTS2
EC50 > 80 μM

Tableau 6. Composés neurotensinergiques non peptidiques

 62

Surligné en Vert : Structure commune avec le SR48692; Surligné en Bleu : Structure

commune avec le composé de Wyeth; Surligné en Rouge : Structure commune avec le
ML314.

3.2.4. Les composés allostériques

La plupart des composés cités précédemment agissent comme des agonistes ou des
antagonistes en se liant au site orthostérique des récepteurs. Cependant, certains composés,
dits allostériques, peuvent se lier sur des sites distincts. Les ligands allostériques induisent
des changements conformationnels du RCPG en modifiant le site orthostérique et/ou en
agissant au niveau des protéines G effectrices. Les modulateurs allostériques positifs
améliorent l’affinité et/ou l’efficacité du ligand endogène, alors que les modulateurs
allostériques négatifs les diminuent (Wootten et al., 2013).

Pour le système neurotensinergique, il existe deux modulateurs allostériques des

récepteurs NTS1, le ML314 et le SBI-553 (Tableau 6). Ces deux composés sont des agonistes
biaisés. Un composé est dit « biaisé » s’il est capable d’activer sélectivement les voies de
signalisation dépendantes des protéines G ou des β-arrestines. En absence de NT, ces deux
composés recrutent les β-arrestines, mais n’ont aucun effet sur l’activation de la protéine
Gαq/11 (Peddibhotla et al., 2013; Pinkerton et al., 2019). Or en présence de NT, ils agissent
comme des modulateurs allostériques positifs en augmentant le nombre de sites de liaison
de la NT au niveau des récepteurs NTS1 (Barak et al., 2016; Pinkerton et al., 2019; Slosky
et al., 2020). Le SBI-553 agit également comme un antagoniste en bloquant la mobilisation
calcique de la NT médiée par l’activation des protéines Gαq/11 (Pinkerton et al., 2019); (Slosky
et al., 2020). Ces composés sont actifs in vivo, puisque leur administration i.p. diminue
l’hyperlocomotion chez des souris transgéniques dont le gène codant pour le transporteur de
dopamine a été déplété (Barak et al., 2016; Pinkerton et al., 2019). L’injection i.p. de SBI-
553 atténue également les comportements addictions aux psychostimulants sans induire
d’effets indésirables médiés par NTS1 (hypotension, hypothermie et trouble de locomotion)
(Slosky et al., 2020).
 63

Notre laboratoire, en collaboration avec le laboratoire du Pr Marsault, s’est également

intéressé au développement de composés allostériques en conceptualisant et en développant
des pepducines. Les pepducines sont des composés peptidiques dont la séquence correspond
à l’une des boucles intracellulaires du RCPG. Au niveau de son extrémité N-terminale, un
groupement palmitate est ajouté afin de permettre sa translocation du compartiment
extracellulaire vers le compartiment intracellulaire ainsi que son ancrage à la membrane
plasmique. En interagissant avec la boucle intracellulaire cible, les pepducines modulent le
signal du récepteur comme le font les agonistes ou les modulateurs allostériques (Carr and
Benovic, 2016). Nous avons récemment publié une première étude sur une pepducine
neurotensinergique : PP-001. Cette pepducine cible la 1re boucle intracellulaire du récepteur
NTS1. Les essais in vitro ont montré que PP-001 agissait comme un agoniste allostérique et
ces résultats ont été confirmés in vivo puisqu’une injection i.t. de PP-001 chez le rat induit
de l’analgésie dans différents types de douleur (Brouillette et al., 2020).

Le système neurotensinergique offre une grande diversité pour le développement

d’analogues, car des composés peptidiques linéaires, macrocycliques, ou non peptidiques
peuvent se lier et activer les récepteurs NTS1 et NTS2. De plus, en fonction des effets
physiologiques souhaités, des agonistes, des antagonistes, des modulateurs allostériques ou
des analogues biaisés peuvent être développés ce qui augmente encore plus le nombre de
possibilités. En revanche, NTS1 semble moins permissif que NTS2, considérant qu’une
modification en position 11 induit une perte d’affinité importante pour le récepteur NTS1.
Cette position 11 sera très importante pour ce projet de thèse puisque nous ciblerons
préférentiellement les récepteurs NTS2.

Face au grand nombre de stratégies qui peuvent être envisagées, le système

neurotensinergique représente une piste prometteuse pour le développement de composés à
visée thérapeutique. Néanmoins, ce système possède tout de même quelques limites non
négligeables dont il est primordial de s’affranchir.
 64

Les limites du système neurotensinergique

3.3.1. Une faible stabilité plasmatique

La première limite de la NT est son instabilité plasmatique. Différents essais in vitro

ont montré que la demi-vie plasmatique de la NT ou de la NT(8-13) était de l’ordre de
quelques minutes (Eiselt et al., 2019a; Schindler et al., 2019; Sousbie et al., 2018b).

Les premières études sur la dégradation de la NT ont été réalisées in vitro sur des
membranes synaptiques purifiées de cerveau de rat. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques
pour certaines peptidases a permis de distinguer trois sites de clivage, ainsi que les enzymes
responsables (Figure 16). Les peptidases EC 3.4.24.15 (oligopeptidases) sont responsables
du premier clivage entre les deux arginines en positions 8 et 9. Ensuite, le second clivage se
situe entre la proline et la tyrosine en positions 10 et 11. Ce clivage est réalisé par les
peptidases EC 3.4.24.11 (enképhalinases) et EC 3.4.24.16 (neurolysine). Les peptidases EC
3.4.24.11 sont également responsables du troisième clivage entre la tyrosine et l’isoleucine
en positions 11 et 12 (Checler et al., 1983; 1984; 1985). Ces trois enzymes appartiennent à
la famille des Zn-métallopeptidases. Elles sont largement distribuées dans le cerveau et les
tissus périphériques et ont un rôle majeur dans la dégradation de peptides actifs au niveau
des espaces extracellulaires (Kitabgi, 2006b).

Les fragments de NT issus des clivages par les métallopeptidases subissent également
des dégradations par l’action d’endopeptidases et d’exopeptidases (clivent au niveau
terminal) (Figure 16). Le fragment NT(1-10) généré par les endopeptidases EC.3.4.24.11 et
l’EC.3.4.24.16 est dégradé en NT(1-8) par l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA).
Le fragment NT(1-13) produit par l’EC.3.4.24.15 subit une dégradation par le dipeptyl
aminopeptidase post-proline pour devenir un fragment de NT(11-13). La NT(11-13) est la
cible d’aminopeptidases et entraine la libération d’une tyrosine (Kitabgi, 2006b).
 65

Figure 16. Les zones de clivage de la neurotensine.

En couleur, lignes pleines : les trois sites de clivage de la NT ; En lignes pointillées :
fragments de la NT qui subissent un second clivage; En Gras : partie biologiquement active
de la NT (NT(8-13)). Image inspirée de la revue de littérature de (Sarret and Kitabgi, 2009).
ECA, enzyme de conversion de l’angiotensine. © Mélanie Vivancos (Image réalisée sur le
site Biorender.com).

Malheureusement, tous les sites de clivage se situent uniquement sur la portion

biologiquement active de la NT contenant les AA 8 à 13. L’action des différentes peptidases
permet une dégradation presque totale de ce fragment. La présence de ces trois zones de
clivage représente une limite majeure et non négligeable pour le développement de composés
neurotensinergiques basés sur cette séquence.

De plus, une propyl endopeptidase, aussi appelée EC.2.4.21.26 serait également à

l’origine de la dégradation de la NT. Cette endopeptidase est cytosolique et clive les petits
peptides (moins de 30 AA) du côté C-terminal de la proline. En plus de la NT, elle serait
également responsable de la dégradation d’autres neuropeptides tels que l’arginine-
vasopressine, l’angiotensine, la substance P. D’après l’étude de Peltonen et collaborateurs,
cette endopeptidase serait localisée dans les mêmes régions cérébrales que les récepteurs
NTS1 (substance noire, striatum, Nacc et ATV) (Peltonen et al., 2012). Toutefois, le nombre
de publications au sujet de la dégradation de la NT par l’EC.3.4.21.26 reste relativement
 66

faible, et la dégradation de la NT semble être plutôt médiée par l’action des Zn-
métallopeptidases décrites précédemment.

Face à toutes ces endopeptidases responsables de la dégradation de la NT, la mise en

place de stratégies est primordiale pour empêcher cette biodégradation et augmenter ainsi la
stabilité plasmatique des composés.

3.3.2. Passage de la barrière hématoencéphalique

Un des plus grands défis pour le développement de médicaments dont la cible est au
niveau du SNC est le passage de la BHE. La BHE est composée de neurones, de cellules
endothéliales, de péricytes, d’astrocytes et de jonctions serrées. Elle a pour rôle de réguler
étroitement le mouvement d’ions, de nutriments, de molécules, des neurotoxines et des
neurotransmetteurs entre le sang et le cerveau (Abbott et al., 2010). Ce contrôle précis de
l’homéostasie du SNC permet le bon fonctionnement du cerveau tout en le protégeant des
toxines et des agents pathogènes (Daneman and Prat, 2015).

La BHE représente une véritable limite d’un point de vue pharmacologique. Le plus
souvent, les peptides ne sont pas capables de passer la BHE (Pardridge, 1998). L’absence
d’effets physiologiques centraux (analgésie, hypothermie, hypolocomotion) suite à une
administration périphérique de NT laisse penser qu’elle ne traverse pas la BHE ou qu’elle
est dégradée avant d’atteindre le cerveau (Demeule et al., 2014; Nemeroff et al., 1977).

Parmi tous les composés neurotensinergiques décrits dans la littérature, la NT1, le

NT66L, le NT69L, le NT77L, le NT79, le HPI-201, le HPI-363, le ML314 ainsi que deux
composés cycliques (JMV1193 et JMV2012) ont été identifiés comme étant capables de
passer la BHE. L’injection périphérique de ces composés, hormis le ML314, par voie
intraveineuse ou intrapéritonéale induit de l’analgésie et/ou de l’hypothermie. Mis à part
pour le composé NT1, aucune étude approfondie sur le passage de la BHE n’a été réalisée
pour ces composés. Cette absence d’étude peut remettre en question si ces composés passent
bel et bien la BHE (Banks et al., 1995; Boules et al., 2001a; 2003; Bredeloux et al., 2008;
 67

Lee et al., 2014; Peddibhotla et al., 2013; Smith et al., 2012; Tyler et al., 1999; VanKemmel,
1996; Wei et al., 2013).

En 2014, en collaboration avec l’équipe de la compagnie d’Angiochem, notre équipe

a étudié par perfusion cérébrale in situ le passage de la NT à travers la BHE (Demeule et al.,
2014). Cette technique permet de déterminer deux paramètres pharmacocinétiques
importantes, le volume de distribution (Vd ; μl/gr) et le coefficient de transport (Kin ; μl/g/s).
Le Vd correspond au rapport entre la quantité de molécules présentes dans le cerveau et la
concentration sanguine. Le Kin représente la capacité de la molécule à traverser la BHE. Plus
ces deux valeurs sont élevées, plus le composé est capable de traverser la BHE. D’après leurs
résultats, la NT traverse faiblement la BHE avec une constante d’entrée Kin : 0.27 μl/sec/gr
de cerveau et un volume de distribution Vd : 7.4 ml/ 100 gr de cerveau, et son injection i.v.
chez le rat n’induit aucun effet analgésique (Demeule et al., 2014).

Pour favoriser le passage de la NT à travers la BHE, ces chercheurs ont développé

une nouvelle stratégie visant à utiliser le récepteur low-density lipoprotein receptor-related
protein 1 (LRP1) comme transporteur actif. LRP1 est un récepteur présent au niveau des
cellules endothéliales des vaisseaux sanguins qui permet le transport de molécules de la
circulation sanguine vers le parenchyme cérébral. En 2008, ils ont synthétisé un peptide,
appelé Angiopep-2 (AN2), capable de se lier aux récepteurs LRP1 (Figure 17). Ce nouvel
outil peptidique peut être couplé à une molécule d’intérêt pour lui permettre de franchir la
BHE (Demeule et al., 2008). Quelques années plus tard, ils ont couplé l’AN2 à la NT pour
former un peptide hybride ANG2002 (AN2-NT) qui est capable de passer la BHE (Figure
17). D’après des essais de liaison, ce couplage ne modifie en aucun cas l’affinité de la NT
pour les récepteurs NTS1 et NTS2 humains (ANG2002, Ki : 13.0 nM pour hNTS1 et Ki :
3.3 nM pour hNTS2). De plus, l’injection i.v. de ce composé induit de l’analgésie dans
différents types de douleur chez le rat à des doses très faibles de 0.05 mg/kg. Lors des essais
de perfusion cérébrale in situ, ils ont observé que le Kin : 2.7 μl/sec/gr et le Vd : 62.4 ml/ 100
gr de cerveau de l’ANG2002 étaient 10 fois supérieurs à ceux de la NT (Demeule et al.,
2014). L’absence d’effets physiologiques centraux après une injection périphérique de NT
pourrait donc s’expliquer par sa difficulté à passer la BHE (valeurs de Kin et Vd relativement
 68

faibles). La faible concentration de NT qui se retrouve dans le cerveau suite une injection
i.v. ne serait pas suffisante pour induire une réponse physiologique. Étant donné sa faible
stabilité plasmatique, il se pourrait aussi que la NT soit dégradée avant même qu’elle puisse
atteindre le cerveau.

Dans notre laboratoire, nous avons également couplé l’AN2 à la NT(8-13) ainsi qu’à
la morphine et à son métabolite principal, la morphine-6-glucuronide (M6G). Suite à ce
couplage, leur effet analgésique est potentialisé suite à une injection i.v. et une plus grande
quantité de composés se retrouve au niveau du cerveau (Eiselt et al., 2019a; 2020). L’AN2
est donc un peptide très prometteur pour le développement de composés neurotensinergiques
qui agissent principalement au niveau central.

Figure 17. Structure chimique de l’AN2 et de l’ANG2002.

L’AN2 peut traverser la BHE grâce à sa liaison aux récepteurs LRP1. Image réalisée par ©
Philippe Sarret et adaptée par © Mélanie Vivancos (Image modifiée sur le site
Biorender.com).
 69

4. Problématique de recherche

Actuellement, les opioïdes, tels que la morphine, sont généralement prescrits pour
traiter les patients qui souffrent de douleur chronique. Un des effets importants du système
opioïdergique est le développement de tolérance au fil du temps limitant son utilisation sur
le long terme. Pour maintenir une même efficacité analgésique, les doses doivent être
régulièrement augmentées, entrainant ainsi une hausse des effets secondaires (constipation,
dépression respiratoire et dépendance). Face à des patients généralement peu soulagés et au
développement de comorbidités (anxiété et dépression), des antidépresseurs, des
anticonvulsivants peuvent également être prescrits (Ciaramella, 2019; Sutherland et al.,
2018). La prévalence mondiale de la douleur chronique, ses impacts sociaux et économiques
ainsi que la crise des opioïdes actuelle montrent qu’il est nécessaire et urgent de développer
de nouvelles alternatives au système opioïdergique pour traiter la douleur.

Dans cette optique, le système neurotensinergique semble être une piste prometteuse.
En effet, la neurotensine exerce des effets analgésiques plus puissants que ceux de la
morphine lorsqu’elle est injectée à dose équimolaire par voie intracisternale ou microinjectés
directement dans la PAG (Al-Rodhan et al., 1991; Nemeroff et al., 1979). Même si la
localisation des récepteurs neurotensinergiques et opioïdergiques au niveau des voies
nociceptives de la douleur laissent prétende de possibles interactions entre ces deux
systèmes, plusieurs études ont montré que l’analgésie induite par le système
neurotensinergique était indépendante du système opioïdergique (utilisation du naloxone, un
antagoniste des récepteurs opioïdes, et de souris déplétées des récepteurs Mu) (Behbehani
and Pert, 1984; Bredeloux et al., 2006; Clineschmidt et al., 1979; Osbahr et al., 1981)
(McMahon et al., 2001). Un autre effet physiologique intéressant du système
neurotensinergique est son implication dans le contrôle des troubles anxieux. Par conséquent,
le développement d’analogues NT pourrait permettre de traiter à la fois la douleur chronique
et certaines comorbidités associées comme l’anxiété.

Les effets physiologiques de la NT sont en particulier médiés par l’activation de deux

RCPG, NTS1 et NTS2. L’activation des récepteurs NTS1 induit de l’analgésie et diminue
 70

l’anxiété. Néanmoins, ils provoquent également de l’hypothermie et de l’hypotension, soit

des effets physiologiques qui sont considérés comme indésirables lors d’un traitement
antalgique. En revanche, les récepteurs NTS2 sont des cibles plus intéressantes puisque leur
activation produit uniquement un effet antalgique et anxiolytique.

Parallèlement, l’hypothermie thérapeutique légère (32 à 35°C) est généralement

utilisée dans certaines conditions pathologiques comme l’encéphalopathie néonatale ou
encore chez des patients adultes ayant subi un arrêt cardiaque ou un accident vasculaire
cérébral ischémique. Cette baisse de température corporelle a un effet neuroprotecteur en
diminuant la neuroinflammation et en maintenant l’intégrité de la BHE (Sun et al., 2019).
Les composés NTS1-sélectifs qui induisent une légère baisse de température corporelle (-1
à 3°C) pourraient donc être exploités cliniquement dans un contexte d’hypothermie
thérapeutique appliquée.
 71

5. Hypothèse et objectifs de recherche

En considérant les caractéristiques du système neurotensinergique et de ces

récepteurs, nous émettons les hypothèses suivantes :
Le développement de nouveaux analogues neurotensinergiques ciblant principalement
le récepteur NTS2 représente une avenue prometteuse pour traiter à la fois la douleur
chronique et l’anxiété qui y est associée sans pour autant induire d’effets secondaires.

L’effet hypothermiant des analogues NTS1-sélectifs pourrait être exploité pour induire
des effets neuroprotecteurs en situation clinique critique.

Le laboratoire du Pr Sarret est en collaboration avec le laboratoire de chimie du Pr

Cavelier en France. Tout au long de mon doctorat, ils ont développé différentes stratégies
pour synthétiser de nouveaux analogues neurotensinergiques. Notre rôle a donc été de
caractériser les effets in vitro et in vivo de ces nouveaux composés peptidiques. Afin de
répondre à nos hypothèses de recherche, nous nous sommes fixés les différents objectifs
suivants :

1. Évaluer in vitro l’effet des différentes modifications de la NT(8-13) sur

l’affinité envers les récepteurs hNTS1 et hNTS2.
Cet objectif est la première étape que nous effectuons afin d’évaluer l’impact des différentes
modifications sur l’affinité des analogues pour les récepteurs NTS1 (hNTS1) et NTS2
(hNTS2) humains. Pour déterminer leur affinité, nous réalisons des essais de radioliaison sur
des membranes de cellules qui expriment de façon stable les récepteurs hNTS1 et hNTS2. À
travers cet objectif, nous avons étudié quatre séries de composés présentant des
modifications différentes en positions 8-9 (liaison réduite), 10 (Silaproline ou CycloF), 11
(Lysine, N-homo-Tyramine, N-homo-Tryptamine, D-Tryptophane) et 13 (TMSAla ou Cyclo
F).
 72

2. Mesurer l’effet des modifications sur la stabilité plasmatique des composés.

Comme nous l’avons mentionné précédemment, une des limites du système
neurotensinergique est son instabilité plasmatique. Notre second objectif consiste à
déterminer l’impact des différentes modifications pour protéger les composés de la
dégradation enzymatique et augmenter ainsi leur stabilité plasmatique. Pour cela, nous avons
évalué in vitro le temps de demi-vie plasmatique de tous nos nouveaux composés dans du
plasma de rat.

3. Évaluer le potentiel analgésique de nos nouveaux composés.

Après avoir déterminé l’affinité de nos composés sur hNTS1 et hNTS2 ainsi que leur stabilité
plasmatique, uniquement les composés les plus sélectifs pour NTS2 et/ou les plus stables ont
été testés in vivo. Pour cet objectif, les composés sont injectés directement dans le SNC, par
voie intrathécale. Dans un premier temps, le potentiel analgésique de nos analogues a été
évalué en douleur aiguë thermique avec le test de retrait de la queue. Cette technique est non
invasive et permet d’avoir un premier aperçu du profil analgésique de nos composés. Par la
suite, les meilleurs composés ont également été testés en douleur tonique (test à la formaline)
ainsi qu’en douleur chronique (douleur neuropathique et inflammatoire).

4. Vérifier que nos composés NTS2-selectifs n’induisent pas d’effets

indésirables médiés par NTS1.
Même si la plupart de nos composés testés en douleur ciblent principalement le récepteur
NTS2, certains d’entre eux ont malgré tout une affinité pour NTS1. De ce fait, il été
primordial d’évaluer l’effet de ces composés sur la pression artérielle (injection
intraveineuse) ainsi que sur la température corporelle (injection intrathécale).

5. Évaluer le caractère anxiolytique d’un composé NTS2-sélectif dans un

contexte de douleur chronique.
Comme nous l’avons décrit précédemment, la douleur chronique est souvent associée au
développement de comorbidités telles que l’apparition d’anxiété et/ou de dépression. Pour
être dans des conditions similaires que celles observées chez l’homme, nous avons mis au
point un modèle d’anxiété induit par la présence d’une douleur chronique inflammatoire. Par
 73

la suite, nous avons évalué la capacité d’un analogue NTS2-sélectif, injecté par voie i.c.v., à
réduire les comportements anxieux.

6. Déterminer l’impact des différentes modifications sur l’effet hypothermiant

des composés NTS1-sélectifs.
L’induction d’une légère hypothermie a des effets neuroprotecteurs lors de situations
cliniques critiques comme l’ischémie cérébrale. Par conséquent, l’effet hypothermiant des
composés NTS1-sélectifs pourrait être utilisé pour ce type de pathologie. À travers cet
objectif, nous avons évalué l’effet des différentes modifications sur le potentiel
hypothermiant de nos composés (analogues non sélectifs et NTS1-sélectifs).
 74

ARTICLES

Article 1
Metabolically Stable Neurotensin Analogs Exert Potent and Long-Acting
Analgesia Without Hypothermia

Auteurs de l’article : Mélanie Vivancosa,b, Roberto Fanellic, Élie Besserer-Offroya,b,1,

Martin Resua-Rojasa,b, Christine E. Monad, Santo Previtic,2, Emmanuelle Rémondc, Jean-
Michel Longpréa,b, Florine Cavelierc,3,*, Philippe Sarreta,b,3,**

a
Department of Pharmacology-Physiology, Faculty of Medicine and Health Sciences,
Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada
b
Institut de Pharmacologie de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec,
Canada
c
Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR-CNRS 5247, Université
Montpellier, ENSCM, Montpellier, France
d
Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at
the University of California at Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

1
Present address: Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University,
Montréal, QC, Canada
2
Present address: Department of Chemical, Biological, Pharmaceutical and Environmental
Sciences, University of Messina, Vial Annunziata, Messina, Italy
3
Lead Author

Statut de l’article : Soumis dans le journal « Behavioural Brain Research » le 1er Juillet
2020.
Numéro de soumission : BBRES-D-20-00619

Avant-propos : Cette publication est issue d’une collaboration avec l’équipe du Pr Cavelier
Florine (France) qui a développé et synthétisé tous les analogues neurotensinergiques
présents dans la publication. Pour ma part, j’ai été en charge de caractériser in vitro l’affinité
 75

de ces nouveaux composés sur les récepteurs hNTS1 et hNTS2 ainsi que leur stabilité
plasmatique. De plus, j’ai réalisé des tests in vivo pour déterminer le potentiel analgésique
des composés (douleur aiguë, tonique et chronique inflammatoire) tout en vérifiant leurs
effets sur la température corporelle et la pression artérielle. J’ai également rédigé entièrement
le papier et réalisé toutes les figures du papier à partir de mes résultats. J’évalue ma
contribution pour cet article à environ 80%.

Résumé :
La neurotensine est un tridécapeptide endogène impliqué dans l’inhibition de la transmission
douloureuse. En agissant sur deux récepteurs couplés aux protéines G, NTS1 et NTS2,
l’administration centrale de NT permet d’induire de l’analgésie. Or, l’activation des
récepteurs NTS1 par la NT produit également de l’hypotension et de l’hypothermie, ce qui
représente un obstacle pour le développement de composés analgésiques. Dans cette étude,
nous avons mis en œuvre différentes stratégies chimiques pour améliorer la stabilité
plasmatique de la NT(8-13) et augmenter la sélectivité envers NTS2. Par la suite, nous avons
déterminé in vivo l’effet des nouveaux analogues sur la pression artérielle et la température
corporelle ainsi que leur potentiel analgésique dans différents types de douleur chez le rat.
Nous avons donc synthétisé une série d’analogues neurotensinergiques basés sur la séquence
de la NT(8-13) auquel nous avons ajouté une liaison réduire entre les deux lysines8-9. Ensuite,
la proline en position 10 et l’isoleucine en position 11 ont été substituées par des acides
aminés non naturels tels qu’une Silaproline (Sip) et un (L)-Triméthylsilylalanine (TMSAla),
respectivement. La combinaison de la liaison réduite8-9 en présence d’une Sip10 et d’une
TMSAla13 (JMV5296) a considérablement augmenté la demi-vie plasmatique d’environ 20h
et a permis d’obtenir un composé 25 fois sélectif pour NTS2. L’administration centrale de
JMV5296 induit un puissant effet analgésique en douleur aiguë (test retrait de la queue),
tonique (test à la formaline) et chronique inflammatoire (injection de l'adjuvant complet de
Freund (CFA)), sans pour autant induire d’hypothermie. À travers ces résultats, nous avons
donc observé que la combinaison de ces trois modifications permet d’améliorer le profil
pharmacologique et thérapeutique de la NT(8-13). Ces observations sont très prometteuses
et permettront d’orienter les futurs travaux basés sur le développement d’analogues
neurotensinergiques stables et analgésiques.
 76

Metabolically Stable Neurotensin Analogs Exert Potent and Long-Acting

Analgesia Without Hypothermia

Mélanie Vivancosa,b, Roberto Fanellic, Élie Besserer-Offroya,b,1, Martin Resua-Rojasa,b,

Christine E. Monad, Santo Previtic,2, Emmanuelle Rémondc, Jean-Michel Longpréa,b, Florine
Cavelierc,3,*, Philippe Sarreta,b,3,**

a
Department of Pharmacology-Physiology, Faculty of Medicine and Health Sciences,
Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada
b
Institut de Pharmacologie de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec,
Canada
c
Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR-CNRS 5247, Université
Montpellier, ENSCM, Montpellier, France
d
Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at
the University of California at Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

1
Present address: Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University,
Montréal, QC, Canada
2
Present address: Department of Chemical, Biological, Pharmaceutical and Environmental
Sciences, University of Messina, Vial Annunziata, Messina, Italy
3
Lead Author

Corresponding Authors:

**
Philippe Sarret, Ph.D.
Dept of Pharmacology-Physiology
Université de Sherbrooke
3001, 12e Avenue Nord
Sherbrooke, QC, Canada, J1H 5N4
Philippe.Sarret@USherbrooke.ca
Phone: +1 (819) 821-8000 ext. 72554
*
Florine Cavelier, Ph.D.
IBMM, UMR-CNRS-5247
Université de Montpellier
19 Place Eugène Bataillon
34095 Montpellier Cedex 5, France
Florine.Cavelier@umontpellier.fr
Phone: +33 (0) 467 14 37 65
 77

Abstract

The endogenous tridecapeptide neurotensin (NT) has emerged as an important

inhibitory modulator of pain transmission, exerting its analgesic action through the activation
of the G protein-coupled receptors, NTS1 and NTS2. Whereas both NT receptors mediate
the analgesic effects of NT, NTS1 activation also produces hypotension and hypothermia,
which may represent obstacles for the development of new pain medications. In the present
study, we implemented various chemical strategies to improve the metabolic stability of the
biologically active fragment NT(8-13) and assessed their NTS1/NTS2 relative binding
affinities. We then determined their ability to reduce the nociceptive behaviors in acute,
tonic, and chronic pain models and to modulate blood pressure and body temperature. To
this end, we synthesized a series of NT(8-13) analogs carrying a reduced amide bond at Lys8-
Lys9 and harboring site-selective modifications with unnatural amino acids, such as
silaproline (Sip) and trimethylsilylalanine (TMSAla). Incorporation of Sip and TMSAla
respectively in positions 10 and 13 of NT(8-13) combined with the Lys8-Lys9 reduced amine
bond (JMV5296) greatly prolonged the plasma half-life time over 20 hours. These
modifications also led to a 25-fold peptide selectivity toward NTS2. More importantly,
central delivery of JMV5296 was able to induce a strong antinociceptive effect in acute (tail-
flick), tonic (formalin), and chronic inflammatory (CFA) pain models without inducing
hypothermia. Altogether, these results demonstrate that the chemically-modified NT(8-13)
analog JMV5296 exhibits a better therapeutic profile and may thus represent a promising
avenue to guide the development of new stable NT agonists and improve pain management.

Keywords: unnatural amino acid, antinociception, TMSAla, silaproline, chronic pain,

metabolic stability
 78

Highlights

• Incorporation of reduced amide bond, silaproline and TMSAla in NT(8-13) resulted

in JMV5296, a 25-fold NTS2-selective analog.

• Combination of these three chemical modifications increased resistance toward

proteases having a plasma stability over 20 hours.

• Intrathecal injection of JMV5296 induced potent antinociception in acute, tonic and

chronic inflammatory pain models.

• Central delivery of JMV5296 had no impact on body temperature.

Chemical compounds studied in this article

NT(8-13) (PubChem CID 5311318)
PD149163 (PubChem CID 73064239)
JMV431 (Pubchem SID 135652223)
 79

1. Introduction

Chronic pain is an important public health problem affecting more than 20% of the
worldwide population [1]. Opioid drugs are extensively used in the treatment of chronic pain
despite a long list of undesired effects and their limited long-term efficacy to relieve pain for
many patients [2, 3]. Even with the growing awareness of the risks associated with opioid
misuse, overdose and addiction, opioid use is still rising, thus leading to the current opioid
crisis in North America [4, 5]. Thus, the societal and economic burden, healthcare costs and
high prevalence of chronic pain encourage researchers to seek for new pain medications with
an increased benefits/side effects ratio [6, 7]. Among the development strategies, drugs
targeting non-opioid seven transmembrane domain receptors (7TMRs, also known as G
protein-coupled receptors) represent a promising therapeutic avenue in pain research [7].
The development of peptide-based therapeutics is undergoing an exciting revival in the last
decade, when compared to small molecule drugs [8, 9]. Peptides often offer high target
selectivity and specificity as well as enhanced efficacy, safety and tolerability profiles.
However, naturally occurring peptides are often not directly suitable for clinical use due to
low oral bioavailability, poor blood-brain barrier (BBB) penetration, and short half-life in
physiological fluids related to their poor resistance to proteolytic degradation [8, 10].
Among the promising alternatives to opioid pain medications, neurotensin (NT)
receptors emerge as attractive targets for the treatment of pain [7, 11]. Neurotensin (NT) is
a small neuropeptide of 13 amino acids (pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-
Ile-Leu) [12] known to mediate its physiological effects through its binding to two receptors
that belongs to 7TMRs superfamily, namely NTS1 and NTS2 [13]. Peripherally, NT acts as
an hormone in the cardiovascular system where it induces a drop in blood pressure [14, 15],
controls appetite [16] and regulates gastrointestinal motility [17]. When administered
directly into the central nervous system (CNS), NT is known to play a role in the regulation
of anxiety [18, 19] as well as in dopaminergic (DAergic)-associated diseases, such as
schizophrenia, drug abuse, and Parkinson’s disease [20-22]. NT and its analogs also produce
persistent hypothermia [20, 23] and analgesia [24-26]. Both NTS1 and NTS2 receptors are
present in CNS regions involved in nociceptive transmission and pain modulation, such as
the spinal dorsal horn, periaqueductal gray (PAG), rostroventral medulla (RVM), dorsal
 80

raphe nucleus, raphe magnus and pallidus [25, 27-29]. Moreover, the neurotensinergic
system is gaining further interests for pain relief as NT-induced analgesia is not altered by
the administration of the opioid antagonists’ naloxone and naltrexone, thereby supporting
that NT receptor activation mediates its antinociception action independently of the opioid
system [30].
Amino acids forming the C-terminal moiety of the native NT peptide, at position 8
to 13 (Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu), were identified as the minimal sequence for NT receptor
binding and biological activity [31, 32]. Therefore, compound synthesis and structure-
activity relationship studies have allowed the development of new NT(8-13) selective
analogs targeting either NTS1 or NTS2 receptors and permitted the discrimination of their
respective physiological effects [33, 34]. While analgesia in acute, tonic, and chronic pain
paradigms was demonstrated to be mediated by the activation of both receptors [24, 25, 28,
34-36], only NTS1 activation was associated with hypotension [14, 37] and hypothermia
[38].
Adverse effects (hypothermia and hypotension) combined to certain limitations of the
native peptide for therapeutic use preclude safe administration of native NT or NT(8-13) as
non-opioid pain-relieving medications. Therefore, chemical modifications of the backbone
and the incorporation of unnatural amino acids are necessary to optimize the
pharmacological properties of newly synthesized NT(8-13) drug candidates. In the present
study, we evaluate the impact of site-selective chemical modifications of NT(8-13) to
improve the peptide metabolic stability and its analgesic efficacy in different experimental
pain models as well as to reduce the unwanted effects triggered by NTS1 activation.
 81

2. Materials and Methods

2.1 Peptide chemistry and characterization

Full synthetic procedures and characterization of the compounds presented in this study are
reported in [39].

2.2 Competitive radioligand binding assay

CHO-K1 cells stably expressing hNTS1 (ES-690-C from PerkinElmer, Montréal,
Canada) or 1321N1 cells stably expressing hNTS2 (ES-691-C from PerkinElmer) were
cultured respectively in DMEM/F12 or DMEM. Culture media were supplemented with 10%
FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 20 mM HEPES and 0.4 mg/mL G418,
and cells were incubated at 37°C in a humidified chamber at 5% CO2. All media and
additives are from Wisent (St-Bruno, Canada). Competitive radioligand binding experiments
were performed as previously described [40]. Briefly, 50 μg of cell membranes, expressing
125
either hNTS1 or hNTS2, were incubated with I-Tyr3-NT (2200 Ci/mmol, from
PerkinElmer, Billerica, MA). Competition was done with increasing concentrations of NT
analogs diluted in binding buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 % BSA) and ranging from
10–11 to 10–5 M. After one hour of incubation at room temperature, the binding reaction was
terminated by filtration in 96-well glass-fiber filter plates (GF/C, Millipore, Billerica, MA)
and plate was washed three times with ice-cold binding buffer. Filters were then counted in
a γ-counter (1470 Wizard2, PerkinElmer). Non-specific binding was measured in the
presence of 10–5 M unlabeled NT(8–13) and represented less than 5% of total binding. IC50
values were determined from the competition curves as the unlabeled ligand concentration
inhibiting half of the 125I-Tyr3-NT-specific binding. Data were plotted using GraphPad Prism
8 using the One-site – Fit log (IC50) and represent the mean ± SEM of at least three separate
experiments.
IC50 calculated from the competitive radioligand binding assays were then
transformed into Ki using the Cheng−Prusoff equation [41] :
IC50
K! =
[L]
'1 + K -
"
 82

where L refers to the concentration of radiolabeled tracer (125I-[Tyr3]- NT) and Kd refers to
the equilibrium dissociation constant of the radioligand. Determined Kd are 0.7 nM and 3.4
nM for NTS1 and NTS2, respectively.

2.3 Plasma stability

Rat plasma was obtained from blood by keeping the translucent phase after
centrifugation at 15,000g over 5 min. Plasma stability assay was carried out by incubating
compounds in rat plasma at a final concentration of 0.156 mM. NT(8-13), JMV438, and
JMV449 were incubated 0, 1, 2, 5, 10, 30 and 60 min, whereas JMV5206, JMV5170, and
JMV5296 were incubated for longer times (0, 1, 2, 4, 8, 16 and 24 hours) at 37°C. Then, 70
μl of a solution containing 10% Trichloroacetic acid (TCA) and 0.5% nicotinamine, as an
internal standard, was added to stop the degradation by proteases. After centrifugation at
15,000g for 30 min, supernatant was filtered through 0.22 μm filter and analyzed by
UPLC/MS for quantification, as previously described [42]. % of remaining peptide over time
was graphed into GraphPad Prism 8 and the half-life of each compound was calculated using
one-phase decay fit and represented the mean ± SEM of at least three separate experiments.

2.4 Animals, housing and habituation

Experimental procedures were approved by the Animal Care Committee of the
Université de Sherbrooke (protocol n°035-18B) and were in accordance with policies and
directives of the Canadian Council on Animal Care. Furthermore, all procedures involving
animals followed the ARRIVE recommendations [43].
Adult male Sprague-Dawley rats, weighing 200-225 g (Charles River laboratories,
St-Constant, Québec, Canada) were maintained on a 12 h light/dark cycle with free access
to food and water. Rats were housed two by transparent cage on aspen shavings in a quiet
room. Animals were acclimatized for 4 days to the animal care facility and for 3 days to the
manipulations and testing devices prior behavioral studies.

2.4.1 Behavioral studies

Behavioral experiments were always performed by the same scientist in a quiet room
between 08.00 AM and 12.00 PM to reduce variation related to the circadian rhythm.
 83

2.4.2 Intrathecal administration of compounds

Rats were lightly anesthetized with isoflurane/oxygen (Baxter corporation,
Mississauga, ON, Canada; 2 L/min) flow and 25 μl of compounds were injected intrathecally
(i.t.) with a 27 G 1/2 needle into the subarachnoid space between L5 and L6 vertebrae. All
compounds were diluted in saline at 5 mg/ml.

2.4.3 Tail-flick test

Effects of i.t. injection of NT analogs or vehicle were assessed on acute thermal
nociception using the tail-flick test (Tail-Flick Analgesia meter V2.00, Colombus
Instruments, Columbus, Ohio, USA). Tail-flick test measures sensitivity to a high-intensity
light beam focused on the tail of the rat. The tail withdrawal latency (time to curl or flick tail
out of light beam path, in s), relates to pain sensitivity. Light intensity was set at 6 and a
determined 10 s cut-off was used. On the test day, baseline latencies measures were taken
before drug injection to provide a mean baseline. Tail-flick latencies were measured at
baseline and at each 10 min for up to 40 min after drug administration. Data are expressed
as mean ± SEM for 5 – 8 rats in each compound-treated group.

2.4.4 Formalin test

The analgesic effect of JMV5296 was assessed in a tonic pain paradigm using the
formalin test. Five minutes after i.t. injection of saline or JMV5296 (60 μg/kg), rats received
a 50 μl of diluted 2% formaldehyde (i.e. 5% formalin; Bioshop, Burlington, Canada) into the
plantar surface of the right hind paw. Immediately, rats were placed in clear plastic chambers
(30 × 30 × 30 cm) positioned over a mirror angled at 45° to allow an unobstructed view of
the paws and their behaviors were observed for the next 60 min. An intra-plantar injection
of formalin produced the biphasic nocifensive response typical of this persistent pain model
[44]. The two distinct phases of spontaneous pain behaviors that occur in rodents are
proposed to reflect a direct effect of formalin on sensory receptors (acute phase, 0-9 min
post-intraplantar injection) and a longer lasting pain due to inflammation and central
sensitization (inflammatory phase, 21-60 min post-intraplantar injection).
Nociceptive behaviors were assessed using a weighted score as described previously
 84

[45, 46]. Following injection of formalin into the hind paw, nociceptive mean score was
determined for each 3 min block during 60 min by measuring the time spent in each of four
behavioral categories: 0, the injected paw is comparable to the contralateral paw; 1, the
injected paw has little, or no weight placed on it; 2, the injected paw is elevated and is not in
contact with any surface; 3, the injected paw is licked, bitten, or shaken [45]. The behaviors
believed to represent higher levels of pain intensity were given higher weighted scores. The
weighted average pain intensity score ranging from 0 to 3 was then calculated by multiplying
the time spent in each category by the category weight, summing these products, and dividing
by the total time in a given time interval. The pain score was thus calculated from the
following formula (1×T1 + 2×T2 + 3×T3)/180 where T1, T2, and T3 are the durations (in
seconds) spent in behavioral categories 1, 2, or 3, respectively, during each 180 second block.
The area under the curve (AUC) was calculated during all the duration of the test (0-60 min)
using GraphPad Prism 8. Data represent the mean ± SEM of 5 animals for each condition.

2.4.5 Chronic inflammatory pain (CFA)

Chronic inflammatory pain was induced with an intraplantar injection of 100 μl of
Complete Freund’s Adjuvant (CFA) (Calbiochem, USA) using a 25 G needle. CFA was
injected in the plantar surface of the left hind paw of rats under isoflurane anesthesia. The
injected CFA solution was supplemented with desiccated Mycobacterium butyricum
(Becton, Dickinson and company, Sparks, USA) for a final concentration of 4 mg of bacteria
membrane/ml. Saline was added to the mixture to prepare a homogenous 1:1 (w:w) emulsion.
To determine the presence of mechanical allodynia, rats were placed in enclosures
with an elevated wire mesh floor. A series of 5 von Frey hairs (2, 4, 6, 10, 15 g) was applied
alternately on both ipsilateral and contralateral hind paws at 15 s intervals to measure tactile
allodynia. The von Frey filament was directed to the plantar surface with sufficient force to
cause slight curvature of the hair [47]. A positive response was recorded when the paw was
withdrawn, or the pre-set cut-off was reached (15 g). Measurements of mechanical allodynia
were performed before injection of CFA (baseline, day 0). Then, 3 and 14 days after
induction of inflammatory pain, JMV5296 or saline were injected i.t. and the presence of
mechanical allodynia was assessed. Furthermore, percentage of anti-allodynic effect was
determined at the analgesic peak and calculated using the following equation: % Anti-
 85

allodynic effect = 100 × [(CFA) – (baseline)] / [(sham) – (baseline)]. From the latter formula,
0% represents no anti-allodynic effect of the compound, while 100% corresponds to a
complete relief of mechanical hypersensitivity. Data represent the mean ± SEM of 7 – 8
animals for each condition.

2.4.6 Core body temperature

Body temperature was measured using a thermistor probe inserted into the rectum of
adult Sprague-Dawley rats. Temperatures were recorded immediately before administration
of compounds (baseline) and each 10 min for up to 60 min following i.t. administration of
saline or NT analogs at 30 μg/kg. Changes in body temperature from baseline (Δ body temp)
were determined for each animal. Data are expressed as mean ± SEM, of at least 5 animals.

2.4.7 Blood pressure monitoring

Rats were anesthetized with a mixture of ketamine/xylazine (87 mg/kg: 13 mg/ kg,
i.m,) and placed in a supine position on a heating pad. Mean, systolic and diastolic arterial
blood pressure as well a heart rate were measured through a catheter (PE 50 filled with
heparinized saline) inserted in the right carotid artery and connected to a Micro-Med
transducer (model TDX-300, USA) linked to a blood pressure Micro-Med analyzer (model
BPA-100c). Another catheter (PE 10 filled with heparinized saline) was inserted in the left
jugular vein for injections (1 mL/kg, 5–10 sec) of saline or NT analogs at 0.01 mg/kg. Blood
pressure was recorded each 5 sec for up to 300 sec following intravenous injection. For
relative potency evaluation, changes in arterial blood pressure (Δ MABP) were determined
from the basal pressure of the rat. Data represents the mean ± SEM of 5 – 10 animals for
each condition.

2.5 Statistical analysis

All graphs and statistical analysis were performed using GraphPad Prism 8
(GraphPad software, La Jolla, CA, USA). Normality of variables was assessed for all in vivo
related results prior to the application of any other statistical tests using the Shapiro-Wilk
test (alpha, 0.05). A two-way ANOVA followed by Bonferroni’s test in multiple
comparisons was used to determine significative differences between drug- and saline-
 86

treated rats in tail-flick, body temperature, formalin, and CFA-treated rats. For AUC in tail-
flick and body temperature measurement, a one-way ANOVA followed by Dunnett’s post
hoc multiple comparisons was used to compare drugs and saline. Finally, AUC in formalin
test and percentage of % of anti-allodynic effect were analyzed using an unpaired t-test. A
difference in response between saline and NT analogs was considered significative with a p-
value < 0.05.

3. Results and discussion

3.1 Rational design of NT(8-13) peptide

Both Arg residues in positions 8 and 9 were replaced by two Lys for ease synthesis
(JMV438). It was previously demonstrated that this amino acid di-substitution had no impact
on NTS1 and NTS2 receptor binding or activation [48-50]. Therefore, the subsequent
chemical modifications of the NT(8-13) sequence were based on the JMV438 derivative.
Firstly, the chemical modifications referred in this study were focused on increasing
plasma stability at two different proteolytic cleavage sites of NT(8-13), such as Arg8-Arg9
and Pro10-Tyr11. Therefore, Arg8-Arg9 was replaced by a reduced amine bond (Ψ[CH2NH])
between Lys8-Lys 9, this N-terminal protection conferring resistance against proteolytic
degradation, with minor impact on NT receptor binding [39, 48, 49]. Pro10 was then
substituted by the silylated proline analog silaproline (Sip) [51]. This isostere unnatural
amino acid of proline introduced at position 10 protects against the second enzymatic
cleavage. We recently demonstrated that the replacement of Pro10 by Sip10 did not affect the
compound’s structure [51] or receptor binding affinity [52], however, this modification
slightly increased its resistance toward proteases [36, 52].
Secondly, the C-terminal end of NT(8-13) is constituted of lipophilic residues Ile12
and Leu13 that play an important role for the recognition and activation of NT receptors [53,
54]. It was previously reported that the substitution of Leu13 by the (L)-(Trimethylsilyl)-
Alanine (TMSAla) residue increased affinity toward both NTS1 and NTS2 receptors [55].
From the aforementioned modifications, a series of NT(8-13) analogs harboring a reduced
amine bond combined with Sip and/or TMSAla substitutions were synthetized and
 87

characterized in vitro for their binding affinities and plasma stability (Table 1). We then
assessed the influence of those chemical modifications in preclinical models of acute, tonic
and inflammatory chronic pain and their ability to induce NTS1-mediated hypotension and
hypothermia.

