SEPARATION ET TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

I- GENERALITES
Éluant (ou, plus rarement, Solvant) est le terme qui désigne le la phase mobile
liquide.
Diluant : terme désignant un liquide inerte utilisé pour dissoudre l’extractant, et
pour diluer le système.
Extractant : terme qui désigne un agent d’extraction d’ions métalliques.
Raffinat : désigne la phase mobile après qu’un soluté en ait été extrait (le mélange
appauvri en soluté).
Extrait : désigne la phase enrichie en soluté que l’on obtient après l’extraction.
Extraction : désigne l’opération qui extrait un soluté non-désiré d’un liquide
organique.
Chromatographie : C’est un procédé physique de séparation basé sur la
différence d’affinité des substances constituantes à analyser à l’égard de deux
phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile.
Volume mort (Vm): C’est en quelque sorte tout volume externe aux particules
imprégnées de liquide (phase stationnaire) contenues dans la colonne. Le volume
interstitiel (intra-particules et inter-particules contenues dans la colonne) ajouté
au volume extra-colonne (auquel contribue l’injecteur, le détecteur, les tubes
connecteurs et les raccords) se combinent pour former le volume mort. Ce volume
mort peut être déterminé en injectant dans la colonne un composé inerte, par
exemple un liquide qui n’interagirait pas avec la phase stationnaire. On retrouve
aussi les abréviations V0 ou Vm (pour volume mort).
Détecteur : C’est un dispositif électronique qui met en évidence de façon
quantitative la présence des composés séparés pendant l’élution. Il existe
différents types de détecteurs.
Les plus courants sont : les détecteurs de rayonnement dans l’UV-visible, les
détecteurs à réfractomètre différentiel, les détecteurs électrochimiques, les
détecteurs de conductivité et les détecteurs de fluorescence.
Chromatographie de déplacement : c’est un procédé chromatographique où la
phase mobile a plus d’affinité que le soluté (l’échantillon) pour la phase
stationnaire.
L’échantillon est placé sur la colonne et est donc ensuite déplacé par la phase
mobile qui est plus fortement absorbée que les différentes composantes de
l’échantillon. Les molécules de l’échantillon sont donc poussées devant par la
phase mobile. On obtient pour résultat une meilleure élution du soluté. Ces
techniques de déplacement sont utilisées principalement en chromatographie
liquide à haute performance (CLHP, ou HPLC).
Standard externe : c’est un échantillon distinct contenant des quantités connues
des composés (ou solutés) d’intérêt. Les standards externes sont utilisés
principalement pour l’identification de pics en comparant les temps d’élution.
Hydrophile : désigne l’affinité pour l’eau. Ce terme convient autant aux phases
stationnaires compatibles avec l’eau qu’aux molécules solubles dans l’eau. La
plupart des colonnes utilisées pour la séparation de protéines sont de nature
hydrophile et ne devraient pas absorber ni dénaturer les protéines contenues dans
une solution aqueuse.
Injecteur : c’est un dispositif servant à injecter de façon précise une quantité
prédéterminée d’échantillon dans le flot de la phase mobile. L’injecteur peut être
un simple dispositif manuel ou encore un appareil sophistiqué d’échantillonnage
permettant l’injection automatisée de plusieurs échantillons différents (peut être
une opération sans surveillance humaine).
Coefficient de partage (K) : rapport entre la quantité de soluté dans la phase
stationnaire et la quantité de soluté dans la phase mobile. Il peut aussi être appelé
coefficient de distribution, KD.
Temps de rétention (tr) : désigne le temps entre l’injection et l’apparition du
sommet du pic. Le temps de rétention ajusté ou réduit, tr’, est le temps de rétention
soustrait du temps passé dans la phase stationnaire.
Volume de rétention (Vr) : correspond au volume de la phase mobile requis pour
éluer une substance de la colonne. On désigne également par Vm le volume mort
ou volume nul, KD le coefficient de distribution et Vs, le volume de la phase
stationnaire.
Phase stationnaire : c’est la phase immobile impliquée dans le processus de
chromatographie.
En chromatographie liquide, cette phase peut être un solide, ou encore une paroi
ou un support solide enduit de la substance qui joue le rôle de la phase stationnaire.
La phase stationnaire choisie est souvent une caractéristique du mode de
chromatographie liquide (LC) utilisé. Par exemple, le gel de silice est utilisé en
chromatographie d’adsorption, l’enduit d’octadécilsilane est typique de la
chromatographie en phase inverse,

