Cours du Pr Noureddine BOURHIM SV6 Parcours BG 20/21

TRAVAUX DIRIGÉS DE BIOCHIMIE

EXERCICE I
Une enzyme catalyse la réaction : S -----> P.
Les vitesses initiales ont été déterminées pour chacune des concentrations initiales en substrat
suivantes :
SM
1.10-2 1.10-3 1.10-4 7,5.10-5 6,25.10-6

Vi (nmol / l / min)
75 74,9 60 56,25 15

Q1: Vérifier que la cinétique est Michaeliènne.

-5 -5
Q2: Si [S] = 2,5.10 M, quelle est la vitesse initiale? Même question pour [S] = 5.10 M et [S]= 0,02M.
-2
Q3: Si [S] = 1.10 M, quelle est la vitesse initiale si la quantité d’enzyme est doublée?
Q4: Si [S] = 0,04 M, quelle est la concentration en [P] après 3 min?
Q5 : Si [S] = 6.10-6 M, quelle est la concentration en [P] après 3 min ?

EXERCICE II
Une enzyme purifiée de masse molaire 800000 g/mol, catalyse la transformation de S
-5
(substrat) en P (produit) avec un KM = 10 M. La solution d'enzyme pure, à la
-2
concentration de 150 mg/ml, est capable, si la concentration en S est de 1 x 10 M, de
-5
catalyser la réaction à une vitesse de 3 x 10 M/min.
Q1: Donnez la définition de l'activité molaire et son unité.
Est-il possible de calculer l'activité molaire de l’enzyme décrite ici ? Si oui, justifiez votre
réponse et calculez-la.

EXERCICE III
Un étudiant en biochimie arrive en retard à un examen pratique dont voici l'énoncé :
Soit E une enzyme qui transforme S (substrat incolore) en P (produit jaune). Vous réaliserez
à partir d'une solution de S à 1M les dilutions suivantes auxquelles vous ajouterez E et
incuberez 10 minutes à 37°C. Le volume final est de 1 ml. Vous prendrez ensuite la D0 410 nm.
-3 -3 -3 -3 -2 -2 -2 -1 -1
[S] : 10 M ; 2 x 10 M ; 3 x 10 M ; 5 x 10 M ; 10 M ; 2 x 10 M ; 3 x 10 M ; 10 M ; 2 x 10 M et
-1
3 x 10 M. Vous déterminerez graphiquement KM (en M) et Vmax (en mmoles/min) de l’enzyme
pour S.  = 5000 M-1cm-1.
N'ayant plus assez de temps notre étudiant décide de résoudre son problème différemment et
ne fait les mesures que pour 2 valeurs de [S] :
-3 -2
D0 = 0,25 pour [S]= 5 x 10 M D0 = 0,35 pour [S] = 10 M

Q1: Comment passe-t-on de la DO à 410 nm à la vitesse en mmoles/min ? Calculer la vitesse

pour les deux valeurs de DO données.
Q2: Quel est la démarche de l'étudiant, déterminez KM et Vmax et recherchez les risques.

EXERCICE IV
1/ Dans une réaction de cinétique de type Michaelis-Menten, on obtient k1=7x107 M-1.s-1,
k-1=1x103s-1 et k2=2x104 s-1. Quelles sont les valeurs de KD et KM.
2/ Les résultats suivants sont obtenus au cours d’une réaction enzymatique, (A) en l’absence, (B) et (C) en
présence de deux substances différentes à la concentration 5 mM. [E]0 est le même dans chaque expérience.
 S (mM) A v (μmol /ml/ s B v (μmol/ml/s C v (μmol /ml /s
1 12 4,3 5,5
2 20 8 9
4 29 14 13
8 35 21 16
12 40 26 18
a- Déterminer KM et Vmax de l’enzyme

b- Quels est l’effet de B et C sur l’enzyme

EXERCICE V
La lactate déshydrogénase catalyse la réduction réversible du pyruvate en lactate :

PYRUVATE + NADH + H+ LACTATE + NAD+

Les vitesses initiales de la réaction sont déterminées pour différentes concentrations [S] 0
pyruvate. La concentration du NADH est constante et égale à 5,4 10-4 M et KMNADH = 5,4 10-5 M
On suit la disparition du NADH à λ = 340 nm en fonction du temps.
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1 2 3 4 5 9
[S]0 (mM)
vi U.A/min 0,075 0,125 0,157 0,180 0,200 0,212 0,232 0,250 0,270 0,270 0,250 0,240 0,190

1/ Tracez la courbe de saturation et commentez l'allure.

2/ Déterminez tous les paramètres cinétiques de cette réaction.
3/ Expliquez ce mécanisme.
Données : εNADH = 6220 M-1.cm-1 ; U.A. = unité d'absorbance

EXERCICE VI
L’hexokinase et la glucokinase sont deux isoenzymes du métabolisme des sucres. On
se propose d’étudier les caractéristiques cinétiques de ces deux enzymes vis à vis de
leur substrat commun ; le glucose. Les vitesses des réactions ont été mesurées pour
des concentrations différentes du glucose à 25°C et à pH=7. Les résultats obtenus
sont présentés au niveau du tableau I. La concentration en enzyme utilisée pour les
deux séries d’expériences est la même.