3.2 Site-selective modifications with unnatural amino acids generate stable and selective
NT(8-13) analogs
Binding affinities of NT(8-13) analogs were carried out on membranes prepared from
cells stably expressing either hNTS1 or hNTS2. Receptor binding affinity, selectivity, as
well as peptide half-life in plasma are summarized in Table 1. We observed that the
substitution of the N-terminal Arg doublet of NT(8-13) by Lys-Lys (JMV438) had no
significant impact on NTS1 and NTS2 binding, as it was previously reported [48-50]. The
incorporation of a reduced amine bond (Ψ[CH2NH]) between Lys8-Lys9 (JMV449) induced
a slight increase in binding affinity at both NTS1 and NTS2 receptors, thus creating a
compound with a small selectivity gain toward NTS2 of nearly 10-fold when compared to
the native NT(8-13). Moreover, the presence of the reduced bond improved the plasma
stability by a factor of 8.5 in comparison with NT(8-13). This chemical modification was
then conserved in all synthetized compounds. Substitution of Pro10 by Sip (JMV5170)
induced a loss in binding affinity at both NTS1 and NTS2 receptors, when compared to
JMV449 (~150- and ~450-fold decrease for NTS1 and NTS2, respectively). However, this
substitution greatly improved the degradation profile of JMV5170 with more than 150-fold
increase in plasma half-life (> 20 hours), compared to JMV449 (< 10 min). This was
previously observed, in a lesser extent, with JMV2009, a NT(8-13) analog bearing a Sip in
position 10 but lacking the reduced amine bond between Lys8-Lys9 . JMV2009 displayed a
slightly reduced affinity at both NTS1 and NTS2 receptor sites but an extended ex-vivo
plasma half-life when compared to the full-length NT peptide, undoubtedly mediated by a
reduced recognition by metallo-endopeptidases [36, 52]. The incorporation of a TMSAla
residue in position 13, together with the reduced amine bond at the N-terminal dibasic
residues (JMV5206) did not affect the binding affinities for NTS1 and NTS2 compared to
JMV449 but led to a moderate increase in plasma stability with a half-life of more than 2
hours. Interestingly, this combination did not influence binding affinities toward NT
 88

receptors as we would have expected when looking at its counterpart without the reduced
bond. Indeed, this later compound (namely JMV2007) showed a drastic increase in affinity
for both receptors (IC50 of 0.02 nM for hNTS1 and 0.26 nM for hNTS2), leading to a NT(8-
13) analog with one of the highest affinity described to date [55]. Finally, we combined the
incorporation of Sip10 and TMSAla13 with the reduced amine bond which leads to JMV5296.
This compound showed an increased selectivity profile toward NTS2 (> 25-fold), with an
extended resistance to protease degradation with a half-life of more than 20 hours. Even
though JMV5296 is not the most potent NT(8-13) analog reported herein, it is highly stable
with a higher selectivity toward NTS2 and may thus represent an interesting compound for
non-opioid pain management with reduced adverse effects as its affinity for NTS1 is
significantly decreased.

3.3 Central delivery of NT(8-13) analogs with a reduced amine bond reduces acute pain
We first used the tail-flick acute pain paradigm to evaluate the antinociceptive
response of NT(8-13) analogs bearing a reduced amine bond to thermal stimuli. Each analog
was injected intrathecally (i.t.) at a dose of 60 μg/kg in male Sprague-Dawley rats and the
tail withdrawal latency was evaluated over 40 min after spinal delivery (Fig. 1A). We found
that all tested NT(8-13) analogs were able to trigger an antinociceptive response in this pain
model. JMV449 displayed a transient antinociceptive response with a maximum at 10 min
after injection before returning rapidly to basal level at 20 min. Maximal antinociceptive
responses were observed after 20 min for JMV5206 and JMV5296 while it was delayed to
30 min for JMV5170. Despite the drastic loss of its binding affinities at both NT receptors,
it is interesting to note that JMV5170 is still able to increase the response latency to thermal
stimuli, in the same range as the other more potent NT(8-13) analogs.
We then calculated the area under the curve (AUC) for each analog to have a better
understanding of the antinociceptive action over time (Fig. 1B). A similar increase of AUC
was observed for JMV5170, JMV5206 and JMV5296, when compared to the saline-treated
group. Despite showing a transient increase in tail withdrawal latency, JMV449 did not
significatively increased AUC, which might reflect its short plasma half-life. Their analgesic
response to acute thermal pain is comparable to non-selective NT(8-13) analogs not bearing
a reduced bond (i.e. JMV2009 [36] and JMV2007 [55]), suggesting that in the case of
 89

multiple modifications, the addition of the reduced bond did not confer a better efficacy in
this pain paradigm. Additionally, the response of these new NT derivatives was comparable
to the one produced by i.t.-administered opioid analgesics. Indeed, based on the literature,
ED50 of morphine and hydromorphone, two clinically-relevant opiate derivatives, in the tail-
flick test are 7.4 and 78 nmol, respectively [56, 57]. At the tested dose in the present study,
we injected 20 nmol of compound to produce the same analgesic effect that these two
opioids.

3.4 JMV5296 elicits moderated hypotensive response and no hypothermia

Before further consideration in more disease-relevant pain models, we evaluated the
ability of these NT(8-13) analogs to produce hypotension and hypothermia, two known
NTS1-related physiological effects [20]. We first evaluated the hypotensive action of these
compounds after a systemic injection at a dose of 0.01 mg/kg. Arterial blood pressure was
measured after i.v. injection of NT(8-13) analogs and reported as the difference in mean
arterial blood pressure (ΔMABP) from the baseline recorded before injection (Fig. 2A). At
this dose, JMV449 and JMV5206 produced a characteristic triphasic effect on blood pressure
[58] with a sustained drop of approximately -40 to -50 mmHg. These profiles are comparable
to an i.v. injection of the NTS1-selective agonist PD149163 as well as to i.v. delivery of
NT(8-13) at a 10-time higher dose (0.1 mg/kg) (Supplementary Fig. S1) [55]. The high
potency of these NTS1 analogs JMV449 and JMV5206 at inducing drop in blood pressure
is probably related to their higher resistance to proteases. In the same condition, JMV5170
and JMV5296 elicited a smaller first drop in blood pressure with a maximum reaching of -
20 to -25 mmHg. However, after returning to the basal, no second hypotensive response was
found at this dose, they rather induced a sustained hypertensive phase, likely due to the
compensation mechanisms of the vascular system in response to the first drop, as it is
observed with NT(8-13) at the same dose (Supplementary Fig. S1). The remaining
hypotensive effect of these two compounds can be attributed to their ability to bind NTS1,
as the highly NTS2-selective ligand JMV431 fails to induce any drop of blood pressure at
the same dose or at a 10-time higher dose (Supplementary Fig. S1). Hypotension mediated
by NTS1, can be triggered after an i.v. injection of a non-selective neurotensinergic
compound but also after i.t. administration at higher doses. As previously shown by [59], an
 90

i.t. administration of at least 75 µM of NT is required to induce a change in blood pressure.

For the purpose of comparison, a dose of 60 µg/kg of NT(8-13) analog represents an i.t.
injection of less than 500 nM (for a rat weighting 300 g). Thus, when using spinal injections
of NT(8-13) analogs, blood pressure lowering should not be a problem as long as the dose is
not escalated.
We next evaluated the effect of these NT(8-13) analogs on hypothermia after i.t.
delivery at a dose of 30 µg/kg. Body temperature was measured 60 min after injection and
reported as the variation of temperature (Δ Body Temperature) from the baseline before
injection (Fig. 2B). Our results showed that JMV5170 and JMV5206 induced a significant
decrease of body temperature of -2°C, 1 h after injection. Interestingly, JMV449 and
JMV5296 had no effect on body temperature, compared to saline-treated animals. Only a
few NT(8-13) analogs acting at NTS1 were reported to discriminate between hypothermia
and analgesia, like NT27 and NT77L. Although the concept of ligand bias signaling provides
a basis to explain such ability to part between hypothermia and analgesia, it has previously
been reported that stability of NT(8-13) analogs is a key factor driving hypothermic response
[39]. Therefore, it is not surprising that JMV449, which possesses a plasma half-life of less
than 10 min did not promote hypothermia. As expected, the compounds with an extended
plasma stability, JMV5170 and JMV5206, triggered important and sustained hypothermia in
the same manner than the NTS1-selective agonist PD149163 (Supplementary Fig. S1), a
compound that also bears a reduced amine bond to improve its resistance toward proteases
[60]. In sharp contrast, JMV5296, a very stable compound failed to induce any drop of core
body temperature conceivably due to its low affinity for NTS1 and enhanced selectivity
toward NTS2. Indeed, JMV431, a NTS2-selective compound, also failed to induce
hypothermia after i.t. injection in the same conditions (Supplementary Fig. S1). Altogether,
our characterization of this NT(8-13) analog series in acute thermal pain and for adverse
effects revealed JMV5296 as a fairly NTS2-selective ligand with an extended plasma half-
life and an interesting benefits/undesired effects ratio. These results prompted us to further
characterize JMV5296 in more challenging pain paradigms.
 91

3.5 JMV5296 alleviates tonic and chronic inflammatory pain

Tonic pain induced by the injection of formalin into the rat hind paw is extensively
used to investigate the ability of novel analgesics to reduce persistent inflammatory pain.
Tonic pain models have been acknowledged to be of greater relevance to clinical pain than
acute phasic pain models [44, 61]. This model has been previously used to characterize
neurotensinergic compounds for their analgesic properties [28, 29]. Therefore, we evaluated
the effect of an i.t. injection of JMV5296 at a dose of 60 µg/kg in the formalin-induced pain
model.
The injection of formalin in the hind paw of saline-treated animals produces a
biphasic nociceptive response [62]. Although the first phase of nociceptive behaviors (acute
phase, 0 to 9 min) reflects the direct activation of peripheral nociceptors, the second phase,
observed between 21 to 60 min, results from peripheral inflammatory mediators, excitation
of spinal dorsal hon neurons and central sensitization [46, 61]. As compared to the saline-
treated rats, JMV5296 showed no significant reduction of pain behaviors during the acute
phase (Fig. 3A). However, an important and sustained analgesic effect was measured during
the inflammatory phase, reducing the nociceptive behaviors by almost 85% when compared
to the saline group (Fig. 3B). The analgesic response of JMV5296 in the formalin pain test
is comparable to the response elicited by an i.t. injection of either JMV2007 or JMV2009,
two non-selective NT agonists [36, 55]. It is interesting to note that JMV5296 did not
decreased the pain behaviors in the acute phase, which contrast with the response of
JMV2007 that completely abolished the nociceptive behaviors in the acute phase. When
compared to the highly selective NTS2 ligand JMV431, the response elicited by JMV5296
in this persistent pain paradigm is greater than the one of JMV431 at the same dose of 60
µg/kg [28], indicating that a fairly selective NTS2 agonist can be of high interest. Indeed, it
has been shown that NTS2 might not be involved during the first half of the second
inflammatory phase [63] thus, the weak affinity of JMV5296 for NTS1 seems to be required
to achieve a complete analgesic relief during the full inflammatory phase.
Finally, the analgesic potential of JMV5296 was evaluated in a chronic inflammatory
pain model induced by intraplantar injection of the Complete Freund Adjuvant (CFA),
creating an inflammatory chronic condition and the development of mechanical allodynia
[64]. We assessed the anti-allodynic efficacy of an i.t. injection of JMV5296 at a dose of 60
 92

µg/kg at days 3 and 14 after CFA injection, allowing us to evaluate the potential of JMV5296
on the early inflammatory phase (3 days post-CFA) as well as after the development of
chronic inflammatory pain (14 days post-CFA). The baseline paw withdrawal threshold
(PWT) was determined before CFA injection. PWT was also recorded on the ipsilateral paw
at days 3 and 14 post-CFA before i.t. injection of JMV5296 or saline. PWT was then
determined at 15, 30, 60, and 90 min after spinal drug administration. Development of
mechanical allodynia was comparable at days 3 and 14 post-CFA with a PWT around 4 g
(Fig. 4A, C). At days 3 and 14 post-CFA, JMV5296 induced a significant and sustained
reduction of mechanical allodynia characterized by the increase of PWT at 15- and 30-min
post-injection followed by a slow return to the basal PWT at 60 min after spinal delivery
(Fig. 4A, C). This reduction of mechanical allodynia can be better illustrated using the % of
anti-allodynic effect at the maximal analgesic time point (i.e. 15 and 30 min for day 3 or 14,
respectively). At day 3, JMV5296 produced a 52% reversal of allodynia, as compared to
59% at day 14 (Fig. 4B, D). Chronic inflammatory pain, which usually requires opioid dose
escalation, is a debilitating condition often resulting in patient non-adherence to treatment
[65]. Furthermore, this type of pain has multiple negative impacts, affecting patient’s
activities, deteriorating quality-of-life and severely increasing the apparition of comorbid
conditions, such as sleep, anxiety, and depressive disorders [66, 67]. Compared to other
chronic pain conditions like neuropathic pain, JMV5296 is as potent as other NT analogs
like JMV431 and JMV2009 and even more potent than morphine or tricyclic antidepressants
[36, 68, 69]. Thus, the strong anti-allodynic effects of JMV5296 could lead to an
improvement in the management of health and quality-of-life outcomes. We could therefore
suggest that reliable and effective pain relief in persistent and chronic inflammatory
conditions could be reached using NT(8-13) analogs, acting as JMV5296, or by combining
neurotensinergic drugs with opioid therapy, thus allowing the use of smaller doses and
limiting undesired effects. Accordingly, combination therapy using NT analogs and
morphine, or fentanyl, has already been found to be effective for pain relief and mitigating
NT- and opioid-related side effects [70, 71]. Finally, these results demonstrated that
JMV5296 induced a strong analgesic effect in both persistent and chronic inflammatory pain
paradigms and that preferring NTS2-selective NT(8-13) analogs may represent an interesting
alternative to limit the use of opioids and increase pain relief in chronic pain patients.
 93

4. Conclusion and perspectives

The present study reports the characterization of a series of NT(8-13) analogs

harboring a reduced amine bond and additional substitutions with unnatural silylated amino
acids to give rise to metabolically stable and powerful analgesic pseudopeptide compounds.
Incorporation of a reduced amine bond between Lys8-Lys9, Sip in position 10 and a TMSAla
in position 13 of NT(8-13) resulted in the generation of JMV5296. These modifications
produced a fairly NTS2-selective analog with extended resistance to proteolytic degradation
which displays antinociceptive properties in acute, tonic and chronic pain models without
inducing hypothermia. This study provides further evidence for NTS2 as a relevant target
for pain modulation, thus offering a non-opioid option for the treatment of chronic pain.
However, one of the biggest challenges remaining in the development of NT(8-13)
peptide analogs as potential analgesic drugs is the achievement of proper CNS penetration.
Indeed, JMV5296 does not possess the characteristics that are favorable for crossing the
blood-brain barrier (BBB) following systemic administration. We successfully applied a
Trojan horse strategy to bypass the BBB and increase penetration of NT peptides using
conjugation of NT with a brain-penetrant peptide ligand of LRP1 receptor (An2) [72]. Thus,
conjugating JMV5296 with An2 is a strategy under investigation to generate brain-penetrant
NTS2-selective analogs.
 94

Credit authorship contribution statement

Mélanie Vivancos: Methodology, Investigation, Formal analysis, Writing - original draft,
Vizualisation. Roberto Fanelli: Resources. Élie Besserer-Offroy: Validation, Writing -
review & editing. Martin Resua-Rojas: Investigation. Christine E. Mona: Resources.
Santo Previti: Resources. Emmanuelle Rémond: Resources. Jean-Michel Longpré:
Validation, Writing - review & editing. Florine Cavelier: Validation, review & editing,
Supervision, Funding acquisition. Philippe Sarret: Validation, Writing - review & editing,
Supervision, Funding acquisition.
Florine Cavelier and Philippe Sarret contributed equally to the supervision of this work
and are designated to handle any correspondence and material requests. All authors have
given approval to the final version of the manuscript.

Conflict of interest
The authors declare that they have no known competing financial interests or personal
relationships which have, or could be perceived to have, influenced the work reported in this
article.

Acknowledgments
The authors thank Professors É. Marsault and P. D’Orléan-Juste (Dept. Pharmacology-
Physiology, Université de Sherbrooke) for allowing them to use, the UPLC/MS instrument
for plasma stability assays and the use of Micro-Med transducer for the blood pressure
measurements, respectively.

MV was supported by a PhD scholarship from the Institut de Pharmacologie de Sherbrooke

(IPS) and Centre d′Excellence en Neurosciences de l′Université de Sherbrooke (CNS).
Funding from Montpellier University (FC for postdoctoral fellowship to RF) is also
acknowledged. ÉBO is the recipient of a Fond de recherche du Québec – Santé (FRQ-S,
255989) and a Canadian Institute of Health Research (CIHR, MFE-164740) research
fellowships. PS holds a Tier 1 Canada Research Chair in Neurophysiopharmacology of
Chronic Pain and is a member of the FRQ-S-funded Québec Pain Research Network.
 95

Funding sources
This research was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research
[grant number FDN-148413].

References

[1] D.S. Goldberg, S.J. McGee, Pain as a global public health priority, BMC Public Health
11 (2011) 770.
[2] I. Kissin, The development of new analgesics over the past 50 years: a lack of real
breakthrough drugs, Anesth Analg 110(3) (2010) 780-9.
[3] O.A. de Leon-Casasola, Opioids for chronic pain: new evidence, new strategies, safe
prescribing., Am J Med, 2013, pp. S3-11.
[4] T. Gomes, M.M. Mamdani, J.M. Paterson, I.A. Dhalla, D.N. Juurlink, Trends in high-
dose opioid prescribing in Canada, Can Fam Physician 60(9) (2014) 826-32.
[5] T. Munzing, Physician Guide to Appropriate Opioid Prescribing for Noncancer Pain,
Perm J 21 (2017) 16-169.
[6] E. Besserer-Offroy, P. Sarret, Sending out Biased Signals: an Appropriate Proposition
for Pain?, Douleur et Analgésie 32(2) (2019) 108-110.
[7] M.J. Perez de Vega, A. Ferrer-Montiel, R. Gonzalez-Muniz, Recent progress in non-
opioid analgesic peptides, Arch Biochem Biophys 660 (2018) 36-52.
[8] K. Fosgerau, T. Hoffmann, Peptide therapeutics: current status and future directions,
Drug Discov Today 20(1) (2015) 122-8.
[9] A.A. Kaspar, J.M. Reichert, Future directions for peptide therapeutics development, Drug
Discov Today 18(17-18) (2013) 807-17.
[10] P. McGonigle, Peptide therapeutics for CNS indications., Biochem Pharmacol, 2012,
pp. 559-566.
[11] P. Sarret, Cavelier, F., Neurotensin and its Receptors, in: ELSEVIER (Ed.),
Neurosciences and biobehavioral psychology2018.
[12] R. Carraway, S.E. Leeman, The isolation of a new hypotensive peptide, neurotensin,
from bovine hypothalami, J Biol Chem 248(19) (1973) 6854-61.
 96

[13] J.P. Vincent, J. Mazella, P. Kitabgi, Neurotensin and neurotensin receptors, Trends
Pharmacol Sci 20(7) (1999) 302-9.
[14] O.E. Osadchii, Emerging role of neurotensin in regulation of the cardiovascular system,
Eur J Pharmacol 762 (2015) 184-92.
[15] F. Rioux, R. Quirion, S. St-Pierre, D. Regoli, F.B. Jolicoeur, F. Belanger, A. Barbeau,
The hypotensive effect of centrally administered neurotensin in rats, Eur J Pharmacol 69(3)
(1981) 241-7.
[16] M. Izaguirre, V. Catalan, G. Fruhbeck, Elucidating the Role of Peripheral Neurotensin
in Appetite Control, Endocrinology 157(9) (2016) 3391-3.
[17] D. Zhao, C. Pothoulakis, Effects of NT on gastrointestinal motility and secretion, and
role in intestinal inflammation, Peptides 27(10) (2006) 2434-44.
[18] T. Ollmann, L. Peczely, K. Laszlo, A. Kovacs, R. Galosi, E. Berente, Z. Karadi, L.
Lenard, Positive reinforcing effect of neurotensin microinjection into the ventral pallidum in
conditioned place preference test, Behav Brain Res 278 (2015) 470-5.
[19] I.C. Hou, C. Suzuki, N. Kanegawa, A. Oda, A. Yamada, M. Yoshikawa, D. Yamada,
M. Sekiguchi, E. Wada, K. Wada, K. Ohinata, beta-Lactotensin derived from bovine beta-
lactoglobulin exhibits anxiolytic-like activity as an agonist for neurotensin NTS(2) receptor
via activation of dopamine D(1) receptor in mice, J Neurochem 119(4) (2011) 785-90.
[20] M. Boules, Z. Li, K. Smith, P. Fredrickson, E. Richelson, Diverse roles of neurotensin
agonists in the central nervous system, Front Endocrinol (Lausanne) 4 (2013) 36.
[21] F. St-Gelais, C. Jomphe, L.E. Trudeau, The role of neurotensin in central nervous system
pathophysiology: what is the evidence?, J Psychiatry Neurosci 31(4) (2006) 229-45.
[22] L. Ferraro, S. Beggiato, D.O. Borroto-Escuela, L. Ravani, W.T. O'Connor, M.C.
Tomasini, A.C. Borelli, L.F. Agnati, T. Antonelli, S. Tanganelli, K. Fuxe, Neurotensin
NTS1-dopamine D2 receptor-receptor interactions in putative receptor heteromers:
relevance for Parkinson's disease and schizophrenia, Curr Protein Pept Sci 15(7) (2014) 681-
90.
[23] G. Bissette, C.B. Nemeroff, P.T. Loosen, A.J. Prange, Jr., M.A. Lipton, Hypothermia
and intolerance to cold induced by intracisternal administration of the hypothalamic peptide
neurotensin, Nature 262(5569) (1976) 607-9.
 97

[24] Y.P. Feng, J. Wang, Y.L. Dong, Y.Y. Wang, Y.Q. Li, The roles of neurotensin and its
analogues in pain, Curr Pharm Des 21(7) (2015) 840-8.
[25] P.R. Dobner, Neurotensin and pain modulation, Peptides 27(10) (2006) 2405-14.
[26] P. Kleczkowska, A.W. Lipkowski, Neurotensin and neurotensin receptors:
characteristic, structure-activity relationship and pain modulation--a review, Eur J
Pharmacol 716(1-3) (2013) 54-60.
[27] P. Sarret, L. Gendron, P. Kilian, H.M. Nguyen, N. Gallo-Payet, M.D. Payet, A. Beaudet,
Pharmacology and functional properties of NTS2 neurotensin receptors in cerebellar granule
cells, J Biol Chem 277(39) (2002) 36233-43.
[28] G. Roussy, M.-A. Dansereau, S. Baudisson, F. Ezzoubaa, K. Belleville, N. Beaudet, J.
Martinez, E. Richelson, P. Sarret, Evidence for a role of NTS2 receptors in the modulation
of tonic pain sensitivity., Mol Pain, 2009, p. 38.
[29] G. Roussy, M.-A. Dansereau, L. Doré-Savard, K. Belleville, N. Beaudet, E. Richelson,
P. Sarret, Spinal NTS1 receptors regulate nociceptive signaling in a rat formalin tonic pain
model., J Neurochem, 2008, pp. 1100-1114.
[30] B.V. Clineschmidt, J.C. McGuffin, Neurotensin administered intracisternally inhibits
responsiveness of mice to noxious stimuli, European Journal of Pharmacology 46(4) (1977)
395-396.
[31] C. Granier, J. van Rietschoten, P. Kitabgi, C. Poustis, P. Freychet, Synthesis and
characterization of neurotensin analogues for structure/activity relationship studies. Acetyl-
neurotensin-(8--13) is the shortest analogue with full binding and pharmacological activities,
Eur J Biochem 124(1) (1982) 117-24.
[32] E. Besserer-Offroy, R.L. Brouillette, S. Lavenus, U. Froehlich, A. Brumwell, A. Murza,
J.M. Longpre, E. Marsault, M. Grandbois, P. Sarret, R. Leduc, The signaling signature of the
neurotensin type 1 receptor with endogenous ligands, Eur J Pharmacol (2017).
[33] D. Feifel, J. Goldenberg, G. Melendez, P.D. Shilling, The acute and subchronic effects
of a brain-penetrating, neurotensin-1 receptor agonist on feeding, body weight and
temperature, Neuropharmacology 58(1) (2010) 195-8.
[34] P. Sarret, M.J. Esdaile, A. Perron, J. Martinez, T. Stroh, A. Beaudet, Potent spinal
analgesia elicited through stimulation of NTS2 neurotensin receptors, J Neurosci 25(36)
(2005) 8188-96.
 98

[35] A.V. Buhler, H.K. Proudfit, G.F. Gebhart, Neurotensin-produced antinociception in the
rostral ventromedial medulla is partially mediated by spinal cord norepinephrine, Pain 135(3)
(2008) 280-90.
[36] P. Tétreault, É. Besserer-Offroy, R.L. Brouillette, A. René, A. Murza, R. Fanelli, K.
Kirby, A.J. Parent, I. Dubuc, N. Beaudet, J. Côté, J.-M. Longpré, J. Martinez, F. Cavelier, P.
Sarret, Pain relief devoid of opioid side effects following central action of a silylated
neurotensin analog, European Journal of Pharmacology (2020).
[37] M. Sousbie, M. Vivancos, R.L. Brouillette, E. Besserer-Offroy, J.M. Longpre, R. Leduc,
P. Sarret, E. Marsault, Structural Optimization and Characterization of Potent Analgesic
Macrocyclic Analogues of Neurotensin (8-13), J Med Chem 61(16) (2018) 7103-7115.
[38] A. Remaury, N. Vita, S. Gendreau, M. Jung, M. Arnone, M. Poncelet, J.M. Culouscou,
G. Le Fur, P. Soubrie, D. Caput, D. Shire, M. Kopf, P. Ferrara, Targeted inactivation of the
neurotensin type 1 receptor reveals its role in body temperature control and feeding behavior
but not in analgesia, Brain Res 953(1-2) (2002) 63-72.
[39] S. Previti, M. Vivancos, E. Rémond, S. Beaulieu, J.-M. Longpré, S. Ballet, P. Sarret, F.
Cavelier, Insightful Backbone Modifications Preventing Proteolytic Degradation of
Neurotensin Analogs Improve NTS1-Induced Protective Hypothermia, Frontiers in
Chemistry 8 (2020).
[40] M. Sousbie, E. Besserer-Offroy, R.L. Brouillette, J.M. Longpre, R. Leduc, P. Sarret, E.
Marsault, In Search of the Optimal Macrocyclization Site for Neurotensin, ACS Med Chem
Lett 9(3) (2018) 227-232.
[41] Y. Cheng, W.H. Prusoff, Relationship between the inhibition constant (K1) and the
concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction,
Biochem Pharmacol 22(23) (1973) 3099-108.
[42] D. Hapău, E. Rémond, R. Fanelli, M. Vivancos, A. René, J. Côté, É. Besserer-Offroy,
J.-M. Longpré, J. Martinez, V. Zaharia, P. Sarret, F. Cavelier, Stereoselective Synthesis of
β-(5-Arylthiazolyl) α-Amino Acids and Use in Neurotensin Analogues, European Journal of
Organic Chemistry 2016(5) (2016) 1017-1024.
[43] C. Kilkenny, W. Browne, I.C. Cuthill, M. Emerson, D.G. Altman, N.C.R.R.G.W.
Group, Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines, Br J
Pharmacol 160(7) (2010) 1577-9.
 99

[44] A. Tjolsen, O.G. Berge, S. Hunskaar, J.H. Rosland, K. Hole, The formalin test: an
evaluation of the method, Pain 51(1) (1992) 5-17.
[45] D. Dubuisson, S.G. Dennis, The formalin test: a quantitative study of the analgesic
effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats, Pain 4(2) (1977)
161-74.
[46] T.J. Coderre, M.E. Fundytus, J.E. McKenna, S. Dalal, R. Melzack, The formalin test: a
validation of the weighted-scores method of behavioural pain rating, Pain 54(1) (1993) 43-
50.
[47] S.R. Chaplan, F.W. Bach, J.W. Pogrel, J.M. Chung, T.L. Yaksh, Quantitative
assessment of tactile allodynia in the rat paw, J Neurosci Methods 53(1) (1994) 55-63.
[48] S. Doulut, M. Rodriguez, D. Lugrin, F. Vecchini, P. Kitabgi, A. Aumelas, J. Martinez,
Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin, Pept Res 5(1) (1992) 30-8.
[49] D. Lugrin, F. Vecchini, S. Doulut, M. Rodriguez, J. Martinez, P. Kitabgi, Reduced
peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin: binding and biological activities, and
in vitro metabolic stability, Eur J Pharmacol 205(2) (1991) 191-8.
[50] E. Eiselt, S. Gonzalez, C. Martin, M. Chartier, C. Betti, J.M. Longpre, F. Cavelier, D.
Tourwe, L. Gendron, S. Ballet, P. Sarret, Neurotensin Analogues Containing Cyclic
Surrogates of Tyrosine at Position 11 Improve NTS2 Selectivity Leading to Analgesia
without Hypotension and Hypothermia, ACS Chem Neurosci 10(11) (2019) 4535-4544.
[51] F. Cavelier, B. Vivet, J. Martinez, A. Aubry, C. Didierjean, A. Vicherat, M. Marraud,
Influence of silaproline on peptide conformation and bioactivity, J Am Chem Soc 124(12)
(2002) 2917-23.
[52] É. Besserer-Offroy, P. Tétreault, R.L. Brouillette, A. René, A. Murza, R. Fanelli, K.
Kirby, A.J. Parent, I. Dubuc, N. Beaudet, J. Côté, J.-M. Longpré, J. Martinez, F. Cavelier, P.
Sarret, Data set describing the in vitro biological activity of JMV2009, a novel silylated
neurotensin(8-13) analog, Data in Brief (2020).
[53] P. Kitabgi, C. Poustis, C. Granier, J. Van Rietschoten, J. Rivier, J.L. Morgat, P.
Freychet, Neurotensin binding to extraneural and neural receptors: comparison with
biological activity and structure--activity relationships, Mol Pharmacol 18(1) (1980) 11-9.
 100

[54] R. Fanelli, N. Floquet, E. Besserer-Offroy, B. Delort, M. Vivancos, J.M. Longpre, P.

Renault, J. Martinez, P. Sarret, F. Cavelier, Use of Molecular Modeling to Design Selective
NTS2 Neurotensin Analogues, J Med Chem 60(8) (2017) 3303-3313.
[55] R. Fanelli, E. Besserer-Offroy, A. Rene, J. Cote, P. Tetreault, J. Collerette-Tremblay,
J.M. Longpre, R. Leduc, J. Martinez, P. Sarret, F. Cavelier, Synthesis and Characterization
in Vitro and in Vivo of (l)-(Trimethylsilyl)alanine Containing Neurotensin Analogues, J Med
Chem 58(19) (2015) 7785-95.
[56] K. Jhamandas, B. Milne, M. Sutak, C. Gouarderes, J.M. Zajac, H.Y. Yang, Facilitation
of spinal morphine analgesia in normal and morphine tolerant animals by neuropeptide SF
and related peptides, Peptides 27(5) (2006) 953-63.
[57] G.A. Tejwani, A.K. Rattan, The role of spinal opioid receptors in antinociceptive effects
produced by intrathecal administration of hydromorphone and buprenorphine in the rat,
Anesth Analg 94(6) (2002) 1542-6.
[58] W.E. Fantegrossi, M.C. Ko, J.H. Woods, E. Richelson, Antinociceptive, hypothermic,
hypotensive, and reinforcing effects of a novel neurotensin receptor agonist, NT69L, in
rhesus monkeys, Pharmacol Biochem Behav 80(2) (2005) 341-9.
[59] B. Zogovic, P.M. Pilowsky, Intrathecal neurotensin is hypotensive, sympathoinhibitory
and enhances the baroreflex in anaesthetized rat, Br J Pharmacol 166(1) (2012) 378-89.
[60] D.J. Wustrow, M.D. Davis, H.C. Akunne, A.E. Corbin, J.N. Wiley, L.D. Wise, T.G.
Heffner, Reduced amide bond neurotensin 8–13 mimetics with potent in vivo activity,
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 5(9) (1995) 997-1002.
[61] J. Sawynok, X.J. Liu, The Formalin Test: Characteristics and Usefulness of the Model,
Reviews in Analgesia 7(2) (2003) 145-163.
[62] H. Wheeler-Aceto, F. Porreca, A. Cowan, The rat paw formalin test: comparison of
noxious agents, Pain 40(2) (1990) 229-238.
[63] C.A. Porro, M. Cavazzuti, Spatial and temporal aspects of spinal cord and brainstem
activation in the formalin pain model, Progress in Neurobiology 41(5) (1993) 565-607.
[64] P. Tétreault, M.-A. Dansereau, L. Doré-Savard, N. Beaudet, P. Sarret, Weight bearing
evaluation in inflammatory, neuropathic and cancer chronic pain in freely moving rats.,
Physiol. Behav., 2011, pp. 495-502.
 101

[65] R. Benyamin, A.M. Trescot, S. Datta, R. Buenaventura, R. Adlaka, N. Sehgal, S.E.

Glaser, R. Vallejo, Opioid Complications and Side Effects, Pain Physician 11(2) (2008)
S105-S120.
[66] J. Devulder, U. Richarz, S.H. Nataraja, Impact of long-term use of opioids on quality of
life in patients with chronic, non-malignant pain., Curr Med Res Opin, 2005, pp. 1555-1568.
[67] A.J. Parent, N. Beaudet, H. Beaudry, J. Bergeron, P. Berube, G. Drolet, P. Sarret, L.
Gendron, Increased anxiety-like behaviors in rats experiencing chronic inflammatory pain,
Behav Brain Res 229(1) (2012) 160-7.
[68] P. Tetreault, N. Beaudet, A. Perron, K. Belleville, A. Rene, F. Cavelier, J. Martinez, T.
Stroh, A.M. Jacobi, S.D. Rose, M.A. Behlke, P. Sarret, Spinal NTS2 receptor activation
reverses signs of neuropathic pain, FASEB J 27(9) (2013) 3741-52.
[69] K. Angeby-Moller, O.G. Berge, F.P. Hamers, Using the CatWalk method to assess
weight-bearing and pain behaviour in walking rats with ankle joint monoarthritis induced by
carrageenan: effects of morphine and rofecoxib, J Neurosci Methods 174(1) (2008) 1-9.
[70] E. Eiselt, J. Cote, J.M. Longpre, V. Blais, P. Sarret, L. Gendron, The combination of
opioid and neurotensin receptor agonists improves their analgesic/adverse effect ratio, Eur J
Pharmacol 848 (2019) 80-87.
[71] P. Kleczkowska, P. Kosson, S. Ballet, I. Van Den Eynde, Y. Tsuda, D. Tourwé, A.W.
Lipkowski, PK20, a new opioid-neurotensin hybrid peptide that exhibits central and
peripheral antinociceptive effects., Mol Pain, 2010, p. 86.
[72] M. Demeule, N. Beaudet, A. Regina, E. Besserer-Offroy, A. Murza, P. Tetreault, K.
Belleville, C. Che, A. Larocque, C. Thiot, R. Beliveau, J.M. Longpre, E. Marsault, R. Leduc,
J.E. Lachowicz, S.L. Gonias, J.P. Castaigne, P. Sarret, Conjugation of a brain-penetrant
peptide with neurotensin provides antinociceptive properties, J Clin Invest 124(3) (2014)
1199-213.
 102

Table

Table 1. Binding affinities and plasma stability of NT(8-13) analogs. Bold indicates
synthetic changes from native peptide NT(8-13). Data are expressed as mean ± SEM [39].
Binding (nM)
NTS1/NTS2
Compound Sequence Ki ± SEM Plasma half-life
Selectivity
hNTS1 hNTS2

NT(8-13) H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 1.65 ± 0.06 2.29 ± 0.16 0.72 0.98 ± 0.08 min

JMV438 H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 4.00 ± 0.35 1.12 ± 0.23 3.57 1.57 ± 0.27 min

JMV449 H-LysΨ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 2.02 ± 0.80 0.29 ± 0.08 6.96 8.37 ± 2.02 min

JMV5170 H-LysΨ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH 296 ± 51 133 ± 33 2.23 22.1 ± 1.9 h

JMV5206 H-LysΨ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-TMSAla-OH 2.45 ± 0.17 0.54 ± 0.11 4.53 2.13 ± 0.19 h

JMV5296 H-LysΨ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH 610 ± 31 23.7 ± 4.6 25.4 20.6 ± 4.15 h

 103

Figure Legends

Fig. 1. Antinociceptive action of NT(8-13) analogs with a reduced amine bond in acute
thermal pain model. (A) Time-dependent antinociceptive effect of NT analogs (60 µg/kg)
on tail-flick latencies in rats. Baseline latencies were taken three times before acute i.t.
injection. Latencies were determined every 10 min for up to 40 min following drug
administration. *** P < 0.001 (vs. Saline) in a two-way ANOVA followed by Bonferroni’s
post hoc test. (B) Area under the curve (a.u., arbitrary units) determined for the entire
duration of the tail-flick test (40 min) for each analog * P < 0.05 and *** P < 0.001 (vs.
Saline) in a one-way ANOVA followed by Dunnett’s post hoc test for multiple comparisons.
Each data point represents the mean ± S.E.M. n = 5-8 rats per group.

Fig. 2. Effects of NT analogs on NTS1-mediated adverse effects. (A) Effect of NT analogs

on mean arterial blood pressure (ΔMABP) recorded on anesthetized rats after i.v. injection
at a dose of 0.01 mg/kg. Each data point represents the mean ± S.E.M. n = 5-8 rats per group.
(B) Hypothermia (ΔBody Temperature) induced by acute i.t. injection of saline or NT
analogs (60 µg/kg). Baseline body temperature assessment was performed before i.t.
injection. *** P < 0.001 (vs. Saline) in a one-way ANOVA followed by a Dunnett’s post hoc
test. Datapoints represent mean ± S.E.M. of determinations made in 5-8 rats.

Fig. 3. Effects of central administration of JMV5296 on tonic persistent pain. (A)

Reduction of the nocifensive behaviors after i.t. injection of JMV5296 (60 µg/kg) in the
formalin-induced tonic pain model. * P < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 (vs. Saline) in a
two-way ANOVA followed by a Bonferroni’s post hoc test. (B). Cumulative nociceptive
response expressed as AUC was measured during the total duration of the formalin test (0 –
60 min). *** P < 0.001 (vs. Saline) in an unpaired t-test. Each symbol represents the mean
± S.E.M. of determinations made in 5 rats.

Fig. 4. Effects of JMV5296 on mechanical allodynia provoked by CFA injection.

(A, C) Paw withdrawal thresholds were assessed with a manual von Frey hair at day 3 (A)
and day 14 (C) after CFA injection. Baseline (BL) withdrawal thresholds were determined
 104

for all rats prior to CFA injection. Acute i.t. injection of JMV5296 (60 µg/kg) at day 3 and
day 14, post-CFA effectively reduces the mechanical hypersensitivity. ** P < 0.01; *** P <
0.001 (vs. Saline) in a two-way ANOVA followed by a Bonferroni’s post hoc test. (B, D)
Percentage of anti-allodynia calculated at 15 min post-injection of JMV5296 at day 3 (B)
and at 30 min post-injection of JMV5296 at day 14 (D). JMV5296 was effective to attenuate
the development of mechanical allodynia. * P < 0.05; *** P < 0.001 (vs. Saline) in an
unpaired t-test. Each datapoint represents mean ± SEM of 7-8 animals per group.
 105

Figures

Fig. 1.

Fig. 2.
 106

Fig. 3.

Fig. 4.
 107

Graphical abstract
 108

Supporting information

Supplementary Fig. S1. Effects of NT(8-13) and reference compounds PD149163 and
JMV431 on blood pressure and body temperature. (A) Effect of NT(8-13), PD149163
and JMV431 on mean arterial blood pressure (ΔMABP) recorded on anesthetized rats after
i.v. injection at a dose of 0.1 or 0.01 mg/kg. Each data point represents the mean ± S.E.M. n
= 5-8 rats per group. (B) Hypothermia (ΔBody Temperature) induced by acute i.t. injection
of saline, PD149163, or JMV431 (60 µg/kg). Assessment of the baseline body temperature
was performed before i.t. injection. *** P < 0.001 (vs. Saline) in a one-way ANOVA
followed by a Dunnett’s post hoc test. Datapoints represent mean ± S.E.M. of determinations
made in 6-8 rats.
 109

Article 3
Insightful backbone modifications preventing proteolytic degradation of
neurotensin analogues improve NTS1-induced protective hypothermia

Auteurs de l’article : Santo Previti1,3,#, Mélanie Vivancos2,# , Emmanuelle Rémond1,

Sabrina Beaulieu2 , Jean-Michel Longpré2 , Steven Ballet3 , Philippe Sarret2* , Florine
Cavelier1*

1
Institut des Biomolécules Max Mousseron, IBMM, UMR-5247, CNRS, Université de
Montpellier, ENSCM, Place Eugène Bataillon, 34095 Montpellier cedex 5, France.

2
Department of Pharmacology-Physiology, Faculty of Medicine and Health Sciences,
Institut de Pharmacologie de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, J1H 5N4,
Québec, Canada.

3
Research Group of Organic Chemistry, Departments of Bioengineering Sciences and
Chemistry, Vrije Universiteit Brussel, Pleinlaan 2, Brussels 1050, Belgium.

#
Equal contribution

Statut de l’article : Publié dans Frontiers in Chemistry le 05 Juin 2020.

Frontiers in Chemistry. 2020 June 05 ; 8:406.
doi: 10.3389/fchem.2020.00406

Avant-propos : Cette publication est issue d’une collaboration avec l’équipe du Pr Cavelier
Florine (France) et du Pr Ballet Steven (Belgique). Les deux équipes ont développé et
synthétisé tous les analogues neurotensinergiques qui sont présentés dans la publication.
Pour ma part, j’ai été en charge de caractériser in vitro (affinité sur les récepteurs hNTS1 et
hNTS2, stabilité plasmatique) et in vivo (test de température corporelle) ces différents
composés. J’ai également contribué à la rédaction du papier et à la réalisation de toutes les
figures du papier à partir de mes résultats. J’évalue ma contribution pour cet article à plus de
60%.
 110

Résumé :
L’hypothermie thérapeutique représente une stratégie intéressante pour protéger le cerveau
lors de situation d’urgence, par exemple lors d’accident vasculaire cérébral ou de blessure
traumatique. Les effets physiologiques de la neurotensine (NT) sont médiés par l’activation
de deux récepteurs couplés aux protéines G, NTS1 et NTS2. Lors d’une injection au niveau
du système nerveux central, la NT provoque une importante baisse de la température
corporelle. De plus en plus d’études montrent que l’effet hypothermiant de la NT est médié
par l’activation des récepteurs NTS1. En effet, l’injection d’analogues NTS1-sélectifs de la
NT(8-13) provoque une hypothermie de 2 à 5°C et exerce des effets neuroprotecteurs. La
NT(8-13) est métaboliquement instable dans le plasma (demi-vie < 2 minutes). Cette
instabilité représente une véritable limite pour être utilisée en clinique. Durant cette étude,
nous avons synthétisé différents analogues basés sur la séquence de la NT(8-13). Ensuite,
nous avons évalué l’effet de ces différentes modifications, en présence ou non d’une liaison
réduite entre les deux lysines8-9, sur la stabilité plasmatique et l’hypothermie. Pour augmenter
la stabilité plasmatique des composés, nous avons également substitué certains acides aminés
de la NT(8-13) par des acides aminés non naturels tels que Sip10, D-Trp11, Dmt11, Tle12 et
TMSAla13. Nos résultats de stabilité plasmatique ont révélé que la combinaison de ces
différentes modifications a permis d’obtenir un composé très stable et résistant à la
dégradation plasmatique (demi-vie > 24 heures ; 16). De plus, les analogues présentant une
liaison réduite combinée à un TMSAla13 (4), Sip10 (6), Lys11 et TMSAla13 (12), D-Trp11 et
TMSAla13 (14), Dmt11-Tle12 (16) ont des effets hypothermiants soutenus (-3°C à 1 heure
post-injection). À travers ces résultats, nous avons observé que les effets hypothermiants des
composés étaient principalement reliés à leur stabilité plasmatique plutôt qu’à leur affinité
pour NTS1. En conclusion, ces résultats montrent l'importance d’avoir une liaison amine
réduite8-9 pour optimiser la stabilité plasmatique de la NT(8-13). De plus, l’hypothermie
induite par les agonistes NTS1-sélectifs stables pourrait être utilisée pour induire un effet
neuroprotecteur dans certaines conditions pathologiques.
 111

Insightful backbone modifications preventing proteolytic degradation of

neurotensin analogues improve NTS1-induced protective hypothermia

Santo Previti1,3,#, Mélanie Vivancos2,# , Emmanuelle Rémond1, Sabrina Beaulieu2 , Jean-

Michel Longpré2 , Steven Ballet3 , Philippe Sarret2* , Florine Cavelier1*

1
Institut des Biomolécules Max Mousseron, IBMM, UMR-5247, CNRS, Université de
Montpellier, ENSCM, Place Eugène Bataillon, 34095 Montpellier cedex 5, France.

2
Department of Pharmacology-Physiology, Faculty of Medicine and Health Sciences,
Institut de Pharmacologie de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, J1H 5N4,
Québec, Canada.

3
Research Group of Organic Chemistry, Departments of Bioengineering Sciences and
Chemistry, Vrije Universiteit Brussel, Pleinlaan 2, Brussels 1050, Belgium.

#
Equal contribution

*
Co-corresponding Authors:

Florine Cavelier, Ph.D. Philippe Sarret, Ph.D.

Institut des Biomolécules Max Mousseron Department of Pharmacology -Physiology
IBMM, UMR-5247, CNRS Faculty of Medicine and Health Sciences
Université Montpellier, ENSCM Université de Sherbrooke
Place Eugène Bataillon 3001, 12th Avenue North
34095 Montpellier Cedex 5 Sherbrooke, Québec, J1H 5N4
France Canada
Tel: (+33) 467143765 Tel: (819) 821-8000, Ext: 72554
Email: florine.cavelier@umontpellier.fr Email: Philippe.Sarret@USherbrooke.ca
 112

Abstract

Therapeutic hypothermia represents a brain-protective strategy for multiple emergency

situations, such as stroke or traumatic injury. Neurotensin (NT), which exerts its effects
through activation of two G protein-coupled receptors, namely NTS1 and NTS2 induces a
strong and long-lasting decrease in core body temperature after its central administration.
Growing evidence demonstrates that NTS1 is the receptor subtype mediating the
hypothermic action of NT. As such, potent NTS1 agonists designed on the basis of the
minimal C-terminal NT(8-13) bioactive fragment have been shown to produce mild
hypothermia and exert neuroprotective effects under various clinically relevant conditions.
The high susceptibility of NT(8-13) to protease degradation (half-life < 2 min) represents,
however, a serious limitation for its use in pharmacological therapy. In light of this, we report
here a structure-activity relationship study in which pairs of NT(8-13) analogues have been
developed, based on the incorporation of a reduced Lys8-Lys9 bond. To further stabilize the
peptide bonds, a panel of backbone modifications was also inserted along the peptide
sequence, including Sip10, D-Trp11, Dmt11, Tle12 and TMSAla13. Our results revealed that the
combination of appropriate chemical modifications leads to compounds exhibiting improved
resistance to proteolytic cleavages (> 24 hours; 16). Among them, the NT(8-13) analogues
harboring the reduced amine bond combined with the unnatural amino acids TMSAla13 (4),
Sip10 (6) or the di-substitution Lys11 - TMSAla13 (12), D-Trp11 - TMSAla13 (14) and Dmt11 -
Tle12 (16) produced sustained hypothermic effects (-3°C for at least 1 hour). Importantly, we
observed that hypothermia was mainly driven by the increased stability of the NT(8-13)
derivatives, instead of the high binding affinity at NTS1. Altogether, these result reveal the
importance of the reduced amine bond in optimizing the metabolic properties of the NT(8-
13) peptide and support the development of stable NTS1 agonists as first drug-candidate in
neuroprotective hypothermia.