II-Procédés de séparation
II-1-Technique de séparation
II-1-1-Extraction au solvant
L’extraction liquide-liquide, aussi connue sous le nom d’extraction au solvant (ou
plus rarement, extraction par partage), est une méthode de séparation des
composés basée sur leur solubilité relative dans deux liquides différents non-
miscibles, habituellement l’eau et un solvant organique. C’est l’extraction d’une
substance d’une phase liquide dans une autre phase liquide. Dans cette méthode,
une solution (généralement aqueuse) contenant un ou des soluté(s) est mise en
contact avec un solvant (généralement organique) dans le but de transférer un
soluté (ou plus) de la solution aqueuse vers le solvant. Le mélange est agité
vigoureusement afin d’augmenter l’entrée en contact des particules de la solution
avec celles du solvant. On utilise généralement une ampoule à décantation pour
cette opération. L’appareil est ensuite laissé au repos afin de permettre aux deux
phases de se séparer.

II-1-2-Coefficient de partage
Le coefficient de partage ou de distribution (K) est le rapport des concentrations
d’un composé (ou soluté) dans les deux phases d’un mélange de deux solvants
non miscibles à l’équilibre. Ce coefficient est une mesure de la différence de
solubilité du composé entre les deux solvants présents.
Normalement, un des solvants choisis est l’eau (ou une solution aqueuse), et le
second est un solvant organique (donc hydrophobe : qui ne se dissout pas dans
l’eau), comme l’octanol, par exemple.
Ainsi, les coefficients de partage et de distribution sont en quelque sorte une
mesure de l’hydrophilie (affinité avec l’eau) ou de l’hydrophobie (incompatibilité
avec l’eau) d’une substance chimique.

II-1-3-Facteurs influençant l’extraction au solvant

La polarité du soluté et la polarité du solvant : en général, les composés polaires
seront dissous dans les solvants polaires et les solutés non-polaires se retrouveront
dans le solvant organique, à moins que celui-ci ne contienne un nombre suffisant
de groupes fonctionnels hydrophiles tels que les groupements hydroxyles ou
sulfoniques.
Généralement, on ne pourra extraire les composés ioniques à l’aide d’un liquide
organique. Ceux-ci pourront être extraits en les faisant réagir avec des agents
chélatants (ou complexants) afin de former de grosses entités non-polaires.

II-2-Distillation
Les distillations opérées à l’échelle du laboratoire sont presque exclusivement des
distillations discontinues, c’est-à-dire que l’on distille complètement le mélange
en ses composés avant de recharger l’appareil avec le même mélange, et l’on
répète le processus. L’appareil utilisé, souvent appelé distillerie, est constituer d’
un bouilleur, dans lequel le liquide de départ est chauffé; un condensateur (ou
réfrigérant) dans lequel la vapeur est refroidie et revient à l’état liquide; puis un
réceptacle où le liquide purifié concentré (appelé distillat) est recueilli.
Il existe plusieurs techniques pour la distillation en laboratoire.

II-2-1-Distillation simple
Dans la distillation simple, toutes les vapeurs chaudes produites sont
immédiatement canalisées dans le condensateur qui refroidit et condense les
vapeurs. Par contre, le distillat ne sera pas pur ; sa composition sera identique à la
composition de la vapeur à une température et à une pression données.
La distillation simple est donc utilisée uniquement pour séparer des liquides dont
les points d’ébullition diffèrent significativement (d’au moins 25°C selon la
recommandation) ou encore pour séparer des liquides d’avec des solides non
volatiles ou des huiles. Dans ces cas, les pressions de vapeur des composants sont
généralement suffisamment différentes. Toujours dans ce cas et selon l’utilisation
visée, le distillat obtenu pourrait être suffisamment pur.