GLUCOKINASE HEXOKINASE
[Glucose] Vi [Glucose] Vi
en 10-3M mM/min en 10-3M mM/min
5,0 1,61 5,0 0,490
6,7 2,00 6,7 0,575
10,0 2,67 10,0 0,607
20,0 2,93 20,0 0,806
50,0 4,17 50,0 0,893
1/ Déterminer les paramètres cinétiques pour ces deux enzymes. Comparer les deux
paramètres cinétiques. Quelles conclusions déduisez-vous ?
2/Sachant que la concentration intracellulaire hépatique de glucose est de 5 mM
(glycémie normale) :
a- Calculer en pourcentage de Vmax, les vitesses initiales des réactions catalysées
par les deux enzymes.
b- Quelle serait l’influence d’une augmentation importante de la glycémie?
c- Indiquer laquelle de ces deux enzymes est susceptible d’intervenir efficacement
en cas d’élévation de la concentration en glucose au-delà de 5 mM. Justifier votre
réponse.
3/La cinétique de l’hexokinase en absence ou en présence du glucose-6-phosphate
(G-6-P) donne les résultats présentés
sur la figure 1 en représentation de En présence de 5 mM G6P
Lineweaver-Burk. Interpréter ce
résultat 1/V
Figure 1 : Effet du
Glucose-6-phosphate
sur
L’activité de
l’hexokinase.
En absence du G6P

1/[Glucose]
EXERCICE VII
On étudie la cinétique d’action de la malonyl-transacylase qui catalyse.

Malonyl-COA + ACP malonyl-ACP + CoA – SH

On suit la réaction par comptage radioactif en utilisant la malonyl-COA marqué et on

suit l’incorporation de la radioactivité sur l’ACP, le tableau suivant donne la vitesse en
nanomoles de malonyl transférées par minutes quand l’expérience à lieu dans 0,2 ml pour
une concentration d’enzyme de 5,98 x10-10 mol/L.

[ACP] (µM) 12,5 25 75

[Malonyl-CoA]
(µM)
12,5 0,2 0,28 0,38
25 0,25 0,40 0,60
40 0,29 0,465 0,83
50 0,29 0,50 0,93
60 0,30 0,52 1,01

- Déterminer le mécanisme d’interaction de l’enzyme pour le substrat.

- Calculer les paramètres cinétiques pour les 2 substrats et calculer kcat.

- Proposer le mécanisme réactionnel selon la représentation de Cleland
 EXERCICE VIII
On étudie le comportement de glutamate déshydrogénase de levure

Glutamate + NADP+ -cétoglutarate + NH3 + NADPH + H+

On étudie la réaction de gauche vers la droite en la démarrant avec le mélange E + NADP+.

Les vitesses initiales sont mesurées par l’apparition de NADPH par spectrophotométrie à 340
nm. On opère dans chaque cas avec 0,2 ml de substrat contenant 5,2 µg d’enzyme.

Le tableau suivant donne l a vitesse en µmole de NADPH/µg d’enzyme/min. Déterminer les

paramètres cinétiques et proposer le mécanisme réactionnel selon Cleland.

GLU mM 5 10 20 50 100
NADP+ mM
0,05 9,70 x10-3 1,68 x10-2 2,5 x10-2 4,08 x10-2 6,25 x10-
2

0, 062 1,16 x10-2 2,00x10-2 2,98 x10-2 4,76 x10-2 7,41x10-2

0,083 1,43 x10-2 2,47x10-2 3,64 x10-2 5,71 x10-2 8,69x10-2
0,125 1,89 x10-2 3,17x10-2 4,76 x10-2 7,14 x10-2 1,05x10-1
0,25 2,86 x10-2 4,55x10-2 6,45 x10-2 1,00 x10-1 1,33x10-1
1 4,17 x10-2 6,67x10-2 9,09 x10-2 1,10 x10-1 1,54x10-1

EXERCICE IX
Une enzyme catalyse une réaction entre deux substrats A et B :

A+B C+D
Afin de déterminer le schéma cinétique de la réaction, on a mesuré les vitesses initiales de la
réaction en présence de concentrations variables des substrats :
Les résultats suivants ont été obtenus :

A 0,1 0,2 0,5 1 2

B
0,1 0,05 0,10 0,21 0,33 0,46
0,2 0,09 0,16 0,30 0,43 0,55
0,5 0,14 0,24 0,40 0,52 0,62
1 0,17 0,28 0,45 0,57 0,65
2 0,20 0,31 0,48 0,59 0,66

A et B sont exprimés en absorbance à 357 nm et les vitesses sont exprimées en variation

d’absorbance (DO) à 357 nm par minutes. Les coefficients d’extinction molaire à 357 nm
pour les différents corps sont les suivants : A : 1350 ; B : 225 ; C : 720 ; D : 1830.

a- Déterminer le mécanisme de la réaction

b- Déterminer les constances cinétiques de cette réaction

c- Representer le mécanisme réaction en utilisant la représentation de Cleland.