Keywords: NTS1, reduced peptide bonds, unnatural amino acids, proteolytic stability,
hypothermia.
 113

Introduction

Mild hypothermia (32°C-35°C) has been proven to exert neuroprotective effects in a variety
of neurological conditions, such as global ischemia after cardiac arrest, hypoxic-ischemic
encephalopathy, ischemic stroke and traumatic injury (Huber et al., 2019). Indeed,
therapeutic cooling has been described to counteract many of the deleterious processes
occurring in the setting of cerebral ischemia, including neuroinflammation, free radical
production, excitotoxicity, apoptosis as well as blood-brain barrier disruption (Sun et al.,
2019). To date, hypothermia is achieved by internal or external cooling interventions (Chen
et al., 2014). However, these physical methods have serious limitations, which includes slow
onset of action, undesirable shivering and vasoconstriction responses, need for general
anesthesia and poor ability to implement in an out-of-hospital environment (Sun et al., 2019).
There is therefore a growing interest to develop drugs that safely reduce the body temperature
by controlling the hypothalamic set point (Kurisu et al., 2019).
Neurotensin (NT) is an endogenous tridecapeptide (pGlu–Leu–Tyr–Glu–Asn–Lys–Pro–
Arg–Arg–Pro–Tyr–Ile–Leu–OH) first isolated in 1973 from the bovine hypothalamus
(Carraway and Leeman, 1973) that acts as an active neuromodulator/neurotransmitter within
the central nervous system (Boules et al., 2013). Among the first NT-induced effects to be
reported, was its ability to produce a marked and sustained hypothermia after intracisternal
or intracerebroventricular injection in a variety of mammals, including rat, mouse and
monkey (Bissette et al., 1976; Fantegrossi et al., 2005; Nemeroff et al., 1977). Accordingly,
intracerebral injection of NT in regions known to be involved in thermoregulatory
homeostasis and rich in NT innervation, such as the anterior hypothalamus and medial
preoptic area, produces a dose-dependent decrease in body temperature (Bissette et al., 1982;
Kalivas et al., 1985; Martin et al., 1980). In addition to its role in the neural control of
thermoregulation, central delivery of NT and derivatives also displays potent analgesia and
antipsychotic-like effects (Dobner, 2006; Feng et al., 2015; St-Gelais et al., 2006).
Brain NT exerts its effects through binding and activation of three different receptors: NTS1
and NTS2, both belonging to the class A G protein-coupled receptor (GPCR) family, and
NTS3, a sortilin-like receptor, characterized by a single transmembrane domain (Sarret and
Cavelier, 2018; Vincent et al., 1999). There is now compelling evidence to support that NTS1
 114

is the receptor responsible for the hypothermic effects of NT agonists. Indeed, highly potent
NTS1 agonists, such as the NT69L, PD149163 and NT-2 Eisai peptides produce a long-
lasting hypothermia following peripheral administration (Feifel et al., 2010; Katz et al., 2001;
Tyler-McMahon et al., 2000). In addition, in vivo blockade of NTS1 receptor expression,
using antisense strategies or mice lacking NTS1, provides direct evidence for the relationship
between hypothermia and NTS1 binding (Mechanic et al., 2009; Pettibone et al., 2002;
Remaury et al., 2002; Tyler-McMahon et al., 2000). Likewise, the use of NTS2-selective
analogues, such as JMV431 or NT79 and inactivation of NTS2 further confirm the main role
played by NTS1 in brain and body temperature control (Boules et al., 2010; Dubuc et al.,
1999). More recently, a series of studies has highlighted the benefit of achieving regulated
reduction of body temperature using NTS1 agonists in different clinically relevant situations.
For instance, systemic administration of NT69L, PD149163 or HPI-201 (formally ABS-201)
produced mild hypothermia and exerted neuroprotective effects after ischemic stroke,
intracerebral hemorrhage, resuscitation from cardiac arrest and traumatic brain injury (Choi
et al., 2012; Gu et al., 2015; Katz et al., 2001; Lee et al., 2016a; 2016b; Wei et al., 2013; Xue
et al., 2017; Zhao et al., 2020; Zhong et al., 2020).
Following NT’s isolation, multiple structure-activity relationship (SAR) studies have
enabled the identification of the C-terminal peptide fragment H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-
OH (i.e., NT(8-13)), as the minimum sequence for producing NT activity (Granier et al.,
1982; St-Pierre et al., 1981; Uhl et al., 1977). Of note, the positive charges at Arg8 and Arg9
as well as the side chain length at position 9 are important for retaining adequate NTS1
binding affinity (Cusack et al., 1995; Hadden et al., 2005). The main drawback in the use of
NT(8-13) as a drug is its extremely short biological half-life (< 2 min) due to rapid in vivo
proteolysis by several peptidases (Chart 1). After intravenous infusion, NT(8-13) is indeed
degraded by a combination of three metalloendopeptidases referred to as EC 3.4.24.11 (also
known as nephrilysin), EC 3.4.24.15 (thimetoligopeptidase) and EC 3.4.24.16 (neurolysin)
that show cleaving activity at the Arg8-Arg9, Pro10-Tyr11 and Tyr11-Ile12 positions (Checler et
al., 1984; Checler et al., 1985; Checler et al., 1986). In the last two decades, many efforts
were dedicated to increase NT’s half-life, without affecting the biological activity (Sarret, et
al., 2018). Among the strategies used, modifications such as reduced peptide bonds, N-
terminal methylation and acetylation, cyclization, modifications to the peptide backbone and
 115

incorporation of unnatural amino acids represent the classical approaches used by

medicinal/peptide chemists to improve the peptide biostability (Adessi and Soto, 2002;
Werner et al., 2016).
In view of designing proteolytically stable NT(8-13) analogues, we decided here to
synthesize a series of 8 specific pairs of NT(8-13) derivatives, divided in two groups based
on the incorporation of a reduced Lys8-Lys9 pseudopeptide bond. Additional backbone
modifications were also introduced at Pro10, Tyr11, Ile12 and Leu13 (Chart 2). We then studied
how these chemical substitutions influenced the peptide plasma stability, NTS1/NTS2
binding affinity as well as their ability to induce changes in body temperature.

Chart 1: Minimum sequence of NT required for the biological activity and its enzymatic
degradation sites.
 116

Chart 2: Unnatural amino acids and backbone modifications inserted into the NT(8-13)
analogues.
 117

Materials and Methods

Chemistry
All data regarding chemistry section are reported in the Supporting Information. Please note
that among the NT(8-13) analogues described here, some of them were already described in
previous publications, as indicated in the appropriate section (see Table S1).

Biology
Competitive Radioligand binding Assay
CHO-K1 cells stably expressing hNTS1 (ES-690-C from PerkinElmer) or 1321N1 cells
stably expressing hNTS2 (ES-691-C from PerkinElmer) were cultured respectively in
DMEM/F12 or DMEM. Culture media were supplemented with 10% FBS, 100 U/mL
penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 20 mM HEPES and 0.4 mg/mL G418, and cells were
incubated at 37°C in a humidified chamber at 5% CO2. All media and additives are from
Wisent (St-Bruno, QC). Competitive radioligand binding experiments were performed by
incubating 50 μg of freshly prepared cell membranes, expressing either hNTS1 or hNTS2,
125
with 50 pM (for hNTS1) or 280 pM (for hNTS2) I-Tyr3-NT (2200 Ci/mmol, from
PerkinElmer, Billerica, MA). Increasing concentrations diluted in binding buffer (50 mM
Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 % BSA) and ranging from 10–11 or 10-10 to 10–5 or 10-4 M of NT
analogues were added. After one hour of incubation at room temperature, the binding
reaction mixture was transferred in polyethylenimine-coated 96 well filter plates (Millipore,
Billerica, MA). Reaction was terminated by filtration and plates were washed three times
with 200 μl of ice-cold binding buffer. Glass-fiber filters were then counted in a γ-counter
(1470 Wizard2, PerkinElmer). Non-specific binding was measured in the presence of 10–5
M unlabeled NT(8–13) and represented less than 5 % of total binding. IC50 values were
determined from the competition curves as the unlabeled ligand concentration inhibiting half
125
of the I-Tyr3-NT-specific binding. Data were plotted using GraphPad Prism 8 using the
One-site – Fit log (IC50) and represent the mean ± SEM of at least three separate experiments
performed in triplicate.
IC50 calculated from the competitive radioligand binding assays were then transformed into
Ki using the Cheng−Prusoff equation (Cheng and Prusoff, 1973):
 118

IC50
Ki:
[L]
( 1 + Kd )

where L refers to the concentration of radiolabeled tracer (125I-[Tyr3]- NT) and Kd refers to
the equilibrium dissociation constant of the radioligand. For NTS1, Kd : 0.7 nM whereas for
NTS2, Kd : 3.4 nM.

Plasma stability
Rat plasma was obtained from blood by keeping the translucent phase after centrifugation at
15 000 g over 5 min. Plasma stability assay was carried out by incubating each compound at
different incubation times in rat plasma at a final concentration of 0.156 mM. NT(8-13) and
compounds without reduced amine bounds were incubated during short incubation times (0,
1, 2, 5, 10 and 30 minutes) whereas all analogues with reduced amine bounds, except
compound 2, were tested during longer incubation times (0, 1, 2, 4, 8, 16, and 24 hours) at
37°C. Then, 70 μl of a solution containing 10% trichloroacetic acid (TCA) and 0.5%
nicotinamine, an internal standard, was added to stop the degradation by proteases. After
centrifugation at 15 000 g for 30 min, supernatant was filtered through 0.22 μm filter and
analyzed by UPLC/MS (Water H Class Acquity UPLC, mounted with Acquity UPLC BEH
C18 column, 1.7 μm, 2.1 x 50 mm and paired to a SQ Detector 2). Compounds 1, 2 and 5
were analyzed using the mass or UV spectrum. Quantification was done by determining the
area under the curve (AUC) ratio of each compound over AUC of nicotinamine for each
incubation time. Data were plotted into GraphPad Prism 8 and the half-life of each compound
was calculated using one-phase decay fit and represented the mean ± SEM of minimum three
separate experiments.

Animals, housing and habituation

The experimental procedures in this study were approved by the Animal Care Committee of
the Université de Sherbrooke (protocol n°035-18B) and were in accordance with policies
and directives of the Canadian Council on Animal Care. Adult male Sprague-Dawley rats,
weighing 175-225 grams (Charles River laboratories, St-Constant, Québec, Canada) were
maintained on a 12h light/dark cycle with free access to food and water and were housed two
per cage on Aspen shavings in a quiet room.
 119

Intrathecal injection
Rats were lightly anesthetized with isoflurane/oxygen (Baxter corporation, Mississauga, ON,
Canada; 2 L/min) flow and 25 μl of each compound were injected intrathecally with a 27G1/2
needle (BD PrecisionGlide, USA) into the subarachnoid space between vertebrae L5 and L6.
Analogues 1 to 14 were diluted in physiological saline at 5 mg/ml, whereas compounds 15
and 16 were diluted in DMSO. For body temperature measurement, injected solution of these
both compounds contained 6% DMSO at final concentration (30 μg/kg).

Body Temperature measurement

Three consecutive days prior to testing, animals were individually acclimatized to
manipulations and to a thermistor probe 5 minutes per day. The day of the test, experiments
were always performed in a quiet room and between 08.00 AM and 12.00 PM to reduce any
variation related to the circadian rhythm. Body temperature was measured using a thermistor
probe inserted into the rectum of adult Sprague-Dawley rats. Temperatures were recorded
immediately before (baseline) and each 10 min for up to 60 min following intrathecal
administration of saline, vehicle (6% DMSO) or NT analogues at 30 μg/kg. Changes in body
temperature (Δ body temp) from baseline were determined for each animal. Data are
expressed as mean ± SEM of 5 to 20 animals per condition.

Statistical Analysis
Data are expressed as mean ± standard errors of the mean (SEM). All graphs and statistical
analysis were performed using GraphPad Prism 8 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA).
A two-way ANOVA followed by Bonferroni’s multiple comparisons test was used to
determine significant differences between drug- and vehicle-treated rats at different
timepoints post-injection.
 120

Results

Design of the NT(8-13) analogues

A series of 8 specific pairs of NT(8-13) analogues was synthesized with the main objective
to develop novel metabolically stable and potent NT(8-13) compounds (Table 1). Since a
double Arg8-Arg9 substitution with Lys8-Lys9 is well-tolerated in terms of binding, this
modification in positions 8-9 was preserved in all analogues (Granier et al., 1982; St-Pierre
et al., 1981; Uhl et al., 1977). In addition, it has been previously shown that the incorporation
of a reduced Lys8-Lys9 pseudopeptide bond in NT(8-13) analogues provides resistance to
exonuclease cleavage with no significant influence on their biological activities (Fanelli et
al., 2017; Lugrin et al., 1991). Thus, a second subset of NT(8-13) analogues encompassing
a reduced amine bond between these two basic residues was prepared (Table 1). Introduction
of reduced bonds is a well-known backbone modification, which induces a conformational
change in the peptide, increases the flexibility in the peptide chain and also adds a positive
charge into the backbone (Calbo et al., 1999; Coy et al., 1988). To further reduce the possible
cleavage at the Pro10-Tyr11 and Tyr11-Ile12 scissile amine bonds, several residues were
additionally substituted in the NT(8-13) sequence by unnatural amino acids based on
previous findings. For example, compounds 3 (H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-TMSAla-OH) and 5
(H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH) carrying the silylated amino acids trimethylsilylalanine
(TMSAla) and silaproline (Sip), respectively, showed an improved Ki value against NTS1
and a slightly improved plasma stability compared to NT(8-13) (Fanelli et al., 2015). For
these reasons, the corresponding analogues bearing the reduced Lys-Lys pseudopeptide bond
were synthesized, namely analogues 4 (H-LysΨ[CH2NH]-Lys-Pro-Tyr-Ile-TMSAla-OH)
and 6 (H-LysΨ[CH2NH]-Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH). Additionally, we synthesized the
NT(8-13) derivatives 7 (H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH) and 8 (H-LysΨ[CH2NH]Lys-
Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH), in which both silylated amino acids were inserted.
Previous studies have also revealed that substitution of the Tyr11 residue could provide a
handle controlling NT receptor subtype selectivity (Boules, et al., 2010; Dubuc, et al., 1999;
Einsiedel et al., 2011; Fanelli, et al., 2017; Held et al., 2013). Accordingly, compound 9 (H-
Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH), previously reported in (Einsiedel et al., 2011; Fanelli et al.,
2017; Magafa et al., 2019; Richelson et al., 2008) showed a significant selectivity in favor
 121

to NTS2 (NTS2/NTS1 ratio : 25). The corresponding analogue 10 (H-LysΨ[CH2NH]Lys-

Pro-Lys-Ile-Leu-OH) bearing the reduced Lys-Lys bond was now synthesized. In analogy
with the first series of analogues, the high lipophilic TMSAla residue was introduced at the
C-terminal end to replace the hydrophobic character of Leu13, giving rise to compounds 11
(H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH) and 12 (H-LysΨ[CH2NH]Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-
OH).
The importance of the tyrosine residue at position 11 was further investigated by replacing
Tyr11 by D-Trp11, which strongly increases the peptide’s half-life as well as the selectivity
towards NTS2 when compared to the native sequence (Jolicoeur et al., 1984; Richard et al.,
2001). This substitution was combined with the incorporation of TMSAla at position 13 to
afford compounds 13 (H-Lys-Lys-Pro-D-Trp-Ile-TMSAla-OH) and 14 (H-
Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-D-Trp-Ile-TMSAla-OH). Finally, we evaluated the plasma stability
and ability to regulate body temperature for 15 and 16, which carry the unnatural amino acids
2’,6’-di-methyl-tyrosine (Dmt) and tert-leucine (Tle) in positions 11 and 12, respectively
(15: H-Lys-Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH, 16: H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH)
(Eiselt et al., 2019).
 122

Table 1: Chemical structures of NT analogues. On the left, hexapeptides carrying the

standard amide bond between Lys8 and Lys9. On the right, analogues bearing the reduced
Lys8-Lys9 pseudopeptide bond.

1 H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH
3 H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile- TMSAla-OH
5 H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH
7 H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH
9 H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH
11 H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH
13 H-Lys-Lys-Pro-(D)Trp-Ile-TMSAla-OH
15 H-Lys-Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH
2 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH
4 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-TMSAla-OH
6 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH
8 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH
10 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH
12 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH
14 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-(D)Trp-Ile-TMSAla-OH
16 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH

Peptide synthesis
The synthesis of all NT(8-13) analogues are detailed in the Supporting Information. Please
note that the synthesis of some of these NT(8-13) derivatives have already been published
elsewhere: compounds 1, 9, 11 in (Fanelli et al., 2017; Lugrin et al., 1991); compound 2 in
(Fanelli, et al., 2017; Lugrin, et al., 1991); compounds 3 and 5 in (Doulut et al., 1992; Fanelli
et al., 2015; René et al., 2013; Vivet et al., 2000) and compounds 15 and 16 in (Eiselt et al.,
2019; Fanelli et al., 2015). Briefly, the designed hexapeptides were synthesized in solution
starting from Boc-Leu-OMe commercially available, or Boc-TMSAla-OMe, which was
previously described following the standard Boc strategy (Fanelli, et al., 2015). Boc-Sip-OH
and Boc-Lys(Boc)Ψ[CH2NH]Lys(Boc)-OH were synthesized, as previously reported
(Doulut et al., 1992; Fanelli et al., 2015; René et al., 2013; Vivet et al., 2000).
 123

Biological properties

Impact of the peptide backbone modifications on receptor binding affinity

We first investigated the effects of adding a reduced Lys8-Lys9 pseudopeptide bond in
combination with the substitution of Pro10, Tyr11, Ile12 and Leu13 by natural (Lys) or unnatural
amino acids (Sip, TMSAla, D-Trp11, Dmt, Tle) on binding affinities for NTS1 and NTS2
receptors. To this aim, we determined the ability of these NT(8-13) derivatives to inhibit the
binding of 125I-[Tyr3]-NT to membranes prepared from cells stably expressing either hNTS1
or hNTS2 receptors. The results are summarized in Table 2 and Figure 1. As indicated in
Table 2, the radioligand binding studies on some NT(8-13) analogues, already reported in
previous studies (Fanelli, et al., 2017; Lugrin, et al., 1991) Fanelli et al., 2015; (Fanelli, et
al., 2017; Lugrin, et al., 1991) (Eiselt, et al., 2019), were repeated in a same set of
experiments for comparison purposes.
As previously observed (Fanelli, et al., 2017; Granier, et al., 1982; Held, et al., 2013; Lugrin,
et al., 1991; St-Pierre, et al., 1981; Uhl, et al., 1977), arginine-to-lysine substitutions at
positions 8 and 9 (compound 1) or the insertion of the reduced amine bond between those
two residues (2) had no major impact on NTS1/NTS2 receptor binding. As already reported
(Doulut, et al., 1992; Fanelli, et al., 2015; René, et al., 2013; Vivet, et al., 2000), insertion of
the TMSAla residue in position 13 (3) was well tolerated by both receptors, with significantly
improved affinity at NTS1 (Ki : 0.018 nM), when compared to either 1 or to the native NT(8-
13) peptide (220 and 80-fold increase, respectively). However, the combination of the
reduced amine bond with the TMSAla residue (4) induced an important loss of affinity at the
NTS1 site, as compared to 3 (140-fold decrease).
Replacement of proline in position 10 by the unnatural amino acid surrogate silaproline (5)
confers similar conformational properties to the NT(8-13) peptide. However, the presence of
a dimethylsilyl group exerts protective effect against enzymatic degradation (Cavelier et al.,
2002; Fanelli, et al., 2015). Compared to its NT(8-13) counterpart (i.e. 1), incorporation of
Sip10 (5) decreased the affinity to both NT receptors, as previously published (Doulut, et al.,
1992; Fanelli, et al., 2015; René, et al., 2013; Vivet, et al., 2000). Introduction of the
hydrolytically stable CH2NH bond (6) was also found to substantially amplify the reduction
in binding affinities compared to NT(8-13), with a 200- and almost 50-fold decrease in NTS1
 124

and NTS2 binding, respectively (Table 2). In contrast, the combination of Sip with TMSAla
at positions 10 and 13 (7) seems to have a stronger influence on NTS1 binding (35-fold
decrease compared to NT(8-13)), with only a 6-fold reduction in the binding profile to NTS2.
Addition of the reduced amine bond to this double substitution to produce analogue 8 seems
to be detrimental for NTS1, with a 400-fold decrease in affinity and no apparent change in
the binding to NTS2.
We and others have previously demonstrated that Tyr11 is a critical position for NTS1/NTS2
affinity and selectivity (Einsiedel, et al., 2011; Fanelli, et al., 2017; Magafa, et al., 2019;
Richelson, et al., 2008). As, expected, insertion of Lys at position 11 (9) resulted in an
important loss of affinity on NTS1 and NTS2, of more than 5000-fold and 110-fold,
respectively, compared to NT(8-13). The incorporation of the reduced amine bond (10) had
a relatively low impact on NTS1 binding affinity (Ki : 6600 nM). However, compared to 9,
combining the reduced bond at position 8-9 with a positively charged amino acid resulted in
a substantial improvement of affinity for NTS2 (Ki : 26 nM). Therefore, this combination of
modifications significantly enhanced the selectivity towards NTS2 (> 250-fold) (Table 2).
Incorporation of TMSAla at position 13 in presence of Lys11 (11) further increased the
affinity towards both NTS1 (10-fold) and NTS2 (4-fold), compared to 9. Likewise, the
addition of the reduced Lys8-Lys9 bond, leading to compound 12 was found to be beneficial
for NTS1 (4-fold) and NTS2 (50-fold) binding affinities, compared to 11. These binding data
are in accordance with previous findings (Fanelli, et al., 2017; Lugrin, et al., 1991).
Tyr11 was also replaced by two different non-natural amino acids, such as D-Trp and the
tyrosine analogue Dmt. Interestingly, the presence of a D-Trp in combination with a
TMSAla13 (13) caused a dramatic loss in affinity for NTS1 (200 000-fold), when compared
to 3, but maintained a relatively good binding affinity to NTS2 (Ki : 8.5 nM). Then, the
presence of the reduced amine bond combined with D-Trp11 and TMSAla13 (14) favored the
binding to NTS1 by 65-fold without modifying binding at NTS2 (Table 2). Finally, as shown
previously (Eiselt, et al., 2019; Fanelli, et al., 2017; Lugrin, et al., 1991), NT(8-13) analogues
harboring a Tyr mimic at position 11 (i.e. Dmt11) and a Tle residue at position 12, coupled
or not to a CH2NH reduced amine bond (15 and 16) showed lower binding affinity at NTS1
with no significant influence on NTS2 binding.
 125

Table 2: Binding affinities towards the hNTS1 and hNTS2 receptors, plasma stability and
body temperature of NT(8-13) and its derivatives. Data are expressed ± SEM.

Plasma Hypothermia
Binding, Ki (nM) NTS1/NTS2
Name Sequence stability (30 μg/kg ; i.t.)
Selectivity
hNTS1 hNTS2 (Half-life) △Temp (°C)
NT(8-13) H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 1.5 ± 0.03 2.7 ± 0.2 0.6 1.0 ± 0.1 min 0.26 ± 0.3
(a)
1 H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 4.0 ± 0.4 1.1 ± 0.2 3.6 1.6 ± 0.3 min 0.27 ±0.2
(b)
2 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 2.0 ± 0.8 0.31 ± 0.08 6 8.4 ± 2.0 min -0.36 ± 0.3
(c)
3 H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile- TMSAla-OH 0.018 ± 0.004 0.25 ± 0.07 0.1 1.6 ± 0.3 min -0.07 ± 0.1
4 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-TMSAla-OH 2.5 ± 0.2 0.55 ± 0.1 4.5 2.0 ± 0.2 h -2.0 ± 0.10 ****
(c)
5 H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH 14 ± 11 21 ± 4 0.7 4.5 ± 0.8 min -0.07 ± 0.2
6 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH 300 ± 50 130 ± 30 2.3 22 ± 2 h -2.2 ± 0.3 ****

7 H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH 55 ± 5 16 ± 4 3.4 3.5 ± 0.1 min -0.30 ± 0.6

8 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH 610 ± 30 24 ± 5 25 20 ± 4 h -0.22 ± 0.2

9 (a)
H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH 7 600 ± 1 000 310 ± 100 25 2.9 ± 0.2 min 0.32 ± 0.2
10 H- Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH 6 600 ± 2 000 26 ± 15 254 5.0 ± 0.2 h 0.28 ± 0.2

11 (a)
H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH 710 ± 100 76 ± 20 9.3 2.8 ± 0.1 min 0.04 ± 0.2
12 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH 150 ± 60 1.5 ± 0.7 100 10 ± 1 h -0.41 ± 0.2 *

13 H-Lys-Lys-Pro-(D)Trp-Ile-TMSAla -OH 3 600 ± 600 8.5 ± 2 423 10 ± 2 min 0.40 ± 0.2

14 H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-(D)Trp-Ile-TMSAla-OH 55 ± 3 3.5 ± 0.6 16 19 ± 0.3 h -1.8 ± 0.2 ****
(d)
15 H-Lys-Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH 57 ± 6 2.4 ± 1 24 4.6 ± 0.6 min 0.14 ± 0.2
16(d) H-Lysψ(CH2NH)Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH 110 ± 2) 1.4 ± 0.5 79 > 24 h -2.0 ± 0.3 ***

Please note that synthesis and binding data of some of these NT(8-13) analogues have already been reported elsewhere: (a) compounds 1, 9, 11
in (Fanelli, et al., 2017; Lugrin, et al., 1991); (b) compound 2 in (Fanelli, et al., 2017; Lugrin, et al., 1991); (c) compounds 3 and 5 in (Doulut, et
al., 1992; Fanelli, et al., 2015; René, et al., 2013; Vivet, et al., 2000) and (d) compounds 15 and 16 in (Eiselt, et al., 2019; Fanelli, et al., 2015).
For NT(8-13) and 3, the plasma stability were also reported in (Doulut, et al., 1992; Fanelli, et al., 2015; René, et al., 2013; Vivet, et al., 2000).
 126

125
Figure 1: Displacement curves of I-[Tyr3]-NT by a series of NT(8-13) analogues at the
NTS1 (A) and NTS2 (B) binding sites. Data are expressed ± SEM of at least three separate
experiments. For compounds 3, 5, 15 and 16, Ki values were taken from the literature
(Fanelli, et al., 2015); (Eiselt, et al., 2019).
 127

Influence of the different proteolytic cleavage sites of NT(8-13) on plasma stability

One of the major hurdles to the use of peptides as drug candidates is their poor metabolic
stability in vivo. As such, NT(8-13) activity is hampered by its extremely short half-life (< 2
min) due to its rapid degradation in vivo by several endopeptidases (Fanelli, et al., 2015).
Enzymatic degradation of NT(8-13) occurs at three cleavage sites: Arg8-Arg9, Pro10-Tyr11
and Tyr11-Ile12 (Chart 1) (Checler, et al., 1984; Checler, et al., 1985; Checler, et al., 1986).
Here, we used different chemical strategies to stabilize the backbone of NT(8-13) in the
proximity of the three cleavage sites. The stability was determined by incubating these NT(8-
13) analogues for 24h in rat plasma at 37°C (Figure 2). The half-lives of these compounds
are summarized in Table 2.
In accordance with the literature (Doulut, et al., 1992; Fanelli, et al., 2015; René, et al., 2013;
Vivet, et al., 2000), we observed that NT(8-13) is rapidly degraded in plasma with a half-life
of 1 ± 0.1 min. As predicted, arginine-to-lysine substitutions at positions 8 and 9 (1) did not
improve the metabolic stability. Protection of the peptide bond between the two N-terminal
basic residues was found to slightly improve the half-life of 2 (T1/2: 8.4 ± 2.0 min). These
results support previous findings demonstrating that the NT(9-13) fragment is the first
metabolite of NT(8-13) (Held, et al., 2013). Compound 3 modified at its C-terminal by
incorporation of a TMSAla residue in position 13 exhibited similar stability than 1 (T1/2: 1.6
± 0.3 min), as previously observed (Doulut, et al., 1992; Fanelli, et al., 2015; René, et al.,
2013; Vivet, et al., 2000). However, the combination of TMSAla13 with the reduced amine
bond at Lys8-Lys9 (4) significantly inhibited the proteolytic degradation (T1/2: 2.0 ± 0.2 h),
thus indicating that TMSAla13 may limit the cleavage of the peptide bonds on the C-terminal
side.
We next investigated the effects of incorporating non-natural amino acids at the two other
cleavage sites, Pro10-Tyr11 and Tyr11-Ile12 on the peptide stability in plasma. To this end,
Pro10, Tyr11 and Ile12 were respectively substituted by Sip, D-Trp or Dmt, and Tle. We first
observed that the presence of Sip (5) alone or in combination with TMSAla13 (7) did not
produce a protective effect on the peptide (T1/2 ≃ 4 min). Likewise, the di-substitution of D-
Trp11 with TMSAla13 (13) and the presence of a Dmt-Tle in position 11-12 (15) did not
generate NT(8-13) analogues exhibiting higher resistance to proteases (< 10 min). The
replacement of Tyr11 by Lys11 in presence (11) or not (9) of TMSAla13 was also ineffective
 128

in producing stable NT(8-13) derivatives (T1/2 ≃ 3 min). Interestingly, the combination of

the reduced amine bond with either Sip10 (6) or Lys11 (10) led to a significant improvement
in proteolytic stability (T1/2 : 22 h and 5 h, respectively). Accordingly, addition of the reduced
amine bond to the double substitution Sip10 and TMSAla13 (8), Lys11 and TMSAla13 (12), D-
Trp11 and TMSAla13 (14) or Dmt11 and Tle12 (16) further increased the peptide stability, with
half-lives exceeding 20 hours.
 129

Figure 2: Plasma stability of novel derivatives of NT(8-13). Compounds without reduced

Lys8-Lys9 pseudopeptide bond were tested for short incubation times (A) while NT(8-13)
analogues carrying reduced amine bonds were evaluated during longer time periods (B).
Determination of the percentage (%) of compounds at different incubation times in rat
plasma. Half-life was calculated for each chemically modified peptide. Error bars represent
mean ± SEM of at least three separate experiments for each compound.
 130

Effect of the peptide backbone modifications on NTS1-mediated hypothermia

There is now growing evidence demonstrating that NT and its derivatives induce persistent
hypothermia through activation of the NTS1 receptor subtype (Liu et al., 2016). The abilities
of each NT(8-13) analog to reduce body temperature were then assessed every 10 min for up
to 1 hour following central administration. All compounds shown in Figure 3 were injected
intrathecally (i.t.) at 30 μg/kg and the change in body temperature reported in Table 2.
Spinal delivery of the chemically-modified NT(8-13) analogues exhibiting high-affinity for
NTS1 but poor plasma stability (i.e. 1, 2, 3, 5, 7 and 15) were not effective in reducing the
body temperature, compared to the saline-treated group. A fortiori, compounds 9, 11 and 13
having low affinity for NTS1 and high susceptibility to protease degradation did not induce
hypothermia. In sharp contrast, the highly stable compounds 4, 14 and 16 showing good
affinity for NTS1 induced strong and persistent hypothermia, with a temperature drop of
more than 2°C, up to 60 min. Interestingly, 6 and 12 showing high resistance to protease
degradation but lower affinity at NTS1 were still able to produce a slight decrease in core
body temperature. Finally, the highly stable compounds 8 and 10 presenting high affinity
and selectivity for NTS2 did not cause drop in body temperature, thus reinforcing the main
role played by NTS1 in NT-induced hypothermia. Altogether, these results highlighted the
importance of these backbone modifications in NTS1-mediating body temperature control.
 131

Figure 3: Physiological effects of NT(8-13) analogues on body temperature. Change in body

temperature (Δ Body temp) was calculated at 10 min intervals over 1h following their
intrathecal injection at 30 μg/kg. For each specific pair, compounds with (dotted line) or
without (solid line) reduced amide bounds were represented on the same graph (n: 5 to 20
 132

rats per group). Error bars represent mean ± SEM. A two-way ANOVA followed by
Bonferroni’s multiple comparisons test was performed. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p <
0.001; **** p < 0.0001; as compared to vehicle-injected rats.

Discussion

The extremely short half-life of NT represents a serious limitation for its potential use in
pharmacological therapy. Therefore, the development of NT(8-13) analogues showing
increased resistance to enzymatic cleavages of peptide bonds, while improving their
biological activity in vivo is of great importance. In this work, we present a panel of novel
linear NT hexapeptides in which several backbone modifications, including D-amino acid or
unnatural amino acid substitutions and incorporation of reduced peptide bonds were
combined to stabilize the peptide bonds and increase their metabolic stability. To this aim,
we synthesized a series of 8 specific pairs of NT(8-13) analogues harboring or not a reduced
Lys8-Lys9 pseudopeptide bond and evaluated the effects of these chemical modifications on
receptor binding, peptide stability and in vivo efficacy. As illustrated in Figure 4, our results
demonstrated that NTS1-mediating hypothermia is mainly driven by the increased stability
of the NT(8-13) derivatives, instead of the high binding affinity at NTS1.
 133

Figure 4: Three-dimensional (3D) data representation. Binding on NTS1, plasma stability

and hypothermia represent the three coordinates of each compound. For hypothermia, results
were presented as area under the curve (AUC). Compounds carrying the reduced Lys8-Lys9
bond are in red whereas non-reduced analogues are shown in black. The stable NT(8-13)
analogues exhibiting a good affinity for NTS1 and inducing hypothermia are surrounded by
a blue circle. The orange circle includes compounds with a good affinity for hNTS1 and short
plasma half-life that do not affect body temperature. Compounds with a low affinity toward
hNTS1 exerting no hypothermic action are represented with the green circle.

In terms of binding, we first found that the reduced pseudopeptide bond inserted at position
8-9 (2) was well tolerated. This is consistent with previous findings showing that NT(8-13)
derivatives bearing a CH2NH bond at position 8-9 retained the receptor binding and full
biological activity whereas the pseudopeptide analogues with reduced bonds at positions 10-
11, 11-12 or 12-13 exhibited a marked decrease in binding affinity, in the range of two to
 134

four orders of magnitude (Lugrin, et al., 1991; Wustrow et al., 1995). The importance of N-
terminal positively charged amino acids for proper NTS1 binding is also in good agreement
with the crystal structure of the NTS1-NT(8-13) complex in its activated-like conformation
(Krumm et al., 2016; White et al., 2012). There is indeed charge complementarity between
the electronegative rim of the wide open binding pocket on the extracellular surface of NTS1
and the positive-charged arginine side chains of NT(8-13). Substitution of Leu13 by the
unnatural silicon-containing and hydrophobic amino acid, TMSAla also improved the
binding affinity at both NTS1 and NTS2 (3), giving rise to a NTS1 analogue with one of the
highest affinities described to date (Ki ≃ 20 pM) (Fanelli, et al., 2015). Accordingly, the C-
terminal end of NT(8-13) establishes hydrophobic contact with the concave NTS1 binding
pocket and the negatively charged carboxylate of Leu13 located in an electropositive
environment is predicted to form a salt bridge with Arg327 of NTS1 (Krumm, et al., 2016;
White, et al., 2012). Alanine scan strategy, consisting to replace each amino acid of NT(8-
13) with alanine, further supports the functional importance of the isopropyl group of Leu13
in receptor binding (Henry et al., 1993). The proline at position 10, playing a crucial role for
peptide conformation was also replaced by the silylated proline surrogate (Sip), which
displays very similar conformational properties that the proline residue (Rémond et al. 2016;
Rémond et al., 2017). The substitution of the g-carbon by a dimethylsilyl group was found
to slightly decrease the binding affinity of 5 at both NT receptors. The tight oriented
hydrophobic binding site for the pyrrolidine ring of Pro10 as well as the extensive van der
Waals interactions with the residue Trp339 in ECL3 of NTS1 might in part explain this loss
in receptor binding (White, et al., 2012). Importantly, we also found that the NT(8-13)
analogues harboring a CH2NH bond at position 8-9 combined to TMSAla13 (4), Sip10 (6), or
to both silylated amino acids (8) exhibited low binding at NTS1 while the NTS2 was less
affected by these chemical modifications. This is also true for compound 7 carrying the
double substitution Sip10 with TMSAla13.
Additional backbone modifications were also introduced at the Tyr11-Ile12 peptide bond.
Substitution of Tyr11 by the lysine residue (9, 10) was found to be detrimental for NT(8-13)
binding at NTS1, thus leading to a substantial selectivity towards NTS2 (> 250-fold).
Accordingly, we recently demonstrated using molecular dynamics simulations that the Tyr11
residue of NT(8-13) is facing a basic residue (Arg212) located in the ECL2 of NTS1 or an
 135

acid residue (Glu179) at the same position in NTS2 (Fanelli, et al., 2017). As a result, Lys11
of NT(8-13) is only able to form the expected salt bridge with Glu179 in the NTS2 receptor.
As predicted, TMSAla addition to 9 and 10 (i.e. 11 and 12, respectively) led to a substantial
improvement in binding affinity at both NTS1 and NTS2. The importance of the tyrosine
residue in position 11 was further investigated by replacing Tyr11 by D-Trp11. We found that
the incorporation of a bulky aromatic D-isomer combined to TMSAla13 (13) caused a
dramatic loss of binding affinity at NTS1, when compared to 3 (200 000-fold) and
subsequent NTS2 selectivity (> 420-fold). This result is consistent with recent findings
indicating that Tyr11 is a key residue for determining receptor selectivity, extension of the
aromaticity and changes in side chain orientation favoring selectivity towards the NTS2
receptor (Boules, et al., 2010; Dubuc, et al., 1999; Einsiedel, et al., 2011; Eiselt, et al., 2019;
Fanelli, et al., 2017; Held, et al., 2013; Richard, et al., 2001). Strikingly, addition of the
reduced Lys-Lys bond to 13 greatly restored the binding affinity at NTS1 (14). Despite the
fact that peptides containing less than 20 amino acid residues lack significant secondary
structure, they can adopt specific bioactive conformations to interact with the biological
target. In this context, we might hypothesize that the multiple modifications introduced into
the NT(8-13) peptide can dramatically modify the peptide structure and thereby alter its
ability to bind to NTS1. Finally, NT(8-13) analogues harboring Dmt11-Tle12, coupled or not
to a CH2NH reduced amine bond (15, 16) showed lower binding affinity at NTS1 than NTS2,
as expected by the importance of position 11 in receptor subtype selectivity. Altogether, these
results demonstrated that NTS2 is more permissive than NTS1 to peptide backbone
substitutions. Similarly, with a few exceptions, analogues bearing the reduced moiety
showed better affinity at NTS2 when compared to the corresponding non-reduced analogues.
These findings are well-supported by the high-resolution crystal structure of NTS1, which
reveals that the overall shape of the NTS1 ligand-binding pocket is narrower than that
observed in other peptide receptors (White, et al., 2012).
In the present study, we further evaluated different strategies for improving proteolytic
resistance of NT(8-13) peptide analogues. We found that only the combination of appropriate
chemical modifications led to the development of metabolically stable analogues. Indeed,
compounds harboring only the reduced Lys-Lys bond (2) or a single amino substitution (3,
5, 9) exhibited extremely short half-life (< 10 min). Likewise, the di-substituted compounds
 136

Sip10 - TMSAla13 (7), Lys11 - TMSAla13 (11), D-Trp11 - TMSAla13 (13) and Dmt11 - Tle12 (15)
generated to limit the enzymatic cleavages of the Pro10-Tyr11 and Tyr11-Ile12 bond sites were
not stable in rat plasma (< 10 min), leaving the N-terminus accessible to the
metalloendopeptidase (i.e. EC 3.4.24.15) and aminopeptidases (Checler, et al., 1984;
Checler, et al., 1985; Checler, et al., 1986; Orwig et al., 2009). Interestingly, our results
revealed that the combination of the reduced Lys-Lys bond with Sip10 (6), Lys11 (10) or
TMSAla13 (4) resulted in significant improvement of the peptide plasma stability (half-lives
ranging from 2 to 22 hours). This is quite surprising since all of these NT(8-13) derivatives
are still supposed to be cleavable by the endopeptidases EC 3.4.24.11 and EC 3.4.24.16 at
the Pro10-Tyr11 or Tyr11-Ile12 positions (Checler, et al., 1984; Checler, et al., 1985; Checler,
et al., 1986). This increased metabolic stability might be explained by the fact that the
chemical modifications introduced in the NT(8-13) peptide can reshape the peptide structure
in a conformation not suitable for its recognition by peptidases. This hypothesis is supported
by previous findings showing that some chemical modifications quite distant from the
susceptible site can dramatically affect the cleavage efficiency by peptidases. For instance,
the growth hormone releasing factor ((GRF(1-29)-NH2) can be protected against its
proteolytic hydrolysis in plasma by the dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) between positions
2 and 3 by chemical modifications distal to the N-terminus, such as at the residue positions
21 and 25 (Su et al., 1991). Likewise, steric changes of the peptide structure have been
proposed to explain the increased susceptibility of the cytotoxic T-lymphocyte-epitope 13
amino acid peptide to endopeptidases following terminal modifications (Marschutz et al.,
2002). Finally, protection of the different proteolytic cleavage sites by the combination of
the reduced amine bond with the double substitution Sip10 - TMSAla13 (8), Lys11 - TMSAla13
(12), D-Trp11 - TMSAla13 (14) or Dmt11 - Tle12 (16) abolished sufficiently the accessibility of
the susceptible sites to peptidases to extend their plasma stability for at least 24 hours.
Overall, these results highlight the importance of the reduced amine bond in optimizing the
metabolic properties of the NT(8-13) peptide and reinforce the need to combine appropriate
chemical modifications to generate stable NT(8-13) analogues exhibiting prolonged plasma
half-life in vivo.
Hypothermia therapy has been found to exert neuroprotective effects in many neurological
diseases, such as stroke, traumatic brain injury, intracranial pressure elevation and neonatal
 137

encephalopathy (Huber, et al., 2019); (Sun, et al., 2019). In light of this, there is now growing
evidence demonstrating that NT(8-13) analogues induce regulated reduction of body and
brain temperatures through activation of the NTS1 receptor subtype (Liu, et al., 2016).
Indeed, administration of the NTS1 agonists, NT69L, PD149163, HPI-201 or HPI-363
produced mild hypothermia and improved the neurological outcomes compared with that of
results from external cooling (Choi, et al., 2012; Gu, et al., 2015; Katz, et al., 2001; Lee et
al., 2014; Lee, et al., 2016a; 2016b; Wei, et al., 2013; Xue, et al., 2017; Zhao, et al., 2020;
Zhong, et al., 2020). Here, we therefore determined the ability of these specific pairs of
NT(8-13) analogues to regulate the body temperature and evaluated the contribution of the
receptor binding affinity and peptide plasma stability on the hypothermic activity. Our data
clearly demonstrated that the peptide metabolic stability is more important to the
hypothermic response of the NT(8-13) analogues than the receptor binding affinity. Indeed,
all NT(8-13) derivatives exhibiting a high-affinity at NTS1 but low plasma stability (1, 2, 3,
5, 7 and 15) were not effective to induce drop in body temperature, while highly stable
compounds (4, 14 and 16) showing good affinity for NTS1 exerted long-lasting hypothermia.
This latter observation was further strengthened by the presence of a hypothermic response
following administration of 6 and 12, which show a high resistance to protease degradation
but a relatively low affinity at NTS1. As expected, compounds 9, 11 and 13 having low
affinity for NTS1 and high susceptibility to peptidases did not cause drop in body
temperature. Consistent with our results, Orwig and colleagues identified that the N-terminal
capping of NT(8-13) leading to increased stability in vivo can compensate for a reduction in
binding affinity to NTS1 (Orwig, et al., 2009). Accordingly, the neuropeptide neuromedin
N, a closely related hexapeptide of NT(8-13), which does not normally produce hypothermia
due to its poor stability can, however, induce a hypothermic effect when administered in the
presence of peptidase inhibitors (Dubuc et al., 1988).

In conclusion, these results indicate that these backbone modifications to the NT(8-13)
peptide are required for NTS1-mediating hypothermia and that the relatively good binding
affinity for NTS1 does not translate directly into biological responses, the main driver of this
physiological effect being the increased in vivo stability.
 138

Acknowledgments
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research (CIHR) (FDN-
148413) awarded to P.S. and by France Life Imaging (grant ANR-11-INBS-0006 - S. P.)
from the French program «Investissements d’Avenir» to F.C. M.V. was supported by a
research fellowship from the Institut de Pharmacologie de Sherbrooke (IPS) and Centre
d′Excellence en Neurosciences de l′Université de Sherbrooke (CNS). P.S. holds a Canada
Research Chair in Neurophysiopharmacology of Chronic Pain. The authors thank Pr Éric
Marsault for allowing them to use the UPLC/MS instrument for plasma stability assays.

Author Contributions Statement

S.P. and M.V. contributed equally to this study. S.P. was in charge of synthesizing the
compounds and writing of the chemical part of the manuscript. M.V. did the biological part
of paper and wrote the in vitro and in vivo sections. The manuscript was written by M.V.,
S.P., E.R., J.M.L., S.B., F.C and P.S. All authors have given their approval to the final
version of the manuscript.

Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
 139

References

Adessi, C. and Soto, C. (2002). Converting a peptide into a drug: strategies to improve
stability and bioavailability. Curr Med Chem 9, 963-978. doi:
10.2174/0929867024606731
Bissette, G., Luttinger, D., Mason, G. A., Hernandez, D. E. and Loosen, P. T. (1982).
Neurotensin and thermoregulation. Ann N Y Acad Sci 400, 268-282. doi:
10.1111/j.1749-6632.1982.tb31575.x
Bissette, G., Nemeroff, C. B., Loosen, P. T., Prange, A. J., Jr. and Lipton, M. A. (1976).
Hypothermia and intolerance to cold induced by intracisternal administration of the
hypothalamic peptide neurotensin. Nature 262, 607-609. doi: 10.1038/262607a0
Boules, M., Li, Z., Smith, K., Fredrickson, P. and Richelson, E. (2013). Diverse roles of
neurotensin agonists in the central nervous system. Front Endocrinol 4:36. doi:
10.3389/fendo.2013.00036
Boules, M., Liang, Y., Briody, S., Miura, T., Fauq, I., Oliveros, A., Wilson, M., Khaniyev,
S., Williams, K., Li, Z., Qi, Y., Katovich, M. and Richelson, E. (2010). NT79: A
novel neurotensin analog with selective behavioral effects. Brain Res 1308, 35-46.
doi: 10.1016/j.brainres.2009.10.050
Calbo, S., Guichard, G., Bousso, P., Muller, S., Kourilsky, P., Briand, J. P. and Abastado, J.
P. (1999). Role of peptide backbone in T cell recognition. J Immunol 162, 4657-4662.
Carraway, R. and Leeman, S. E. (1973). The isolation of a new hypotensive peptide,
neurotensin, from bovine hypothalami. J Biol Chem 248, 6854-6861
Cavelier, F., Vivet, B., Martinez, J., Aubry, A., Didierjean, C., Vicherat, A. and Marraud, M.
(2002). Influence of silaproline on peptide conformation and bioactivity. J Am Chem
Soc 124, 2917-2923. doi: 10.1021/ja017440q
Checler, F., Emson, P. C., Vincent, J. P. and Kitabgi, P. (1984). Inactivation of neurotensin
by rat brain synaptic membranes. Cleavage at the Pro10-Tyr11 bond by
endopeptidase 24.11 (enkephalinase) and a peptidase different from proline-
endopeptidase. J Neurochem 43, 1295-1301. doi: 10.1111/j.1471-
4159.1984.tb05386.x
 140

Checler, F., Vincent, J. P. and Kitabgi, P. (1985). Inactivation of neurotensin by rat brain
synaptic membranes partly occurs through cleavage at the Arg8-Arg9 peptide bond
by a metalloendopeptidase. J Neurochem 45, 1509-1513. doi: 10.1111/j.1471-
4159.1985.tb07220.x
Checler, F., Vincent, J. P. and Kitabgi, P. (1986). Purification and characterization of a novel
neurotensin-degrading peptidase from rat brain synaptic membranes. J Biol Chem
261, 11274-11281
Chen, F., Qi, Z., Luo, Y., Hinchliffe, T., Ding, G., Xia, Y. and Ji, X. (2014). Non-
pharmaceutical therapies for stroke: mechanisms and clinical implications. Prog
Neurobiol 115, 246-269. doi: 10.1016/j.pneurobio.2013.12.007
Cheng, Y. and Prusoff, W. H. (1973). Relationship between the inhibition constant (K1) and
the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an
enzymatic reaction. Biochem Pharmacol 22, 3099-3108.
Choi, K. E., Hall, C. L., Sun, J. M., Wei, L., Mohamad, O., Dix, T. A. and Yu, S. P. (2012).
A novel stroke therapy of pharmacologically induced hypothermia after focal
cerebral ischemia in mice. FASEB J 26, 2799-2810. doi: 10.1096/fj.11-201822
Coy, D. H., Heinz-Erian, P., Jiang, N. Y., Sasaki, Y., Taylor, J., Moreau, J. P., Wolfrey, W.
T., Gardner, J. D. and Jensen, R. T. (1988). Probing peptide backbone function in
bombesin. A reduced peptide bond analogue with potent and specific receptor
antagonist activity. J Biol Chem 263, 5056-5060.
Cusack, B., McCormick, D. J., Pang, Y. P., Souder, T., Garcia, R., Fauq, A. and Richelson,
E. (1995). Pharmacological and biochemical profiles of unique neurotensin 8-13
analogs exhibiting species selectivity, stereoselectivity, and superagonism. J Biol
Chem 270, 18359-18366. doi: 10.1074/jbc.270.31.18359
Dobner, P. R. (2006). Neurotensin and pain modulation. Peptides 27, 2405-2414. doi:
10.1016/j.peptides.2006.04.025
Doulut, S., Rodriguez, M., Lugrin, D., Vecchini, F., Kitabgi, P., Aumelas, A. and Martinez,
J. (1992). Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin. Pept Res
5, 30-38.
 141

Dubuc, I., Nouel, D., Coquerel, A., Menard, J. F., Kitabgi, P. and Costentin, J. (1988).
Hypothermic effect of neuromedin N in mice and its potentiation by peptidase
inhibitors. Eur J Pharmacol 151, 117-121. doi: 10.1016/0014-2999(88)90699-1
Dubuc, I., Sarret, P., Labbe-Jullie, C., Botto, J. M., Honore, E., Bourdel, E., Martinez, J.,
Costentin, J., Vincent, J. P., Kitabgi, P. and Mazella, J. (1999). Identification of the
receptor subtype involved in the analgesic effect of neurotensin. J Neurosci 19, 503-
510.
Einsiedel, J., Held, C., Hervet, M., Plomer, M., Tschammer, N., Hübner, H. and Gmeiner, P.
(2011). Discovery of highly potent and neurotensin receptor 2 selective neurotensin
mimetics. J Med Chem 54, 2915-2923. doi: 10.1021/jm200006c
Eiselt, E., Gonzalez, S., Martin, C., Chartier, M., Betti, C., Longpre, J. M., Cavelier, F.,
Tourwe, D., Gendron, L., Ballet, S. and Sarret, P. (2019). Neurotensin analogues
containing cyclic surrogates of tyrosine at position 11 improve NTS2 selectivity
leading to analgesia without hypotension and hypothermia. ACS Chem Neurosci 10,
4535-4544. doi: 10.1021/acschemneuro.9b00390
Fanelli, R., Besserer-Offroy, É., René, A., Côté, J., Tétreault, P., Collerette-Tremblay, J.,
Longpré, J.-M., Leduc, R., Martinez, J., Sarret, P. and Cavelier, F. (2015). Synthesis
and characterization in vitro and in vivo of (L)-(trimethylsilyl)alanine containing
neurotensin analogues. J Med Chem 58, 7785-7795. doi:
10.1021/acs.jmedchem.5b00841
Fanelli, R., Floquet, N., Besserer-Offroy, E., Delort, B., Vivancos, M., Longpré, J. M.,
Renault, P., Martinez, J., Sarret, P. and Cavelier, F. (2017). Use of molecular
modeling to design selective NTS2 neurotensin analogues. J Med Chem 60, 3303-
3313. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01848
Fantegrossi, W. E., Ko, M. C., Woods, J. H. and Richelson, E. (2005). Antinociceptive,
hypothermic, hypotensive, and reinforcing effects of a novel neurotensin receptor
agonist, NT69L, in rhesus monkeys. Pharmacol Biochem Behav 80, 341-349. doi:
10.1016/j.pbb.2004.12.005
Feifel, D., Goldenberg, J., Melendez, G. and Shilling, P. D. (2010). The acute and subchronic
effects of a brain-penetrating, neurotensin-1 receptor agonist on feeding, body weight
 142

and temperature. Neuropharmacology 58, 195-198. doi:

10.1016/j.neuropharm.2009.07.001
Feng, Y. P., Wang, J., Dong, Y. L., Wang, Y. Y. and Li, Y. Q. (2015). The roles of
neurotensin and its analogues in pain. Curr Pharm Des 21, 840-848.
Granier, C., Van Rietschoten, J., Kitabgi, P., Poustis, C. and Freychet, P. (1982). Synthesis
and characterization of neurotensin analogues for structure/activity relationship
studies. Eur. J. Biochem. 124, 117-125. doi: 10.1111/j.1432-1033.1982.tb05913.x
Gu, X., Wei, Z. Z., Espinera, A., Lee, J. H., Ji, X., Wei, L., Dix, T. A. and Yu, S. P. (2015).
Pharmacologically induced hypothermia attenuates traumatic brain injury in neonatal
rats. Exp Neurol 267, 135-142. doi: 10.1016/j.expneurol.2015.02.029
Hadden, M. K., Orwig, K. S., Kokko, K. P., Mazella, J. and Dix, T. A. (2005). Design,
synthesis, and evaluation of the antipsychotic potential of orally bioavailable
neurotensin (8-13) analogues containing non-natural arginine and lysine residues.
Neuropharmacology 49, 1149-1159. doi: 10.1016/j.neuropharm.2005.06.010
Held, C., Plomer, M., Hübner, H., Meltretter, J., Pischetsrieder, M. and Gmeiner, P. (2013).
Development of a metabolically stable neurotensin receptor 2 (NTS2) ligand.
ChemMedChem 8, 75-81. doi: 10.1002/cmdc.201200376
Henry, J. A., Horwell, D. C., Meecham, K. G. and Rees, D. C. (1993). A Structure-Affinity
Study of the Amino-Acid Side-Chains in Neurotensin - N and C-Terminal Deletions
and Ala-Scan. Bioorg Med Chem Lett 3, 949-952. doi: 10.1016/S0960-
894x(00)80698-8
Huber, C., Huber, M. and Ding, Y. (2019). Evidence and opportunities of hypothermia in
acute ischemic stroke: Clinical trials of systemic versus selective hypothermia. Brain
Circ 5, 195-202. doi: 10.4103/bc.bc_25_19
Jolicoeur, F. B., St-Pierre, S., Aube, C., Rivest, R. and Gagne, M. A. (1984). Relationships
between structure and duration of neurotensin's central action: emergence of long
acting analogs. Neuropeptides 4, 467-476. doi: 10.1016/0143-4179(84)90090-8
Kalivas, P. W., Nemeroff, C. B., Miller, J. S. and Prange, A. J., Jr. (1985). Microinjection of
neurotensin into the ventral tegmental area produces hypothermia: evaluation of
dopaminergic mediation. Brain Res 326, 219-227. doi: 10.1016/0006-
8993(85)90031-9
 143

Katz, L. M., Wang, Y., McMahon, B. and Richelson, E. (2001). Neurotensin analog NT69L
induces rapid and prolonged hypothermia after hypoxic ischemia. Acad Emerg Med
8, 1115-1121. doi: 10.1111/j.1553-2712.2001.tb01126.x
Krumm, B. E., Lee, S., Bhattacharya, S., Botos, I., White, C. F., Du, H., Vaidehi, N. and
Grisshammer, R. (2016). Structure and dynamics of a constitutively active
neurotensin receptor. Sci Rep 6, 38564. doi: 10.1038/srep38564
Kurisu, K., Kim, J. Y., You, J. and Yenari, M. A. (2019). Therapeutic hypothermia and
neuroprotection in acute neurological disease. Curr Med Chem 26, 5430-5455. doi:
10.2174/0929867326666190506124836
Lee, J. H., Wei, L., Gu, X., Wei, Z., Dix, T. A. and Yu, S. P. (2014). Therapeutic effects of
pharmacologically induced hypothermia against traumatic brain injury in mice. J
Neurotrauma 31, 1417-1430. doi: 10.1089/neu.2013.3251
Lee, J. H., Wei, Z. Z., Cao, W., Won, S., Gu, X., Winter, M., Dix, T. A., Wei, L. and Yu, S.
P. (2016). Regulation of therapeutic hypothermia on inflammatory cytokines,
microglia polarization, migration and functional recovery after ischemic stroke in
mice. Neurobiol Dis 96, 248-260. doi: 10.1016/j.nbd.2016.09.013
Liu, K., Khan, H., Geng, X., Zhang, J. and Ding, Y. (2016). Pharmacological hypothermia:
a potential for future stroke therapy? Neurol Res 38, 478-490. doi:
10.1080/01616412.2016.1187826
Lugrin, D., Vecchini, F., Doulut, S., Rodriguez, M., Martinez, J. and Kitabgi, P. (1991).
Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin: binding and
biological activities, and in vitro metabolic stability. Eur J Pharmacol 205, 191-198.
doi: 10.1016/0014-2999(91)90819-c
Magafa, V., Matsoukas, M. T., Karageorgos, V., Dermitzaki, E., Exarchakou, R., Stylos, E.,
Pardalos, M., Margioris, A. N., Varvounis, G., Tzakos, A. G., Spyroulias, G. A. and
Liapakis, G. (2019). Novel stable analogues of the neurotensin C-terminal
hexapeptide containing unnatural amino acids. Amino Acids 51, 1009-1022. doi:
10.1007/s00726-019-02741-2
Marschutz, M. K., Zauner, W., Mattner, F., Otava, A., Buschle, M. and Bernkop-Schnurch,
A. (2002). Improvement of the enzymatic stability of a cytotoxic T-lymphocyte-
 144

epitope model peptide for its oral administration. Peptides 23, 1727-1733. doi:
10.1016/s0196-9781(02)00148-1
Martin, G. E., Bacino, C. B. and Papp, N. L. (1980). Hypothermia elicited by the
intracerebral microinjection of neurotensin. Peptides 1, 333-339. doi: 10.1016/0196-
9781(80)90011-x
Mechanic, J. A., Sutton, J. E., Berson, A. E., Wu, X., Kwan, J., Schreiber, R., Pang, Z. and
Button, D. C. (2009). Involvement of the neurotensin receptor 1 in the behavioral
effects of two neurotensin agonists, NT-2 and NT69L: lack of hypothermic,
antinociceptive and antipsychotic actions in receptor knockout mice. Eur
Neuropsychopharmacol 19, 466-475. doi: 10.1016/j.euroneuro.2009.01.004
Nemeroff, C. B., Bissette, G., Prange, A. J., Jr., Loosen, P. T., Barlow, T. S. and Lipton, M.
A. (1977). Neurotensin: central nervous system effects of a hypothalamic peptide.
Brain Res 128, 485-496. doi: 10.1016/0006-8993(77)90173-1
Orwig, K. S., Lassetter, M. R., Hadden, M. K. and Dix, T. A. (2009). Comparison of N-
terminal modifications on neurotensin(8-13) analogues correlates peptide stability
but not binding affinity with in vivo efficacy. J Med Chem 52, 1803-1813. doi:
10.1021/jm801072v
Pettibone, D. J., Hess, J. F., Hey, P. J., Jacobson, M. A., Leviten, M., Lis, E. V., Mallorga,
P. J., Pascarella, D. M., Snyder, M. A., Williams, J. B. and Zeng, Z. (2002). The
effects of deleting the mouse neurotensin receptor NTR1 on central and peripheral
responses to neurotensin. J Pharmacol Exp Ther 300, 305-313. doi:
10.1124/jpet.300.1.305
Remaury, A., Vita, N., Gendreau, S., Jung, M., Arnone, M., Poncelet, M., Culouscou, J. M.,
Le Fur, G., Soubrie, P., Caput, D., Shire, D., Kopf, M. and Ferrara, P. (2002).
Targeted inactivation of the neurotensin type 1 receptor reveals its role in body
temperature control and feeding behavior but not in analgesia. Brain Res 953, 63-72.
doi: 10.1016/s0006-8993(02)03271-7
René, A., Vanthuyne, N., Martinez, J. and Cavelier, F. (2013). (L)-(Trimethylsilyl)alanine
synthesis exploiting hydroxypinanone-induced diastereoselective alkylation. Amino
Acids 45, 301-307. doi: 10.1007/s00726-013-1492-2
 145

Richard, F., Barroso, S., Martinez, J., Labbe-Jullie, C. and Kitabgi, P. (2001). Agonism,
inverse agonism, and neutral antagonism at the constitutively active human
neurotensin receptor 2. Mol Pharmacol 60, 1392-1398. doi: 10.1124/mol.60.6.1392
Richelson, E., Mccormick, D. J., Pang, Y.-P. and Phillips, K. S. (2008) Peptide analogs that
are potent and selective for human neurotensin receptor subtype 2. WO/2008/137720.
Sarret, P. and Cavelier, F. (2018). Neurotensin and its receptors. Reference Module in
Neuroscience and Biobehavioral Psychology, 1-17. doi:
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809324-5.02316-6
St-Gelais, F., Jomphe, C. and Trudeau, L. E. (2006). The role of neurotensin in central
nervous system pathophysiology: what is the evidence? J Psychiatry Neurosci 31,
229-245
St-Pierre, S., Lalonde, J. M., Gendreau, M., Quirion, R., Regoli, D. and Rioux, F. (1981).
Synthesis of peptides by the solid-phase method. 6. Neurotensin, fragments, and
analogues. J Med Chem 24, 370-376. doi: 10.1021/jm00136a004
Su, C. M., Jensen, L. R., Heimer, E. P., Felix, A. M., Pan, Y. C. and Mowles, T. F. (1991).
In vitro stability of growth hormone releasing factor (GRF) analogs in porcine
plasma. Horm Metab Res 23, 15-21. doi: 10.1055/s-2007-1003601
Sun, Y. J., Zhang, Z. Y., Fan, B. and Li, G. Y. (2019). Neuroprotection by Therapeutic
Hypothermia. Front Neurosci 13, 586. doi: 10.3389/fnins.2019.00586
Tyler-McMahon, B. M., Stewart, J. A., Farinas, F., McCormick, D. J. and Richelson, E.
(2000). Highly potent neurotensin analog that causes hypothermia and
antinociception. Eur J Pharmacol 390, 107-111. doi: 10.1016/s0014-
2999(99)00877-8
Uhl, G. R., Bennett, J. P., Jr. and Snyder, S. H. (1977). Neurotensin, a central nervous system
peptide: apparent receptor binding in brain membranes. Brain Res 130, 299-313. doi:
10.1016/0006-8993(77)90277-3
Vincent, J. P., Mazella, J. and Kitabgi, P. (1999). Neurotensin and neurotensin receptors.
Trends Pharmacol Sci 20, 302-309. doi: 10.1016/s0165-6147(99)01357-7
Vivet, B., Cavelier, F. and Martinez, J. (2000). Synthesis of Silaproline, a New Proline
Surrogate. Eur J Org Chem 2000, 807-811. doi: 10.1002/(SICI)1099-
0690(200003)2000:5<807::AID-EJOC807>3.0.CO;2-E
 146

Wei, S., Sun, J., Li, J., Wang, L., Hall, C. L., Dix, T. A., Mohamad, O., Wei, L. and Yu, S.
P. (2013). Acute and delayed protective effects of pharmacologically induced
hypothermia in an intracerebral hemorrhage stroke model of mice. Neuroscience 252,
489-500. doi: 10.1016/j.neuroscience.2013.07.052
Werner, H. M., Cabalteja, C. C. and Horne, W. S. (2016). Peptide backbone composition and
protease susceptibility: Impact of modification type, position, and tandem
substitution. Chembiochem 17, 712-718. doi: 10.1002/cbic.201500312
White, J. F., Noinaj, N., Shibata, Y., Love, J., Kloss, B., Xu, F., Gvozdenovic-Jeremic, J.,
Shah, P., Shiloach, J., Tate, C. G. and Grisshammer, R. (2012). Structure of the
agonist-bound neurotensin receptor. Nature 490, 508-513. doi: 10.1038/nature11558
Wustrow, D. J., Davis, M. D., Akunne, H. C., Corbin, A. E., Wiley, J. N., Wise, L. D. and
Heffner, T. G. (1995). Reduced amide bond neurotensin-8-13 mimetics with potent
in-vivo activity. Bioorg Med Chem Lett 5, 997-1002. doi: 10.1016/0960-
894x(95)00155-M
Xue, T. F., Ding, X., Ji, J., Yan, H., Huang, J. Y., Guo, X. D., Yang, J. and Sun, X. L. (2017).
PD149163 induces hypothermia to protect against brain injury in acute cerebral
ischemic rats. J Pharmacol Sci 135, 105-113. doi: 10.1016/j.jphs.2017.10.004
Zhao, Y., Wei, Z. Z., Lee, J. H., Gu, X., Sun, J., Dix, T. A., Wei, L. and Yu, S. P. (2020).
Pharmacological hypothermia induced neurovascular protection after severe stroke
of transient middle cerebral artery occlusion in mice. Exp Neurol 325, 113133. doi:
10.1016/j.expneurol.2019.113133
Zhong, W., Yuan, Y., Gu, X., Kim, S. I., Chin, R., Loye, M., Dix, T. A., Wei, L. and Yu, S.
P. (2020). Neuropsychological deficits chronically developed after focal ischemic
stroke and beneficial effects of pharmacological hypothermia in the mouse. Aging
Dis 11, 1-16. doi: 10.14336/AD.2019.0507
 147

Supplementary Data

Materials and Methods

All solvents were purchased from Sigma Aldrich in gradient grade or reagent quality. All
reactions involving air-sensitive reagents were performed under nitrogen or argon.
Purifications were performed with column chromatography using silica gel (Merck 60, 230–
400 mesh). LC/MS system consisted of a Waters Alliance 2690 HPLC, coupled to a ZQ
spectrometer (Manchester, UK) fitted with an electrospray source operated in the positive
ionization mode (ESI+). All the analyses were carried out using a C18 Chromolith Flash 25
x 4.6 mm column operated at a flow rate of 3 ml/min. A gradient of 0 to 100% solvent B was
used over 3 min. Positive-ion electrospray mass spectra were acquired at a solvent flow rate
of 100-200 µL/min. Nitrogen was used for both the nebulizing and drying gas. The data were
obtained in a scan mode ranging from 200 to 1700 m/z in 0.1 s intervals. A total of 10 scans
were summed up to get the final spectrum. All the fully unprotected peptides were purified
using a gradient composed of water/acetonitrile with 0.1% TFA at 50 mL/min flow rate.
Purity was determined by HPLC Agilent 1200 equipped with a column Onyx monolithic
HD-C18 50 x 4.6 mm following a gradient of 0 to 100 % of ACN with 1/1000 of TFA in 10
minutes. All peptides were obtained with purity higher than 95%. High resolution mass
spectra (HRMS) were performed at the “Laboratoire de Mesures Physiques” of Montpellier
University on a Micromass Q-Tof spectrometer equipped with electrospray source ionization
(ESI), using phosphoric acid as an internal standard. All the fully unprotected peptides were
purified using a gradient composed of water/acetonitrile with 0.1% TFA at 50 mL/min flow
rate performed on a PLC2020 Gilson® using a 75 x 21.2 mm Phenomenex® Luna 5u C18(2)
column. Purity was determined by. RP-Analytic HPLC performed on a Agilent 1220 using
a 50 x 4.6 mm Chromolith® High Resolution column. Compounds were separated using a
linear gradient system (0 to 100% solvent B in 10 min) using a constant flow rate of 3mL/
min. High resolution mass spectra (HRMS) were performed at the “Laboratoire de Mesures
Physiques” of Montpellier University on a Micromass Q-Tof spectrometer equipped with
electrospray source ionization (ESI), using phosphoric acid as internal standard.
 148

General procedures

Unnatural amino acids silaproline (Boc-Sip-OH) (Vivet et al., 2000), trimethylsilylalanine

(Boc-TMSAla-OMe) (René et al., 2013; Fanelli et al., 2015) and pseudopeptide Boc-

Lys(Boc)y[CH2NH]Lys(Boc)-OH (Doulut et al., 1992) were prepared according to reported

literature procedures.

General procedure for coupling reaction in solution (GP1)

To a solution of the amino ester or peptide in DMF, the suitable NH protected amino acid or

peptide was added followed by the addition of HATU (1.2 eq.) and N,N-

diisopropyethylamine (3 eq.). The mixture was stirred at room temperature overnight. The

solvent was evaporated and the residue was diluted with EtOAc and consecutively extracted

with 1 M KHSO4 (2×), aqueous NaHCO3 (2×) and brine (2×), dried over Na2SO4 and the

solvent evaporated under reduced pressure to afford the crude product which was then

purified on silica gel and characterized by LC-MS.

General procedure for BOC deprotection in solution with TFA (GP2)

The protected peptide was dissolved in TFA (4 mL/mmol), in the presence of TIS (10%).

The reaction was stirred 2.5 h at room temperature. Volatiles were removed under reduced

pressure. The resulting residue was precipitated in diethyl ether and subsequently filtered

and dried, to afford the corresponding TFA salt. The crude peptides were purified by RP-

HPLC.
 149

General procedure for methyl ester saponification (GP3) The peptide methyl ester was

dissolved in methanol (10 ml/mmol) and a solution of 4N KOH (5 eq.) was added. The

reaction was stirred until disappearance of the starting material. The solvent was removed

under reduced pressure and the resulting residue was dissolved in water (10 mL/mmol), then

acidified with citric acid 15% to pH 4-5. The organic product was extracted with ethyl acetate

(x 4), the organic layer was dried over MgSO4 and concentrated in vacuo, to afford the

corresponding carboxylic acid, which was used for the next step without further purification.

General procedure for Bn and Z deprotection of peptides in solution (GP4)

The protected peptide was dissolved in methanol (5 mL/mmol) and 10% Pd/C under

hydrogen atmosphere. The reaction was stirred 3 h at room temperature. The mixture was

filtered on a pad of celite, which was washed with methanol. The solvent was evaporated

under reduced pressure to afford the free amine.

Synthesis of compound 4 (H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-TMSAla-OH)

Compound 4 was prepared according to a 3+3 fragment coupling as depicted in Scheme S1.

The C-terminal tripeptide H-Tyr(Bn)-Ile-TMSAla-OMe was synthesized following Boc-

chemistry in solution, and general procedure (GP) 1 and GP2 for coupling and Boc-

deprotection, respectively. Pseudopeptide Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-OH was

prepared as reported in literature (Doulut et al., 1992). The subsequent coupling H-Pro-OMe

provided the tripeptide intermediate Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-Pro-OMe, which

after saponification following GP3, gave the corresponding acid. A coupling between

tripeptides Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-Pro-OH and H-Tyr(Bn)-Ile-TMSAla-OMe

 150

provided the desired hexapeptide carrying the protecting groups. Saponification (GP3),

removal of the benzyl on the side chain of Tyr (GP4) and TFA treatment (GP2) presented

the desired compound 4. The presence of a proline residue and a reduced amide bond avoided

racemization during the assembly process. The overall yield was 14% (over 10 steps).

Calculated mass: 777.5059; found mass: 777.5059; HPLC retention time: 1.46 min. HPLC

chromatograms and mass spectra are reported below.

Scheme S1. Synthesis of compound 4. Reagents and conditions: GP1: HATU, DIPEA,
DMF, rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5 h, rt; GP3: 4N KOH, MeOH, rt; GP4: H2, 10% Pd/C,
MeOH, 3h, rt.
 151

Figure S1. HPLC profile of peptide 4.

 152

Figure S2. Mass spectra of peptide 4.

 153

Figure S3. High-Resolution mass spectra of peptide 4.

Synthesis of compound 6 (H-Lysψ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH)

Compound 6 was prepared in accordance to a 2+4 fragment coupling as depicted in Scheme

S2. In contrast to compound 4, the amino acid in position 10 (Sip) was inserted into the C-
terminal subsequence. The tetrapeptide H-Sip-Tyr(Bn)-Ile-Leu-OMe was coupled with the
building block Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-OH, providing the fully protected
hexapeptide Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-Sip-Tyr(Bn)-Ile-Leu-OMe. Subsequently,
saponification (GP3), hydrogenation (GP4) and Boc-deprotection (GP2) provided the
desired product. Calculated mass: 791.5225; found mass: 791.5215; LC-MS retention time:
0.85 min. Overall yield: 21%. LC-MS and mass spectra are reported below.

Scheme S2. Synthesis of compound 6. Reagents and conditions. GP1: HATU, DIPEA, DMF,
rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5h, rt; GP3: 4N KOH, MeOH, rt; GP4: H2, 10% Pd/C, MeOH,
3h, rt.
 154

Figure S4. LCMS of peptide 6.

A)

B)
 155

Figure S5. Mass spectra of peptide 6.

Figure S6. High-Resolution mass spectrum of compound 6.

 156

Synthesis of compound 7 (H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH)

Compound 7 was prepared following the standard approach for peptide synthesis in solution,
with a build-up from the C-terminal position 13 (H-TMSAla-OMe, Scheme S3). Unlike
compound 6, we followed the Boc-chemistry strategy for all couplings (5 in all). Calculated
mass: 834.4855; found mass: 835.49; HPLC retention time over 10 min: 3.673 min; Purity
> 95%. Overall yield: 17% (11 steps). The HPLC chromatogram and mass spectrum are
reported below.

Scheme S3. Synthesis of compound 7. Reagents and conditions. GP1: HATU, DIPEA, DMF,
rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5h, rt; GP3: 4N KOH, MeOH, rt; GP4: H2, 10% Pd/C, MeOH,
3h, rt.
 157

Figure S7. HPLC profile of hexapeptide 7.

 158

Figure S8. Mass spectrum of compound 7

Synthesis of compound 8 (H-Lysψ[CH2NH]Lys-Sip-Tyr-Ile-TMSAla-OH)

Compound 8 was prepared following the procedure above for compound 6, and using a 2+4

fragment coupling as depicted in Scheme S4, by coupling Boc-

Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-OH with H-Sip-Tyr(Bn)-Ile-TMSAla-OMe. The presence of

reduced amide bond in the dipeptide Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-OH avoided

racemization process. Overall yield: 22% (10 steps); Calculated mass (M/2): 411.2579;

found mass (M/2): 411.3; Mass spectra are reported below.

 159

Scheme S4. Synthesis of compound 8. Reagents and conditions. GP1: HATU, DIPEA, DMF,
rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5h, rt; GP3 : 4N KOH, MeOH, rt; GP4: H2, 10% Pd/C,
MeOH, 3h, rt.

A)
 160

B)

Figure S9. Mass spectra of compound 8.

Synthesis of 10 (H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH)

Compound 10 was prepared in according to the procedure described for compound 4, by

coupling Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-Pro-OH and H-Lys(Z)-Ile-Leu-OMe (Scheme
5). Also in this case, the presence of proline in the tripeptide Boc-
Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-Pro-OH avoided the racemization process. Overall yield:
16% (10 steps; purity > 95%). Calculated mass: 712.5450; found mass: 712.5; LC-MS
retention time: 0.63 min. The LC-MS analysis is reported below.
 161

Scheme S5. Synthesis of compound 10. Reagents and conditions. GP1: HATU, DIPEA,
DMF, rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5h, rt; GP3: 4N KOH, MeOH, rt; GP4: H2, 10% Pd/C,
MeOH, 3h, rt.

A)
 162

B)

Figure S10. LC (A) and mass spectrum (B) of peptide 10.

Synthesis of compound 12 (H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH)

Compound 12 was prepared following the procedure above for compound 4, by coupling
Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-Pro-OH and H-Lys(Z)-Ile-TMSAla-OMe (Scheme S6).
The racemization process was avoided due to the presence of reduced amide bond (i.e.
coupling between Boc-Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-OH and H-Pro-OMe) and proline (3 +
3 coupling). Overall yield: 14% (10 steps). Calculated mass: 742.5376; found mass: 742.5;
LC-MS retention time: 0.64 min; Purity > 95%. LC-MS is reported below.
 163

Scheme S6. Synthesis of compound 12. Reagents and conditions. GP1: HATU, DIPEA,
DMF, rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5h, rt; GP3: 4N KOH, MeOH, rt; GP4: H2, 10% Pd/C,
MeOH, 3h, rt.

A)
 164

B)

Figure S11. LC-MS analysis of compound 12.

Synthesis of compound 13 (H-Lys-Lys-Pro-D-Trp-Ile-TMSAla-OH)

Compound 13 was prepared according to a 3+3 fragment coupling as shown in Scheme S7.
As it can be noted, D-Trp was used without any protecting group on the side chain: in order
to avoid undesirable side products, we limited the number of reactions in which D-Trp was
included. For this reason, tripeptide H-D-Trp-Ile-TMSAla-OMe was coupled with the acid
tripeptide Boc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-OH, and only a very low percentage of side products
were detected. Presence of proline in position 10 avoided racemization. Overall yield: 11%
(12 steps). Calculated mass (M/2): 407.7545; found mass (M/2): 407.7; HPLC retention time
over 5 min: 1.60 min; Purity > 95%. The HPLC chromatogram and mass spectra are reported
below.
 165

Scheme S7. Synthesis of compound 13. Reagents and conditions. GP1: HATU, DIPEA,
DMF, rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5h, rt; GP3: 4N KOH, MeOH, rt.
 166

Figure 12S. HPLC profile of hexapeptide 13.

Figure 13S. Mass spectra of compound 13.

 167

Synthesis of compound 14 (H-Lysψ[CH2NH]Lys-Pro-D-Trp-Ile-TMSAla-OH)

Compound 14 was synthesized as described for compound 13, by coupling Boc-

Lys(Boc)ψ[CH2NH]Lys(Boc)-Pro-OH with H-D-Trp-Ile-TMSAla-OMe (Scheme S8).
Overall yield: 10% (9 steps). Calculated mass (M/2): 400.7649; found mass (M/2): 400.7661.
Mass spectra are reported below.

Scheme S8. Synthesis of compound 14. Reagents and conditions. GP1: HATU, DIPEA,
DMF, rt, o.n.; GP2: TFA, 10% TIS, 2.5h, rt; GP3: 4N KOH, MeOH, rt.
 168

Figure 14S. Mass spectra of compound 14.

 169

Table S1. References for each compound already reported in literature.

Code in the
Cmp Sequence Reference
reference paper
(Fanelli et al.,
1 H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 1
2017)

(Lugrin et al.,
2 H-LysΨ[CH2NH]Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH H-[Ψ8,9]
1991)

3 H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-TMSAla-OH (Fanelli et al., 6

5 H-Lys-Lys-Sip-Tyr-Ile-Leu-OH 2015) 10

9 H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-Leu-OH (Fanelli et al., 2

11 H-Lys-Lys-Pro-Lys-Ile-TMSAla-OH 2017) 7

15 H-Lys-Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH 5
(Eiselt et al., 2019)
16 H-LysΨ(CH2NH)Lys-Pro-Dmt-Tle-Leu-OH 9
 170

Table S2. Summary data for the new synthesized peptides.

Calculated Signal in mass
Cmp Retention time
mass spectrometry
1.46 min
4 777.5059 777.5059
HPLC over 5 min
0.85 min
6 791.5225 791.5215
LCMS over 3 min
3.67 min
7 834.4855 835.49
HPLC over 10 min
411.2579 411.3
8 Not available
(M/2) (M/2)
0.63 min
10 712.5450 712.5
LCMS over 3 min
0.64 min
12 742.5376 742.5
LCMS over 3 min
1.60 min
13 407.7545 407.7
HPLC over 5 min

14 400.7649 400.7661 Not available

REFERENCES

Doulut, S., Rodriguez, M., Lugrin, D., Vecchini, F., Kitabgi, P., Aumelas, A. and Martinez,
J. (1992). Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin. Pept Res
5, 30-38.
Eiselt, E., Gonzalez, S., Martin, C., Chartier, M., Betti, C., Longpre, J. M., Cavelier, F.,
Tourwe, D., Gendron, L., Ballet, S. and Sarret, P. (2019). Neurotensin analogues
containing cyclic surrogates of tyrosine at position 11 improve NTS2 selectivity
leading to analgesia without hypotension and hypothermia. ACS Chem Neurosci 10,
4535-4544. doi: 10.1021/acschemneuro.9b00390
 171

Fanelli, R., Besserer-Offroy, É., René, A., Côté, J., Tétreault, P., Collerette-Tremblay, J.,
Longpré, J.-M., Leduc, R., Martinez, J., Sarret, P. and Cavelier, F. (2015). Synthesis
and characterization in vitro and in vivo of (L)-(trimethylsilyl)alanine containing
neurotensin analogues. J Med Chem 58, 7785-7795. doi:
10.1021/acs.jmedchem.5b00841
Fanelli, R., Floquet, N., Besserer-Offroy, E., Delort, B., Vivancos, M., Longpré, J. M.,
Renault, P., Martinez, J., Sarret, P. and Cavelier, F. (2017). Use of molecular
modeling to design selective NTS2 neurotensin analogues. J Med Chem 60, 3303-
3313. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01848
Lugrin, D., Vecchini, F., Doulut, S., Rodriguez, M., Martinez, J. and Kitabgi, P. (1991).
Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin: binding and
biological activities, and in vitro metabolic stability. Eur J Pharmacol 205, 191-198.
doi: 10.1016/0014-2999(91)90819-c
René, A., Vanthuyne, N., Martinez, J. and Cavelier, F. (2013). (L)-(Trimethylsilyl)alanine
synthesis exploiting hydroxypinanone-induced diastereoselective alkylation. Amino
Acids 45, 301-307. doi: 10.1007/s00726-013-1492-2
Vivet, B., Cavelier, F. and Martinez, J. (2000). Synthesis of Silaproline, a New Proline
Surrogate. Eur J Org Chem 2000, 807-811. doi: 10.1002/(SICI)1099-
0690(200003)2000:5<807::AID-EJOC807>3.0.CO;2-E
 172

DISCUSSION

1. Optimisation des propriétés pharmacologiques de la NT(8-13) : une avancée

vers le développement d’analogues neurotensinergiques à visée
thérapeutique.

À l’heure actuelle, aucune molécule neurotensinergique n’est utilisée en clinique,

mais les recherches sur le développement d’analogues neurotensinergiques ne cessent de
croître au fil des années. Ces différentes études ont mené à la synthèse d’analogues linéaires
(peptiques, non peptidiques, allostériques) et macrocycliques capables de lier et d’activer les
récepteurs NT et d’induire des effets physiologiques (analgésie, hypotension, hypothermie,
effet antipsychotique, effet anxiolytique …). Le but principal de ce projet est de développer
des analogues neurotensinergiques linéaires et sélectifs pour les récepteurs NTS2 pour traiter
la douleur chronique et diminuer l’anxiété qui y est associée. Néanmoins, pour envisager une
issue clinique, il faudra s’affranchir des principales limites des analogues de la NT, soit la
faible stabilité plasmatique et la distribution limitée au SNC.

Au cours de ce projet, nous avons développé quatre séries d’analogues

neurotensinergiques. Pour l'ensemble de ces composés, nous avons remplacé les résidus
arginine en position 8 et 9 par des lysines. Comme mentionné dans l’introduction, cette
modification facilite la synthèse chimique des composés sans pour autant affecter leurs
propriétés pharmacologiques.

• Série #1 : Les composés présentaient des modifications en position 8/9 (liaison

réduite), en position 10 (Silaproline) ((Besserer-Offroy et al., 2020); Tétreault et al.,
2020) et en position 13 ((L)‐(Trimethylsilyl)alanine (TMSAla)) (Fanelli et al., 2015).

• Série #2 : Lors du développement de la seconde série, l’équipe de recherche du Pr

Cavelier a d'abord réalisé une représentation 3D du récepteur NTS2 humain par
homologie de séquence avec le récepteur NTS1. Lors de la modélisation de
l’interaction de la NT(8-13) avec les deux récepteurs, ils ont observé que la tyrosine
en position 11 interagissait avec l’arginine212, chargée positivement, de la seconde
 173

boucle extracellulaire du récepteur NTS1 humain. À l’inverse, la Tyr11 interagissait

avec l’acide glutamique179, chargé négativement, du récepteur NTS2 humain. Afin
de cibler préférentiellement les récepteurs NTS2, ils ont substitué la tyrosine par une
lysine, chargée positivement, pour créer des interactions ioniques attractives avec
l’acide glutamique179 du récepteur NTS2. Cette modification a permis d’obtenir un
premier composé (JMV5836), 22 fois plus affin pour NTS2 (Fanelli et al., 2017).
Suite à ces observations, la lysine en position 11 a été combinée avec des
modifications de la série #1 telles que l’ajout d’une liaison réduite8-9 et la substitution
de la Leu13 par un TMSAla.

Nous avons par la suite poursuivi nos études de relation structure/activité afin d’augmenter
la sélectivité des composés envers les récepteurs NTS2. Pour cela, deux séries distinctes de
composés ont été conceptualisées et synthétisées :

• Série #3 : Pour cette série, de nouvelles modifications en position 11 ont été réalisées.
D’après la littérature, Richard et collaborateurs ont observé que lors de substitution
de la tyrosine par un (D)-Tryptophane (D-Trp), le composé était 9 fois plus affin pour
NTS2 (Richard et al., 2001). De plus, la présence d’une N-hTyr en position 11 induit
une perte totale de liaison sur NTS1 sans pour autant affecter l’affinité sur NTS2
(Held et al., 2013). L’AA synthétique N-hTyr consiste à allonger d’un carbone la
chaine latérale de la tyrosine pour rapprocher le groupement aromatique du récepteur
(Figure 18A). En se basant sur ces résultats, l’équipe du Pr Cavelier a substitué la
tyrosine par une N-hTyr et un D-Trp, mais également par une N-homo-Tryptamine
(N-hTrp), qui consiste à allonger d’un carbone la chaine latérale du tryptophane
(Figure 18A). Les modifications D-Trp, N-hTyr et N-hTrp en position 11 ont été
combinées avec des modifications réalisées dans la série #1.

• Série #4 : Dans cette dernière série, les positions 10 et 13 ont été modifiées par un
groupement cyclo-Fluor (CycloF). Le cycloF est un AA synthétique correspondant à
un cyclopropyl substitué par un groupement fluoroisopropyl (cercle jaune ; Figure
18B) Ce fluor peut être radiomarqué (18F) et servir de traceur en tomographie par
 174

émission de positrons (TEP) afin de caractériser la distribution du composé et/ou la

localisation des récepteurs NTS2. Comme seul le cycloF en position 10 a favorisé la
sélectivité pour NTS2, la proline a été substituée par un cyclopropyl substitué par un
groupement isopropyl (cyclo sans F ; cercle vert ; Figure 18B) ou un acide 2-
aminoisobutyrique (Aib) ou un fluor a été ajouté au cycle de la proline en
configuration stéréoisomère R ou S.

Le Tableau 7 résume l’impact des différentes modifications sur l’affinité

NTS1/NTS2, la sélectivité envers NTS2, la stabilité plasmatique et la lipophilicité (calcul du
coefficient de partage (cLog(P)) des composés. Pour la série de composés #3 et #4, il s’agit
de résultats additionnels non publiés. Afin de pouvoir les comparer avec les autres séries de
composés, ces résultats sont inclus dans la discussion. Les structures chimiques de chaque
résidu utilisé sont représentées dans la Figure 18.
 175

Affinité (nM) Sélec T1/2

Série Composé Modifications par rapport à la structure de base NT(8-13) cLog(P)
NTS2 plasma
hNTS1 hNTS2
NT(8-13) H-Arg8-Arg9-Pro10-Tyr11-Ile12-Leu13-OH 1.5 2.7 0.6 1.0 min -3.13
8 9 10 11 12 13
JMV438 H-Lys -Lys -Pro -Tyr -Ile -Leu -OH 4.0 1.1 3.6 1.6 min -0.39
8-9 10 11 12 13
JMV449 H-Lysψ[CH2NH]Lys -Pro -Tyr -Ile -Leu -OH 2.0 0.31 6 8.4 min -0.36
8 9 10 11 12 13
JMV2007 H-Lys -Lys -Pro -Tyr -Ile -TMSAla -OH 0.018 0.25 0.1 1.6 min 0.17
JMV5206 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Pro10-Tyr11-Ile12-TMSAla13-OH 2.5 0.55 4.5 2h 0.20
1 JMV2009 8 9 10 11 12
H-Lys -Lys -Sip -Tyr -Ile -Leu -OH 13
14 21 0.7 4.5 min 2.79
JMV5170 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Sip10-Tyr11-Ile12-Leu13-OH 300 130 2.3 22 h 2.82
8 9 10 11 12 13
JMV6184 H-Lys -Lys -Sip -Tyr -Ile - TMSAla -OH 55 16 3.4 3.5 min 3.35
8-9 10 11 12 13
JMV5296 H-Lysψ[CH2NH]Lys -Sip -Tyr -Ile - TMSAla -OH 610 24 25 20 h 3.38
JMV5836 H-Lys8-Lys9-Pro10-Lys11-Ile12-Leu13-OH 7 600 310 25 2.9 min -1.44
JMV5964 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Pro10-Lys11-Ile12-Leu13-OH 6 600 26 254 5 h -1.41
2
8 9 10 11 12 13
JMV5965 H-Lys -Lys -Pro -Lys -Ile -TMSAla -OH 710 76 9.3 2.8 min -0.88
JMV5966 H- Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Pro10-Lys11-Ile12-TMSAla13-OH 150 1.5 100 10 h -0.85
JMV4961 H-Lys8-Lys9-Pro10-N-hTyr11-Ile12-Leu13-OH >10μM 12 > 5 000 4.0 min 0.56
JMV5297 8-9 10 11
H-Lysψ[CH2NH]Lys -Pro -N-hTyr -Ile -TMSAla -OH 12 13 >10μM 14 > 5 000 > 24 h 1.16
JMV5298 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Sip10-N-hTyr11-Ile12-TMSAla13-OH >10μM 18 > 5 000 ND 5.05
JMV556 8 9 10 11 12
H-Lys -Lys -Pro - (D)Trp -Ile -Leu -OH 13 >10μM 382 > 5 000 5.5 min 0.27
3
JMV5504 8 9 10 11 12
H-Lys -Lys -Pro - (D)Trp -Ile -TMSAla -OH 13 3 600 8.5 423 10 min 0.83
JMV5308 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Pro10-(D)Trp11-Ile12-TMSAla13-OH 55 3.5 16 19 h 0.86
JMV5208 H-Lys8-Lys9-Pro10-N-hTrp11-Ile12-Leu13-OH >10μM 150 > 5 000 3.7 min 1.22
8-9 10 11 12 13
JMV5335 H-Lysψ[CH2NH]Lys -Pro -N-hTrp -Ile -TMSAla -OH >10μM 1.9 > 5 000 > 24 h 1.81
8-9 10 11 12 13
JMV7322 H-Lysψ[CH2NH]Lys -Aib -Tyr -Ile -Leu -OH 434 64 7 1h -0.71
JMV6630 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Pro10-Tyr11-Ile12-CycloF13-OH 2 360 310 8 ND -0.58
8-9 10 11 12 13
JMV6631 H-Lysψ[CH2NH]Lys -CycloF -Tyr -Ile -Leu -OH >10μM 160 > 5 000 > 24 h 0.21
4 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Cyclo(α-R,β-S-iPr)10-Tyr11-Ile12-
JMV7323 >10μM 130 > 5 000 > 24 h 0.37
Leu13-OH
JMV7320 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Pro(4S-F)10-Tyr11-Ile12-Leu13-OH 13 5 2.7 37 min -0.55
JMV7321 H-Lysψ[CH2NH]Lys8-9-Pro(4R-F)10-Tyr11-Ile12-Leu13-OH 2 0.3 7 9.3 min -0.55
 176

Tableau 7. Effet des différentes modifications sur l’affinité, la sélectivité, la stabilité

plasmatique et la lipophilicité.
Plus la couleur devient claire, moins le composé est affin pour le récepteur et plus la
sélectivité envers NTS2 et la stabilité plasmatique augmentent. La sélectivité est le rapport
entre l’affinité mesurée du composé pour NTS1 sur l’affinité mesurée pour NTS2. Plus la
valeur est élevée, plus le composé est sélectif pour les récepteurs NTS2. Le coefficient de
partage (cLog(P)) a été calculé à partir de la structure des composés grâce au logiciel
ChemBioDraw Ultra 13.0, et représente le degré de lipophilicité du composé.
Sélec : Sélectivité ; T1/2 : Temps de demi-vie; Valeurs de cLog(P) en gras : lipophilicité
convenable pour passer la BHE d’après l’étude de Doan et collaborateurs (Mahar Doan et
al., 2002).
177
 178

Figure 18. Structures chimiques des différentes modifications.

Les changements structuraux sont représentés en couleur sur la figure. A. Modifications en
position 8-9, 10, 11 et 13 des composés des séries #1 à 3. B. Modifications de la série #4.
Surlignement en : Bleu : groupement diméthylsilyle ; Rouge : groupement triméthylsilyle ;
Orange : absence du groupement carbonyle ; Violet : présence d’un fluor au niveau de la
proline; Jaune : cyclopropyl substitué par un groupement fluoroisopropyl; Vert :
cyclopropyl substitué par un groupement isopropyl. Aib : Acide 2-aminoisobutyrique.

Sélectivité envers NTS2

Au fil des quatre séries de composés, nous avons obtenu des analogues de plus en
plus sélectifs pour NTS2 (Tableau 7). Au niveau des modifications, nous constatons que la
présence d’une liaison réduite entre les deux lysines 8 et 9 (JMV449) ne modifie pas l’affinité
du composé pour les récepteurs NTS1 et NTS2. En revanche, le calcul de sélectivité laisse
penser que cette modification favorise légèrement la liaison pour NTS2.

La proline en position 10 a un rôle essentiel pour assurer la bonne conformation de

la NT(8-13). Sa substitution par une silaproline (JMV2009) ne modifie pas la conformation
de la molécule (Cavelier et al., 2002). Néanmoins, la présence d’un groupement
diméthylsilyle au niveau du cycle de la proline (cercle bleu ; Figure 18A) induit une baisse
d’affinité d’environ un Log pour les deux récepteurs (Tableau 7). Le groupement Sip est plus
volumineux que la proline, donc cette baisse d’affinité pourrait s’expliquer par un
encombrement stérique entre la molécule et les récepteurs.

La lipophilicité de la leucine en position 13 est importante, car la chaine latérale

interagit avec la pochette hydrophobe des récepteurs (Krumm et al., 2016; White et al.,
2012). Dans notre étude, nous avons substitué la leucine par un TMSAla (JMV2007), qui est
également un AA lipophile non chargé. La présence d’un groupement triméthylsilyle (cercle
rouge ; Figure 18A) à la fin de la chaine latérale de la leucine augmente l’affinité du composé
pour les récepteurs NTS1 et NTS2 d’environ un facteur 10 (Tableau 7) (Fanelli et al., 2015).
La combinaison d’un TMSAla avec une liaison réduite (JMV5206) n’affecte pas la liaison
du composé. En revanche, la présence d’une Sip combinée à la liaison réduite8-9 (JMV5170)
ou à un TMSAla13 (JMV6184) diminue l’affinité des composés envers NTS1 et NTS2
 179

(Tableau 7). En combinant ces trois modifications, nous avons obtenu un premier composé
légèrement sélectif pour NTS2 (JMV5296 ; Sélectivité : 25).