II-2-2-Distillation fractionnée
Dans plusieurs cas, les points d’ébullition des composantes du mélange seront
trop proches l’un de l’autre. On doit alors utiliser la distillation fractionnée afin
de séparer adéquatement les composés. Ceci se fera à l’aide de cycles répétés de
vaporisation condensation à l’intérieur d’une colonne Vigreux.
Figure : appareil de distillation fractionnée

Comment la distillation fractionnée fonctionne-t-elle ?

À mesure que la solution à purifier est chauffée, la vapeur s’élève dans la colonne
de fractionnement. Lors de l’élévation de la vapeur, celle-ci se refroidit, se
condensant sur les parois du réfrigérant et à la surface du matériau de garnissage.
Ici, le condensat continue à être chauffé par les vapeurs chaudes qui s’élèvent, et
il se vaporise une fois de plus. Chaque cycle de vaporisation-condensation (appelé
plateau théorique) donnera une plus pure solution du composé le plus volatile. En
réalité, chaque cycle à une température donnée et n’a pas lieu à la même position
exactement dans la colonne à fractionner.

II-2-3-Hydrodistillation ou entrainement à la vapeur

Figure : hydrodistillation

Comment l’hydrodistillation fonctionne-t-elle ?

L’hydrodistillation, aussi appelée entraînement à la vapeur, est une méthode
servant à distiller des composés sensibles à la chaleur. Ce procédé implique
l’utilisation de vapeur surchauffée (ou vapeur vive) qui sera injectée dans le
liquide brut (le liquide organique à distiller). Certains des composés ciblés vont
s’évaporer, en accord avec leur pression partielle. Le mélange de vapeur est
refroidi et condensé, et généralement on obtiendra une couche huileuse ou
organique ainsi qu’une couche aqueuse.

II-2-4-Distillation sous pression réduite

Figure : Appareil de distillation sous pression réduite

Certains composés ont de très hauts points d’ébullition. Pour amener ces
composés au point d’ébullition, il est souvent préférable de réduire la pression
plutôt que d’augmenter la température. Une fois la pression abaissée à la pression
de vapeur du composé (à une température donnée), l’ébullition ainsi que le reste
du processus de distillation peut débuter. Cette technique fait référence à la
distillation sous pression réduite et ce procédé est souvent opéré en laboratoire à
l’aide d’un évaporateur rotatif.
La distillation sous pression réduite est utile pour les mélanges qui ont un point
d’ébullition plus élevée que leur température de décomposition à la pression
atmosphérique et qui se décomposeraient si l’on tente de les amener à ébullition
sans avoir au préalable abaissé la pression.

III-Techniques de chromatographie
III-1-Théorie sur la chromatographie
La chromatographie est un procédé de séparation basé sur les différences
d’affinité des substances à analyser à l’égard de deux phases, une phase
stationnaire et une phase mobile.
Ces composantes contenues dans la phase stationnaire sont retenues plus
longtemps dans le système que celles qui sont distribuées sélectivement dans la
phase mobile.
En conséquence, les solutés sont élués du système à différents temps, selon l’ordre
croissant de leurs coefficients de distribution dépendamment de la phase
stationnaire ; c’est de cette façon que la séparation s’accomplit.
Les échantillons peuvent être de nature gazeuse, liquide ou solide et peuvent
varier de simple mélange de deux énantiomères à mélange complexe contenant
plusieurs substances chimiques de types très différents. L’analyse peut être faite
moyennant des coûts très élevés et une instrumentation complexe ou encore très
simplement sur une plaque de couche mince très peu coûteuse.
La chromatographie constitue le fondement d’un très grand nombre de techniques
analytiques. Cette partie du module présente les techniques chromatographiques
les plus courantes et leurs applications.

III-2-Le processus d’entraînement

L’entraînement (ou développement du chromatogramme) est le terme utilisé pour
décrire la façon dont les composantes d’un mélange sont séparées durant le
procédé chromatographique.
Il y a trois méthodes de base : le développement frontal, le développement par
déplacement, et l’élution. La plupart des développements chromatographiques
analytiques se font par élution.
III-2-1-Processus d’élution
L’élution peut être décrite telle qu’une série de processus d’absorption-extraction
continus à partir du moment où l’échantillon est injecté ou déposé dans le système
chromatographique jusqu’au temps où le soluté en est extrait.
À mesure que le soluté pénètre dans la phase mobile du système
chromatographique, sa concentration s’accroît et devient supérieure à la limite
requise (concentration d’équilibre) et le soluté passe dans la phase stationnaire.
Le soluté commence immédiatement à entrer dans la phase stationnaire. Puisque
la quantité de phase mobile atteint la phase stationnaire augmente régulièrement
alors la concentration en soluté de cette dernière augmente jusqu’à atteindre la
concentration d’équilibre et commencera à désorber, c’est-à-dire retourner dans
la phase mobile. De là, le soluté sera entraîné plus loin dans (ou sur) la phase
stationnaire.
La phase mobile va continuellement faire progresser le profil de concentration du
soluté dans la phase stationnaire, les concentrations dans les deux phases étant
constamment en relation.
En résumé, la bande de soluté progresse à travers le système chromatographique
suite à un transfert net de soluté de la phase mobile dans la phase stationnaire. Ce
transfert net de soluté est compensé par le passage de soluté de la phase
stationnaire jusqu’à la phase mobile.

III-2-2-Efficacité de la séparation chromatographique

La distribution des analytes (A) entre les phases peut être décrite de façon assez
simple. Un analyte (soluté) est en équilibre entre les deux phases :

APhase mobile Aphase stationnaire

La constante d’équilibre, K, est appelé le coefficient de partage. Il se définit

comme étant le rapport de la concentration molaire de l’analyte dans la phase
stationnaire sur la concentration molaire de l’analyte dans la phase mobile.
Le temps entre l’injection de l’échantillon dans le système et l’atteinte du
détecteur par le pic d’analyte est appelé temps de rétention (tr). Chaque soluté ou
analyte contenu dans l’échantillon injecté aura un temps de rétention différent. Le
temps nécessaire à la phase mobile pour passer à travers la colonne est appelé
temps mort (tm).

Figure : concepts de temps de rétention et de temps mort

III-3-Types de techniques chromatographiques

III-3-1-Chromatographie planaire
La chromatographie planaire regroupe des techniques de séparation dans
lesquelles la phase stationnaire ou se retrouve sur une surface plane. La surface
peut être du papier servant de phase stationnaire (chromatographie sur papier), ou
une couche de particules solides étendue sur un support tel qu’une plaque de verre
(chromatographie sur couche mince).

III-3-2-Chromatographie sur papier

La chromatographie sur papier est une technique impliquant le dépôt d’une petite
quantité de la solution-échantillon en un point situé sur la partie inférieure du
papier chromatographique. Le papier est placé dans une cuve scellée dont le fond
est recouvert d’une petite quantité de solvant. À mesure que le solvant monte sur
le papier par capillarité, il rencontre le dépôt contenant l’échantillon et celui-ci
commence à se déplacer sur le support de papier avec le solvant. Les divers
composés contenus dans l’échantillon vont migrer et parcourir des distances
différentes selon qu’elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. La
vitesse de migration est également influencée par la solubilité des composés dans
le solvant. Elle permet le calcul de la valeur d’une grandeur notée Rf (Référence
frontale) et, qui est égale au rapport de la distance parcourue par l’échantillon sur
la distance parcourue par le solvant. Cette valeur calculée sera comparée aux
valeurs de Rf de composés standards contenues dans un tableau afin d’identifier
la substance inconnue contenue dans l’échantillon déposé.