La tyrosine en position 11 est importante pour cibler le récepteur NTS2. Lors de la

réalisation d’un Alanine scan (Einsiedel et al., 2011) ou la substitution de la tyrosine par des
AA naturels ou non naturels (Tableau 4), une perte d’affinité est généralement observée
uniquement pour les récepteurs NTS1. La présence d’une lysine (JMV5836) induit une
baisse d’affinité importante pour NTS1, augmentant ainsi la sélectivité de plus de 10 fois
pour le récepteur NTS2 (Tableau 7). En revanche, la présence d’un N-hTyr (JMV4961), d’un
(D)Trp (JMV556) ou encore d’un N-h-Trp (JMV5208) induit une perte totale d’affinité pour
NTS1 (Ki > 10 µM) ce qui augmente considérablement la sélectivité du composé.
Au niveau des structures chimiques, nous observons que la tyrosine possède un cycle
aromatique avec une fonction hydroxyle (-OH) (Figure 18A). Ce groupement hydroxyle est
très important pour la liaison aux récepteurs, car la substitution de la Tyr11 par une
phénylalanine (Phe ; cycle aromatique sans fonction hydroxyle) entraine une diminution
d’affinité pour les récepteurs (Kitabgi et al., 1980; Quirion et al., 1980a). En revanche, la
présence d’un acide aminé non aromatique et chargée positivement (lysine ou ornithine)
favorise la liaison aux récepteurs NTS2. L’ajout d’une histidine, un AA chargé positivement
et aromatique (cycle imidazole), restaure l’affinité pour NTS1 et induit une perte de
sélectivité pour NTS2 (Fanelli et al., 2017). Il est donc préférable d’ajouter des AA chargés
positivement et non aromatiques pour cibler les récepteurs NTS2 afin de créer des
interactions ioniques attractives.
La substitution de la tyrosine par un (D)Trp (JMV556) ou une N-hTrp (JMV5208)
induit une perte totale d’affinité pour NTS1 et diminue également l’affinité pour NTS2, mais
ces deux composés sont tout de même sélectifs pour NTS2. Le groupement aromatique du
Trp est plus volumineux que celui de la tyrosine (Figure 18A). La perte d’affinité du JMV556
et JMV5208 pourrait s’expliquer par un encombrement stérique entre la molécule et les
récepteurs ou à un changement d’orientation des cycles aromatiques. En revanche, la
présence d’une N-hTyr (JMV4961) en position 11 provoque une perte totale d’affinité pour
NTS1 sans pour autant affecter l’affinité pour NTS2. En comparaison avec la tyrosine,
l'allongement d’un carbone de la chaine latérale permet de rapprocher le groupement
 180

hydroxyle du récepteur, ce qui favorise l’affinité du composé uniquement pour le récepteur

NTS2. D’après ces résultats, il serait intéressant d’observer si l’ajout d’un groupement
hydroxyle au niveau du cycle aromatique du Trp et de la N-hTrp pourrait augmenter la
sélectivité pour NTS2. Par contre, il se pourrait aussi que la fonction hydroxyle amplifie
l’encombrement stérique induit par le cycle aromatique du Trp.
La combinaison d’AA naturels (Lysine et (D)Trp) ou non naturels (N-hTrp et N-hTyr) en
position 11 avec des modifications décrites précédemment (liaison réduite8-9, Sip10 et
TMSAla13) a amélioré l’affinité des composés majoritairement pour NTS2 sans forcément
améliorer celle pour NTS1. Suite à ces différentes modifications, nous avons obtenu trois
composés (JMV5297, JMV5298 et JMV5335) très sélectifs pour NTS2 (sélectivité > 5 000).

Avec la dernière série de composés, nous avons observé que la présence d’un
cyclopropyl substitué par un groupement fluoroisopropyl (JMV6631) ou isopropyl
(JMV7323) en position 10 permettait de cibler uniquement le récepteur NTS2. Comme nous
l’avons mentionné précédemment, la position 10 est essentielle pour assurer la bonne
conformation de la NT(8-13). Il est donc probable que ces deux groupements induisent un
changement conformationnel de la molécule qui favorise uniquement la liaison à NTS2. En
revanche, la configuration stéréoisomère (R ou S ; JMV7321 et JMV7320) du fluor au niveau
du cycle de la proline ou la présence d’un Aib (JMV7322) n’a aucun effet sur la sélectivité
(Tableau 7 ; Figure 18B).

Tous ces résultats sont très encourageants et montrent qu’une modification en

position 11 permet de cibler le récepteur NTS2. De plus, modifier la position 10 pourrait
induire un changement conformationnel de la molécule qui favoriserait également la liaison
à NTS2. En revanche, pour la plupart des modifications effectuées, les composés sont
toujours affins pour NTS2. Ces résultats montrent que le site de liaison du récepteur NTS2
doit être moins restreint et plus permissif que celui de NTS1.
 181

Augmentation de la stabilité plasmatique

Une limite du système neurotensinergique est la faible stabilité plasmatique de la

NT(8-13), possédant un temps de demi-vie inférieur à 2 minutes (Aronin et al., 1982; Fanelli
et al., 2015; Schindler et al., 2019; Sousbie et al., 2018b). Cette rapide dégradation
enzymatique s’explique par la présence de trois sites de clivage distincts entre l’Arg8 – Arg9,
Pro10 – Tyr11 et Tyr11 – Ile12 par trois Zn-métallopeptidases (EC3.4.24.15, EC3.4.24.16 et
EC3.4.24.11) (Checler et al., 1983; 1984; 1985). Avec une demi-vie plasmatique aussi
courte, aucune injection périphérique n’est envisageable pour avoir une action centrale.

L’effet des différentes modifications sur la stabilité plasmatique des composés a

également été déterminé (Tableau 7). La présence de deux lysines en positions 8 et 9
(JMV438) et d’un TMSAla (JMV2007) en position 13 n’a aucun effet protecteur envers la
biodégradation des composés (T1/2 < 2 min; Tableau 7). En revanche, la présence d’une
liaison réduite entre les deux lysines8-9 (JMV449) semble protéger le composé du premier
clivage plasmatique (2 < T1/2 < 10 min). De plus, une légère augmentation du temps de demi-
vie a été observée en présence d’une silaproline en position 10 (JMV2009) ou d’une
modification en position 11 (Lys, JMV5836; N-hTyr; JMV4961; (D)-Trp; JMV556; N-hTrp
(JMV5208)). Ces résultats laissent supposer que ces modifications en positions 10 et 11
protègent les composés du second et du troisième clivage, respectivement. Lorsque nous
combinons la liaison réduite8-9 avec des modifications en position 10 et/ou 11 et/ou 13, nous
augmentons significativement la stabilité plasmatique des composés, avec une demi-vie
dépassant 1 heure voire même 24h pour certains d’entre eux (JMV5297, JMV5335,
JMV6631, et JMV7323). Face à ces résultats, nous observons l’importance d’avoir une
liaison réduite entre les deux lysines pour protéger le composé du premier clivage
plasmatique. Au niveau structural, l’ajout d’une liaison réduite consiste à remplacer le
groupement amide en amine (retrait du groupement cétone ; Figure 18). L’absence de ce
groupement carbonyle empêche l'endopeptidase EC3.4.24.15 d’hydrolyser le lien peptidique
(Checler et al., 1987). Néanmoins, cette modification seule ne suffit pas pour protéger
totalement le composé de la dégradation plasmatique. Il faut absolument qu’elle soit
combinée avec d’autres modifications aux positions 10, 11 et 13 pour empêcher les deux
 182

autres clivages. Ces modifications sont donc importantes, car elles doivent induire un
remodelage structural qui empêche la reconnaissance et/ou l’action des endopeptidases
EC.3.4.24.11 et EC.3.4.24.16 (Checler et al., 1986; 1987). De plus, l’ajout de l’AN2
(composé ANG2002) ou d’un pharmacophore opioïdergique (Dmt-D-Lys-Phe-Phe ;
composé hybride Opioïde-Neurotensine : PK20) au niveau N-terminal de la NT ou de la
NT(8-13), respectivement, augmente considérablement la stabilité de la portion
neurotensinergique (Stabilité plasmatique ANG2002 > 7 heures ; T1/2 PK20 > 30 heures)
(Demeule et al., 2014; Kleczkowska et al., 2013). Ces observations sont intéressantes si nous
envisageons un jour de coupler nos composés à une de ces deux molécules.

Dans ce projet, la stabilité plasmatique des composés a été déterminée in vitro dans
du plasma de rat. Cet essai permet d’avoir un premier aperçu de l’effet des modifications sur
la résistance enzymatique des composés. En revanche, des études pharmacocinétiques in vivo
seront nécessaires pour déterminer plus précisément leur stabilité plasmatique après une
injection i.v. Les valeurs de demi-vie seront certainement plus faibles que lors des tests in
vitro puisque d'autres facteurs s'ajouteront, tels que le premier passage hépatique et
pulmonaire, ainsi que la clairance rénale.

Des composés plus lipophiles pour passer la BHE

La difficulté de la NT à passer la BHE représente un second obstacle pour son

utilisation en clinique. En effet, l’injection systémique de NT n’induit pas d’effet
analgésique, puisqu’une faible quantité se retrouve au SNC (Demeule et al., 2014). Le but
de notre étude étant de développer des composés à visée thérapeutique pour traiter la douleur
et l’anxiété, il est donc primordial que nos composés passent la BHE puisque la régulation
de ces deux pathologies se fait au niveau central. Actuellement lors de nos tests in vivo, nous
injectons nos analogues par voie intrathécale pour évaluer leur potentiel analgésique. En
revanche, ce mode d’administration n’est pas optimal chez les patients. Chez l’Homme, les
voies d’administration les plus préconisées sont par voie intraveineuse, sous-cutanée,
intrapéritonéale et per os. Pour envisager ces modes d’administration, il est primordial
d’augmenter la stabilité plasmatique des composés ainsi que leur biodisponibilité pour
 183

améliorer leur propriété d’absorption et leur perméabilité à travers la BHE. En 1999, l’équipe
de recherche de Lipinski a établi des règles afin de prédire si une molécule présente les
propriétés potentielles pour traverser la BHE (Pajouhesh and Lenz, 2005). Selon ces règles,
il est probable qu’un composé traverse la BHE si :
- Le poids moléculaire ≤ 400 g/mol.
- Le nombre de liaisons hydrogène donneur ≤ 3.
- Le nombre de liaisons hydrogène accepteur ≤ 7.
- Le coefficient de partage (Log(P)) ≤ 5 (lipophilicité).

Le caractère lipophile d’un composé est essentiel, puisqu’il sera plus susceptible de
traverser les membranes plasmiques composées de lipides qu’une molécule hydrophile. La
lipophilicité est déterminée en mesurant le Log(P), qui correspond au logarithme du rapport
de concentration de la molécule dans l’octanol et dans l’eau (Log(P) :
[molécule]Octanol/[molécule]eau). Plus le Log(P) est élevé, plus le composé est lipophile.
Néanmoins, une molécule trop lipophile s’accumulera dans les graisses et les membranes
plasmiques au lieu de les traverser, ralentissant ainsi sa distribution. Pour favoriser le passage
de la BHE, Lipinski a déterminé que le Log(P) de la molécule doit être inférieur ou égal à 5
(Pajouhesh and Lenz, 2005). Pour notre étude, le Log(P) de nos composés a été calculé à
partir de leur structure chimique grâce au logiciel ChemBioDraw Ultra 13.0 (Tableau 7).

Tout d’abord, nous pouvons observer que la NT(8-13) est hydrophile, avec un
cLog(P) de -3.13. En revanche, la substitution des deux Arg8-9 par deux lysines augmente
d’un facteur dix la lipophilicité (JMV438). Alors que la liaison réduite8-9 n’a aucun effet, la
présence d’un TMSAla13 (JMV2007), d’une Sip10 (JMV2009), d’un (D)-Trp11 (JMV556),
d’une N-h-Trp11 (JMV5208) et d’une N-hTyr11 (JMV4961) augmente grandement la
lipophilicité des composés (0.17 < cLog(P) < 1.22). En revanche, la présence d’une Lysine
en position 11 (JMV5836) diminue la lipophilicité. Hormis pour la Lys11, la combinaison de
ces différentes modifications a permis d’obtenir des composés beaucoup plus lipophiles
(0.20 < cLog(P) < 5.05) que la NT(8-13). La Silaproline a la particularité d’être 14 fois plus
lipophile que la proline (Log(P) : 1.3 pour la Sip versus Log(P) : 0.094 pour la Pro) (Pujals
et al., 2006). Cette augmentation de lipophilicité se confirme dans nos résultats car nous
 184

observons que tous les composés possédant une Sip en position 10 en combinaison ou non
avec d’autres modifications (JMV2009, JMV5170, JMV6184, JMV5296 et JMV5298) sont
très lipophiles (cLog(P) > 2.5 ; Tableau 7). Cette modification est donc très importante et
indispensable pour augmenter la lipophilicité des composés. Au niveau de la série #4, la
présence d’un cyclopropyl substitué par un groupement fluoroisopropyl (JMV6631) ou
isopropyl (JMV7323) en position 10 améliore légèrement la lipophilicité, contrairement à
l’ajout d’un Fluor au niveau du cycle de la proline qui n’a aucun effet (JMV7320 et
JMV7321).

En 2002, l’équipe de recherche de Mahar Doan a comparé les propriétés physico-

chimiques de médicaments agissant ou non au niveau du SNC. D’après leur étude, ils ont
observé que les composés qui passent la BHE sont plus lipophiles (0.16 < cLog(P) < 6.59 ;
moyenne : 3.43) que les autres médicaments (-2.81 < cLog(P) < 6.09 ; moyenne : 2.78)
(Mahar Doan et al., 2002). En se fiant à ces résultats et aux règles de Lipinski, nous pensons
que 15 composés (valeurs cLog(P) en gras ; Tableau 7) sont suffisamment lipophiles pour
passer la BHE.

Le poids moléculaire est un second critère à prendre en considération. D’après les

règles de Lipinski, le poids moléculaire du composé ne doit pas être élevé (masse molaire ≤
400 g/mol) pour diffuser passivement à travers la BHE (Pajouhesh and Lenz, 2005).
Actuellement, tous nos composés linéaires ont un poids moléculaire proche de celui de la
NT(8-13), soit autour de 800–900 g/mol. Les macrocycles neurotensinergiques développés
pas l’équipe du Pr Marsault (Tableau 5) ont l’avantage d’avoir un poids moléculaire
légèrement plus faible, autour de 700 g/mol. Néanmoins, cet écart de masse moléculaire avec
les règles de Lipinski est tout de même important et pourrait limiter le passage de la BHE
malgré leur caractère lipophile. D’après les composés neurotensinergiques présents dans la
littérature qui sont censés passer la BHE (NT1, NT66L, NT69L, NT77L, NT79, HPI-201,
HPI-363, JMV1193, JMV2012), le poids moléculaire ne semble pas être limite (Banks et al.,
1995; Boules et al., 2001a; 2003; Bredeloux et al., 2008; Lee et al., 2014; Smith et al., 2012;
Tyler et al., 1999; VanKemmel, 1996; Wei et al., 2013). En effet, tous ces composés ont un
poids moléculaire semblable ou supérieur à celui de la NT(8-13). De plus, le macrocycle
 185

JMV2012 qui consiste à la dimérisation et la cyclisation de la NT(8-13) est capable de passer

la BHE malgré un poids moléculaire très élevé d’environ 1600 g/mol.

Les deux derniers paramètres en prendre en considération selon les règles de Lipinski
sont le nombre de liaisons hydrogène donneur (≤ 3) et accepteur (≤ 7). D’après sa séquence,
la NT(8-13) compte 11 liaisons hydrogènes donneur et 11 liaisons hydrogènes accepteur.
Nos nouveaux composés étant basés sur la même séquence peptidique que la NT(8-13), alors
il est probable qu’eux aussi ne respectent pas ces deux règles.

Afin de se faire une idée du potentiel de distribution cérébrale de nos composés, des
études in vitro de perméabilité membranaire pourront être envisagées en utilisant l'essai
PAMPA (passage au travers d'une couche de phospholipides), l'essai Caco-2 (passage au
travers d'une couche de cellules épithéliales) ou encore, à l'aide d'un modèle de BHE misant
sur une tri-culture sur filtre perméable Transwell (cellules endothéliales vasculaires
cérébrales, astrocytes et péricytes) (Hellinger et al., 2012; Martins et al., 2016; Nakagawa et
al., 2007; Stone et al., 2019). Ces résultats nous guideront vers une étude in vivo, à l'aide de
perfusion cérébrale in situ et/ou en réalisant une microdialyse intracérébrale (Smith and
Allen, 2003; Westergren et al., 1995).

Même si uniquement une fraction de la dose injectée parvient à traverser la BHE, il

est tout de même possible d'y observer une efficacité. Par exemple, la morphine passe très
faiblement la BHE en raison de sa faible liposolubilité (cLog(P) : 0.90). En effet, 0.08% de
la dose injectée se retrouve au niveau cérébral, mais cette fraction est suffisante pour induire
un puissant effet analgésique lors d’une injection systémique (Bickel et al., 1996; Wu et al.,
1997). Or, l’injection i.v. de NT ne produit aucun effet analgésique (Demeule et al., 2014).
En comparant avec la morphine, cette absence d’effet pourrait s’expliquer par sa masse
moléculaire qui est plus élevée (NT : 1672 g/mol NT ; Morphine : 285 g/mol) et une
lipophilicité plus faible. Néanmoins, des études de perfusion cérébrale in situ ont montré que
la NT et la morphine avaient la même constante d’influx pour entrer dans le cerveau (Kin :
2.2 – 2.7 x10-4 mL/s/g) et le même volume de distribution (Vd : 4.9 – 7.4 mL/100 g de
cerveau). La particularité de ces expériences in situ est qu’il y a peu de sang dans les
 186

capillaires cérébraux, donc la stabilité des composés n’est pas un paramètre à prendre en
considération. Il se pourrait donc que dans ces expériences la NT passe la BHE avec les
mêmes paramètres que la morphine tout simplement, car elle n’est pas dégradée. La
dégradation plasmatique très rapide de la NT suite à son administration pourrait limiter sa
biodisponibilité et donc, son acheminement vers le cerveau. Toutes ces observations
montrent la complexité qu’il y a pour développer des composés qui agissent au niveau du
cerveau.

Outre les tests sur la pression artérielle, nos composés n’ont jamais été injectés par
voie périphérique. Même s’ils sont assez lipophiles, nous pensons que leur haut poids
moléculaire pourrait être un facteur limitant pour qu’ils puissent traverser passivement la
BHE. Si nos composés ne passent pas la BHE, alors nous pourrons envisager de les coupler
au peptide AN2. Comme nous l’avons évoqué dans l’introduction, ce peptide de 19 AA
(Figure 17) se lie aux récepteurs LRP1 présents sur les cellules endothéliales vasculaires
cérébrales et permet un transport actif des molécules de la circulation sanguine vers le
parenchyme cérébral (Demeule et al., 2008). Dans notre laboratoire, l’AN2 a déjà été couplé
à la NT(1-13), la NT(8-13), la morphine et à son métabolite le M6G. Ce couplage a permis
de favoriser leur passage à travers la BHE et d’induire un puissant effet analgésique suite à
une injection i.v. à des doses très faibles (Demeule et al., 2014; Eiselt et al., 2020).
Actuellement, nous travaillons pour coupler nos ligands neurotensinergiques linéaires et
macrocycliques les plus pertinents à l’AN2. L’AN2 est donc un peptide très prometteur pour
l’avancement de nos travaux et nous espérons qu’à l’issue de ce couplage, nos composés
pourront traverser la BHE. Si c’est le cas, cela représentera une avancée de plus dans le
développement de composés neurotensinergiques NTS2-sélectifs à visée thérapeutique. En
revanche, il faudra que nos composés soient suffisamment affins et puissants pour engendrer
un effet physiologique, malgré que seulement une faible quantité atteindra le système
nerveux central.

En 2010, l’équipe de Rossi et collaborateur a observé qu’une application topique de

dérivés neurotensinergiques (NT71 et NT72) induisait de l’analgésie lors de test de douleur
aiguë thermique (Rossi et al., 2010). Par la suite, une autre étude a montré que
 187

l’administration topique de ces deux composés au niveau de la cornée de lapin produisait

également de l’analgésie (Kim et al., 2014). Notre objectif principal est de traiter la douleur
chronique, mais d’après ces résultats nous constatons que les propriétés analgésiques des
analogues NT peuvent être utilisées en douleur aiguë sans avoir à optimiser leur perméabilité
pour passer la BHE. Ces observations sont rassurantes, car si la stratégie avec l’AN2 ne
fonctionne pas, alors nous pourrons diriger notre étude vers le traitement de douleur aiguë et
vérifier si une application topique de nos composés peut diminuer ce type de douleur. De
plus, l’avantage de ce mode d’administration est que les effets indésirables médiés par
l’activation des récepteurs NTS1 (hypotension et hypothermie) sont nettement réduits.

2. Une molécule et une cible pour soulager douleur chronique et anxiété.

Suite à la découverte de la NT dans les années 1970, le nombre d’études portant sur
le système neurotensinergique et la douleur n’a cessé d’augmenter. Dans notre laboratoire,
nous avons montré que l’activation des récepteurs NTS1 et/ou NTS2 induisait de l’analgésie
chez le rat dans des modèles de douleur aiguë (test de retrait de la queue), tonique (test à la
formaline) et chronique neuropathique (ligature du nerf sciatique) (Dubuc et al., 1999;
Guillemette et al., 2012; Roussy et al., 2008; 2009; Sarret et al., 2005; Tétreault et al., 2013).
Depuis 2007, différentes équipes de recherche se sont intéressées à l’effet de la NT sur
l’anxiété. À travers ces études, il a été montré que des agonistes NTS1 et NTS2-sélectifs
pouvaient diminuer l’anxiété (Hou et al., 2011; Ollmann et al., 2015; Shilling and Feifel,
2008; Steele et al., 2017). Face au lien étroit entre la douleur et l’anxiété et l’implication du
système neurotensinergique dans ces deux conditions, l’objectif de ce projet était de
développer de nouveaux analogues neurotensinergiques qui ciblent principalement les
récepteurs NTS2 afin de traiter à la fois la douleur chronique et l’anxiété qui y est associée.

Douleur chronique

Le développement d’analogues NTS2-sélectifs est assez récent et peu d'entre eux ont
été testés en douleur. Le JMV431 (Boc-Arg-Arg-Pro-Tyr-ψ(CH2NH)-Ile-Leu-OH ; Ki
 188

NTS1 : 3 315 nM ; Ki NTS2 : 38 nM ; sélectivité pour NTS2 : 87) fut le premier peptide
NTS2-sélectif synthétisé en 1999 par l’équipe du Pr Jean Martinez (Dubuc et al., 1999). Ce
composé a été caractérisé in vivo dans notre laboratoire, et son injection i.t. induit un effet
analgésique soutenu en douleur thermique aiguë (≃ 20 μg/rat), tonique (dès 30 μg/kg) ainsi
qu’en douleur chronique neuropathique (dès 30 μg/kg) (Roussy et al., 2009; Sarret et al.,
2005; Tétreault et al., 2013). Par la suite, Boules et collaborateurs ont développé l’analogue
NT79 (N-methyl-Arg-Arg-Pro-D-3,1-Nal-tert-Leu-Ile-OH ; Kd NTS1 : 2100 nM ; Kd
NTS2 : 10 nM ; sélectivité pour NTS2 : 210). Il est intéressant d’observer que l’injection i.p.
de ce composé a un effet analgésique en douleur viscérale et douleur tonique, et ne provoque
pas d’hypotension ni d’hypothermie (Boules et al., 2010; 2011). Ces résultats suggèrent que
ce composé doit passer la BHE, mais aucune étude n’a été réalisée pour mesurer ses
paramètres pharmacologiques de passage (Kin et de Vd). Récemment, notre laboratoire a
caractérisé un nouveau composé, le composé 13 (H-β3hLys-Lys-Pro-(6-OH)Tic-Tle-Leu-
OH ; Ki NTS1 : 3786 nM ; Ki NTS2 : 2.9 nM ; sélectivité pour NTS2 : 1324). Cette
molécule est très sélective pour NTS2 (sélectivité : 1324) et induit de l’analgésie en douleur
tonique suite à son administration i.t., sans avoir d’effet sur la pression artérielle et la
température corporelle (Eiselt et al., 2019b). En revanche, les composés très sélectifs pour
NTS2 (Tableau 4) qui ont une Fluorophenyltyrosine (FPTyr), une N-homo-tyramine (N-
hTyr), ou un Tétrahydrofurane (TAA(OH) ou TAA(Br)) en position 11 n’ont jamais été
testés en douleur (Held et al., 2012; Pratsch et al., 2011; Simeth et al., 2017).

Parmi nos quatre séries de composés, nous avons décidé de tester in vivo uniquement
les composés les plus stables (T1/2 > 1 heure) et les plus sélectifs pour NTS2 de chaque série
dans différents types de douleur (aiguë, tonique et chronique). Pour la série #1, le JMV5296
a été notre premier composé stable présentant une affinité accrue pour NTS2 (sélectivité >
25 ; Article n°1 de la thèse). Ensuite dans la série #2, nous avons testé les dérivés JMV5964
et JMV5966 qui sont plus de cent fois sélectifs pour NTS2 (Article n°2 de la thèse). Pour
finir, dans la série #3 et #4, nous avons évalué le potentiel analgésique des composés
uniquement affins pour NTS2, à savoir, le JMV5297, JMV5335 et JMV6631 (Tableau 8).
Ces résultats sont additionnels et ne sont pas encore publiés, mais ils seront tout de même
inclus dans la discussion.
 189

Effet analgésique
Sélectivité Dose Douleur tonique Douleur chronique
Série Composé Douleur
NTS2 (μg/kg) (Phase
aiguë Inflammatoire Neuropathique
inflammatoire)
++
30 - - -
(20 min)
1 JMV5296 > 10
++ ++
60 +++ -
(30 min) (30 min)
+ +
JMV5964 + ∅
2 ≥ 100 30 (10 min) (15 min)
JMV5966 +++ +++ +++ +++
+
30 + - -
(10 min)
JMV5297
++ ++
90 + -
(20 min) (30 min)
3 > 5 000
+
30 ∅ - -
(10 min)
JMV5335
++
90 + - -
(20 min)
+
30 - - -
(10 min)
4 JMV6631 > 5 000
++
90 + - -
(40 min)
Effet analgésique : ∅ : aucun ; + : faible ; ++ : modéré ; +++ : fort ; - : non testé

Tableau 8. Effet analgésique des composés NTS2-sélectifs dans différents types de

douleur.
Tests chez le rat : Douleur aiguë : test de retrait de la queue ; douleur tonique : test à la
formaline ; douleur chronique inflammatoire : modèle d’arthrose induit par l’injection de
CFA ; douleur chronique neuropathique : modèle de constriction du nerf sciatique provoqué
par la ligature du nerf. Pour les composés qui n’ont pas un effet analgésique soutenu, la durée
est indiquée entre parenthèses. L’absence de valeur signifie que le composé est analgésique
pendant toute la période du test (douleur aiguë : 60 minutes ; phase inflammatoire : de 21 à
60 minutes post-injection pour la douleur tonique ; douleur chronique : 90 minutes).

Nos résultats montrent que seul le JMV5966 est capable d’induire une analgésie
soutenue jusqu’à 60 minutes post-injection à une dose de 30 μg/kg (Tableau 8). Le JMV5296
ou les composés très sélectifs pour NTS2 (JMV5297, JMV5335 et JMV6631) semblent être
moins puissants. En effet, pour une même dose ou une dose supérieure (double ou triple), ils
n’induisent pas un effet analgésique aussi soutenu et fort que le JMV5966. Comparativement
aux analogues NTS2-sélectifs déjà publiés, le JMV5966 est plus puissant que le JMV431 en
 190

douleur aiguë thermique et en douleur tonique (Roussy et al., 2009; Sarret et al., 2005). Bien
qu’il soit moins sélectif pour NTS2, le JMV5966 possède les mêmes propriétés analgésiques
en douleur tonique que le composé 13 (Eiselt et al., 2019b). En utilisant des antagonistes des
récepteurs NTS1 (SR48692) et NTS2 (NTRC-844), nous avons pu confirmer que l'effet
analgésique du JMV5966 était principalement médié par l’activation de NTS2.

Le JMV5296, qui présente une affinité résiduelle pour NTS1 (Ki :610 nM), est moins
puissant en analgésie, mais induit de l’hypotension lorsqu’il est injecté i.v. à 0.1 mg/kg (i.v.),
contrairement au JMV5966. Face à ces observations, il serait intéressant d’étudier l’action
de ces composés sur les différentes voies de signalisation des récepteurs NTS1. Cela
permettrait de déterminer si ces deux analogues sont des agonistes biaisés sur la voie des
protéines G ou le recrutement des β-arrestines. Actuellement, aucune voie de signalisation
n’a été associée à l’effet analgésique du système neurotensinergique. L’effet analgésique du
système opioïdergique est médié par l’activation des protéines G et notamment de la protéine
Gαi/o (Kliewer et al., 2019; Machelska and Celik, 2018; Sánchez-Blázquez et al., 2001), donc
il serait probable qu’il en soit de même pour le système neurotensinergique. Pour les
composés affins pour NTS1, nous pourrions évaluer leur capacité à activer les voies de
signalisation et à induire le recrutement des β-arrestines par des essais de transfert d’énergie
de bioluminescence par résonance (BRET ; mesure de l’activation des protéines G ou du
recrutement des β-arrestines) ou par des essais de transfert d’énergie entre molécules
fluorescentes (FRET ; mesure de la production des seconds messagers (AMPc et IP1)). Par
la suite, la corrélation de ces résultats avec leurs effets analgésiques permettrait de déterminer
si ce sont des agonistes biaisés. En fonction des résultats, nous pourrons également
caractériser par quelle voie de signalisation est médiée l’effet analgésique du système
neurotensinergique. En revanche, la difficulté se pose pour étudier les voies de signalisation
de NTS2, car à l’heure actuelle, nous n’avons aucun essai fonctionnel (BRET, FRET,
MAPKinase, internalisation…) qui permet de les caractériser.

Nos résultats montrent que les composés NTS2-sélectifs qui ne sont pas du tout affins
pour NTS1 sont moins bons en analgésie comparé à ceux ayant une affinité résiduelle, de
l’ordre de 100 nM. Prenons par exemple, le JMV5335 (Ki : 1.9 nM pour NTS2) qui a la
 191

même affinité pour NTS2 que le JMV5966, mais qui n’est absolument pas affin pour NTS1.
Injecté à la même dose (30 μg/kg) ou à une dose supérieure (90 μg/kg), son effet analgésique
est beaucoup plus faible que celui du JMV5966. Même si nous avons montré que l’effet
analgésique du JMV5966 était médié principalement par l’activation des récepteurs NTS2,
l’affinité résiduelle pour NTS1 semble tout de même importante. Face à ces résultats, nous
pouvons remettre en question l’intérêt de développer des composés uniquement affins pour
NTS2 pour traiter la douleur. Malgré son affinité pour NTS1, le JMV5966 n’induit pas
d’hypothermie (30 μg/kg ; i.t.) et d’hypotension (0.01mg/kg ; i.v.). Donc, pour avoir un effet
analgésique durable, nous nous demandons si finalement, il n’est pas préférable d’avoir des
composés NTS2-sélectifs qui sont un peu affins pour NTS1 (Ki > 100 nM) plutôt que des
composés uniquement affins pour NTS2. Pour ces deux types de composés, il faudra
s’assurer que l’affinité résiduelle pour NTS1 ou l’augmentation des doses pour les composés
uniquement affins pour NTS2 n’engendrent pas d’effets indésirables.

Outre l’affinité et les voies de signalisation, la lipophilicité des composés semble être
aussi importante. Pour nos tests in vivo, les composés sont injectés i.t. soit directement dans
la moelle épinière qui a la particularité d’être lipophile. Si le composé est trop lipophile, il
se pourrait qu’il s’accumule dans la moelle épinière au lieu de diffuser dans le LCR. D’après
l’étude de Payne et collaborateurs en 1996, ils ont observé que la méthadone (composé
lipophile ; log (P) : 3.93) n’était pas détectée dans le LCR après une injection i.t.
contrairement à l’hydromorphone qui est un composé moins lipophile (Log(P) :1.62) (Payne
et al., 1996). En comparant nos résultats avec les valeurs du cLog(P) de nos composés, nous
observons que le JMV5966 est le composé le plus analgésique, mais également le moins
lipophile (cLog (P) : -0.85), contrairement aux autres composés (1.16 < cLog(P) < 3.38).
Donc, il se pourrait que la lipophilicité des composés soit également un paramètre à prendre
en considération lors des injections i.t. Néanmoins, cela ne semble pas être toujours le cas,
car le JMV5296 est très lipophile (cLog(P) : 3.38), mais il exerce tout de même un effet
analgésique soutenu à 60μg/kg (Tableau 8).

Actuellement, nous n’avons pas déterminé le mécanisme d’action de nos composés.

La localisation des récepteurs au niveau de la ME et des DRG, ainsi que l’effet analgésique
 192

des analogues neurotensinergiques en douleur aiguë thermique et viscérale (injection i.t.)

prouvent que le système neurotensinergique est impliqué dans la modulation spinale de la
douleur (Fanelli et al., 2015; Sarret et al., 2005; Tétreault et al., 2020). Lors du test de
formaline (douleur tonique), l’injection d’une solution de 2% formaldéhyde dans la patte
arrière de l’animal induit différentes réactions nociceptives. La flexion de la patte injectée
est décrite comme un réflexe spinal, alors que le léchage, le secouement et le mordillement
de la patte sont considérés comme des réponses supraspinales (Dubuisson and Dennis, 1977;
Porro et al., 2003). L’injection i.t. d’agoniste NTS2-sélectifs (lévocabastine et JMV431) est
capable de diminuer ces deux réactions nociceptives attestant de l’implication de ces
récepteurs dans la régulation spinale et supraspinale de la douleur (Roussy et al., 2009). Pour
déterminer le mécanisme d’action de nos composés, nous pourrions également regarder leurs
effets sur ces deux paramètres. De plus, l’injection de formaline provoque également une
augmentation significative du facteur de transcription c-fos au niveau de la moelle épinière.
La quantification de c-fos est utilisée comme marqueur fonctionnel pour identifier
l’activation des neurones spinaux lors de stimulation nociceptive, et l’injection intrathécale
d’analogues NTS1 ou NTS2 sélectifs diminue l’expression de c-fos (Roussy et al., 2008;
2009). Seul le JMV5296 et JMV5966 induisent un puissant effet analgésique durant la phase
inflammatoire (de 21 à 60 minutes post injection de formaline). Pour identifier si ces
nouveaux analogues ont un effet au niveau spinal, il serait donc intéressant de quantifier ce
marqueur c-fos après leur administration par voie i.t. Une baisse significative de son
expression signifierait qu’ils agissent au niveau spinal pour réduire l’activation neuronale et
diminuer ainsi le message douloureux.

Les récepteurs neurotensinergiques sont également présents au niveau du cerveau

dans des zones impliquées dans les voies ascendantes et descendantes de la douleur. De plus,
l’effet analgésique de la NT et de ses dérivés suite à une injection i.c.v. ou localisée dans des
régions spécifiques du cerveau montre leur implication dans la régulation supraspinale de la
douleur (Dubuc et al., 1992; Furuta et al., 1984; Gui et al., 2004; Urban and Smith, 1993;
1994). Tel que mentionné précédemment, le test de la formaline permet d’avoir un premier
aperçu sur le mécanisme d’action de nos composés (action au niveau spinal et/ou
supraspinal). Or, il serait intéressant d’élucider plus en détail leur mécanisme d’action sur la
 193

voie descendante de la douleur. Cette voie est constituée du PAG qui projette dans la ME via
la RVM, et permet de faciliter ou inhiber la transmission nociceptive. L’injection d’une forte
concentration de NT au niveau du RVM inhibe le message douloureux en activant les
récepteurs neurotensinergiques présents sur les cellules « On » (qui augmentent la
transmission du message douleur) et « Off » (qui diminuent la transmission du message
douleur) (Neubert et al., 2004). Au niveau des cellules « Off », l’activation des récepteurs
NTS1 et NTS2 induit la relâche de la 5-HT et/ou de la NA, respectivement, dans la moelle
épinière et inhibe le message douloureux (Buhler et al., 2008). Pour le JMV5966, nous
pensons que son effet analgésique au niveau supraspinal pourrait être médié par la libération
de NA dans la ME suite à l’activation des récepteurs NTS2 présents sur les cellules « Off ».
Même si son analgésie est principalement médiée par l’activation de NTS2, il se pourrait
qu’il y ait également une libération de 5-HT médiée par son affinité résiduelle pour NTS1.
La libération simultanément de NA et de 5-HT expliquerait que son effet analgésique soit
aussi puissant après une injection à faible dose (30 μg/kg). En revanche, les composés très
sélectifs pour NTS2 seraient moins puissants tout simplement, car ils induiraient uniquement
la libération de NA. Pour produire un effet analgésique soutenu, il faudrait augmenter leurs
doses pour que la quantité de NA relâchée dans la ME soit suffisante pour inhiber totalement
le message douloureux. Pour vérifier cette hypothèse, il serait intéressant de doser la quantité
de neurotransmetteurs libérée dans la ME après une injection i.t. de nos composés. De plus,
nous pourrions aussi administrer préalablement des antagonistes adrénergiques (Prazosine
pour bloquer les récepteurs α1 et Yohimbine pour les récepteurs α2) et/ou sérotoninergiques
(Méthysergide) au niveau spinal et observer si cela diminue l’effet analgésique de nos
composés.

Le JMV5966 est le composé le plus prometteur, car il possède également des

propriétés analgésiques puissantes en douleur chronique inflammatoire et neuropathique. En
clinique, près de la moitié des patients souffrant de douleur chronique présentent de l’anxiété
(Kroenke et al., 2013). En 1992, l’équipe de recherche de Ruiz a observé une diminution du
taux plasmatique de NT chez des patients souffrant d’anxiété (Saiz Ruiz et al., 1992). Ces
résultats peuvent être corrélés à ceux de l’équipe de Maes et collaborateurs qui ont constaté
une augmentation du taux plasmatique de la propyl endopeptidase (EC.3.4.21.26), une
 194

endopeptidase responsable de la dégradation de la NT, chez des patients souffrant de stress

post-traumatique (Maes et al., 1999). De plus, plusieurs études ont également confirmé
l’implication du système neurotensinergique et des récepteurs NTS2 dans l’anxiété dans des
modèles murins (Fitzpatrick et al., 2012; Hou et al., 2011; László et al., 2010; Normandeau
et al., 2018; Ollmann et al., 2015; Shilling and Feifel, 2008; Shugalev et al., 2012; Steele et
al., 2017). Face à ces observations, nous avons voulu tester si le JMV5966, en plus d’être un
puissant analgésique, possédait également des propriétés anxiolytiques.

Anxiété

La modulation de la douleur et la régulation de l’anxiété ont des circuits distincts,

mais possèdent des régions cérébrales communes telles que le PFC, l’amygdale, le Nac, le
PAG, le thalamus, l’insula et l’hypothalamus (Calhoon and Tye, 2015; Jarrin and Finn, 2019;
Ji and Neugebauer, 2012; Kuner and Flor, 2016; Peirs and Seal, 2016; Tovote et al., 2015).
Hormis ces zones communes, aucune explication n’a été évoquée pour déterminer comment
la douleur chronique peut provoquer de l’anxiété. Chez des patients souffrant de douleur
chronique, des changements fonctionnels et structuraux (plasticité cérébrale) peuvent être
observés dans des régions cérébrales impliquées dans la modulation de la douleur telles que
le PFC, l’Acc, l’insula, l’amygdale, le PAG, le thalamus, l’hippocampe, le cortex
somatosensoriel S1 et S2, le Nac et le VTA (Kuner and Flor, 2016; Mitsi and Zachariou,
2016). Le développement d’anxiété chez ses patients pourrait donc s’expliquer par un
dysfonctionnement de certaines zones cérébrales qui sont aussi présentes dans le circuit
neuronal de l’anxiété. Prenons par exemple le PFC et l’Acc qui ont un rôle dans la perception
sensorielle émotionnelle de la douleur (aspect émotionnel et affectif de la douleur) et dans
l’anxiété (Peirs and Seal, 2016; Zhuo, 2016). Des études d’imagerie fonctionnelle ont révélé
des changements de connectivité fonctionnelle et anatomique de ces deux régions chez des
patients souffrant de douleur chronique du dos(Baliki et al., 2006; 2012; Hashmi et al., 2013).
De plus, Sang et collaborateurs ont remarqué un changement d’activité cérébrale entre le
PFC et l’hippocampe ventral chez des rats qui ont développé de l’anxiété par la présence de
douleur neuropathique. En effet, chez ces rats anxieux, une augmentation de la fréquence des
 195

ondes thêta dans la PFC ainsi qu’une augmentation de la synchronisation des ondes thêta
entre la PFC et l’hippocampe ventral a été observée (Sang et al., 2018).

Afin de bien simuler les conditions observées chez l’homme, nous avons utilisé un
modèle d’anxiété induit par la présence d’une douleur chronique inflammatoire (Parent et
al., 2012). Étant donné que la régulation de l’anxiété se fait uniquement au niveau du cerveau
et qu’on ne sait pas si le JMV5966 est capable de passer la BHE, nous avons décidé de
l’injecter i.c.v. afin d’assurer sa distribution cérébrale. Cette technique nécessite la mise en
place préalable de canule permanente qui permet l'injection subséquente de composé
directement dans le LCR dans les ventricules cérébraux. Lors d’une injection i.c.v. du
JMV5966 à une dose antalgique (30 μg/kg), nous observons une diminution du
comportement anxieux de nos rats dans deux tests d’anxiété (test de la boite éclairée versus
la boite noire et le test de la croix surélevée). Les expériences avec l’antagoniste NTS2-
sélectif (NTRC-844) ont permis de démontrer que l’effet anxiolytique du JMV5966 était
relié à l’activation des récepteurs NTS2.

Avec nos résultats actuels, il est difficile d’établir le mode d’action anxiolytique du
JMV5966, qui plus est, son injection i.c.v. ne nous permet pas de déterminer sur quelles
structures cérébrales il agit. Dans la plupart des publications montrant l’effet
anxiolytique/anxiogène du système neurotensinergique, les composés sont injectés dans des
zones cérébrales précises (Nac, PFC, noyau ovale de la strie terminale (ovBNST), Amygdale,
PV) (László et al., 2010; Li et al., 2020; Normandeau et al., 2018; Ollmann et al., 2015;
Shugalev et al., 2012). Dans notre étude, nous avons choisi d’injecter le JMV5966 i.c.v. pour
faciliter sa diffusion cérébrale. La particularité des récepteurs NTS2 est qu’ils sont
principalement localisés sur des zones impliquées dans la modulation de la douleur et/ou
dans le circuit de l’anxiété. Face à la localisation des récepteurs NTS2 et aux régions
cérébrales communes entre la douleur et l’anxiété, nous avons émis différentes hypothèses
pour essayer d’élucider le mode d’action du JMV5966. À première vue, nous pensons que
l’effet anxiolytique du JMV5966 pourrait être médié par l’activation des récepteurs NTS2
présents dans des zones impliquées dans le circuit de l’anxiété (PFC, BNST, Amygdale, Nac,
SL, Thalamus, Hypothalamus, AVT, PV, Insula et PAG (Asselin et al., 2001; Fassio et al.,
 196

2000; Sarret and Beaudet, 2003; Sarret and Kitabgi, 2009; Sarret et al., 2003b; Uhl et al.,
1979). Ensuite, nous savons que le JMV5966 injecté i.t. est un puissant antalgique donc, il
est probable que son injection i.c.v. induise aussi de l’analgésie. Étant donné des zones
cérébrales communes entre ces deux pathologies, alors il serait probable que l’activation de
certaines régions cérébrales (p. ex. le PFC, l’amygdale, le Nac, le Thalamus, l’insula et la
PAG) par le JMV5966 produise simultanément de l’analgésie et diminue l’anxiété. Pour
finir, d’après les résultats précédents de Sang qui utilise le même type de modèle d’anxiété
que nous, nous supposons que la présence d’une douleur chronique inflammatoire pourrait
également provoquer un dysfonctionnement de certaines zones cérébrales, qui serait à
l’origine du développement de l’anxiété chez nos animaux (Sang et al., 2018). Si c’est le cas,
alors on pourrait se demander si une simple injection i.c.v. du JMV5966 ne permettrait pas
de rétablir le dysfonctionnement cérébral induit par la douleur chronique et diminuer ainsi
les comportements anxieux. L’effet anxiolytique du JMV5966 serait alors indirectement
relié à ses propriétés antalgiques. Pour vérifier ces hypothèses, il serait intéressant d’évaluer
l’effet anxiolytique du JMV5966 dans un autre modèle d’anxiété qui n’est pas médié par la
présence d’une douleur chronique.

Hormis des zones cérébrales communes, la sérotonine et la noradrénaline sont des

neurotransmetteurs importants dans la modulation de la douleur et dans les troubles anxieux
(Millan, 2002; Ossipov et al., 2014; Sheng et al., 2017; Tao et al., 2019; Yam et al., 2018).
Chez des patients souffrant d’anxiété, on observe généralement une altération du système
noradrénergique et sérotoninergique (Liu et al., 2019; Ressler and Nemeroff, 2000). Des
antidépresseurs tricycliques ou des IRS ou IRSN sont généralement prescrits pour restaurer
le taux de ces neurotransmetteurs et diminuer l’anxiété. Lors de douleur chronique
neuropathique, des changements fonctionnels et anatomiques peuvent également altérer ces
deux systèmes (Liu et al., 2010; Ossipov et al., 2014). Néanmoins, l’injection
d’antidépresseurs tricycliques (Amitriptyline) ou d’IRSN (Duolexine, Milnacipran) permet
aussi de restaurer leur taux et d’inhiber le message douloureux (Hayashida and Obata, 2019;
Ito et al., 2018; Nakajima et al., 2012; Obata, 2017). À travers ces résultats, nous observons
que l’augmentation du taux de 5-HT et/ou de NA permet de traiter à la fois l’anxiété et la
douleur chronique. L’équipe de recherche de Zhang et Sang ont étudié le système
 197

sérotoninergique au niveau du PFC dans un modèle d’anxiété induit par la présence d’une
douleur chronique (migraine ou ligature du nerf sciatique) chez le rat. Lors de leur étude, ils
ont observé une diminution du taux de 5-HT dans le PFC, mais l’administration d’une faible
dose d’Amitriptyline per os, un antidépresseur tricyclique, a restauré ce taux et diminué
l’anxiété (Zhang et al., 2017). D’après l’étude de Sang, cette diminution de 5-HT pourrait
s’expliquer par une augmentation significative de l’expression des transporteurs de la
recapture de la sérotonine (Sang et al., 2018). À travers ces deux études, il a été montré que
la présence d’une douleur chronique provoquait un dysfonctionnement du système
sérotoninergique au niveau du PFC qui serait à l’origine du développement d’anxiété. Il
serait donc intéressant de doser la quantité de 5-HT et de NA présent dans le LCR de nos
animaux pour observer si notre modèle d’anxiété provoque également une altération de ces
deux systèmes. Si c’est le cas, alors nous pourrons observer si le JMV5966 agit comme un
antidépresseur tricyclique ou un inhibiteur de la recapture de la 5-HT et de la NA en
restaurant le taux de ces deux neurotransmetteurs.

La dopamine est également un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de

l’anxiété (Brandão and Coimbra, 2019; Zarrindast and Khakpai, 2015). Le système
neurotensinergique interagit étroitement avec le système dopaminergique par sa localisation
(substance noire et ATV) et par son implication dans la physiopathologie de plusieurs
troubles du SNC reliés aux circuits DA (p. ex. la schizophrénie et la maladie de Parkinson)
(Boules et al., 2006; Fassio et al., 2000; Nicot et al., 1994; Sarret and Beaudet, 2003; Tyler-
McMahon et al., 2000). L’équipe de Hou et collaborateurs a été la première à montrer une
interaction entre ces deux systèmes dans la modulation de l’anxiété. Lors de leurs essais, ils
ont observé que l’injection i.p. de β-lactotensine, un agoniste NTS2-sélectif, diminuait
l’anxiété chez les rats. Bien qu’elle n’ait aucune affinité pour les récepteurs
dopaminergiques, l’effet anxiolytique de la β-lactotensine dépendrait de l’activation des
récepteurs D1. Les auteurs ont conclu que l’activation des récepteurs NTS2 favoriserait la
libération de dopamine, qui activerait les récepteurs D1 à l’origine de la diminution de
l’anxiété (Hou et al., 2011). Pour vérifier si notre composé interagit aussi avec le système
dopaminergique, nous pourrions envisager dans un premier temps de doser la dopamine dans
le LCR après une injection i.c.v. du JMV5966. Pour pousser notre étude, nous pourrons
 198

également utiliser des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D1 (SCH23390 et

SKF83566) et D2 (raclopride), ou des animaux n’expriment pas ces deux récepteurs. Comme
avec l’étude de Hou, une diminution de l’effet anxiolytique du JMV5966 lors du blocage de
ces récepteurs prouverait l’interaction de ces deux systèmes dans la modulation de l’anxiété.

Actuellement, des recherches plus approfondies restent à faire pour déterminer

l’action antalgique et anxiolytique du JMV5966. Néanmoins, nous avons montré que cibler
les récepteurs NTS2 représente une piste prometteuse pour traiter à la fois la douleur
chronique et l’anxiété qui y est associée. Or, la régulation de ces deux pathologies se fait au
niveau du SNC et il est donc primordial que les composés puissent traverser la BHE pour
envisager une issue en clinique.

3. Hypotension, hypothermie, des effets physiologiques intéressants pour

traiter d’autres pathologies.

Outre l’effet antalgique et anxiolytique du système neurotensinergique, l’activation

des récepteurs NTS1 agit également au niveau de la température corporelle et de la pression
artérielle. Pour éviter ces effets secondaires non désirés dans un contexte de traitement de la
douleur (hypothermie et hypotension), nous avons préférentiellement ciblé les récepteurs
NTS2. En revanche, les effets hypothermiants et hypotenseurs des composés non sélectifs
ou NTS1-sélectifs pourraient s’avérer intéressants pour traiter d’autres pathologies.

Hypothermie

Il a été montré que lors d’ischémie globale après un arrêt cardiaque, d’accident
vasculaire cérébral ischémique, de blessures traumatiques et d’encéphalopathie hypoxique
ischémique, l’induction d’une légère hypothermie (32 à 35°C) par une méthode
pharmacologique (perfusion de solution saline froide, molécules hypothermiantes) et/ou
physique (application de couvertures refroidissantes, abaissement de la température de la
pièce, bain de glace) chez des patients sous anesthésie générale avait des effets
 199

neuroprotecteurs (Huber et al., 2019). Cela a pour effet de diminuer la neuroinflammation,

la production de radicaux libres, l’apoptose et de maintenir l’intégrité de la BHE (Sun et al.,
2019). Les propriétés hypothermiantes d’agonistes NTS1-sélectifs (PD149163, NT69L,
NT77 et HPI-201, HPI-363) ont déjà été testées dans un modèle murin. Il s’est avéré que ces
analogues induisaient une hypothermie (33 – 35°C) soutenue pendant plusieurs heures et
avaient un effet neuroprotecteur lors d’arrêt cardiaque asphyxique, d’opération du cerveau,
d’une hypoxie-ischémie et lors d’accidents vasculaires cérébraux (Katz et al., 2001; 2004;
Lee et al., 2014; 2016a; 2016b; Zhao et al., 2020; Zhong et al., 2020). L’effet hypothermiant
de ces agonistes NTS1 pourrait donc être utilisé pour traiter ces atteintes neurologiques.

En revanche, pour un traitement analgésique ou anxiolytique, l'hypothermie n'est pas

souhaitable. La plupart des composés développés pendant cette thèse sont sélectifs pour
NTS2, mais certains analogues de la série #1 ainsi que le JMV5308 (série #3), le JMV7320
et JMV7321 (série #4) présentent une affinité résiduelle pour NTS1 (Ki < 100 nM). Dans la
littérature, l’hypothermie médiée par le système neurotensinergique est décrite comme un
effet central (Boules et al., 2013). Ne sachant pas si nos composés passent la BHE, nous les
avons injectés par voie intrathécale. À travers nos résultats, nous avons pu établir une
corrélation entre l’effet hypothermiant des composés, leur stabilité plasmatique ainsi que leur
affinité pour NTS1 (Article n°3 de la thèse). Uniquement les composés stables (T1/2 > 1
heure) et affins pour NTS1 (Ki < 300 nM) induisaient une hypothermie soutenue, d’environ
-2.0 °C, jusqu’à 60 minutes post-injection. En revanche, les composés affins pour NTS1,
mais instables (T1/2 < 10 min) n’avaient aucun effet sur la température corporelle (Previti et
al., 2020). Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus avec la NT(8-13), puisqu’elle est
instable (T1/2 < 2 min) et qu’une injection i.t. ne provoque aucune hypothermie. En revanche,
aucun composé purement sélectif pour NTS2 n’a induit d’hypothermie. Ces résultats
montrent que l’effet hypothermiant modéré des analogues NTS1-séléctifs stables pourra être
prometteur pour ses effets neuroprotecteurs lors de situations cliniques urgentes comme par
exemple lors d’ischémie cérébrale, d’accident cardiovasculaire ou lors d’un arrêt cardiaque.

Toutefois, il est intéressant de constater que, malgré sa faible stabilité plasmatique,

l’injection de NT au niveau du cerveau induit une baisse de température corporelle
 200

contrairement à une injection i.t. (Bissette et al., 1976; Martin et al., 1980; Nemeroff et al.,
1977; Pettibone et al., 2002). D’après ces résultats, il semblerait que l’injection par voie i.t.
ne soit pas la voie d’administration la plus appropriée pour induire de l’hypothermie, car les
composés doivent être relativement stables pour qu’ils aient le temps d’agir au niveau de
l’hypothalamus avant d’être dégradés.

Le mécanisme d’action du système neurotensinergique pour induire de l’hypothermie

n’a pas été élucidé. En revanche, dans certaines études les agonistes NTS1 (NT77, NT69L,
PD149163, HPI-201, HPI-363) sont administrés par voie i.v. ou i.p. et induisent également
de l’hypothermie (Katz et al., 2001; 2004; Lee et al., 2014; 2016a; 2016b; Xue et al., 2017;
Zhao et al., 2020). Or, pour tous ces composés, aucune étude n’a été réalisée pour déterminer
s’ils passent vraiment la BHE.

La première hypothèse face à ces résultats pourrait s’expliquer par l’absence de

barrière étanche au niveau de l’hypothalamus. La région tubérale de l’hypothalamus
médiobasal est située autour du troisième ventricule et se caractérisent par la présence de
noyaux hypothalamiques comme le noyau arqué mais aussi et surtout par l’éminence
médiane qui fait partie des organes circumventriculaires (Kaur and Ling, 2017). L’éminence
médiane est caractérisée par la présence de capillaires fenêtrés permettant la diffusion de
molécules présentes dans la circulation sanguine vers le parenchyme cérébral. On retrouve
notamment au niveau de l’éminence médiane des cellules particulières de type tanycytes qui
expriment des protéines de jonctions serrées comme l’occludine, les claudines et les zonula
occludens. Conjointement avec les cellules endothéliales, les tanycytes facilitent
l’intercommunication entre le sang et le cerveau (Norsted et al., 2008; Wilhelm et al., 2016).
Il se pourrait donc que les analogues NTS1-sélectifs injectés par voie i.v. ou i.m., agissent
directement au niveau de l’hypothalamus pour induire de l’hypothermie.

La seconde hypothèse serait que l’hypothermie pourrait également être une

conséquence indirecte de l’effet hypotenseur du système neurotensinergique. Différentes
équipes de recherche ont observé que l’injection i.v. de NT et d’agonistes NTS1 sélectifs
provoquait de l’hypotension médiée par une vasodilatation (Di Paola and Richelson, 1990;
 201

Eiselt et al., 2019b; Fanelli et al., 2015; Rioux et al., 1983; Zogovic and Pilowsky, 2012). Le
maintien de la vasodilatation et de l’hypotension pourrait engendrer une baisse de la
température corporelle. Pour vérifier cette hypothèse, nous pourrions tout d’abord injecter
nos composés hypotenseurs par voie i.v. et observer leur effet sur la température corporelle.
S’ils induisent de l’hypothermie, alors nous pourrions bloquer leur vasodilatation en injectant
préalablement des vasoconstricteurs et observer s’ils provoquent toujours une baisse de
température. Néanmoins, il semblerait que cette hypothèse ne fonctionne pas lors
d’injections i.p., car le HPI-201 et HPI-363 sont deux agonistes NTS1-sélectifs qui induisent
une hypothermie modérée sans avoir d’effet sur la pression artérielle (Choi et al., 2012; Lee
et al., 2014).

Hypotension

D’après l’étude de Januzzi et collaborateurs, les personnes ayant une forte

concentration du précurseur de la NT (la pro-NT) au niveau sanguin ont plus de risque de
développer des maladies cardiovasculaires (Januzzi et al., 2016). La NT est présente en faible
quantité (0.1 à 0.4 ng/g) au niveau des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires, de
l’aorte et des veines pulmonaires et des vaisseaux coronaires (Onuoha et al., 1999a; 1999b).
Les récepteurs NTS1 sont exprimés dans les cellules du myocarde et dans les cellules
endothéliales des vaisseaux sanguins (Osadchii, 2015; Porzionato et al., 2009; Schaeffer et
al., 1995). Au niveau cardiaque, la NT a pour rôle de réguler la fréquence cardiaque, la
contractilité myocardique, le tonus vasculaire et la pression artérielle (Ceconi et al., 1989;
Kaczyńska and Szereda-Przestaszewska, 2012; Tyler-McMahon et al., 2000). Une étude a
d’ailleurs observé une augmentation significative des taux plasmatiques de NT dans un
modèle murin de choc septique sévère (sham : 10 fmol/ml versus sepsis sévère : 200
fmol/ml). Cette hausse est aussi retrouvée chez des patients en état de choc septique (patients:
224 fmol/ml versus individus sains : 30 fmol/ml) ou de choc cardiogénique (309 fmol/ml).
Pour ces deux pathologies, une hypotension persistante est généralement observée, prouvant
ainsi l’effet de la NT sur la pression artérielle (Piliponsky et al., 2008). Des essais ex vivo sur
des aortes de rat ou des veines pulmonaires de lapin ont montré que l’hypotension médiée
par la NT serait issue de la libération de modulateurs vasoactifs tels que l’histamine, plutôt
 202

que par une action directe sur les muscles lisses vasculaires (Di Paola and Richelson, 1990;
Gully et al., 1996; Obara et al., 1989).

L’effet de la NT(8-13) sur la pression artérielle est dose dépendante. Lors de nos
expérimentations, l’injection i.v. de NT(8-13) à 0.1 mg/kg chez le rat induit un effet
triphasique. Cet effet est composé d’une première phase hypotensive spontanément après
l’injection i.v. (environ - 25 mmHg), suivi d’un retour à des valeurs de pression artérielle
basale et ensuite d’une phase hypotensive soutenue (environ - 40 mmHg) jusqu’à 5 minutes
post injection. En revanche, une injection à 0.01 mg/kg produit un effet biphasique constitué
d’une phase hypotensive d’environ - 30 mmHg, suivie d’une hypertension qui s’atténue au
cours du temps avec un retour à une pression artérielle basale à 15 minutes post-injection.
D’après quelques études, la première phase hypotensive serait médiée par la dégranulation
des cellules mastocytaires qui libèrent de l’histamine à l’origine d’une vasodilatation. Cette
baisse de pression artérielle activerait les barorécepteurs qui stimuleraient le système
nerveux sympathique pour rétablir l’homéostasie artérielle. La libération de catécholamines
par les glandes surrénales permettrait ainsi de restaurer la pression artérielle vers des valeurs
basales (Di Paola and Richelson, 1990; Gully et al., 1996; Kérouac et al., 1983; Rioux et al.,
1982; 1983). La troisième phase hypotensive serait également liée par la libération
d’histamine (Di Paola and Richelson, 1990). Au vu des résultats, nous pensons que
l’injection d’une forte concentration de NT entraine une libération importante d’histamine si
bien que la quantité de catécholamines libérées n’est pas suffisante pour contrecarrer
totalement leur action hypotensive. En revanche, l’administration d’une faible dose de NT
induit une libération d’histamine plus faible, et l’hypotension est directement contrée par la
libération de catécholamines. Pour vérifier cette hypothèse, il serait intéressant de bloquer la
libération d’histamine avec des antagonistes des récepteurs histaminiques H1, ou d’inhiber
le système sympathique en administrant un sympatholytique tel que le propranolol, ou en
réalisant une surrénalectomie (ablation des glandes surrénales). Ces expériences
permettraient de caractériser l’effet biphasique ou triphasique de la NT(8-13) et de nos
analogues sur la pression artérielle et de déterminer si l’action hypotensive de la NT est
vraiment médiée par l’action de l’histamine.
 203

Nous observons qu’uniquement les composés très affins pour NTS1 (0.1 < Ki < 100
nM) induisent un effet triphasique lorsqu’ils sont injectés à 0.1 mg/kg (Tableau 9). À cinq
minutes post-injection, ces composés sont plus puissants que la NT(8-13) puisqu’ils
entrainent une baisse de pression artérielle entre -37 à -70 mmHg. Néanmoins, ils sont moins
puissants que le PD149163, un agoniste NTS1-sélectifs, car la dose de 0.1 mg/kg est létale.
En revanche, l’injection i.v. de PD149163 à 0.01 mg/kg induit un effet triphasique avec une
hypotension soutenue comparable à celle de la NT(8-13) injectée à 0.1 mg/kg (Eiselt et al.,
2019b). Néanmoins, les quatre composés NTS2-sélectifs qui ont été testés n’induisent
aucune modification de la pression artérielle (Tableau 9).

Affinité pour NTS1 △ Pression artérielle à 5 min Effet sur la pression

Composés
(Ki ; nM) (0.1 mg/kg ; i.v.) artérielle
NT(8-13) - 41 mmHg
JMV438 - 70 mmHg
JMV449 0.1 < Ki < 10 nM - 60 mmHg
JMV2007 - 54 mmHg
Triphasique
JMV5206 - 47 mmHg
JMV5170 Ki : 300 nM - 52 mmHg
JMV6184 10 < Ki < 100 nM - 37 mmHg
JMV5296 Ki : 600 nM - 26 mmHg
JMV5964 Ki > 1000 nM - 1 mmHg Aucun effet
JMV5966 Ki : 150 nM 4.5 mmHg Biphasique
JMV5297 - 5.4 mmHg Aucun effet
Ki > 1000 nM
JMV6631 - 0.8 mmHg Aucun effet
PD149163 Ki : 159 nM (b) - 50 mmHg (0.01 mg/kg) (a) Triphasique
JMV431 Ki > 1000 nM (c)
- 5 mmHg Aucun effet
Résultats issus des articles : (a) (Eiselt et al., 2019b) (b) (Petrie et al., 2004) (c) (Dubuc et al., 1999)
Tableau 9. Effet des composés sur la pression artérielle.
Les composés sont injectés par voie intraveineuse à 0.1 mg/kg.

Nos résultats ont confirmé que l’hypotension induite par le système

neurotensinergique était médiée par l’activation des récepteurs NTS1. Étant donné qu’un
agoniste NTS1-sélectif injecté à une dose trop importante peut être létal, cela confirme notre
choix de cibler uniquement les récepteurs NTS2. En revanche, nous avons observé que le
 204

JMV5170 n’est pas très affin pour NTS1 (Ki ≃ 300 nM), mais induit une hypotension
comparable à celle de la NT(8-13). Or, le JMV5966 (Ki : 150 nM) est deux fois plus affin
pour NTS1 que le JMV5170, mais a un effet biphasique sur la pression artérielle comparable
à celui de la NT(8-13) injecté à 0.01mg/kg. Face à ces observations, nous pensons qu’outre
l’affinité, la puissance des composés à activer les récepteurs NTS1 semble importante.
Actuellement, aucune voie de signalisation n’a été associé à l’effet hypotenseur de la NT. Il
est donc difficile de déterminer pourquoi le JMV5170 est si puissant malgré sa faible affinité
pour NTS1. Face aux résultats du JM5966, nous pensons qu’il est moins puissant pour activer
NTS1 ou qu’il n’active pas la voie de signalisation qui est primordiale pour induire de
l’hypotension (composé biaisé). D’après des résultats récents obtenus avec le composé
allostérique SBI-553 (analogue biaisé sur les β-arrestines), il semblerait que l’effet
hypotenseur du système neurotensinergique soit dépendant de l’activation des protéines G et
non du recrutement des β-arrestines (Slosky et al., 2020).

Même si nos analogues ne sont pas affins pour NTS1, il est tout de même important
de caractériser leur effet sur la pression artérielle. Contrairement à l’hypothermie, l’action
des dérivés neurotensinergiques sur la pression artérielle semble moins dépendante de la
stabilité plasmatique. En effet, la NT(8-13), le JMV438 ou le JMV2007 ont une demi-vie
plasmatique inférieure à 2 minutes et induisent une hypotension soutenue comparable à celle
des composés stables (JMV5206 et JMV5170) (Tableau 9). Ces observations étaient
attendues puisque nous injectons directement dans le système cardiovasculaire et que leur
effet sur la pression artérielle est immédiat (effet observable dans les quelques secondes
suivant l’injection).

À travers ces résultats, on pourrait en conclure que l’hypotension induite par le

système neurotensinergique pourrait être utilisée chez des patients souffrant d’hypertension
artérielle. Une étude clinique a récemment montré une corrélation entre le taux de NT et
l’hypertension résistante aux traitements. Les patients qui souffrent de ce type
d’hypertension ont des taux de NT plasmatique faibles (0.380 ng/ml) comparés aux patients
qui ont une pression artérielle contrôlée (0.638 ng/ml) (Bolat et al., 2020). L’administration
d’agonistes neurotensinergiques pourrait être une piste prometteuse pour traiter ces patients.
 205

Étant donné leur effet imminent sur la pression artérielle, ces composés pourraient être
administrés par voie systémique. Ce mode d’administration serait optimal pour une issue en
clinique et ils pourraient être utilisés directement sans avoir à optimiser leur passage à travers
la BHE.
 206

CONCLUSION

Ce projet de doctorat a été divisé en deux volets : un volet chimie avec le

développement d’agonistes neurotensinergiques et un volet pharmacologie en déterminant
les propriétés in vitro et in vivo des composés. Lors de la synthèse de nouveaux analogues
neurotensinergiques, nous avons observé que la position 11 de la NT(8-13) est cruciale pour
cibler le récepteur NTS2. De plus, la présence d’une liaison réduite entre les deux lysines en
positions 8 et 9 combinée avec d’autres modifications est importante pour augmenter la
stabilité plasmatique des composés. Au niveau pharmacologique, nous avons montré que
cibler les récepteurs NTS2 est une piste novatrice pour traiter à la fois la douleur chronique
et l’anxiété, sans induire d’effets indésirables. De plus, l’hypothermie induite par les dérivés
NTS1 stables pourrait être applicable au traitement des patients ayant subi un arrêt cardiaque
ou un accident vasculaire cérébral ischémique.

En revanche, le passage de la BHE est une limite très importante à prendre en

considération. Un composé qui ne traverse pas la BHE n’aura aucune issue possible en
clinique, dans un contexte de traitement de la douleur et de l’anxiété. Actuellement, notre
seule stratégie pour augmenter la biodisponibilité de nos composés serait de les coupler à
l’AN2. En se liant aux récepteurs LRP1, l’AN2 permettrait un passage actif des composés à
travers la BHE. Si cela fonctionne, ces résultats représenteraient une avancée de plus vers le
développement d’antalgiques neurotensinergiques à visée thérapeutique. Toutefois si malgré
le couplage nos composés ne sont toujours pas capables de passer la BHE, alors on pourra
s’orienter vers le développement et la synthèse de macrocycles ou de petites molécules
synthétiques ayant des propriétés se rapprochant des règles de Lipinski.
 207

REMERCIEMENTS

Je tenais tout d’abord à remercier chaleureusement mon directeur de thèse, le Pr Philippe

Sarret, pour m’avoir donné la chance et l’opportunité de réaliser mon doctorat dans son
laboratoire. Cela a été un véritable plaisir de travailler avec toi. Merci d’avoir cru en moi en
me laissant gérer et orienter mon projet comme je le souhaitais. Cela m’a permis d’acquérir
une certaine autonomie et de développer un esprit et une rigueur scientifique. Merci
également de m’avoir donné l’occasion de participer à tant de congrès nationaux et
internationaux et de m’avoir permis de faire un doctorat aussi complet (publications, prix,
bourses de voyage). Merci également pour ta gentillesse, ta bonne humeur quotidienne et
surtout pour ta bienveillance aussi bien au laboratoire qu’en congrès. Et puis, bien sûr, je ne
te remercierai jamais assez de m’avoir permis de rester aussi longtemps en France. Vraiment,
un grand merci pour toutes ces belles années à tes côtés!

Aux collaborateurs, Florine Cavelier et ses deux étudiants postdoctoraux (Roberto et Santo)
sans qui, mon projet de doctorat n’aurait pu avoir lieu. Cela a été très agréable et intéressant
de collaborer avec vous. Grâce à vous et à vos différents peptides, cela m’a permis d’enrichir
mes connaissances en chimie. Je voudrais également remercier l’équipe de recherche du Pr
James B. Thomas. La collaboration avec ce laboratoire de recherche m’a permis de travailler
avec un composé non peptidique (NTRC-844) et surtout de caractériser le premier
antagoniste NTS2-sélectif de la littérature. Pour finir, je voudrais également remercier le
laboratoire du Pr Marsault et l’étudiant au doctorat Marc Sousbie pour la confiance qu’ils
m’ont accordé en me chargeant de caractériser in vivo leurs deux meilleurs macrocycles.
L’avantage de ces différentes collaborations c’est qu’elles m’ont donné l’opportunité de
travailler sur différents types de composés neurotensinergiques.

Merci à toutes les personnes qui ont partagé ma vie au laboratoire pendant ces cinq années
(et neuf mois) de doctorat. Aux assistants de recherche Jean-Michel et Jérôme, pour tous
leurs conseils techniques, leur écoute et bien sûr tout le temps qu’ils m’ont accordés pour
corriger mes articles et ma thèse. À la technicienne animalière Karyn, pour avoir pris le temps
 208

de me former lors de mon arrivée. Grâce à toi, j’ai acquis toutes les techniques in vivo
nécessaires pour réaliser mon projet à bien. Des techniques qui ont d’ailleurs été transmises
aux nouvelles recrues (Magali et Sabrina). Aux étudiants actuels et aux anciens du
laboratoire à savoir Alexandra, Alexandre M, les Camille L et S, Caroline, Cécile, Élie,
Élora, German, Justin, Karine, Kien, Kloé, Mélisange, Magali, Marie-Edith, Marc-André,
les Michael B et D, Olivier, Rébecca, Sabrina, Vincent et Xavier (en espérant n’avoir oublié
personne…). Merci pour tous les conseils scientifiques et l’aide que vous m’avez apportés
pour réaliser au mieux mon projet. Je voudrais également souligner tous ces bons moments
que l’on a passés ensemble aussi bien au laboratoire, que lors d’activité extérieure (Soirées
« Papineau », cabane à sucre, vins et fromages, repas de noël, party d’été, Défi Leucan…),
qu’en congrès ou lors de nos soirées filles « Licorne ». Aux trois grands chimistes du
laboratoire à savoir Alexandre, Michael D et Kien. Merci beaucoup pour le temps que vous
avez passé à m’expliquer quelques notions de chimie indispensables pour mon projet. Grâce
à vous, je suis devenue une chimiste en herbe! Pour finir, à mes deux copines licornes du
labo Sarret : Émilie et Mélissa. Émilie, ma copine de bureau, de congrès, de sport, de soirée
et de tricot avec qui j’ai eu l’honneur de partager une grande partie de mon doctorat. Et
Mélissa, qui nous a rejoints en cours de route avec qui nous avons également partagé plein
de bons moments en soirée ou lors de nos « petite » séance d’Insanity. Trois petites licornes
qui vont maintenant se retrouver en France!

À ma seconde famille, la famille du Chamalay qui se compose d’Eugénie, Christophe et

Lucien (bébé n°1 du Chamalay), Nawel, Camille, Maxime, Émilie, Romain et Mélissa.
Durant mon séjour à Sherbrooke, j’ai eu l’occasion de rencontrer des personnes
extraordinaires dont les liens amicaux ont été rapidement très forts. Je ne vous remercierai
jamais assez pour tous ces moments passés ensemble (Weekend au Chalet, Soirée jeux de
société, et bien plus encore). Rencontrer des personnes comme vous aide vraiment à se sentir
bien dans un pays où l’on est loin de notre famille et de nos amis. Je suis si triste de vous
quitter, mais la migration vers la France ne fait que commencer, et on se retrouvera très
rapidement pour de nouvelles aventures à la Françayse !! Sur un air des temps des
cathédrales, je vous aime fort !
 209

À deux couples d’amis montréalais, Cécile et Étienne ; Aicha, Dom et le petit Noa pour tous
ces superbes moments passés ensembles! Cécile et Étienne, vous penserez à nous en voyant
les Colibris du Casino de Montréal! Et pour Dom et Aicha, les voitures du Mont-Royal n’ont
qu’à bien se tenir. Pleins de souvenirs que je ne suis pas prête d’oublier et j’espère qu’on
pourra se revoir très vite en France, au Canada ou ailleurs!

À tous les autres amis sherbrookois, Xavier, Cyrielle et leurs enfants Zachary et Anne-Laure
; David et Lysa-Anne; Yacine et Marianne, merci pour tous ces bons moments et soirées que
l’on a passés ensemble! J’espère de tout cœur rester en contact avec vous!

A mes voisins Lyse (ou grand-maman de Biscotte) et Lionel. Merci énormément pour votre
gentillesse et tous vos loyaux services durant cette dernière année.

Je passe maintenant du côté français pour remercier certaines personnes importantes, qui
malgré la distance, ont toujours été très présentes pour moi.

À ma famille. Je voudrais tout d’abord remercier mes deux plus grands supporters et
admirateurs : ma Maman et mon Papa qui est devenu ma plus belle étoile au cours de cette
aventure. Merci à tous les deux de m’avoir suivi dans mon aventure au Canada et de m’avoir
encouragé et soutenu et surtout d’avoir cru en moi durant toutes ces années d’études. Malgré
les aléas de la vie, il faut toujours garder la tête haute et aller de l’avant pour venir à bout de
ses projets.
Je tiens également à remercier mes oncles (Tonton Serge et Tonton Francis) et mes tantes
(Tatie Édith et Tatie Nadine) pour votre soutien et de votre présence dans les bons, mais
aussi les moins bons moments! Et pour finir, je voudrais remercier mes cousins/cousines
français : Marc, Cédric, Sandrine, Julianna, Faustine, Cindy, Stessie, et la petite dernière
Mathilde ; Québecois : Cédric, Jennifer et Clémentine ; et Brésilien/Chilien : Aurélien, Féfa
et la petite Lou. Merci d’avoir cru en votre petite cousine !
Merci également à la famille de Mike pour leur soutien.
 210

À mes amis proches. Je voudrais remercier dans un premier temps ma meilleure amie
Marion! Même si ce n’est pas toujours facile de se donner des nouvelles régulièrement en
étant à distance, rien n’a changé entre nous durant ces cinq années séparées. Merci de m’avoir
soutenue et d’avoir cru en moi. Hâte de te retrouver pour repartager des moments avec toi!
Merci également à mes trois autres copines d’enfance dont je suis également très proche :
Cindy, Agnès et Agathe. Merci les filles pour votre soutien et vos messages réguliers durant
ces années à distance. Même si l’on ne se voit pas de quelques mois voire même un an,
l’amitié entre nous reste toujours la même. Merci également à toute l’équipe des Solides
(Marion, Cindy, Alexia, Agnès et Lionel, Pierre-Jean, Agathe et Jeff, Kawuet et Florence,
Jeanne et Thomas, Mika et Pauline, David et Christelle) et les minis Solides (Alice, Flora,
Arthur, Morgan, Jules, Leia et le prochain bébé de 2020) pour votre soutien. Tatie Caribou
revient parmi vous!
Puis merci aussi à Josyan et Jérémy L qui sont aussi des amis importants pour moi et qui ont
été présents tout au long de mon doctorat.
La distance est parfois difficile, mais elle permet surtout de reconnaître nos vrais amis!

Merci à mon copain Mike que j’ai rencontré ici même dans le laboratoire de Philippe. Et oui,
parfois le destin fait bien les choses. Merci pour ton soutien et ton accompagnement
quotidien. Je pense que l’aventure aurait été bien plus compliquée sans toi à mes côtés. Je ne
te remercierai jamais assez pour tous ces conseils qui m’ont été très utiles et formateurs pour
mon doctorat, et surtout pour ta patience pour me supporter lors de mes périodes de stress.
Et surtout, un grand merci pour les corrections ma thèse et de mes expressions sudistes…
Merci aussi pour tous ces beaux moments que l’on a partagés ensemble au Québec!
Maintenant on s’envole pour une nouvelle aventure avec notre petite lapine québécoise :
Biscotte!

Pour finir, je voudrais remercier mes jurys, les Pr David Chatenet, Pr Dimitri Ryczko et Pr
Guylain Boulay d’avoir accepté d’évaluer cette thèse. J’en profite également pour remercier
le Pr Ryczko pour nos discussions de couloir pour la période post-thèse. Ces discussions
m’ont été très bénéfiques et j’espère prendre le bon chemin à l’issue de ce doctorat.
 211

RÉFÉRENCES

Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., and Begley, D. J.
(2010). Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13–25.
doi:10.1016/j.nbd.2009.07.030.

Akunne, H. C., Darling, S., Zoski, K., Sefler, A. M., He, J. X., Sawyer, T. K., et al. (1996).
Functional activity of new C-terminal cyclic-neurotensin fragment analogs.
Neuropeptides 30, 213–218. doi:10.1016/s0143-4179(96)90066-9.

Al-Rodhan, N. R., Richelson, E., Gilbert, J. A., McCormick, D. J., Kanba, K. S., Pfenning,
M. A., et al. (1991). Structure-antinociceptive activity of neurotensin and some novel
analogues in the periaqueductal gray region of the brainstem. Brain Research 557,
227–235.

Altamura, A. C., Moliterno, D., Paletta, S., Maffini, M., Mauri, M. C., and Bareggi, S.
(2013). Understanding the pharmacokinetics of anxiolytic drugs. Expert Opin Drug
Metab Toxicol 9, 423–440. doi:10.1517/17425255.2013.759209.

Amorino, G. P., Deeble, P. D., and Parsons, S. J. (2007). Neurotensin stimulates

mitogenesis of prostate cancer cells through a novel c-Src/Stat5b pathway. Oncogene
26, 745–756. doi:10.1038/sj.onc.1209814.

Aronin, N., Carraway, R. E., Ferris, C. F., Hammer, R. A., and Leeman, S. E. (1982). The
stability and metabolism of intravenously administered neurotensin in the rat. Peptides
3, 637–642.

Asselin, M. L., Dubuc, I., Coquerel, A., and Costentin, J. (2001). Localization of
neurotensin NTS2 receptors in rat brain, using. Neuroreport 12, 1087–1091.

Bai, B., Cai, X., Jiang, Y., Karteris, E., and Chen, J. (2014). Heterodimerization of apelin
receptor and neurotensin receptor 1 induces phosphorylation of ERK(1/2) and cell
proliferation via Gαq-mediated mechanism. J. Cell. Mol. Med. 18, 2071–2081.
doi:10.1111/jcmm.12404.

Baliki, M. N., Chialvo, D. R., Geha, P. Y., Levy, R. M., Harden, R. N., Parrish, T. B., et al.
(2006). Chronic pain and the emotional brain: specific brain activity associated with
spontaneous fluctuations of intensity of chronic back pain. J. Neurosci. 26, 12165–
12173. doi:10.1523/JNEUROSCI.3576-06.2006.

Baliki, M. N., Petre, B., Torbey, S., Herrmann, K. M., Huang, L., Schnitzer, T. J., et al.
(2012). Corticostriatal functional connectivity predicts transition to chronic back pain.
Nat. Neurosci. 15, 1117–1119. doi:10.1038/nn.3153.
 212

Banks, W. A., Wustrow, D. J., Cody, W. L., Davis, M. D., and Kastin, A. J. (1995).
Permeability of the blood-brain barrier to the neurotensin8-13 analog NT1. Brain
Research 695, 59–63.

Barak, L. S., Bai, Y., Peterson, S., Evron, T., Urs, N. M., Peddibhotla, S., et al. (2016).
ML314: A Biased Neurotensin Receptor Ligand for Methamphetamine Abuse. ACS
Chem. Biol. 11, 1880–1890. doi:10.1021/acschembio.6b00291.

Barroso, S., Richard, F., Nicolas-Ethève, D., Reversat, J. L., Bernassau, J. M., Kitabgi, P.,
et al. (2000). Identification of residues involved in neurotensin binding and modeling
of the agonist binding site in neurotensin receptor 1. J Biol Chem 275, 328–336.
doi:10.1074/jbc.275.1.328.

Bean, A. J., Dagerlind, A., Hökfelt, T., and Dobner, P. R. (1992). Cloning of human
neurotensin/neuromedin N genomic sequences and expression in the ventral
mesencephalon of schizophrenics and age/sex matched controls. Neuroscience 50,
259–268. doi:10.1016/0306-4522(92)90421-w.

Behbehani, M. M., and Pert, A. (1984). A mechanism for the analgesic effect of
neurotensin as revealed by behavioral and electrophysiological techniques. Brain
Research 324, 35–42. doi:10.1016/0006-8993(84)90619-x.

Beitz, A. J. (1982). The sites of origin brain stem neurotensin and serotonin projections to
the rodent nucleus raphe magnus. Journal of Neuroscience 2, 829–842.
doi:10.1523/JNEUROSCI.02-07-00829.1982.

Beitz, A. J., Shepard, R. D., and Wells, W. E. (1983). The periaqueductal gray-raphe
magnus projection contains somatostatin, neurotensin and serotonin but not
cholecystokinin. Brain Research 261, 132–137. doi:10.1016/0006-8993(83)91292-1.

Belzak, L., and Halverson, J. (2018). The opioid crisis in Canada: a national perspective.
Health Promot Chronic Dis Prev Can 38, 224–233. doi:10.24095/hpcdp.38.6.02.

Benyamin, R., Trescot, A. M., Datta, S., Buenaventura, R., Adlaka, R., Sehgal, N., et al.
(2008). Opioid complications and side effects. Pain Physician 11, S105–20.

Besserer-Offroy, É., Brouillette, R. L., Lavenus, S., Froehlich, U., Brumwell, A., Murza,
A., et al. (2017). The signaling signature of the neurotensin type 1 receptor with
endogenous ligands. European Journal of Pharmacology 805, 1–13.
doi:10.1016/j.ejphar.2017.03.046.

Besserer-Offroy, É., Tétreault, P., Brouillette, R. L., René, A., Murza, A., Fanelli, R., et al.
(2020). Data set describing the in vitro biological activity of JMV2009, a novel
silylated neurotensin(8-13) analog. Data Brief 31, 105884.
doi:10.1016/j.dib.2020.105884.

Betancur, C., Canton, M., Burgos, A., Labeeuw, B., Gully, D., Rostène, W., et al. (1998).
Characterization of binding sites of a new neurotensin receptor antagonist, [3H]SR
 213

142948A, in the rat brain. European Journal of Pharmacology 343, 67–77.

doi:10.1016/s0014-2999(97)01510-0.

Béraud-Dufour, S., Devader, C., Massa, F., Roulot, M., Coppola, T., and Mazella, J.
(2016). Focal Adhesion Kinase-Dependent Role of the Soluble Form of Neurotensin
Receptor-3/Sortilin in Colorectal Cancer Cell Dissociation. Int J Mol Sci 17, 1860.
doi:10.3390/ijms17111860.

Bickel, U., Schumacher, O. P., Kang, Y. S., and Voigt, K. (1996). Poor permeability of
morphine 3-glucuronide and morphine 6-glucuronide through the blood-brain barrier in
the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 278, 107–113.

Binder, E. B., Kinkead, B., Owens, M. J., and Nemeroff, C. B. (2001). Neurotensin and
dopamine interactions. Pharmacol. Rev. 53, 453–486.

Bingham, B., Ajit, S. K., Blake, D. R., and Samad, T. A. (2009). The molecular basis of
pain and its clinical implications in rheumatology. Nat Clin Pract Rheumatol 5, 28–37.
doi:10.1038/ncprheum0972.

Bissette, G., Nemeroff, C. B., Loosen, P. T., Prange, A. J., and Lipton, M. A. (1976).
Hypothermia and intolerance to cold induced by intracisternal administration of the
hypothalamic peptide neurotensin. Nature 262, 607–609. doi:10.1038/262607a0.

Bolat, I., Pusuroglu, H., Demir, A. R., Ornek, V., and Erturk, M. (2020). Decreased
neurotensin levels as a biomarker in resistant hypertension. Clin. Exp. Hypertens. 42,
266–270. doi:10.1080/10641963.2019.1632340.

Borsotto, M., Veyssiere, J., Moha Ou Maati, H., Devader, C., Mazella, J., and Heurteaux,
C. (2015). Targeting two-pore domain K(+) channels TREK-1 and TASK-3 for the
treatment of depression: a new therapeutic concept. Br. J. Pharmacol. 172, 771–784.
doi:10.1111/bph.12953.

Botto, J. M., Chabry, J., Sarret, P., Vincent, J. P., and Mazella, J. (1998). Stable expression
of the mouse levocabastine-sensitive neurotensin receptor in HEK 293 cell line:
binding properties, photoaffinity labeling, and internalization mechanism. Biochemical
and Biophysical Research Communications 243, 585–590.
doi:10.1006/bbrc.1997.8071.

Boudin, H., Pélaprat, D., Rostène, W., and Beaudet, A. (1996). Cellular distribution of
neurotensin receptors in rat brain: immunohistochemical study using an antipeptide
antibody against the cloned high affinity receptor. J. Comp. Neurol. 373, 76–89.
doi:10.1002/(SICI)1096-9861(19960909)373:1&lt;76::AID-CNE7&gt;3.0.CO;2-A.

Boudin, H., Pélaprat, D., Rostène, W., Pickel, V. M., and Beaudet, A. (1998). Correlative
ultrastructural distribution of neurotensin receptor proteins and binding sites in the rat
substantia nigra. Journal of Neuroscience 18, 8473–8484.
doi:10.1523/JNEUROSCI.18-20-08473.1998.
 214

Boules, M. M., Fredrickson, P., Muehlmann, A. M., and Richelson, E. (2014). Elucidating
the role of neurotensin in the pathophysiology and management of major mental
disorders. Behav Sci (Basel) 4, 125–153. doi:10.3390/bs4020125.

Boules, M., Fredrickson, P., and Richelson, E. (2003). Current topics: brain penetrating
neurotensin analog. Life Sciences 73, 2785–2792. doi:10.1016/s0024-3205(03)00674-
x.

Boules, M., Fredrickson, P., and Richelson, E. (2006). Bioactive analogs of neurotensin:
focus on CNS effects. Peptides 27, 2523–2533. doi:10.1016/j.peptides.2005.12.018.

Boules, M., Johnston, H., Tozy, J., Smith, K., Li, Z., and Richelson, E. (2011). Analgesic
synergy of neurotensin receptor subtype 2 agonist NT79 and morphine. Behav
Pharmacol 22, 573–581. doi:10.1097/FBP.0b013e3283474a3a.

Boules, M., Li, Z., Smith, K., Fredrickson, P., and Richelson, E. (2013). Diverse roles of
neurotensin agonists in the central nervous system. Front Endocrinol (Lausanne) 4, 36.
doi:10.3389/fendo.2013.00036.

Boules, M., Liang, Y., Briody, S., Miura, T., Fauq, I., Oliveros, A., et al. (2010). NT79: A
novel neurotensin analog with selective behavioral effects. Brain Research 1308, 35–
46. doi:10.1016/j.brainres.2009.10.050.

Boules, M., McMahon, B., Warrington, L., Stewart, J., Jackson, J., Fauq, A., et al. (2001a).
Neurotensin analog selective for hypothermia over antinociception and exhibiting
atypical neuroleptic-like properties. Brain Research 919, 1–11. doi:10.1016/s0006-
8993(01)02981-x.

Boules, M., Shaw, A., Liang, Y., Barbut, D., and Richelson, E. (2009). NT69L, a novel
analgesic, shows synergy with morphine. Brain Research 1294, 22–28.
doi:10.1016/j.brainres.2009.07.086.

Boules, M., Warrington, L., Fauq, A., McCormick, D., and Richelson, E. (2001b).
Antiparkinson-like effects of a novel neurotensin analog in unilaterally 6-
hydroxydopamine lesioned rats. European Journal of Pharmacology 428, 227–233.
doi:10.1016/s0014-2999(01)01260-2.

Bourin, M., Petit-Demoulière, B., Dhonnchadha, B. N., and Hascöet, M. (2007). Animal
models of anxiety in mice. Fundam Clin Pharmacol 21, 567–574. doi:10.1111/j.1472-
8206.2007.00526.x.

Brandão, M. L., and Coimbra, N. C. (2019). Understanding the role of dopamine in

conditioned and unconditioned fear. Rev Neurosci 30, 325–337. doi:10.1515/revneuro-
2018-0023.

Bredeloux, P., Cavelier, F., Dubuc, I., Vivet, B., Costentin, J., and Martinez, J. (2008).
Synthesis and biological effects of c(Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-
 215

Leu) (JMV2012), a new analogue of neurotensin that crosses the blood-brain barrier. J.
Med. Chem. 51, 1610–1616. doi:10.1021/jm700925k.

Bredeloux, P., Costentin, J., and Dubuc, I. (2006). Interactions between NTS2 neurotensin
and opioid receptors on two nociceptive responses assessed on the hot plate test in
mice. Behav. Brain Res. 175, 399–407. doi:10.1016/j.bbr.2006.09.016.

Breslin, N. A., Suddath, R. L., Bissette, G., Nemeroff, C. B., Lowrimore, P., and
Weinberger, D. R. (1994). CSF concentrations of neurotensin in schizophrenia: an
investigation of clinical and biochemical correlates. Schizophr. Res. 12, 35–41.
doi:10.1016/0920-9964(94)90082-5.

Brouillette, R. L., Besserer-Offroy, É., Mona, C. E., Chartier, M., Lavenus, S., Sousbie, M.,
et al. (2020). Cell-penetrating pepducins targeting the neurotensin receptor type 1
relieve pain. Pharmacol. Res., 104750. doi:10.1016/j.phrs.2020.104750.

Bruffaerts, R., Demyttenaere, K., Kessler, R. C., Tachimori, H., Bunting, B., Hu, C., et al.
(2015). The associations between preexisting mental disorders and subsequent onset of
chronic headaches: a worldwide epidemiologic perspective. J Pain 16, 42–52.
doi:10.1016/j.jpain.2014.10.002.

Buhler, A. V., Choi, J., Proudfit, H. K., and Gebhart, G. F. (2005). Neurotensin activation
of the NTR1 on spinally-projecting serotonergic neurons in the rostral ventromedial
medulla is antinociceptive. Pain 114, 285–294. doi:10.1016/j.pain.2004.12.031.

Buhler, A. V., Proudfit, H. K., and Gebhart, G. F. (2008). Neurotensin-produced

antinociception in the rostral ventromedial medulla is partially mediated by spinal cord
norepinephrine. Pain 135, 280–290. doi:10.1016/j.pain.2007.06.010.

Calhoon, G. G., and Tye, K. M. (2015). Resolving the neural circuits of anxiety. Nat.
Neurosci. 18, 1394–1404. doi:10.1038/nn.4101.

Carey, L. M., Rice, R. J., and Prus, A. J. (2017). The Neurotensin NTS 1Receptor Agonist
PD149163 Produces Antidepressant-Like Effects in the Forced Swim Test: Further
Support for Neurotensin as a Novel Pharmacologic Strategy for Antidepressant Drugs.
Drug Development Research 53, 453. doi:10.1002/ddr.21393.

Carr, R., and Benovic, J. L. (2016). From biased signalling to polypharmacology:

unlocking unique intracellular signalling using pepducins. Biochem. Soc. Trans. 44,
555–561. doi:10.1042/BST20150230.

Carraway, R., and Leeman, S. (1973). The Isolation of a New Hypotensive Peptide,
Neurotensin, from Bovine Hypothalami*. J Biol Chem 248, 6854–6861.

Carraway, R., and Leeman, S. E. (1975a). The amino acid sequence of a hypothalamic
peptide, neurotensin. J Biol Chem 250, 1907–1911.
 216

Carraway, R., and Leeman, S. E. (1975b). The synthesis of neurotensin. J Biol Chem 250,
1912–1918.

Cavelier, F., Vivet, B., Martinez, J., Aubry, A., Didierjean, C., Vicherat, A., et al. (2002).
Influence of Silaproline on Peptide Conformation and Bioactivity. J. Am. Chem. Soc.
124, 2917–2923. doi:10.1021/ja017440q.

Cáceda, R., Kinkead, B., and Nemeroff, C. B. (2006). Neurotensin: role in psychiatric and
neurological diseases. Peptides 27, 2385–2404. doi:10.1016/j.peptides.2006.04.024.

Ceconi, C., Condorelli, E., Quinzanini, M., Rodella, A., Ferrari, R., and Harris, P. (1989).
Noradrenaline, atrial natriuretic peptide, bombesin and neurotensin in myocardium and
blood of rats in congestive cardiac failure. Cardiovasc. Res. 23, 674–682.
doi:10.1093/cvr/23.8.674.

Chabry, J., Botto, J. M., Nouel, D., Beaudet, A., Vincent, J. P., and Mazella, J. (1995). Thr-
422 and Tyr-424 residues in the carboxyl terminus are critical for the internalization of
the rat neurotensin receptor. J Biol Chem 270, 2439–2442. doi:10.1074/jbc.270.6.2439.

Chalon, P., Vita, N., Kaghad, M., Guillemot, M., Bonnin, J., Delpech, B., et al. (1996).
Molecular cloning of a levocabastine-sensitive neurotensin binding site. FEBS Lett.
386, 91–94.

Charney, D. S. (2003). Neuroanatomical circuits modulating fear and anxiety behaviors.

Acta Psychiatr Scand Suppl 108, 38–50. doi:10.1034/j.1600-0447.108.s417.3.x.