III-3-3-Chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est semblable à la chromatographie sur
papier. Toutefois, au lieu d’utiliser une phase stationnaire de papier, on utilise une
plaque de verre ou de plastique enduite d’une mince couche d’adsorbant inerte,
tel que le gel de silice, d’alumine ou de cellulose. Comparativement au papier,
cette méthode a l’avantage de permettre des élutions plus rapides, de meilleures
séparations, et le choix entre différents adsorbants. Les différents composés
contenus dans l’échantillon vont migrer et parcourir des différentes distances
selon qu’ils interagissent plus ou moins fortement avec l’adsorbant. Elle permet
aussi de calculer une valeur de Rf (référence frontale) qui sera comparée aux
valeurs de Rf de composés standards contenues dans un tableau afin d’identifier
la substance inconnue.

Figure : Processus de séparation par chromatographie sur couche mince

(CCM).

III-3-3-1-Équipement nécessaire pour CCM et chromatographie sur papier

 Préparation de la plaque
En CCM, une variété d’enduits (phase stationnaire) sont disponibles, même si le
gel de silice est de loin le plus courant. Les couches minces de cellulose sont
réalisées en étendant une mixture aqueuse de poudre de cellulose à l’aide d’un
applicateur commercial. Le mélange de cellulose est préparé en ajoutant environ
15g de poudre dans 90ml d’eau distillée et en agitant pendant environ 1 minute
dans un mélangeur.
La poudre de cellulose utilisée pour les CCM inorganiques provient d’un type
spécial de micro cristal.
En chromatographie de partage, des couches minces prêtes à l’utilisation et
préparées avec les adsorbants les plus courants sont disponibles sous forme de
plaques de verre ou de plastiques pré-enduites. Des feuilles de plastique pré-
enduites de cellulose (qui peuvent également contenir un composé fluorescent
aidant à la détection des solutés après l’élution) sont sur le marché et très utiles
pour les CCM inorganiques puisqu’elles peuvent être coupées au format désiré.

III-3-3-2-Différentes étapes de la CCM

 Dépôt de l’échantillon
La solution-échantillon à déposer doit contenir entre 0,1 et 10 mg de cations par
ml et peut être une substance neutre, ou acide mais diluée. Environ 1 μl de solution
est déposé avec une micro-seringue ou micro-pipette près de l’une des extrémités
de la plaque (environ 1,5 à 2 cm du bas de la plaque) et séché à l’air. Il n’est pas
nécessaire d’équilibrer la plaque et le développement (l’élution) peut commencer
immédiatement après que le dépôt soit sec.

Élution de la plaque
Le chromatogramme est habituellement obtenu par une technique ascendante dans
laquelle la plaque est immergée dans le solvant/éluant (on devrait utiliser des
solvants redistillés ou de grades à chromatographie) à une profondeur de 0,5 cm.
La cuve ou chambre est préférablement tapissée de papiers filtres trempés dans
l’éluant; cela a pour effet de provoquer la saturation de la chambre en vapeur de
solvant. L’élution se fait jusqu’à ce que le front d’éluant (front de migration) ait
parcourue la distance requise (généralement 10 à 15 cm). La plaque est ensuite
retirée de la chambre et le front de migration est immédiatement marqué d’un trait
à l’aide d’un crayon.

Identification des analytes en CCM et en chromatographie sur papier

Les substances colorées peuvent être identifiées directement sur la phase
stationnaire qui est blanche, alors que les composés incolores peuvent être
détectés en vaporisant sur la plaque un réactif (révélateur) approprié qui provoque
la coloration des zones occupées par ces solutés. Certains composés sont
fluorescents par irradiation de lumière ultraviolette (UV) et peuvent être repérés
de cette façon. Une substance fluorescente est parfois incorporée dans la phase
stationnaire et permet ainsi l’identification de certains composés (ceux qui ont une
absorption dans la région au-dessus de 230 nm) ; le soluté peut être repéré après
l’élution comme un point sombre lorsqu’exposé à la lumière UV (lorsque cette
méthode de détection est utilisée, l’expérimentateur doit porter des lunettes
spéciales afin de protéger ses yeux des rayons UV). Les points ou taches localisés
ainsi peuvent être marqués à l’aide d’une aiguille ou d’un crayon de plomb.

III-3-4-Chromatographie sur colonne

La chromatographie sur colonne est une technique de séparation dans laquelle la
phase (ou le lit) stationnaire est placée à l’intérieur d’un tube vertical.
La phase stationnaire consiste en de très petites particules ou encore des particules
enduites d’un liquide; dans chacun des cas les particules solides agissent comme
support et sont placées dans la colonne. Les particules de la phase stationnaire
peuvent remplir complètement l’intérieur du tube (colonne remplie) ou être
concentrées sur la paroi intérieure du tube laissant un passage ouvert pour la phase
mobile au centre du tube (colonne tubulaire ouverte).

III-3-5-Chromatographie liquide
La chromatographie liquide (LC) est un type de chromatographie sur colonne dans
lequel la phase mobile est un liquide. LC peut être opérée à l’aide d’une colonne
ou sur une surface plane. Actuellement, la LC qui utilise généralement de très
petites particules de remplissage et une pression relativement haute est appelée
chromatographie liquide à haute performance (CLHP, ou HPLC en anglais).

III-3-5-1- Chromatographie liquide à haute performance (CLHP, ou HPLC

en anglais)
La CLHP est une technique analytique utilisée pour la séparation et
l’identification de solutés organiques ou inorganiques dans divers mélanges,
notamment des échantillons biologiques, pharmaceutiques, alimentaires,
provenant de l’environnement, industriels, etc. Dans un tel processus de
séparation, le liquide pénètre la phase stationnaire poreuse et élue les solutés par
passage dans un détecteur à flux continu. La phase stationnaire est généralement
sous forme de particules uniformes de petit diamètre qui remplissent la colonne
cylindrique. Une colonne typique est fabriquée dans un matériel rigide (tel que du
plastique ou de l’acier inoxydable) et est généralement longue de 5 à 30 cm, avec
un diamètre interne de 1 à 9 mm environ.

Figure : Les différentes composantes d’un système de chromatographie

liquide à haute performance

- Le système de distribution de solvant (ou d’éluant) : pousse le flux de solvant

à travers l’instrument à débit constant.
- Le système d’injection de l’échantillon introduit l’échantillon à l’intérieur
du flot de liquide dans l’instrument.
- La colonne : un tube d’acier inoxydable rempli de billes de silicone qui séparent
les solutés inconnus que l’on cherche à identifier (par exemple séparer la caféine
du sucre).
- Le détecteur : un capteur optique (généralement) qui détecte les changements
dans les caractéristiques du flux de solvant.
- Le système de données : un moyen de contrôler les composantes du système
ainsi que d’entreposer, traiter et présenter les données recueillies.
Une pompe à haute pression est requise pour forcer le passage de la phase mobile
à travers la colonne à un débit de 0,1 à 2 ml par minute. L’échantillon à séparer
est introduit dans la phase mobile par le dispositif d’injection. Celui-ci est manuel
ou automatique et est placé avant la colonne.

Échelles de chromatographie :
La CLHP possède un grand nombre d’applications :
- CLHP analytique : identification exacte et haute sensibilité
- Semi-préparative : identification et obtention de petites quantités d’un analyte
pur (quantité de l’ordre des grammes)
- Préparative : obtention de grandes quantités d’analytes purifiés (haute capacité)
(de l’ordre des kilogrammes)

III-3-5-2-Modes de séparation en CLHP

La séparation d’analytes peut s’opérer par différentes procédures ; chacun de ces
mécanismes donne lieu à chacun des différents modes d’application de la CLHP.

III-3-5-2-1-Chromatographie en phase normale

La CLHP en phase normale sépare les analytes en se basant sur la polarité. Cette
technique utilise une phase stationnaire polaire et une phase mobile non-polaire,
et est employée lorsque l’analyte en jeu est plutôt de nature polaire. L’analyte
polaire s’associe à la phase stationnaire et est retenu par elle. La force d’adsorption
augmente avec la polarité, et l’interaction entre l’analyte polaire et la phase
stationnaire, aussi polaire, augmente le temps d’élution (relativement à la phase
mobile).