Checler, F., Barelli, H., Kwan, C. Y., Kitabgi, P., and Vincent, J. P. (1987). Neurotensin-
metabolizing peptidases in rat fundus plasma membranes. J. Neurochem. 49, 507–512.
doi:10.1111/j.1471-4159.1987.tb02893.x.

Checler, F., Emson, P. C., Vincent, J. P., and Kitabgi, P. (1984). Inactivation of
neurotensin by rat brain synaptic membranes. Cleavage at the Pro10-Tyr11 bond by
endopeptidase 24.11 (enkephalinase) and a peptidase different from proline-
endopeptidase. J. Neurochem. 43, 1295–1301. doi:10.1111/j.1471-
4159.1984.tb05386.x.

Checler, F., Mazella, J., Kitabgi, P., and Vincent, J. P. (1986). High-affinity receptor sites
and rapid proteolytic inactivation of neurotensin in primary cultured neurons. J.
Neurochem. 47, 1742–1748. doi:10.1111/j.1471-4159.1986.tb13083.x.

Checler, F., Vincent, J. P., and Kitabgi, P. (1983). Degradation of neurotensin by rat brain
synaptic membranes: involvement of a thermolysin-like metalloendopeptidase
(enkephalinase), angiotensin-converting enzyme, and other unidentified peptidases. J.
Neurochem. 41, 375–384. doi:10.1111/j.1471-4159.1983.tb04753.x.

Checler, F., Vincent, J. P., and Kitabgi, P. (1985). Inactivation of neurotensin by rat brain
synaptic membranes partly occurs through cleavage at the Arg8-Arg9 peptide bond by
 217

a metalloendopeptidase. J. Neurochem. 45, 1509–1513. doi:10.1111/j.1471-

4159.1985.tb07220.x.

Choi, K.-E., Hall, C. L., Sun, J.-M., Wei, L., Mohamad, O., Dix, T. A., et al. (2012). A
novel stroke therapy of pharmacologically induced hypothermia after focal cerebral
ischemia in mice. FASEB J. 26, 2799–2810. doi:10.1096/fj.11-201822.

Christopoulos, A., and Kenakin, T. (2002). G protein-coupled receptor allosterism and

complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323–374. doi:10.1124/pr.54.2.323.

Ciaramella, A. (2019). Psychopharmacology of chronic pain. Handb Clin Neurol 165, 317–
337. doi:10.1016/B978-0-444-64012-3.00019-8.

Clineschmidt, B. V., McGuffin, J. C., and Bunting, P. B. (1979). Neurotensin:

Antinocisponsive action in rodents. European Journal of Pharmacology 54, 129–139.
doi:10.1016/0014-2999(79)90415-1.

Cortese, B. M., and Phan, K. L. (2005). The role of glutamate in anxiety and related
disorders. CNS Spectr 10, 820–830. doi:10.1017/s1092852900010427.

Currie, S. R., and Wang, J. (2005). More data on major depression as an antecedent risk
factor for first onset of chronic back pain. Psychol Med 35, 1275–1282.
doi:10.1017/S0033291705004952.

D'Mello, R., and Dickenson, A. H. (2008). Spinal cord mechanisms of pain. Br J Anaesth
101, 8–16. doi:10.1093/bja/aen088.

Dal Farra, C., Sarret, P., Navarro, V., Botto, J. M., Mazella, J., and Vincent, J. P. (2001).
Involvement of the neurotensin receptor subtype NTR3 in the growth effect of
neurotensin on cancer cell lines. Int. J. Cancer 92, 503–509. doi:10.1002/ijc.1225.

Daneman, R., and Prat, A. (2015). The blood-brain barrier. Cold Spring Harb Perspect
Biol 7, a020412. doi:10.1101/cshperspect.a020412.

Demeule, M., Beaudet, N., Régina, A., Besserer-Offroy, É., Murza, A., Tétreault, P., et al.
(2014). Conjugation of a brain-penetrant peptide with neurotensin provides
antinociceptive properties. J. Clin. Invest. 124, 1199–1213. doi:10.1172/JCI70647.

Demeule, M., Régina, A., Ché, C., Poirier, J., Nguyen, T., Gabathuler, R., et al. (2008).
Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 324, 1064–1072. doi:10.1124/jpet.107.131318.

Demyttenaere, K., Bruffaerts, R., Lee, S., Posada-Villa, J., Kovess, V., Angermeyer, M. C.,
et al. (2007). Mental disorders among persons with chronic back or neck pain: results
from the World Mental Health Surveys. Pain 129, 332–342.
doi:10.1016/j.pain.2007.01.022.
 218

Devader, C., Roulot, M., Moréno, S., Minelli, A., Bortolomasi, M., Congiu, C., et al.
(2017). Serum sortilin-derived propeptides concentrations are decreased in major
depressive disorder patients. J Affect Disord 208, 443–447.
doi:10.1016/j.jad.2016.10.049.

Di Paola, E. D., and Richelson, E. (1990). Cardiovascular effects of neurotensin and some
analogues on rats. European Journal of Pharmacology 175, 279–283.
doi:10.1016/0014-2999(90)90565-n.

Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (2014). Diagnostic and Statistical
Manual of Mental Disorders. Fifth Edition. American Psychiatric Association.

Dobner, P. R. (2006). Neurotensin and pain modulation. Peptides 27, 2405–2414.

doi:10.1016/j.peptides.2006.04.025.

Dobner, P. R., Barber, D. L., Villa-Komaroff, L., and McKiernan, C. (1987). Cloning and
sequence analysis of cDNA for the canine neurotensin/neuromedin N precursor. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 3516–3520. doi:10.1073/pnas.84.10.3516.

Doré-Savard, L., Roussy, G., Dansereau, M.-A., Collingwood, M. A., Lennox, K. A., Rose,
S. D., et al. (2008). Central delivery of Dicer-substrate siRNA: a direct application for
pain research. Mol. Ther. 16, 1331–1339. doi:10.1038/mt.2008.98.

Doulut, S., Rodriguez, M., Lugrin, D., Vecchini, F., Kitabgi, P., Aumelas, A., et al. (1992).
Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin. Pept. Res. 5, 30–38.

Driggers, E. M., Hale, S. P., Lee, J., and Terrett, N. K. (2008). The exploration of
macrocycles for drug discovery--an underexploited structural class. Nat Rev Drug
Discov 7, 608–624. doi:10.1038/nrd2590.

Dubuc, I., Costentin, J., Doulut, S., Rodriguez, M., Martinez, J., and Kitabgi, P. (1992).
JMV 449: a pseudopeptide analogue of neurotensin-(8-13) with highly potent and
long-lasting hypothermic and analgesic effects in the mouse. European Journal of
Pharmacology 219, 327–329.

Dubuc, I., Sarret, P., Labbé-Jullié, C., Botto, J. M., Honoré, E., Bourdel, E., et al. (1999).
Identification of the receptor subtype involved in the analgesic effect of neurotensin.
Journal of Neuroscience 19, 503–510.

Dubuisson, D., and Dennis, S. G. (1977). The formalin test: a quantitative study of the
analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats.
Pain 4, 161–174.

Durant, C., Christmas, D., and Nutt, D. (2010). The pharmacology of anxiety. Curr Top
Behav Neurosci 2, 303–330. doi:10.1007/7854_2009_8.

Ehlers, R. A., Zhang, Y., Hellmich, M. R., and Evers, B. M. (2000). Neurotensin-mediated
activation of MAPK pathways and AP-1 binding in the human pancreatic cancer cell
 219

line, MIA PaCa-2. Biochemical and Biophysical Research Communications 269, 704–
708. doi:10.1006/bbrc.2000.2335.

Einsiedel, J., Held, C., Hervet, M., Plomer, M., Tschammer, N., Hübner, H., et al. (2011).
Discovery of highly potent and neurotensin receptor 2 selective neurotensin mimetics.
J. Med. Chem. 54, 2915–2923. doi:10.1021/jm200006c.

Eiselt, E., Côté, J., Longpre, J.-M., Blais, V., Sarret, P., and Gendron, L. (2019a). The
combination of opioid and neurotensin receptor agonists improves their
analgesic/adverse effect ratio. European Journal of Pharmacology 848, 80–87.
doi:10.1016/j.ejphar.2019.01.048.

Eiselt, E., Gonzalez, S., Martin, C., Chartier, M., Betti, C., Longpre, J.-M., et al. (2019b).
Neurotensin Analogues Containing Cyclic Surrogates of Tyrosine at Position 11
Improve NTS2 Selectivity Leading to Analgesia without Hypotension and
Hypothermia. ACS Chem Neurosci 10, 4535–4544.
doi:10.1021/acschemneuro.9b00390.

Eiselt, E., Otis, V., Belleville, K., Yang, G., Larocque, A., Régina, A., et al. (2020). Use of
a Noninvasive Brain-Penetrating Peptide-Drug Conjugate Strategy to Improve the
Delivery of Opioid Pain Relief Medications to the Brain. J. Pharmacol. Exp. Ther.
374, 52–61. doi:10.1124/jpet.119.263566.

Fan, Y., Lai, M. H., Sullivan, K., Popiolek, M., Andree, T. H., Dollings, P., et al. (2008).
The identification of neurotensin NTS1 receptor partial agonists through a ligand-
based virtual screening approach. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18,
5789–5791. doi:10.1016/j.bmcl.2008.09.075.

Fanelli, R., Besserer-Offroy, É., René, A., Côté, J., Tétreault, P., Collerette-Tremblay, J., et
al. (2015). Synthesis and Characterization in Vitro and in Vivo of (l)-
(Trimethylsilyl)alanine Containing Neurotensin Analogues. J. Med. Chem. 58, 7785–
7795. doi:10.1021/acs.jmedchem.5b00841.

Fanelli, R., Floquet, N., Besserer-Offroy, É., Delort, B., Vivancos, M., Longpre, J.-M., et
al. (2017). Use of Molecular Modeling to Design Selective-NTS2 Neurotensin
Analogues. J. Med. Chem. 60, acs.jmedchem.6b01848–3313.
doi:10.1021/acs.jmedchem.6b01848.

Fang, F. G., Moreau, J. L., and Fields, H. L. (1987). Dose-dependent antinociceptive action
of neurotensin microinjected into the rostroventromedial medulla of the rat. Brain
Research 420, 171–174. doi:10.1016/0006-8993(87)90255-1.

Fantegrossi, W. E., Ko, M. C. H., Woods, J. H., and Richelson, E. (2005). Antinociceptive,
hypothermic, hypotensive, and reinforcing effects of a novel neurotensin receptor
agonist, NT69L, in rhesus monkeys. Pharmacol. Biochem. Behav. 80, 341–349.
doi:10.1016/j.pbb.2004.12.005.
 220

Fassio, A., Evans, G., Grisshammer, R., Bolam, J. P., Mimmack, M., and Emson, P. C.
(2000). Distribution of the neurotensin receptor NTS1 in the rat CNS studied using an
amino-terminal directed antibody. Neuropharmacology 39, 1430–1442.

Feifel, D., Goldenberg, J., Melendez, G., and Shilling, P. D. (2010). The acute and
subchronic effects of a brain-penetrating, neurotensin-1 receptor agonist on feeding,
body weight and temperature. Neuropharmacology 58, 195–198.
doi:10.1016/j.neuropharm.2009.07.001.

Feifel, D., Shilling, P. D., Fazlinejad, A. A., and Melendez, G. (2016). Antipsychotic drug-
like facilitation of latent inhibition by a brain-penetrating neurotensin-1 receptor
agonist. J. Psychopharmacol. (Oxford) 30, 312–317. doi:10.1177/0269881115625360.

Fitzcharles, M.-A., Baerwald, C., Ablin, J., and Häuser, W. (2016). Efficacy, tolerability
and safety of cannabinoids in chronic pain associated with rheumatic diseases
(fibromyalgia syndrome, back pain, osteoarthritis, rheumatoid arthritis): A systematic
review of randomized controlled trials. Schmerz 30, 47–61. doi:10.1007/s00482-015-
0084-3.

Fitzpatrick, K., Winrow, C. J., Gotter, A. L., Millstein, J., Arbuzova, J., Brunner, J., et al.
(2012). Altered sleep and affect in the neurotensin receptor 1 knockout mouse. Sleep
35, 949–956. doi:10.5665/sleep.1958.

Furuta, S., Kisara, K., Sakurada, S., Sakurada, T., Sasaki, Y., and Suzuki, K. (1984).
Structure-antinociceptive activity studies with neurotensin. Br. J. Pharmacol. 83, 43–
48. doi:10.1111/j.1476-5381.1984.tb10117.x.

Fuxe, K., Borroto-Escuela, D., Fisone, G., Agnati, L. F., and Tanganelli, S. (2014).
Understanding the role of heteroreceptor complexes in the central nervous system.
Curr. Protein Pept. Sci. 15, 647–647. doi:10.2174/138920371507140916122738.

Gailly, P., Najimi, M., and Hermans, E. (2000). Evidence for the dual coupling of the rat
neurotensin receptor with pertussis toxin-sensitive and insensitive G-proteins. FEBS
Lett. 483, 109–113. doi:10.1016/s0014-5793(00)02095-0.

Gaskin, D. J., and Richard, P. (2012). The economic costs of pain in the United States. J
Pain 13, 715–724. doi:10.1016/j.jpain.2012.03.009.

Gendron, L., Perron, A., Payet, M.-D., Gallo-Payet, N., Sarret, P., and Beaudet, A. (2004).
Low-affinity neurotensin receptor (NTS2) signaling: internalization-dependent
activation of extracellular signal-regulated kinases 1/2. Molecular Pharmacology 66,
1421–1430. doi:10.1124/mol.104.002303.

Giordanetto, F., and Kihlberg, J. (2014). Macrocyclic drugs and clinical candidates: what
can medicinal chemists learn from their properties? J. Med. Chem. 57, 278–295.
doi:10.1021/jm400887j.
 221

Goldberg, D. S., and McGee, S. J. (2011). Pain as a global public health priority. BMC
Public Health 11, 770. doi:10.1186/1471-2458-11-770.

Granier, C., Rietschoten, J., Kitabgi, P., Poustis, C., and Freychet, P. (1982). Synthesis and
Characterization of Neurotensin Analogues for Structure/Activity Relationship Studies.
Acetyl-neurotensin-(8-13) Is the Shortest Analogue with Full Binding and
Pharmacological Activities. Eur J Biochem 124, 117–125. doi:10.1111/j.1432-
1033.1982.tb05913.x.

Gray, T. S., and Magnuson, D. J. (1992). Peptide immunoreactive neurons in the amygdala
and the bed nucleus of the stria terminalis project to the midbrain central gray in the
rat. Peptides 13, 451–460. doi:10.1016/0196-9781(92)90074-d.

Gui, X., Carraway, R. E., and Dobner, P. R. (2004). Endogenous neurotensin facilitates
visceral nociception and is required for stress-induced antinociception in mice and rats.
Neuroscience 126, 1023–1032. doi:10.1016/j.neuroscience.2004.04.034.

Guillemette, A., Dansereau, M. A., Beaudet, N., Richelson, E., and Sarret, P. (2012).
Intrathecal administration of NTS1 agonists reverses nociceptive behaviors in a rat
model of neuropathic pain. Eur J Pain 16, 473–484. doi:10.1016/j.ejpain.2011.07.008.

Gully, D., Lespy, L., Canton, M., Rostène, W., Kitabgi, P., Le Fur, G., et al. (1996). Effect
of the neurotensin receptor antagonist SR48692 on rat blood pressure modulation by
neurotensin. Life Sciences 58, 665–674.

Hammer, R. A., Leeman, S. E., Carraway, R., and Williams, R. H. (1980). Isolation of
human intestinal neurotensin. J Biol Chem 255, 2476–2480.

Hapău, D., Rémond, E., Fanelli, R., Vivancos, M., René, A., Côté, J., et al. (2016).
Stereoselective Synthesis of β-(5-Arylthiazolyl) α-Amino Acids and Use in
Neurotensin Analogues. Eur. J. Org. Chem. 2016, 1017–1024.
doi:10.1002/ejoc.201501495.

Harro, J. (2018). Animals, anxiety, and anxiety disorders: How to measure anxiety in
rodents and why. Behav. Brain Res. 352, 81–93. doi:10.1016/j.bbr.2017.10.016.

Hashmi, J. A., Baliki, M. N., Huang, L., Baria, A. T., Torbey, S., Hermann, K. M., et al.
(2013). Shape shifting pain: chronification of back pain shifts brain representation
from nociceptive to emotional circuits. Brain 136, 2751–2768.
doi:10.1093/brain/awt211.

Hauser, A. S., Chavali, S., Masuho, I., Jahn, L. J., Martemyanov, K. A., Gloriam, D. E., et
al. (2018). Pharmacogenomics of GPCR Drug Targets. Cell 172, 41–54.e19.
doi:10.1016/j.cell.2017.11.033.

Hayashida, K.-I., and Obata, H. (2019). Strategies to Treat Chronic Pain and Strengthen
Impaired Descending Noradrenergic Inhibitory System. Int J Mol Sci 20, 822.
doi:10.3390/ijms20040822.
 222

Held, C., Hübner, H., Kling, R., Nagel, Y. A., Wennemers, H., and Gmeiner, P. (2013).
Impact of the proline residue on ligand binding of neurotensin receptor 2 (NTS2)-
selective peptide-peptoid hybrids. ChemMedChem 8, 772–778.
doi:10.1002/cmdc.201300054.

Held, C., Plomer, M., Hübner, H., Meltretter, J., Pischetsrieder, M., and Gmeiner, P.
(2012). Development of a Metabolically Stable Neurotensin Receptor 2 (NTS2)
Ligand. ChemMedChem 8, 75–81. doi:10.1002/cmdc.201200376.

Hellinger, E., Veszelka, S., Tóth, A. E., Walter, F., Kittel, A., Bakk, M. L., et al. (2012).
Comparison of brain capillary endothelial cell-based and epithelial (MDCK-MDR1,
Caco-2, and VB-Caco-2) cell-based surrogate blood-brain barrier penetration models.
Eur J Pharm Biopharm 82, 340–351. doi:10.1016/j.ejpb.2012.07.020.

Hermans, E., Vanisberg, M. A., Geurts, M., and Maloteaux, J. M. (1997). Down-regulation
of neurotensin receptors after ligand-induced internalization in rat primary cultured
neurons. Neurochem. Int. 31, 291–299. doi:10.1016/s0197-0186(96)00155-6.

Hershberger, P., Hedrick, M., Peddibhotla, S., Maloney, P., Li, Y., Milewski, M., et al.
(2010). Small Molecule Agonists for the Neurotensin 1 Receptor (NTR1 Agonists).

Heurteaux, C., Lucas, G., Guy, N., El-Yacoubi, M., Thümmler, S., Peng, X.-D., et al.
(2006). Deletion of the background potassium channel TREK-1 results in a depression-
resistant phenotype. Nat. Neurosci. 9, 1134–1141. doi:10.1038/nn1749.

Hill, K. P. (2015). Medical Marijuana for Treatment of Chronic Pain and Other Medical
and Psychiatric Problems: A Clinical Review. JAMA 313, 2474–2483.
doi:10.1001/jama.2015.6199.

Hillhouse, T. M., and Prus, A. J. (2013). Effects of the neurotensin NTS1 receptor agonist
PD149163 on visual signal detection in rats. European Journal of Pharmacology 721,
201–207. doi:10.1016/j.ejphar.2013.09.035.

Hogan, M.-E., Taddio, A., Katz, J., Shah, V., and Krahn, M. (2016). Incremental health
care costs for chronic pain in Ontario, Canada: a population-based matched cohort
study of adolescents and adults using administrative data. Pain 157, 1626–1633.
doi:10.1097/j.pain.0000000000000561.

Holly, E. N., Ebrecht, B., and Prus, A. J. (2011). The neurotensin-1 receptor agonist
PD149163 inhibits conditioned avoidance responding without producing catalepsy in
rats. Eur Neuropsychopharmacol 21, 526–531. doi:10.1016/j.euroneuro.2010.12.004.

Holmes, B. B., Rady, J. J., Smith, D. J., and Fujimoto, J. M. (1999). Supraspinal
neurotensin-induced antianalgesia in mice is mediated by spinal cholecystokinin. Jpn.
J. Pharmacol. 79, 141–149. doi:10.1254/jjp.79.141.
 223

Hong, F., Cusack, B., Fauq, A., and Richelson, E. (1997). Peptidic and Non-peptidic
Neurotensin Analogs. Current Medicinal Chem 4, 421–434.

Hooten, W. M. (2016). Chronic Pain and Mental Health Disorders: Shared Neural
Mechanisms, Epidemiology, and Treatment. Mayo Clin. Proc. 91, 955–970.
doi:10.1016/j.mayocp.2016.04.029.

Hou, I.-C., Suzuki, C., Kanegawa, N., Oda, A., Yamada, A., Yoshikawa, M., et al. (2011).
β-Lactotensin derived from bovine β-lactoglobulin exhibits anxiolytic-like activity as
an agonist for neurotensin NTS(2) receptor via activation of dopamine D(1) receptor in
mice. J. Neurochem. 119, 785–790. doi:10.1111/j.1471-4159.2011.07472.x.

Huang, W., Masureel, M., Qu, Q., Janetzko, J., Inoue, A., Kato, H. E., et al. (2020).
Structure of the neurotensin receptor 1 in complex with β-arrestin 1. Nature 579, 303–
308. doi:10.1038/s41586-020-1953-1.

Huber, C., Huber, M., and Ding, Y. (2019). Evidence and opportunities of hypothermia in
acute ischemic stroke: Clinical trials of systemic versus selective hypothermia. Brain
Circ 5, 195–202. doi:10.4103/bc.bc_25_19.

Hübner, H., Schellhorn, T., Gienger, M., Schaab, C., Kaindl, J., Leeb, L., et al. (2016).
Structure-guided development of heterodimer-selective GPCR ligands. Nat Commun 7,
12298–12. doi:10.1038/ncomms12298.

Hylden, J. L., and Wilcox, G. L. (1983). Antinociceptive action of intrathecal neurotensin

in mice. Peptides 4, 517–520. doi:10.1016/0196-9781(83)90057-8.

Ito, S., Suto, T., Saito, S., and Obata, H. (2018). Repeated Administration of Duloxetine
Suppresses Neuropathic Pain by Accumulating Effects of Noradrenaline in the Spinal
Cord. Anesth. Analg. 126, 298–307. doi:10.1213/ANE.0000000000002380.

Januzzi, J. L., Lyass, A., Liu, Y., Gaggin, H., Trebnick, A., Maisel, A. S., et al. (2016).
Circulating Proneurotensin Concentrations and Cardiovascular Disease Events in the
Community: The Framingham Heart Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36,
1692–1697. doi:10.1161/ATVBAHA.116.307847.

Jarrin, S., and Finn, D. P. (2019). Optogenetics and its application in pain and anxiety
research. Neurosci Biobehav Rev 105, 200–211. doi:10.1016/j.neubiorev.2019.08.007.

Jelsema, C. L., and Axelrod, J. (1987). Stimulation of phospholipase A2 activity in bovine

rod outer segments by the beta gamma subunits of transducin and its inhibition by the
alpha subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 3623–3627.
doi:10.1073/pnas.84.11.3623.

Jensen, K. B., Loitoile, R., Kosek, E., Petzke, F., Carville, S., Fransson, P., et al. (2012).
Patients with fibromyalgia display less functional connectivity in the brain's pain
inhibitory network. Mol Pain 8, 32. doi:10.1186/1744-8069-8-32.
 224

Ji, G., and Neugebauer, V. (2012). Modulation of medial prefrontal cortical activity using
in vivo recordings and optogenetics. Mol Brain 5, 36–10. doi:10.1186/1756-6606-5-36.

Ji, R.-R., Xu, Z.-Z., and Gao, Y.-J. (2014). Emerging targets in neuroinflammation-driven
chronic pain. Nat Rev Drug Discov 13, 533–548. doi:10.1038/nrd4334.

Jolas, T., and Aghajanian, G. K. (1997). Neurotensin and the serotonergic system. Prog.
Neurobiol. 52, 455–468. doi:10.1016/s0301-0082(97)00025-7.

Jolicoeur, F. B., Gagné, M. A., Rivest, R., Drumheller, A., and St-Pierre, S. (1993).
Atypical neuroleptic-like behavioral effects of neurotensin. Brain Res. Bull. 32, 487–
491. doi:10.1016/0361-9230(93)90295-m.

Kaczyńska, K., and Szereda-Przestaszewska, M. (2012). Cardio-respiratory effects of

systemic neurotensin injection are mediated through activation of neurotensin NTS1
receptors. European Journal of Pharmacology 691, 245–250.
doi:10.1016/j.ejphar.2012.07.020.

Kalivas, P. W., Gau, B. A., Nemeroff, C. B., and Prange, A. J. (1982). Antinociception
after microinjection of neurotensin into the central amygdaloid nucleus of the rat.
Brain Research 243, 279–286.

Kalivas, P. W., Nemeroff, C. B., Miller, J. S., and Prange, A. J. (1985). Microinjection of
neurotensin into the ventral tegmental area produces hypothermia: evaluation of
dopaminergic mediation. Brain Research 326, 219–227. doi:10.1016/0006-
8993(85)90031-9.

Kalueff, A. V., and Nutt, D. J. (2007). Role of GABA in anxiety and depression. Depress
Anxiety 24, 495–517. doi:10.1002/da.20262.

Katz, L. M., Wang, Y., McMahon, B., and Richelson, E. (2001). Neurotensin analog
NT69L induces rapid and prolonged hypothermia after hypoxic ischemia. Acad Emerg
Med 8, 1115–1121.

Katz, L. M., Young, A., Frank, J. E., Wang, Y., and Park, K. (2004). Neurotensin-induced
hypothermia improves neurologic outcome after hypoxic-ischemia. Crit. Care Med.
32, 806–810.

Kaur, C., and Ling, E.-A. (2017). The circumventricular organs. Histol. Histopathol. 32,
879–892. doi:10.14670/HH-11-881.

Keiser, A. A., Matazel, K. S., Esser, M. K., Feifel, D., and Prus, A. J. (2014). Systemic
administration of the neurotensin NTS₁-receptor agonist PD149163 improves
performance on a memory task in naturally deficient male brown Norway rats. Exp
Clin Psychopharmacol 22, 541–547. doi:10.1037/a0037912.
 225

Kérouac, R., St-Pierre, S., and Rioux, F. (1982). Influence of various drugs on the
variations of blood pressure, hematocrit and plasma histamine caused by neurotensin
and compound 48/80 in rats. Neuropeptides 3, 145–157. doi:10.1016/0143-
4179(82)90010-5.

Kérouac, R., St-Pierre, S., Manning, M., and Rioux, F. (1983). Partial blockade of
neurotensin-induced hypotension in rats by nephrectomy captopril and saralasin.
Possible mechanisms. Neuropeptides 3, 295–307. doi:10.1016/0143-4179(83)90047-1.

Kim, C., Barbut, D., Heinemann, M. H., Pasternak, G., and Rosenblatt, M. I. (2014).
Synthetic neurotensin analogues are nontoxic analgesics for the rabbit cornea. Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. 55, 3586–3593. doi:10.1167/iovs.13-13050.

Kim, E.-J., Lee, D. K., Hong, S.-G., Han, J., and Kang, D. (2017). Activation of TREK-1,
but Not TREK-2, Channel by Mood Stabilizers. Int J Mol Sci 18, 2460.
doi:10.3390/ijms18112460.

Kinkead, B., Shahid, S., Owens, M. J., and Nemeroff, C. B. (2000). Effects of acute and
subchronic administration of typical and atypical antipsychotic drugs on the
neurotensin system of the rat brain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 67–73.

Kislauskis, E., Bullock, B., McNeil, S., and Dobner, P. R. (1988). The rat gene encoding
neurotensin and neuromedin N. Structure, tissue-specific expression, and evolution of
exon sequences. J Biol Chem 263, 4963–4968.

Kitabgi, P. (2002). Targeting neurotensin receptors with agonists and antagonists for
therapeutic purposes. Curr Opin Drug Discov Devel 5, 764–776.

Kitabgi, P. (2006a). Functional domains of the subtype 1 neurotensin receptor (NTS1).

Peptides 27, 2461–2468. doi:10.1016/j.peptides.2006.02.013.

Kitabgi, P. (2006b). Inactivation of neurotensin and neuromedin N by Zn

metallopeptidases. Peptides 27, 2515–2522. doi:10.1016/j.peptides.2005.12.017.

Kitabgi, P., and Freychet, P. (1979). Neurotensin: contractile activity, specific binding, and
lack of effect on cyclic nucleotides in intestinal smooth muscle. European Journal of
Pharmacology 55, 35–42.

Kitabgi, P., Carraway, R., and Leeman, S. E. (1976). Isolation of a Tridecapeptide its
Partial Characterization from Bovine Intestinal Tissue and as Neurotensin*. J Biol
Chem 251, 7053–7058.

Kitabgi, P., Checler, F., and Vincent, J. P. (1984). Comparison of some biological
properties of neurotensin and its natural analogue LANT-6. European Journal of
Pharmacology 99, 357–360. doi:10.1016/0014-2999(84)90147-x.
 226

Kitabgi, P., De Nadai, F., Rovère, C., and Bidard, J. N. (1992). Biosynthesis, maturation,
release, and degradation of neurotensin and neuromedin N. Ann. N. Y. Acad. Sci. 668,
30–42. doi:10.1111/j.1749-6632.1992.tb27337.x.

Kitabgi, P., Poustis, C., Granier, C., Van Rietschoten, J., Rivier, J., Morgat, J. L., et al.
(1980). Neurotensin binding to extraneural and neural receptors: comparison with
biological activity and structure--activity relationships. Molecular Pharmacology 18,
11–19.

Kitabgi, P., Rostène, W., Dussaillant, M., Schotte, A., Laduron, P. M., and Vincent, J. P.
(1987). Two populations of neurotensin binding sites in murine brain: discrimination
by the antihistamine levocabastine reveals markedly different radioautographic
distribution. European Journal of Pharmacology 140, 285–293. doi:10.1016/0014-
2999(87)90285-8.

Kleczkowska, P., and Lipkowski, A. W. (2013). Neurotensin and neurotensin receptors:

characteristic, structure-activity relationship and pain modulation--a review. European
Journal of Pharmacology 716, 54–60. doi:10.1016/j.ejphar.2013.03.004.

Kleczkowska, P., Bojnik, E., Leśniak, A., Kosson, P., Van den Eynde, I., Ballet, S., et al.
(2013). Identification of Dmt-D-Lys-Phe-Phe-OH as a highly antinociceptive
tetrapeptide metabolite of the opioid-neurotensin hybrid peptide PK20. Pharmacol Rep
65, 836–846. doi:10.1016/s1734-1140(13)71064-8.

Kliewer, A., Schmiedel, F., Sianati, S., Bailey, A., Bateman, J. T., Levitt, E. S., et al.
(2019). Phosphorylation-deficient G-protein-biased μ-opioid receptors improve
analgesia and diminish tolerance but worsen opioid side effects. Nat Commun 10, 367–
11. doi:10.1038/s41467-018-08162-1.

Kozasa, T., Hajicek, N., Chow, C. R., and Suzuki, N. (2011). Signalling mechanisms of
RhoGTPase regulation by the heterotrimeric G proteins G12 and G13. J. Biochem.
150, 357–369. doi:10.1093/jb/mvr105.

Kroenke, K., Outcalt, S., Krebs, E., Bair, M. J., Wu, J., Chumbler, N., et al. (2013).
Association between anxiety, health-related quality of life and functional impairment
in primary care patients with chronic pain. Gen Hosp Psychiatry 35, 359–365.
doi:10.1016/j.genhosppsych.2013.03.020.

Krumm, B. E., Lee, S., Bhattacharya, S., Botos, I., White, C. F., Du, H., et al. (2016).
Structure and dynamics of a constitutively active neurotensin receptor. Sci Rep 6,
38564–15. doi:10.1038/srep38564.

Kuner, R., and Flor, H. (2016). Structural plasticity and reorganisation in chronic pain. Nat.
Rev. Neurosci. 18, 20–30. doi:10.1038/nrn.2016.162.

Labbé-Jullié, C., Deschaintres, S., Gully, D., Le Fur, G., and Kitabgi, P. (1994). Effect of
the nonpeptide neurotensin antagonist, SR 48692, and two enantiomeric analogs, SR
 227

48527 and SR 49711, on neurotensin binding and contractile responses in guinea pig
ileum and colon. J. Pharmacol. Exp. Ther. 271, 267–276.

Lafrance, M., Roussy, G., Belleville, K., Maeno, H., Beaudet, N., Wada, K., et al. (2010).
Involvement of NTS2 receptors in stress-induced analgesia. Neuroscience 166, 639–
652. doi:10.1016/j.neuroscience.2009.12.042.

Lambert, P. D., Gross, R., Nemeroff, C. B., and Kilts, C. D. (1995). Anatomy and
mechanisms of neurotensin-dopamine interactions in the central nervous system. Ann.
N. Y. Acad. Sci. 757, 377–389.

Lazarova, M., Popatanasov, A., Klissurov, R., Stoeva, S., Pajpanova, T., Kalfin, R., et al.
(2018). Preventive Effect of Two New Neurotensin Analogues on Parkinson's Disease
Rat Model. J. Mol. Neurosci. 66, 552–560. doi:10.1007/s12031-018-1171-6.

László, K., Tóth, K., Kertes, E., Péczely, L., and Lénárd, L. (2010). The role of neurotensin
in positive reinforcement in the rat central nucleus of amygdala. Behav. Brain Res.
208, 430–435. doi:10.1016/j.bbr.2009.12.022.

Lee, J. H., Wei, L., Gu, X., Wei, Z., Dix, T. A., and Yu, S. P. (2014). Therapeutic effects of
pharmacologically induced hypothermia against traumatic brain injury in mice. J.
Neurotrauma 31, 1417–1430. doi:10.1089/neu.2013.3251.

Lee, J. H., Wei, L., Gu, X., Won, S., Wei, Z. Z., Dix, T. A., et al. (2016a). Improved
Therapeutic Benefits by Combining Physical Cooling With Pharmacological
Hypothermia After Severe Stroke in Rats. Stroke 47, 1907–1913.
doi:10.1161/STROKEAHA.116.013061.

Lee, J. H., Wei, Z. Z., Cao, W., Won, S., Gu, X., Winter, M., et al. (2016b). Regulation of
therapeutic hypothermia on inflammatory cytokines, microglia polarization, migration
and functional recovery after ischemic stroke in mice. Neurobiol. Dis. 96, 248–260.
doi:10.1016/j.nbd.2016.09.013.

Li, A. H., Yeh, T. H., Tan, P. P., Hwang, H. M., and Wang, H. L. (2001). Neurotensin
excitation of serotonergic neurons in the rat nucleus raphe magnus: ionic and
molecular mechanisms. Neuropharmacology 40, 1073–1083. doi:10.1016/s0028-
3908(01)00030-2.

Li, B., Chang, L.-L., and Xi, K. (2020). Neurotensin 1 receptor in the prelimbic cortex
regulates anxiety-like behavior in rats. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry
104, 110011. doi:10.1016/j.pnpbp.2020.110011.

Lindström, L. H., Widerlöv, E., Bisette, G., and Nemeroff, C. (1988). Reduced CSF
neurotensin concentration in drug-free schizophrenic patients. Schizophr. Res. 1, 55–
59. doi:10.1016/0920-9964(88)90040-0.
 228

Liu, F., Yang, P., Baez, M., and Ni, B. (2004). Neurotensin negatively modulates Akt
activity in neurotensin receptor-1-transfected AV12 cells. J. Cell. Biochem. 92, 603–
611. doi:10.1002/jcb.20098.

Liu, F.-Y., Qu, X.-X., Ding, X., Cai, J., Jiang, H., Wan, Y., et al. (2010). Decrease in the
descending inhibitory 5-HT system in rats with spinal nerve ligation. Brain Research
1330, 45–60. doi:10.1016/j.brainres.2010.03.010.

Liu, H., Tian, Y., Ji, B., Lu, H., Xin, Q., Jiang, Y., et al. (2016). Heterodimerization of the
kappa opioid receptor and neurotensin receptor 1 contributes to a novel β-arrestin-2-
biased pathway. Biochim. Biophys. Acta 1863, 2719–2738.
doi:10.1016/j.bbamcr.2016.07.009.

Liu, Y., Zhao, J., and Guo, W. (2018). Emotional Roles of Mono-Aminergic
Neurotransmitters in Major Depressive Disorder and Anxiety Disorders. Front Psychol
9, 2201. doi:10.3389/fpsyg.2018.02201.

Liu, Y., Zhao, J., Fan, X., and Guo, W. (2019). Dysfunction in Serotonergic and
Noradrenergic Systems and Somatic Symptoms in Psychiatric Disorders. Front
Psychiatry 10, 286. doi:10.3389/fpsyt.2019.00286.

Lugrin, D., Vecchini, F., Doulut, S., Rodriguez, M., Martinez, J., and Kitabgi, P. (1991).
Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of neurotensin: binding and biological
activities, and in vitro metabolic stability. European Journal of Pharmacology 205,
191–198.

Lundquist, J. T., and Dix, T. A. (1999). Preparation and receptor binding affinities of cyclic
C-terminal neurotensin (8-13) and (9-13) analogues. Bioorganic & Medicinal
Chemistry Letters 9, 2579–2582.

Lydiard, R. B. (2003). The role of GABA in anxiety disorders. J Clin Psychiatry 64 Suppl
3, 21–27.

Machelska, H., and Celik, M. Ö. (2018). Advances in Achieving Opioid Analgesia Without
Side Effects. Front Pharmacol 9, 1388. doi:10.3389/fphar.2018.01388.

Maes, M., Lin, A. H., Bonaccorso, S., Goossens, F., Van Gastel, A., Pioli, R., et al. (1999).
Higher serum prolyl endopeptidase activity in patients with post-traumatic stress
disorder. J Affect Disord 53, 27–34. doi:10.1016/s0165-0327(98)00086-x.

Mahar Doan, K. M., Humphreys, J. E., Webster, L. O., Wring, S. A., Shampine, L. J.,
Serabjit-Singh, C. J., et al. (2002). Passive permeability and P-glycoprotein-mediated
efflux differentiate central nervous system (CNS) and non-CNS marketed drugs. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 303, 1029–1037. doi:10.1124/jpet.102.039255.

Malik, I., Christensen, S., Stavenhagen, J. B., and Dietz, G. P. H. (2017). Development of a
Cell-Based Assay to Assess Binding of the proNGF Prodomain to Sortilin. Cell. Mol.
Neurobiol. 70, 451–14. doi:10.1007/s10571-017-0558-1.
 229

Mann, J. J., Oquendo, M. A., Watson, K. T., Boldrini, M., Malone, K. M., Ellis, S. P., et al.
(2014). Anxiety in major depression and cerebrospinal fluid free gamma-aminobutyric
acid. Depress Anxiety 31, 814–821. doi:10.1002/da.22278.

Marsault, É., and Peterson, M. L. (2011). Macrocycles are great cycles: applications,
opportunities, and challenges of synthetic macrocycles in drug discovery. J. Med.
Chem. 54, 1961–2004. doi:10.1021/jm1012374.

Martin, G. E., Bacino, C. B., and Papp, N. L. (1980). Hypothermia elicited by the
intracerebral microinjection of neurotensin. Peptides 1, 333–339. doi:10.1016/0196-
9781(80)90011-x.

Martin, S., Navarro, V., Vincent, J.-P., and Mazella, J. (2002a). Neurotensin receptor-1 and
-3 complex modulates the cellular signaling of neurotensin in the HT29 cell line.
Gastroenterology 123, 1135–1143. doi:10.1053/gast.2002.36000.

Martin, S., Vincent, J.-P., and Mazella, J. (2002b). Recycling ability of the mouse and the
human neurotensin type 2 receptors depends on a single tyrosine residue. J. Cell. Sci.
115, 165–173.

Martins, J. P., Alves, C. J., Neto, E., and Lamghari, M. (2016). Communication from the
periphery to the hypothalamus through the blood-brain barrier: An in vitro platform.
Int J Pharm 499, 119–130. doi:10.1016/j.ijpharm.2015.12.058.

Mazella, J. (2001). Sortilin/neurotensin receptor-3: a new tool to investigate neurotensin

signaling and cellular trafficking? Cell. Signal. 13, 1–6. doi:10.1016/s0898-
6568(00)00130-3.

Mazella, J., and Vincent, J.-P. (2006a). Functional roles of the NTS2 and NTS3 receptors.
Peptides 27, 2469–2475. doi:10.1016/j.peptides.2006.04.026.

Mazella, J., and Vincent, J.-P. (2006b). Internalization and recycling properties of
neurotensin receptors. Peptides 27, 2488–2492. doi:10.1016/j.peptides.2006.02.012.

Mazella, J., Borsotto, M., and Heurteaux, C. (2018). The Involvement of Sortilin/NTSR3 in
Depression as the Progenitor of Spadin and Its Role in the Membrane Expression of
TREK-1. Front Pharmacol 9, 1541. doi:10.3389/fphar.2018.01541.

Mazella, J., Botto, J. M., Guillemare, E., Coppola, T., Sarret, P., and Vincent, J. P. (1996).
Structure, functional expression, and cerebral localization of the levocabastine-
sensitive neurotensin/neuromedin N receptor from mouse brain. Journal of
Neuroscience 16, 5613–5620. doi:10.1523/JNEUROSCI.16-18-05613.1996.

Mazella, J., Pétrault, O., Lucas, G., Deval, E., Béraud-Dufour, S., Gandin, C., et al. (2010).
Spadin, a sortilin-derived peptide, targeting rodent TREK-1 channels: a new concept in
the antidepressant drug design. PLoS Biol 8, e1000355.
doi:10.1371/journal.pbio.1000355.
 230

Mazella, J., Zsürger, N., Navarro, V., Chabry, J., Kaghad, M., Caput, D., et al. (1998). The
100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol
Chem 273, 26273–26276.

McMahon, B. M., Stewart, J. A., Jackson, J., Fauq, A., McCormick, D. J., and Richelson,
E. (2001). Intraperitoneal injection of antisense peptide nucleic acids targeted to the
mu receptor decreases response to morphine and receptor protein levels in rat brain.
Brain Research 904, 345–349.

Mechanic, J. A., Sutton, J. E., Berson, A. E., Wu, X., Kwan, J., Schreiber, R., et al. (2009).
Involvement of the neurotensin receptor 1 in the behavioral effects of two neurotensin
agonists, NT-2 and NT69L: lack of hypothermic, antinociceptive and antipsychotic
actions in receptor knockout mice. Eur Neuropsychopharmacol 19, 466–475.
doi:10.1016/j.euroneuro.2009.01.004.

Méndez, M., Souazé, F., Nagano, M., Kelly, P. A., Rostène, W., and Forgez, P. (1997).
High affinity neurotensin receptor mRNA distribution in rat brain and peripheral
tissues. Analysis by quantitative RT-PCR. J. Mol. Neurosci. 9, 93–102.
doi:10.1007/BF02736853.

Millan, M. J. (2002). Descending control of pain. Prog. Neurobiol. 66, 355–474.

Mitsi, V., and Zachariou, V. (2016). Modulation of pain, nociception, and analgesia by the
brain reward center. Neuroscience 338, 81–92.
doi:10.1016/j.neuroscience.2016.05.017.

Moody, T. W., Lee, L., Ramos-Alvarez, I., and Jensen, R. T. (2019). Neurotensin receptors
regulate transactivation of the EGFR and HER2 in a reactive oxygen species-
dependent manner. European Journal of Pharmacology 865, 172735.
doi:10.1016/j.ejphar.2019.172735.

Moréno, S., Devader, C. M., Pietri, M., Borsotto, M., Heurteaux, C., and Mazella, J.
(2018). Altered Trek-1 Function in Sortilin Deficient Mice Results in Decreased
Depressive-Like Behavior. Front Pharmacol 9, 863. doi:10.3389/fphar.2018.00863.

Morinville, A., Martin, S., Lavallée, M., Vincent, J.-P., Beaudet, A., and Mazella, J.
(2004). Internalization and trafficking of neurotensin via NTS3 receptors in HT29
cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36, 2153–2168. doi:10.1016/j.biocel.2004.04.013.

Morris, N. J., Ross, S. A., Lane, W. S., Moestrup, S. K., Petersen, C. M., Keller, S. R., et
al. (1998). Sortilin is the major 110-kDa protein in GLUT4 vesicles from adipocytes. J
Biol Chem 273, 3582–3587. doi:10.1074/jbc.273.6.3582.

Morrison, S. F. (2016). Central control of body temperature. F1000Res 5, 880.

doi:10.12688/f1000research.7958.1.
 231

Moulin, D. E., Clark, A. J., Speechley, M., and Morley-Forster, P. K. (2002). Chronic pain
in Canada--prevalence, treatment, impact and the role of opioid analgesia. Pain Res
Manag 7, 179–184. doi:10.1155/2002/323085.

Möhler, H. (2012). The GABA system in anxiety and depression and its therapeutic
potential. Neuropharmacology 62, 42–53. doi:10.1016/j.neuropharm.2011.08.040.

Munzing, T. (2017). Physician Guide to Appropriate Opioid Prescribing for Noncancer

Pain. Perm J 21, 16–169. doi:10.7812/TPP/16-169.

Mücke, M., Phillips, T., Radbruch, L., Petzke, F., and Häuser, W. (2018). Cannabis-based
medicines for chronic neuropathic pain in adults. Cochrane Database Syst Rev 3,
CD012182. doi:10.1002/14651858.CD012182.pub2.

Müller, K. M., Tveteraas, I. H., Aasrum, M., Ødegård, J., Dawood, M., Dajani, O., et al.
(2011). Role of protein kinase C and epidermal growth factor receptor signalling in
growth stimulation by neurotensin in colon carcinoma cells. BMC Cancer 11, 421–12.
doi:10.1186/1471-2407-11-421.

Najimi, M., Gailly, P., Maloteaux, J. M., and Hermans, E. (2002). Distinct regions of C-
terminus of the high affinity neurotensin receptor mediate the functional coupling with
pertussis toxin sensitive and insensitive G-proteins. FEBS Lett. 512, 329–333.
doi:10.1016/s0014-5793(02)02285-8.

Nakagawa, S., Deli, M. A., Nakao, S., Honda, M., Hayashi, K., Nakaoke, R., et al. (2007).
Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of
rat brain endothelial cells. Cell. Mol. Neurobiol. 27, 687–694. doi:10.1007/s10571-
007-9195-4.

Nakajima, K., Obata, H., Iriuchijima, N., and Saito, S. (2012). An increase in spinal cord
noradrenaline is a major contributor to the antihyperalgesic effect of antidepressants
after peripheral nerve injury in the rat. Pain 153, 990–997.
doi:10.1016/j.pain.2012.01.029.

Naranjo, J. R., Arnedo, A., Molinero, M. T., and Del Rio, J. (1989). Involvement of spinal
monoaminergic pathways in antinociception produced by substance P and neurotensin
in rodents. Neuropharmacology 28, 291–298. doi:10.1016/0028-3908(89)90106-8.

Navarro, V., Martin, S., Sarret, P., Nielsen, M. S., Petersen, C. M., Vincent, J., et al.
(2001). Pharmacological properties of the mouse neurotensin receptor 3. Maintenance
of cell surface receptor during internalization of neurotensin. FEBS Lett. 495, 100–105.
doi:10.1016/s0014-5793(01)02367-5.

Nemeroff, C. B., Bissette, G., Prange, A. J., Loosen, P. T., Barlow, T. S., and Lipton, M. A.
(1977). Neurotensin: central nervous system effects of a hypothalamic peptide. Brain
Research 128, 485–496. doi:10.1016/0006-8993(77)90173-1.
 232

Nemeroff, C. B., Osbahr, A. J., Manberg, P. J., Ervin, G. N., and Prange, A. J. (1979).
Alterations in nociception and body temperature after intracisternal administration of
neurotensin, beta-endorphin, other endogenous peptides, and morphine. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 76, 5368–5371.