III-3-5-2-2-Chromatographie en phase inverse ou inversée

La CLHP en phase inverse (en anglais : RP-HPLC) consiste en une phase
stationnaire non-polaire et une phase mobile aqueuse, modérément polaire. Une
phase stationnaire courante est une silice traitée avec R‑Me2SiCl
(diméthylchlorosilane), où R représente un groupement alkyle tel que C18H37 – ou
C8H17 –. Le temps de rétention est par conséquent plus long pour les molécules
non polaires, celles-ci permettant aux molécules polaires de s’éluer plus
facilement. Le temps de rétention est augmenté par l’ajout de solvant polaire à la
phase mobile et raccourci par l’ajout d’un solvant plus hydrophobe.

III-3-5-2-3-Chromatographie d’exclusion stérique

La chromatographie d’exclusion stérique, aussi connue sous le nom de
chromatographie à perméation (pénétration d’un perméat à travers un solide) de
gel ou chromatographie de filtration sur gel, sépare les molécules sur la base de
leur taille (volume). C’est généralement une chromatographie de basse résolution.
Elle est ainsi souvent réservée pour l’étape finale de perfectionnement de la
purification. De plus, cette technique est utile pour la détermination de la structure
tertiaire et quaternaire de protéines purifiées; elle est aussi la technique de base
pour la détermination du poids moléculaire moyen de polymères naturels et
synthétiques.

III-3-5-2-4-Chromatographie d’échange d’ions ou échangeuse d’ions

En chromatographie d’échange d’ions, la rétention est basée sur l’affinité entre
les ions du soluté et les sites chargés qui se trouvent sur la phase stationnaire. Les
ions de même charge que ceux situés sur cette phase stationnaire sont exclus.
Certains types d’échangeurs d’ions comprennent :
1. les résines polystyrènes : permettent les liaisons covalentes qui augmentent
la stabilité de la chaîne. Plus de liaisons réduit les déviations et augmente le temps
d’atteinte de l’équilibre, et éventuellement améliore la sélectivité.
2. les échangeurs d’ions de cellulose et de dextrine (gels) : ils possèdent des pores
de taille plus grande et une faible densité de charges et sont ainsi appropriés pour
la séparation de protéines.
3. les échangeurs d’ions de verre à pore contrôlé ou de silice poreuse.

III-3-6-Chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (CPG), aussi parfois appelée
chromatographie gaz-liquide, est une technique de séparation dans laquelle la
phase mobile est un gaz.
Cette technique est toujours opérée en colonne, laquelle est normalement de type
« remplie » ou de type capillaire.
La CPG est basée sur un principe d’équilibre de partage de l’analyte entre une
phase stationnaire solide (souvent un matériel à base de silicone liquide) et une
phase mobile gazeuse (le plus souvent de l’hélium ou de l’azote). La phase
stationnaire est fixée à l’intérieur d’un tube de verre de petit diamètre (colonne
capillaire) ou à une matrice solide à l’intérieur de tube de métal plus large (colonne
remplie). Les hautes températures utilisées en CPG la rendent inappropriée pour
la séparation des protéines ou de biopolymères de hauts poids moléculaires.
Figure : Composantes du système à chromatographie en phase gazeuse

Un système typique de chromatographie en phase gazeuse est formé de six

composantes majeures qui sont explicités ci-dessous :
Gaz porteur ou gaz vecteur
Le gaz porteur doit être chimiquement inerte. Les gaz couramment utilisés sont
l’azote, l’hélium, l’argon et le dioxyde de carbone. Le choix du gaz porteur est
souvent imposé par le type de détecteur utilisé. Le système de gaz porteur contient
des dispositifs qui purifient le gaz en en retirant l’humidité et le dioxygène.

Injecteur
Pour une efficacité optimale de la colonne, la quantité d’échantillon ne devrait pas
être trop grande et devrait être introduite dans la colonne à la manière d’un jet de
vapeur (une injection lente de gros échantillons cause l’élargissement de pic et la
perte de résolution). La méthode d’injection la plus commune est la suivante ; on
utilise une micro-seringue pour injecter l’échantillon à travers le septum de
caoutchouc, dans la chambre d’injection se trouvant à la tête de la colonne. La
température de la chambre d’injection où est injecté l’échantillon est
généralement plus élevée d’environ 50° que la température d’ébullition du
composé le moins volatile contenu dans l’échantillon.
Pour les colonnes remplies, les formats d’échantillons varient du dixième de
microlitre jusqu’à 20 μl. Les colonnes capillaires, quant à elles, nécessitent
beaucoup moins de quantité d’échantillon, généralement autour de 0,1 à 3 μl.