Neubert, M. J., Kincaid, W., and Heinricher, M. M. (2004). Nociceptive facilitating

neurons in the rostral ventromedial medulla. Pain 110, 158–165.
doi:10.1016/j.pain.2004.03.017.

Nicholas, M., Vlaeyen, J. W. S., Rief, W., Barke, A., Aziz, Q., Benoliel, R., et al. (2019).
The IASP classification of chronic pain for ICD-11: chronic primary pain. Pain 160,
28–37. doi:10.1097/j.pain.0000000000001390.

Nicot, A., Rostène, W., and Berod, A. (1994). Neurotensin receptor expression in the rat
forebrain and midbrain: a combined analysis by in situ hybridization and receptor
autoradiography. J. Comp. Neurol. 341, 407–419. doi:10.1002/cne.903410310.

Normandeau, C. P., Ventura-Silva, A. P., Hawken, E. R., Angelis, S., Sjaarda, C., Liu, X.,
et al. (2018). A Key Role for Neurotensin in Chronic-Stress-Induced Anxiety-Like
Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology 43, 285–293. doi:10.1038/npp.2017.134.

Norsted, E., Gömüç, B., and Meister, B. (2008). Protein components of the blood-brain
barrier (BBB) in the mediobasal hypothalamus. J. Chem. Neuroanat. 36, 107–121.
doi:10.1016/j.jchemneu.2008.06.002.

Nouel, D., Sarret, P., Vincent, J. P., Mazella, J., and Beaudet, A. (1999). Pharmacological,
molecular and functional characterization of glial neurotensin receptors. Neuroscience
94, 1189–1197. doi:10.1016/s0306-4522(99)00354-1.

Obata, H. (2017). Analgesic Mechanisms of Antidepressants for Neuropathic Pain. Int J

Mol Sci 18, 2483. doi:10.3390/ijms18112483.

Oishi, M., Inagaki, C., and Takaori, S. (1984). Influence of histamine and prostaglandin on
desensitization to neurotensin in rat blood pressure. Neuropeptides 4, 351–359.
doi:10.1016/0143-4179(84)90110-0.

Oladosu, F. A., Maixner, W., and Nackley, A. G. (2015). Alternative Splicing of G Protein-
Coupled Receptors: Relevance to Pain Management. Mayo Clin. Proc. 90, 1135–1151.
doi:10.1016/j.mayocp.2015.06.010.

Ollmann, T., Péczely, L., László, K., Kovács, A., Gálosi, R., Kertes, E., et al. (2015).
Anxiolytic effect of neurotensin microinjection into the ventral pallidum. Behav. Brain
Res. 294, 208–214. doi:10.1016/j.bbr.2015.08.010.

Onuoha, G. N., Alpar, E. K., Chukwulobelu, R., and Nicholls, D. P. (1999a). Distributions
of VIP, substance P, neurokinin A and neurotensin in rat heart: an
immunocytochemical study. Neuropeptides 33, 19–25. doi:10.1054/npep.1999.0026.
 233

Onuoha, G. N., Nicholls, D. P., Alpar, E. K., Ritchie, A., Shaw, C., and Buchanan, K.
(1999b). Regulatory peptides in the heart and major vessels of man and mammals.
Neuropeptides 33, 165–172. doi:10.1054/npep.1999.0017.

Osadchii, O. E. (2015). Emerging role of neurotensin in regulation of the cardiovascular

system. European Journal of Pharmacology 762, 184–192.
doi:10.1016/j.ejphar.2015.05.025.

Osbahr, A. J., Nemeroff, C. B., Luttinger, D., Mason, G. A., and Prange, A. J. (1981).
Neurotensin-induced antinociception in mice: antagonism by thyrotropin-releasing
hormone. J. Pharmacol. Exp. Ther. 217, 645–651.

Ossipov, M. H., Morimura, K., and Porreca, F. (2014). Descending pain modulation and
chronification of pain. Curr Opin Support Palliat Care 8, 143–151.
doi:10.1097/SPC.0000000000000055.

Ouyang, Q., Chen, G., Zhou, J., Li, L., Dong, Z., Yang, R., et al. (2016). Neurotensin
signaling stimulates glioblastoma cell proliferation by upregulating c-Myc and
inhibiting miR-29b-1 and miR-129-3p. Neuro-oncology 18, 216–226.
doi:10.1093/neuonc/nov114.

Ouyang, Q., Zhou, J., Yang, W., Cui, H., Xu, M., and Yi, L. (2017). Oncogenic role of
neurotensin and neurotensin receptors in various cancers. Clin. Exp. Pharmacol.
Physiol. 44, 841–846. doi:10.1111/1440-1681.12787.

Pain terms: a list with definitions and notes on usage. Recommended by the IASP
Subcommittee on Taxonomy. (1979). Pain terms: a list with definitions and notes on
usage. Recommended by the IASP Subcommittee on Taxonomy. Pain 6, 249.

Pajouhesh, H., and Lenz, G. R. (2005). Medicinal chemical properties of successful central
nervous system drugs. NeuroRx 2, 541–553. doi:10.1602/neurorx.2.4.541.

Pardridge, W. M. (1998). CNS drug design based on principles of blood-brain barrier

transport. J. Neurochem. 70, 1781–1792.

Parent, A. J., Beaudet, N., Beaudry, H., Bergeron, J., Bérubé, P., Drolet, G., et al. (2012).
Increased anxiety-like behaviors in rats experiencing chronic inflammatory pain.
Behav. Brain Res. 229, 160–167. doi:10.1016/j.bbr.2012.01.001.

Payne, R., Gradert, T. L., and Inturrisi, C. E. (1996). Cerebrospinal fluid distribution of
opioids after intraventricular & lumbar subarachnoid administration in sheep. Life
Sciences 59, 1307–1321. doi:10.1016/0024-3205(96)00456-0.

Pazos, A., López, M., and Flórez, J. (1984). Different mechanisms are involved in the
respiratory depression and analgesia induced by neurotensin in rats. European Journal
of Pharmacology 98, 119–123. doi:10.1016/0014-2999(84)90116-x.
 234

Pearson, G., Robinson, F., Beers Gibson, T., Xu, B. E., Karandikar, M., Berman, K., et al.
(2001). Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and
physiological functions. Endocr. Rev. 22, 153–183. doi:10.1210/edrv.22.2.0428.

Peddibhotla, S., Hedrick, M. P., Hershberger, P., Maloney, P. R., Li, Y., Milewski, M., et
al. (2013). Discovery of ML314, a Brain Penetrant Non-Peptidic β-Arrestin Biased
Agonist of the Neurotensin NTR1 Receptor. ACS Med Chem Lett 4, 846–851.
doi:10.1021/ml400176n.

Peirs, C., and Seal, R. P. (2016). Neural circuits for pain: Recent advances and current
views. Science 354, 578–584. doi:10.1126/science.aaf8933.

Pelaprat, D. (2006). Interactions between neurotensin receptors and G proteins. Peptides

27, 2476–2487. doi:10.1016/j.peptides.2006.04.027.

Peltonen, I., Myöhänen, T. T., and Männistö, P. T. (2012). Different interactions of prolyl
oligopeptidase and neurotensin in dopaminergic function of the rat nigrostriatal and
mesolimbic pathways. Neurochem. Res. 37, 2033–2041. doi:10.1007/s11064-012-
0825-y.

Perron, A., Sharif, N., Gendron, L., Lavallée, M., Stroh, T., Mazella, J., et al. (2006).
Sustained neurotensin exposure promotes cell surface recruitment of NTS2 receptors.
Biochemical and Biophysical Research Communications 343, 799–808.
doi:10.1016/j.bbrc.2006.03.047.

Perron, A., Sharif, N., Sarret, P., Stroh, T., and Beaudet, A. (2007). NTS2 modulates the
intracellular distribution and trafficking of NTS1 via heterodimerization. Biochemical
and Biophysical Research Communications 353, 582–590.
doi:10.1016/j.bbrc.2006.12.062.

Petersen, C. M., Nielsen, M. S., Jacobsen, C., Tauris, J., Jacobsen, L., Gliemann, J., et al.
(1999). Propeptide cleavage conditions sortilin/neurotensin receptor-3 for ligand
binding. EMBO J. 18, 595–604. doi:10.1093/emboj/18.3.595.

Petersen, C. M., Nielsen, M. S., Nykjaer, A., Jacobsen, L., Tommerup, N., Rasmussen, H.
H., et al. (1997). Molecular identification of a novel candidate sorting receptor purified
from human brain by receptor-associated protein affinity chromatography. J Biol Chem
272, 3599–3605. doi:10.1074/jbc.272.6.3599.

Petkova-Kirova, P., Rakovska, A., Corte, Della, L., Zaekova, G., Radomirov, R., and
Mayer, A. (2008). Neurotensin modulation of acetylcholine, GABA, and aspartate
release from rat prefrontal cortex studied in vivo with microdialysis. Brain Res. Bull.
77, 129–135. doi:10.1016/j.brainresbull.2008.04.003.

Petrie, K. A., Bubser, M., Casey, C. D., Davis, M. D., Roth, B. L., and Deutch, A. Y.
(2004). The neurotensin agonist PD149163 increases Fos expression in the prefrontal
cortex of the rat. Neuropsychopharmacology 29, 1878–1888.
doi:10.1038/sj.npp.1300494.
 235

Pettibone, D. J., Hess, J. F., Hey, P. J., Jacobson, M. A., Leviten, M., Lis, E. V., et al.
(2002). The effects of deleting the mouse neurotensin receptor NTR1 on central and
peripheral responses to neurotensin. J. Pharmacol. Exp. Ther. 300, 305–313.

Pérez de Vega, M. J., Ferrer-Montiel, A., and González-Muñiz, R. (2018). Recent progress
in non-opioid analgesic peptides. Arch. Biochem. Biophys. 660, 36–52.
doi:10.1016/j.abb.2018.10.011.

Piiper, A., and Zeuzem, S. (2004). Receptor tyrosine kinases are signaling intermediates of
G protein-coupled receptors. Current Pharmaceutical Design 10, 3539–3545.
doi:10.2174/1381612043382936.

Piliponsky, A. M., Chen, C.-C., Nishimura, T., Metz, M., Rios, E. J., Dobner, P. R., et al.
(2008). Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a
mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392–398. doi:10.1038/nm1738.

Pinkerton, A. B., Peddibhotla, S., Yamamoto, F., Slosky, L. M., Bai, Y., Maloney, P., et al.
(2019). Discovery of β-Arrestin Biased, Orally Bioavailable, and CNS Penetrant
Neurotensin Receptor 1 (NTR1) Allosteric Modulators. J. Med. Chem. 62, 8357–8363.
doi:10.1021/acs.jmedchem.9b00340.

Porro, C. A., Cavazzuti, M., Lui, F., Giuliani, D., Pellegrini, M., and Baraldi, P. (2003).
Independent time courses of supraspinal nociceptive activity and spinally mediated
behavior during tonic pain. Pain 104, 291–301. doi:10.1016/s0304-3959(03)00015-0.

Porzionato, A., Macchi, V., Amagliani, A., Castagliuolo, I., Parenti, A., and De Caro, R.
(2009). Neurotensin receptor 1 immunoreactivity in the peripheral ganglia and carotid
body. Eur J Histochem 53, e16–e16. doi:10.4081/ejh.2009.e16.

Pratsch, G., Unfried, J. F., Einsiedel, J., Plomer, M., Hübner, H., Gmeiner, P., et al. (2011).
Radical arylation of tyrosine and its application in the synthesis of a highly selective
neurotensin receptor 2 ligand. Org. Biomol. Chem. 9, 3746–3752.
doi:10.1039/c1ob05292f.

Previti, S., Vivancos, M., Rémond, E., Beaulieu, S., Longpre, J.-M., Ballet, S., et al.
(2020). Insightful Backbone Modifications Preventing Proteolytic Degradation of
Neurotensin Analogs Improve NTS1-Induced Protective Hypothermia. Front Chem 8,
406. doi:10.3389/fchem.2020.00406.

Prus, A. J., Hillhouse, T. M., and LaCrosse, A. L. (2014). Acute, but not repeated,
administration of the neurotensin NTS1 receptor agonist PD149163 decreases
conditioned footshock-induced ultrasonic vocalizations in rats. Progress in
Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry 49, 78–84.
doi:10.1016/j.pnpbp.2013.11.011.

Pujals, S., Fernandez-Carneado, J., Kogan, M. J., Martinez, J., Cavelier, F., and Giralt, E.
(2006). Replacement of a proline with silaproline causes a 20-fold increase in the
 236

cellular uptake of a Pro-rich peptide. J. Am. Chem. Soc. 128, 8479–8483.

doi:10.1021/ja060036c.

Quirion, R., Gaudreau, P., St-Pierre, S., Rioux, F., and Pert, C. B. (1982). Autoradiographic
distribution of [3H]neurotensin receptors in rat brain: visualization by tritium-sensitive
film. Peptides 3, 757–763. doi:10.1016/0196-9781(82)90011-0.

Quirion, R., Regoli, D., Rioux, F., and St-Pierre, S. (1980a). Structure-activity studies with
neurotensin: analysis of positions 9, 10 and 11. Br. J. Pharmacol. 69, 689–692.
doi:10.1111/(ISSN)1476-5381.

Quirion, R., Rioux, F., Regoli, D., and St-Pierre, S. (1980b). Compound 48/80 inhibits
neurotensin-induced hypotension in rats. Life Sciences 27, 1889–1895.
doi:10.1016/0024-3205(80)90435-x.

Radke, J. M., Owens, M. J., Ritchie, J. C., and Nemeroff, C. B. (1998). Atypical
antipsychotic drugs selectively increase neurotensin efflux in dopamine terminal
regions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11462–11464.
doi:10.1073/pnas.95.19.11462.

Remaury, A., Vita, N., Gendreau, S., Jung, M., Arnone, M., Poncelet, M., et al. (2002).
Targeted inactivation of the neurotensin type 1 receptor reveals its role in body
temperature control and feeding behavior but not in analgesia. Brain Research 953,
63–72. doi:10.1016/S0006-8993(02)03271-7.

Ressler, K. J., and Nemeroff, C. B. (2000). Role of serotonergic and noradrenergic systems
in the pathophysiology of depression and anxiety disorders. Depress Anxiety 12 Suppl
1, 2–19. doi:10.1002/1520-6394(2000)12:1+<2::AID-DA2>3.0.CO;2-4.

Rémond, E., Martin, C., Martinez, J., and Cavelier, F. (2016). Silicon-Containing Amino
Acids: Synthetic Aspects, Conformational Studies, and Applications to Bioactive
Peptides. Chem. Rev. 116, 11654–11684. doi:10.1021/acs.chemrev.6b00122.

Richard, F., Barroso, S., Martinez, J., Labbé-Jullié, C., and Kitabgi, P. (2001). Agonism,
inverse agonism, and neutral antagonism at the constitutively active human neurotensin
receptor 2. Molecular Pharmacology 60, 1392–1398. doi:10.1124/mol.60.6.1392.

Richner, M., Pallesen, L. T., Ulrichsen, M., Poulsen, E. T., Holm, T. H., Login, H., et al.
(2019). Sortilin gates neurotensin and BDNF signaling to control peripheral
neuropathic pain. Sci Adv 5, eaav9946. doi:10.1126/sciadv.aav9946.

Riezzo, G., Chimienti, G., Clemente, C., D'Attoma, B., Orlando, A., Mammone Rinaldi,
C., et al. (2017). Colonic Transit Time and Gut Peptides in Adult Patients with Slow
and Normal Colonic Transit Constipation. Biomed Res Int 2017, 3178263–10.
doi:10.1155/2017/3178263.
 237

Rioux, F., Kérouac, R., and St-Pierre, S. (1983). Peripheral vasodilation and plasma
extravasation are part of the mechanism of neurotensin-induced hypotension in the
anesthetized rat. Neuropeptides 3, 355–365. doi:10.1016/0143-4179(83)90024-0.

Rioux, F., Kérouac, R., Quirion, R., and St-Pierre, S. (1982). Mechanisms of the
cardiovascular effects of neurotensin. Ann. N. Y. Acad. Sci. 400, 56–74.
doi:10.1111/j.1749-6632.1982.tb31560.x.

Rioux, F., Quirion, R., St-Pierre, S., Regoli, D., Jolicoeur, F. B., Bélanger, F., et al. (1981).
The hypotensive effect of centrally administered neurotensin in rats. European Journal
of Pharmacology 69, 241–247. doi:10.1016/0014-2999(81)90469-6.

Rosell, S., and Rökaeus, A. (1979). The effect of ingestion of amino acids, glucose and fat
on circulating neurotensin-like immunoreactivity (NTLI) in man. Acta Physiol. Scand.
107, 263–267. doi:10.1111/j.1748-1716.1979.tb06472.x.

Rossi, G. C., Matulonis, J. E., Richelson, E., Barbut, D., and Pasternak, G. W. (2010).
Systemically and topically active antinociceptive neurotensin compounds. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 334, 1075–1079. doi:10.1124/jpet.109.165282.

Roussy, G., Beaudry, H., Lafrance, M., Belleville, K., Beaudet, N., Wada, K., et al. (2010).
Altered morphine-induced analgesia in neurotensin type 1 receptor null mice.
Neuroscience 170, 1286–1294. doi:10.1016/j.neuroscience.2010.08.016.

Roussy, G., Dansereau, M.-A., Baudisson, S., Ezzoubaa, F., Belleville, K., Beaudet, N., et
al. (2009). Evidence for a role of NTS2 receptors in the modulation of tonic pain
sensitivity. Mol Pain 5, 38–15. doi:10.1186/1744-8069-5-38.

Roussy, G., Dansereau, M.-A., Doré-Savard, L., Belleville, K., Beaudet, N., Richelson, E.,
et al. (2008). Spinal NTS1 receptors regulate nociceptive signaling in a rat formalin
tonic pain model. J. Neurochem. 105, 1100–1114. doi:10.1111/j.1471-
4159.2007.05205.x.

Rowe, W., Viau, V., Meaney, M. J., and Quirion, R. (1995). Stimulation of CRH-mediated
ACTH secretion by central administration of neurotensin: evidence for the
participation of the paraventricular nucleus. J. Neuroendocrinol. 7, 109–117.
doi:10.1111/j.1365-2826.1995.tb00673.x.

Saiz Ruiz, J., Carrasco Perera, J. L., and Hernanz, A. (1992). [Plasma neuropeptides in
affective and anxiety disorders]. Arch Neurobiol (Madr) 55, 1–5.

Salamone, J. D., Correa, M., Farrar, A., and Mingote, S. M. (2007). Effort-related functions
of nucleus accumbens dopamine and associated forebrain circuits.
Psychopharmacology (Berl.) 191, 461–482. doi:10.1007/s00213-006-0668-9.

Sang, K., Bao, C., Xin, Y., Hu, S., Gao, X., Wang, Y., et al. (2018). Plastic change of
prefrontal cortex mediates anxiety-like behaviors associated with chronic pain in
neuropathic rats. Mol Pain 14, 1744806918783931. doi:10.1177/1744806918783931.
 238

Sarret, P., and Beaudet, A. (2003). “Chapter VI Neurotensin receptors in the central
nervous system,” in Peptide Receptors Part II Handbook of Chemical Neuroanatomy.
(Elsevier), 323–400. doi:10.1016/S0924-8196(02)80008-2.

Sarret, P., and Kitabgi, P. (2009). “Neurotensin and Receptors,” in Encyclopedia of

Neuroscience (Elsevier), 1021–1034. doi:10.1016/B978-008045046-9.01469-8.

Sarret, P., Beaudet, A., Vincent, J. P., and Mazella, J. (1998). Regional and cellular
distribution of low affinity neurotensin receptor mRNA in adult and developing mouse
brain. J. Comp. Neurol. 394, 344–356.

Sarret, P., Esdaile, M. J., Perron, A., Martinez, J., Stroh, T., and Beaudet, A. (2005). Potent
spinal analgesia elicited through stimulation of NTS2 neurotensin receptors. J.
Neurosci. 25, 8188–8196. doi:10.1523/JNEUROSCI.0810-05.2005.

Sarret, P., Gendron, L., Kilian, P., Nguyen, H. M. K., Gallo-Payet, N., Payet, M.-D., et al.
(2002). Pharmacology and functional properties of NTS2 neurotensin receptors in
cerebellar granule cells. J Biol Chem 277, 36233–36243.
doi:10.1074/jbc.M202586200.

Sarret, P., Krzywkowski, P., Segal, L., Nielsen, M. S., Petersen, C. M., Mazella, J., et al.
(2003a). Distribution of NTS3 receptor/sortilin mRNA and protein in the rat central
nervous system. J. Comp. Neurol. 461, 483–505. doi:10.1002/cne.10708.

Sarret, P., Perron, A., Stroh, T., and Beaudet, A. (2003b). Immunohistochemical
distribution of NTS2 neurotensin receptors in the rat central nervous system. J. Comp.
Neurol. 461, 520–538. doi:10.1002/cne.10718.

Savdie, C., Ferguson, S. S. G., Vincent, J. P., Beaudet, A., and Stroh, T. (2006). Cell-type-
specific pathways of neurotensin endocytosis. Cell Tissue Res. 324, 69–85.
doi:10.1007/s00441-005-0102-3.

Sánchez-Blázquez, P., Gómez-Serranillos, P., and Garzón, J. (2001). Agonists determine

the pattern of G-protein activation in mu-opioid receptor-mediated supraspinal
analgesia. Brain Res. Bull. 54, 229–235. doi:10.1016/s0361-9230(00)00448-2.

Schaeffer, P., Laplace, M. C., Savi, P., Pflieger, A. M., Gully, D., and Herbert, J. M.
(1995). Human umbilical vein endothelial cells express high affinity neurotensin
receptors coupled to intracellular calcium release. J Biol Chem 270, 3409–3413.
doi:10.1074/jbc.270.7.3409.

Schiller, E. Y., Goyal, A., Cao, F., and Mechanic, O. J. (2020). Opioid Overdose. MMWR
Surveill. Summ. 64, 1–14.

Schindler, L., Bernhardt, G., and Keller, M. (2019). Modifications at Arg and Ile Give
Neurotensin(8-13) Derivatives with High Stability and Retained NTS1 Receptor
Affinity. ACS Med Chem Lett 10, 960–965. doi:10.1021/acsmedchemlett.9b00122.
 239

Schopflocher, D., Taenzer, P., and Jovey, R. (2011). The prevalence of chronic pain in
Canada. Pain Res Manag 16, 445–450. doi:10.1155/2011/876306.

Schotte, A., Leysen, J. E., and Laduron, P. M. (1986). Evidence for a displaceable non-
specific [3H]neurotensin binding site in rat brain. Naunyn Schmiedebergs Arch.
Pharmacol. 333, 400–405.

Sefler, A. M., He, J. X., Sawyer, T. K., Holub, K. E., Omecinsky, D. O., Reily, M. D., et al.
(1995). Design and structure-activity relationships of C-terminal cyclic neurotensin
fragment analogues. J. Med. Chem. 38, 249–257. doi:10.1021/jm00002a006.

Servotte, S., Camby, I., Debeir, O., Deroanne, C., Lambert, C. A., Lapière, C. M., et al.
(2006). The in vitro influences of neurotensin on the motility characteristics of human
U373 glioblastoma cells. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 32, 575–584.
doi:10.1111/j.1365-2990.2006.00760.x.

Sharma, R. P., Janicak, P. G., Bissette, G., and Nemeroff, C. B. (1997). CSF neurotensin
concentrations and antipsychotic treatment in schizophrenia and schizoaffective
disorder. Am J Psychiatry 154, 1019–1021. doi:10.1176/ajp.154.7.1019.

Sheng, J., Liu, S., Wang, Y., Cui, R., and Zhang, X. (2017). The Link between Depression
and Chronic Pain: Neural Mechanisms in the Brain. Neural Plasticity 2017, 9724371–
10. doi:10.1155/2017/9724371.

Shi, J., and Kandror, K. V. (2005). Sortilin is essential and sufficient for the formation of
Glut4 storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev. Cell 9, 99–108.
doi:10.1016/j.devcel.2005.04.004.

Shilling, P. D., and Feifel, D. (2008). The neurotensin-1 receptor agonist PD149163 blocks
fear-potentiated startle. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 748–752.
doi:10.1016/j.pbb.2008.05.025.

Shugalev, N. P., Stavrovskaia, A. V., Iamshchikova, N. G., Ol'shanskiĭ, A. S., and

Miroshnichenko, E. V. (2012). [Reproduction of passive avoidance reactions after
neurotensin microinjection into nucleus accumbens of rat brain against the background
of reserpine action]. Zh Vyssh Nerv Deiat Im I P Pavlova 62, 357–363.

Simeth, N. A., Bause, M., Dobmeier, M., Kling, R. C., Lachmann, D., Hübner, H., et al.
(2017). NTS2-selective neurotensin mimetics with tetrahydrofuran amino acids.
Bioorg. Med. Chem. 25, 350–359. doi:10.1016/j.bmc.2016.10.039.

Site internet OMS : Charge mondiale des troubles mentaux et nécessité d’une réponse
globale coordonnée du secteur de la santé et des secteurs sociaux au niveau des pays
OMS. Available at: https://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/EB130/B130_9-fr.pdf
[Accessed June 01, 2020].

Site internet Chapitre 2 sur la douleur. Available at: http://www.medecine.ups-

tlse.fr/DCEM2/module6/arielle/chapitre_02.pdf [Accessed June 01, 2020].
 240

Singh, V. M., Browne, T., and Montgomery, J. (2020). The Emerging Role of Toxic
Adulterants in Street Drugs in the US Illicit Opioid Crisis. Public Health Rep 135, 6–
10. doi:10.1177/0033354919887741.

Skrzydelski, D. (2003). Differential Involvement of Intracellular Domains of the Rat NTS1

Neurotensin Receptor in Coupling to G Proteins: A Molecular Basis for Agonist-
Directed Trafficking of Receptor Stimulus. Molecular Pharmacology 64, 421–429.
doi:10.1124/mol.64.2.421.

Slosky, L. M., Bai, Y., Tóth, K., Ray, C., Rochelle, L. K., Badea, A., et al. (2020). β-
Arrestin-Biased Allosteric Modulator of NTSR1 Selectively Attenuates Addictive
Behaviors. Cell 181, 1364–1379.e14. doi:10.1016/j.cell.2020.04.053.

Smith, D. J., Hawranko, A. A., Monroe, P. J., Gully, D., Urban, M. O., Craig, C. R., et al.
(1997). Dose-dependent pain-facilitatory and -inhibitory actions of neurotensin are
revealed by SR 48692, a nonpeptide neurotensin antagonist: influence on the
antinociceptive effect of morphine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 282, 899–908.

Smith, K. E., Boules, M., Williams, K., and Richelson, E. (2012). NTS1 and NTS2 mediate
analgesia following neurotensin analog treatment in a mouse model for visceral pain.
Behav. Brain Res. 232, 93–97. doi:10.1016/j.bbr.2012.03.044.

Smith, Q. R., and Allen, D. D. (2003). In situ brain perfusion technique. Methods Mol.
Med. 89, 209–218. doi:10.1385/1-59259-419-0:209.

Sol, J.-C., Chaynes, P., and Lazorthes, Y. Douleurs : bases anatomiques, physiologiques et
psychologiques

Souazé, F., and Forgez, P. (2006). Molecular and cellular regulation of neurotensin
receptor under acute and chronic agonist stimulation. Peptides 27, 2493–2501.
doi:10.1016/j.peptides.2006.04.029.

Sousbie, M., Besserer-Offroy, É., Brouillette, R. L., Longpre, J.-M., Leduc, R., Sarret, P.,
et al. (2018a). In Search of the Optimal Macrocyclization Site for Neurotensin. ACS
Med Chem Lett 9, 227–232. doi:10.1021/acsmedchemlett.7b00500.

Sousbie, M., Vivancos, M., Brouillette, R. L., Besserer-Offroy, É., Longpre, J.-M., Leduc,
R., et al. (2018b). Structural Optimization and Characterization of Potent Analgesic
Macrocyclic Analogues of Neurotensin (8–13). J. Med. Chem. 7, 179–184.
doi:10.1021/acs.jmedchem.8b00175.

St-Gelais, F., Jomphe, C., and Trudeau, L.-E. (2006). The role of neurotensin in central
nervous system pathophysiology: what is the evidence? J Psychiatry Neurosci 31,
229–245.

Steele, F. F., Whitehouse, S. C., Aday, J. S., and Prus, A. J. (2017). Neurotensin NTS1 and
NTS2 receptor agonists produce anxiolytic-like effects in the 22-kHz ultrasonic
 241

vocalization model in rats. Brain Research 1658, 31–35.

doi:10.1016/j.brainres.2017.01.012.

Steimer, T. (2011). Animal models of anxiety disorders in rats and mice: some conceptual
issues. Dialogues Clin Neurosci 13, 495–506.

Stiller, C. O., Gustafsson, H., Fried, K., and Brodin, E. (1997). Opioid-induced release of
neurotensin in the periaqueductal gray matter of freely moving rats. Brain Research
774, 149–158. doi:10.1016/s0006-8993(97)81698-8.

Stone, L. S., and Molliver, D. C. (2009). In Search of Analgesia: Emerging Poles of

GPCRs in Pain. Molecular Interventions 9, 234–251. doi:10.1124/mi.9.5.7.

Stone, N. L., England, T. J., and O'Sullivan, S. E. (2019). A Novel Transwell Blood Brain
Barrier Model Using Primary Human Cells. Front Cell Neurosci 13, 230.
doi:10.3389/fncel.2019.00230.

Sun, Y.-J., Zhang, Z.-Y., Fan, B., and Li, G.-Y. (2019). Neuroprotection by Therapeutic
Hypothermia. Front Neurosci 13, 586. doi:10.3389/fnins.2019.00586.

Sutherland, A. M., Nicholls, J., Bao, J., and Clarke, H. (2018). Overlaps in pharmacology
for the treatment of chronic pain and mental health disorders. Prog.
Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 87, 290–297.
doi:10.1016/j.pnpbp.2018.07.017.

Swift, S. L., Burns, J. E., and Maitland, N. J. (2010). Altered expression of neurotensin
receptors is associated with the differentiation state of prostate cancer. Cancer Res. 70,
347–356. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-1252.

Tanaka, K., Masu, M., and Nakanishi, S. (1990). Structure and functional expression of the
cloned rat neurotensin receptor. Neuron 4, 847–854. doi:10.1016/0896-
6273(90)90137-5.

Tang, N. K. Y., and Crane, C. (2006). Suicidality in chronic pain: a review of the
prevalence, risk factors and psychological links. Psychol Med 36, 575–586.
doi:10.1017/S0033291705006859.

Tao, Z.-Y., Wang, P.-X., Wei, S.-Q., Traub, R. J., Li, J.-F., and Cao, D.-Y. (2019). The
Role of Descending Pain Modulation in Chronic Primary Pain: Potential Application of
Drugs Targeting Serotonergic System. Neural Plasticity 2019, 1389296–16.
doi:10.1155/2019/1389296.

Taylor, D. P., Riblet, L. A., Stanton, H. C., Eison, A. S., Eison, M. S., and Temple, D. L.
(1982). Dopamine and antianxiety activity. Pharmacol. Biochem. Behav. 17 Suppl 1,
25–35. doi:10.1016/0091-3057(82)90507-x.

Tershner, S. A., and Helmstetter, F. J. (2000). Antinociception produced by mu opioid

receptor activation in the amygdala is partly dependent on activation of mu opioid and
 242

neurotensin receptors in the ventral periaqueductal gray. Brain Research 865, 17–26.
doi:10.1016/s0006-8993(00)02179-x.

Tétreault, P., Beaudet, N., Perron, A., Belleville, K., René, A., Cavelier, F., et al. (2013).
Spinal NTS2 receptor activation reverses signs of neuropathic pain. FASEB J. 27,
3741–3752. doi:10.1096/fj.12-225540.

Tétreault, P., Besserer-Offroy, É., Brouillette, R. L., René, A., Murza, A., Fanelli, R., et al.
(2020). Pain relief devoid of opioid side effects following central action of a silylated
neurotensin analog. European Journal of Pharmacology 882, 173174.
doi:10.1016/j.ejphar.2020.173174.

Thomas, J. B., Giddings, A. M., Olepu, S., Wiethe, R. W., Harris, D. L., Narayanan, S., et
al. (2015a). Identification of N-{[6-chloro-4-(2,6-dimethoxyphenyl)quinazolin-2-
yl]carbonyl}-l-leucine (NTRC-808), a novel nonpeptide chemotype selective for the
neurotensin receptor type 2. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 25, 292–296.
doi:10.1016/j.bmcl.2014.11.047.

Thomas, J. B., Giddings, A. M., Olepu, S., Wiethe, R. W., Warner, K. R., Sarret, P., et al.
(2015b). The amide linker in nonpeptide neurotensin receptor ligands plays a key role
in calcium signaling at the neurotensin receptor type 2. Bioorganic & Medicinal
Chemistry Letters 25, 2060–2064. doi:10.1016/j.bmcl.2015.03.083.

Thomas, J. B., Giddings, A. M., Wiethe, R. W., Olepu, S., Warner, K. R., Sarret, P., et al.
(2014a). Identification of 1-({[1-(4-fluorophenyl)-5-(2-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-3-
yl]carbonyl}amino)cyclohexane carboxylic acid as a selective nonpeptide neurotensin
receptor type 2 compound. J. Med. Chem. 57, 5318–5332. doi:10.1021/jm5003843.

Thomas, J. B., Giddings, A. M., Wiethe, R. W., Olepu, S., Warner, K. R., Sarret, P., et al.
(2014b). Identification of N-[(5-{[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}-3-
(trifluoroacetyl)-1H-indol-1-yl)acetyl]-l-leucine (NTRC-824), a neurotensin-like
nonpeptide compound selective for the neurotensin receptor type 2. J. Med. Chem. 57,
7472–7477. doi:10.1021/jm500857r.

Thomas, J. B., Vivancos, M., Giddings, A. M., Wiethe, R. W., Warner, K. R., Murza, A., et
al. (2016). Identification of 2-({[1-(4-Fluorophenyl)-5-(2-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-
3-yl]carbonyl}amino)tricyclo[3.3.1.13,7]decane-2-carboxylic Acid (NTRC-844) as a
Selective Antagonist for the Rat Neurotensin Receptor Type 2. ACS Chem Neurosci 7,
acschemneuro.6b00097–1231. doi:10.1021/acschemneuro.6b00097.

Todisco, A., Takeuchi, Y., Urumov, A., Yamada, J., Stepan, V. M., and Yamada, T.
(1997). Molecular mechanisms for the growth factor action of gastrin. Am. J. Physiol.
273, G891–8. doi:10.1152/ajpgi.1997.273.4.G891.

Tovote, P., Fadok, J. P., and Lüthi, A. (2015). Neuronal circuits for fear and anxiety. Nat.
Rev. Neurosci. 16, 317–331. doi:10.1038/nrn3945.
 243

Toy-Miou-Leong, M., Cortes, C. L., Beaudet, A., Rostène, W., and Forgez, P. (2004).
Receptor trafficking via the perinuclear recycling compartment accompanied by cell
division is necessary for permanent neurotensin cell sensitization and leads to chronic
mitogen-activated protein kinase activation. J Biol Chem 279, 12636–12646.
doi:10.1074/jbc.M303384200.

Treede, R.-D., Rief, W., Barke, A., Aziz, Q., Bennett, M. I., Benoliel, R., et al. (2015). A
classification of chronic pain for ICD-11. Pain 156, 1003–1007.
doi:10.1097/j.pain.0000000000000160.

Tyler, B. M., Douglas, C. L., Fauq, A., Pang, Y.-P., Stewart, J. A., Cusack, B., et al.
(1999). In vitro binding and CNS effects of novel neurotensin agonists that cross the
blood–brain barrier. Neuropharmacology 38, 1027–1034. doi:10.1016/S0028-
3908(99)00011-8.

Tyler-McMahon, B. M., Stewart, J. A., Farinas, F., McCormick, D. J., and Richelson, E.
(2000). Highly potent neurotensin analog that causes hypothermia and antinociception.
European Journal of Pharmacology 390, 107–111.

Uhl, G. R., Goodman, R. R., and Snyder, S. H. (1979). Neurotensin-containing cell bodies,
fibers and nerve terminals in the brain stem of the rat: immunohistochemical mapping.
Brain Research 167, 77–91. doi:10.1016/0006-8993(79)90264-6.

Urban, M. O., and Gebhart, G. F. (1997). Characterization of biphasic modulation of spinal

nociceptive transmission by neurotensin in the rat rostral ventromedial medulla. J.
Neurophysiol. 78, 1550–1562. doi:10.1152/jn.1997.78.3.1550.

Urban, M. O., and Smith, D. J. (1993). Role of neurotensin in the nucleus raphe magnus in
opioid-induced antinociception from the periaqueductal gray. J. Pharmacol. Exp. Ther.
265, 580–586.

Urban, M. O., and Smith, D. J. (1994). Localization of the antinociceptive and

antianalgesic effects of neurotensin within the rostral ventromedial medulla.
Neuroscience Letters 174, 21–25. doi:10.1016/0304-3940(94)90109-0.

Urban, M. O., Smith, D. J., and Gebhart, G. F. (1996). Involvement of spinal

cholecystokininB receptors in mediating neurotensin hyperalgesia from the medullary
nucleus raphe magnus in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 278, 90–96.

Vadnie, C. A., Ayers-Ringler, J., Oliveros, A., Abulseoud, O. A., Choi, S., Hitschfeld, M.
J., et al. (2016). Antipsychotic-like effects of a neurotensin receptor type 1 agonist.
Behav. Brain Res. 305, 8–17. doi:10.1016/j.bbr.2016.02.019.

Vadnie, C. A., Hinton, D. J., Choi, S., Choi, Y., Ruby, C. L., Oliveros, A., et al. (2014).
Activation of neurotensin receptor type 1 attenuates locomotor activity.
Neuropharmacology 85, 482–492. doi:10.1016/j.neuropharm.2014.05.046.
 244

Van Kemmel, F. M., Dubuc, I., Bourdel, E., Fehrentz, J. A., Martinez, J., and Costentin, J.
(1996). A C-terminal cyclic 8–13 neurotensin fragment analog appears less exposed to
neprilysin when it crosses the blood-brain barrier than the cerebrospinal fluid-brain
barrier in mice. Neuroscience Letters 217, 58–60. doi:10.1016/0304-3940(96)13074-3.

Van Kemmel, F. (1996). A C-terminal cyclic 8–13 neurotensin fragment analog appears
less exposed to neprilysin when it crosses the blood–brain barrier than the
cerebrospinal fluid–brain barrier in mice. Neuroscience Letters 217, 58–60.
doi:10.1016/S0304-3940(96)13074-3.

Vandenbulcke, F., Nouel, D., Vincent, J. P., Mazella, J., and Beaudet, A. (2000). Ligand-
induced internalization of neurotensin in transfected COS-7 cells: differential
intracellular trafficking of ligand and receptor. J. Cell. Sci. 113 ( Pt 17), 2963–2975.

Vincent, J. P. (1995). Neurotensin receptors: binding properties, transduction pathways,

and structure. Cell. Mol. Neurobiol. 15, 501–512. doi:10.1007/bf02071313.

Vincent, J.-P., Mazella, J., and Kitabgi, P. (1999). Neurotensin and neurotensin receptors.
Trends in Pharmacological Sciences 20, 302–309. doi:10.1016/S0165-6147(99)01357-
7.

Vita, N., Laurent, P., Lefort, S., Chalon, P., Dumont, X., Kaghad, M., et al. (1993). Cloning
and expression of a complementary DNA encoding a high affinity human neurotensin
receptor. FEBS Lett. 317, 139–142.

Vita, N., Oury-Donat, F., Chalon, P., Guillemot, M., Kaghad, M., Bachy, A., et al. (1998).
Neurotensin is an antagonist of the human neurotensin NT2 receptor expressed in
Chinese hamster ovary cells. European Journal of Pharmacology 360, 265–272.
doi:10.1016/S0014-2999(98)00678-5.

Wacker, D., Stevens, R. C., and Roth, B. L. (2017). How Ligands Illuminate GPCR
Molecular Pharmacology. Cell 170, 414–427. doi:10.1016/j.cell.2017.07.009.

Walker, N., Lepee-Lorgeoux, I., Fournier, J., Betancur, C., Rostène, W., Ferrara, P., et al.
(1998). Tissue distribution and cellular localization of the levocabastine-sensitive
neurotensin receptor mRNA in adult rat brain. Brain Res. Mol. Brain Res. 57, 193–
200.

Wang, S. (2019). Historical Review: Opiate Addiction and Opioid Receptors. Cell
Transplant 28, 233–238. doi:10.1177/0963689718811060.

Wei, S., Sun, J., Li, J., Wang, L., Hall, C. L., Dix, T. A., et al. (2013). Acute and delayed
protective effects of pharmacologically induced hypothermia in an intracerebral
hemorrhage stroke model of mice. Neuroscience 252, 489–500.
doi:10.1016/j.neuroscience.2013.07.052.
 245

Westergren, I., Nyström, B., Hamberger, A., and Johansson, B. B. (1995). Intracerebral
dialysis and the blood-brain barrier. J. Neurochem. 64, 229–234. doi:10.1046/j.1471-
4159.1995.64010229.x.

White, J. F., Noinaj, N., Shibata, Y., Love, J., Kloss, B., Xu, F., et al. (2012). Structure of
the agonist-bound neurotensin receptor. Nature 490, 508–513.
doi:10.1038/nature11558.

Wilhelm, I., Nyúl-Tóth, Á., Suciu, M., Hermenean, A., and Krizbai, I. A. (2016).
Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers 4, e1143544.
doi:10.1080/21688370.2016.1143544.

Williams, F. G., and Beitz, A. J. (1993). Chronic pain increases brainstem

proneurotensin/neuromedin-N mRNA expression: a hybridization-histochemical and
immunohistochemical study using three different rat models for chronic nociception.
Brain Research 611, 87–102. doi:10.1016/s0006-8993(93)90001-4.

Wootten, D., Christopoulos, A., and Sexton, P. M. (2013). Emerging paradigms in GPCR
allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov 12, 630–644.
doi:10.1038/nrd4052.

Wu, D., Kang, Y. S., Bickel, U., and Pardridge, W. M. (1997). Blood-brain barrier
permeability to morphine-6-glucuronide is markedly reduced compared with morphine.
Drug Metab. Dispos. 25, 768–771.

Xue, T.-F., Ding, X., Ji, J., Yan, H., Huang, J.-Y., Guo, X.-D., et al. (2017). PD149163
induces hypothermia to protect against brain injury in acute cerebral ischemic rats. J.
Pharmacol. Sci. 135, 105–113. doi:10.1016/j.jphs.2017.10.004.

Yam, M. F., Loh, Y. C., Tan, C. S., Khadijah Adam, S., Abdul Manan, N., and Basir, R.
(2018). General Pathways of Pain Sensation and the Major Neurotransmitters Involved
in Pain Regulation. Int J Mol Sci 19, 2164. doi:10.3390/ijms19082164.

Yamada, M., Lombet, A., Forgez, P., and Rostène, W. (1998). Distinct functional
characteristics of levocabastine sensitive rat neurotensin NT2 receptor expressed in
Chinese hamster ovary cells. Life Sciences 62, PL 375–80. doi:10.1016/s0024-
3205(98)00192-1.

Zarrindast, M.-R., and Khakpai, F. (2015). The Modulatory Role of Dopamine in Anxiety-
like Behavior. Arch Iran Med 18, 591–603.

Zhang, M., Liu, Y., Zhao, M., Tang, W., Wang, X., Dong, Z., et al. (2017). Depression and
anxiety behaviour in a rat model of chronic migraine. J Headache Pain 18, 27–10.
doi:10.1186/s10194-017-0736-z.

Zhang, X. H., Yin, G. X., and Ni, H. (1999). [Effect of intracerebroventricular neurotensin
injection on blood pressure in rat]. Sheng Li Xue Bao 51, 140–146.
 246

Zhang, X., Xu, Z. Q., Bao, L., Dagerlind, A., and Hökfelt, T. (1995). Complementary
distribution of receptors for neurotensin and NPY in small neurons in rat lumbar DRGs
and regulation of the receptors and peptides after peripheral axotomy. Journal of
Neuroscience 15, 2733–2747.

Zhao, D., and Pothoulakis, C. (2006). Effects of NT on gastrointestinal motility and

secretion, and role in intestinal inflammation. Peptides 27, 2434–2444.
doi:10.1016/j.peptides.2005.12.016.

Zhao, Y., Wei, Z. Z., Lee, J. H., Gu, X., Sun, J., Dix, T. A., et al. (2020). Pharmacological
hypothermia induced neurovascular protection after severe stroke of transient middle
cerebral artery occlusion in mice. Exp. Neurol. 325, 113133.
doi:10.1016/j.expneurol.2019.113133.

Zhong, W., Yuan, Y., Gu, X., Kim, S. I.-Y., Chin, R., Loye, M., et al. (2020).
Neuropsychological Deficits Chronically Developed after Focal Ischemic Stroke and
Beneficial Effects of Pharmacological Hypothermia in the Mouse. Aging Dis 11, 1–16.
doi:10.14336/AD.2019.0507.

Zhuo, M. (2016). Neural Mechanisms Underlying Anxiety-Chronic Pain Interactions.

Trends Neurosci. 39, 136–145. doi:10.1016/j.tins.2016.01.006.

Zogovic, B., and Pilowsky, P. M. (2012). Intrathecal neurotensin is hypotensive,

sympathoinhibitory and enhances the baroreflex in anaesthetized rat. Br. J. Pharmacol.
166, 378–389. doi:10.1111/j.1476-5381.2011.01760.x.
 247

ANNEXES

Annexe 1 : Article n°4

Structural Optimization and Characterization of Potent Analgesic Macrocyclic

Analogues of Neurotensin (8–13)

Marc Sousbie†, Mélanie Vivancos†, Rebecca L. Brouillette, Elie Besserer-Offroy, Jean-

Michel Longpré, Richard Leduc, Philippe Sarret,* and Eric Marsault*

Department of Pharmacology and Physiology, Faculty of Medicine and Health Sciences,

Institut de Pharmacologie de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, 3001 12e Avenue Nord,
Sherbrooke, Quebec J1H 5N4, Canada

†
These authors have contributed equally to this work
 248

Annexe 2 : Article n°5

Identification of 2‐({[1-(4-Fluorophenyl)-5-(2- methoxyphenyl)‐1H‐

pyrazol-3- yl]carbonyl}amino)tricyclo[3.3.1.13,7]decane-2-carboxylic Acid
(NTRC-844) as a Selective Antagonist for the Rat Neurotensin Receptor Type 2

James B. Thomas,*,† Mélanie Vivancos,‡ Angela M. Giddings,† Robert W. Wiethe,† Keith

R. Warner,† Alexandre Murza,‡ Élie Besserer-Offroy,‡ Jean-Michel Longpré,‡ Scott P.
Runyon,† Ann M. Decker,† Brian P. Gilmour,† and Philippe Sarret‡

†
Center for Drug Discovery, RTI International, P.O. Box 12194, Research Triangle Park,
North Carolina 27709, United States

‡
Department of Pharmacology and Physiology, Faculty of Medicine and Health Sciences,
Université de Sherbrooke, 3001, 12th Ave.
North, Sherbrooke, QC J1H 5N4, Canada