Colonnes
Il existe deux types de colonnes ; remplie et capillaire (ou tubulaire). Les colonnes
remplies contiennent un support (habituellement fait à la base de terre de
diatomées) inerte et finement divisé, et sur lequel est imprégnée la phase
stationnaire liquide.
La plupart des colonnes remplies sont longues de 1,5 à 10 mètres et possèdent un
diamètre de 2 à 4 mm.
Les colonnes capillaires ont un diamètre interne de quelques dixièmes de
millimètre.
On peut retrouver les types suivants : colonne tubulaire ouverte à paroi tapissée
(wallcoated open tubular, WCOT) ou colonne ouverte capillaire où la paroi est
recouverte d’un matériau support (support-coated open tubular, SCOT). Les
colonnes à paroi tapissée consistent en un tube capillaire ayant ses parois
recouvertes d’une couche de phase stationnaire liquide. Dans les colonnes à
matériau support, la paroi interne du capillaire est recouverte d’un mince film du
matériau support en question, tel que la terre de diatomées, sur lequel la phase
stationnaire a été adsorbée. Les colonnes SCOT sont généralement moins
efficaces que les colonnes WCOT. Ces deux derniers types sont toutefois plus
efficaces que les colonnes remplies.
Four pour colonnes
Pour obtenir des résultats reproductibles, la température des colonnes doit être
contrôlée et maintenue dans des intervalles de l’ordre des dixièmes de degrés. La
température optimale de colonne est imposée par la température d’ébullition de
l’échantillon.
Afin de maintenir une température reproductible, la colonne chromatographique
est conservée dans un four pouvant être réglé à différentes températures.
Détecteurs
Plusieurs types de détecteurs sont utilisés en chromatographie. Des détecteurs
différents ont des sélectivités différentes. Un détecteur non-sélectif réagit à tous
les composés excepté le gaz porteur. Un détecteur sélectif réagit à une gamme de
composés ayant en commun une propriété physique ou chimique, alors qu’un
détecteur spécifique réagira à un seul composé chimique. Les détecteurs peuvent
également être regroupés en deux principaux ensembles : les détecteurs dépendant
de la concentration et ceux dépendant du débit massique. La forme du signal
donné par un détecteur dépendant de la concentration est liée à la concentration
du soluté dans le détecteur. Ceci n’affecte généralement pas l’échantillon. La
dilution de l’échantillon par les gaz auxiliaires/d’appoint réduira la réponse du
détecteur. Les détecteurs dépendants du débit massique vont habituellement
détruire l’échantillon lors de la détection. Le signal reçu est lié au taux auquel les
molécules de soluté entrent dans le détecteur. La réponse de ce type de détecteur
n’est pas affectée par les gaz auxiliaires.

Détecteur Type Gaz Sélectivité Sensibilité

auxiliaire
Ionisation à Débit Dihydrogène La plupart des
flamme (FID) massique et air composés 100 pg
organiques
Capture Gaz Halogénures,
d’électrons Concentra auxiliaires nitrates, nitriles,
(ECD) tion péroxydes, 10 fg
anhydrides et
organométalliques
Thermo- Débit Dihydrogène Azote et
ionisation (TID) massique air phosphore
ou détecteur 10 pg
azote-phosphore
Photométrique Débit Dihydrogène Soufre,
(FPD) massique , air ou phosphore,
dioxygène arsénic, 100pg
germanium,
sélénium ,chrome
Photo-ionisation Concentra Gaz Composés
(PID) tion auxiliaires aliphatiques,
aromatiques,
cétones, esters,
aldehydes, 2 pg
amines,hétérocycl
iques, sulfures
organiques et
quelques
organométalliques