Électrospray

par Bertrand MONÉGIER

Rhône Poulenc Rorer
Centre de recherche de Vitry-Alfortville
Responsable du laboratoire de spectrométrie de masse

1. Principe........................................................................................................ PE 3 350 - 2
1.1 Description de l’interface ............................................................................. — 2
1.2 Mécanismes d’ionisation ............................................................................. — 3
1.3 Particularités de l’électrospray .................................................................... — 3
2. Interprétation des spectres.................................................................... — 5
2.1 Espèces multichargées ................................................................................ — 5
2.1.1 Calcul de la masse moléculaire.......................................................... — 5
2.1.2 Précision de la mesure........................................................................ — 5
2.1.3 Spectres SM/SM d’ions multichargés ............................................... — 6
2.2 Espèces monochargées ............................................................................... — 6
3. Applications ............................................................................................... — 6
3.1 Étude des biomolécules............................................................................... — 6
3.2 Couplage avec les différentes techniques chromatographiques ............. — 7
3.2.1 Chromatographie liquide.................................................................... — 7
3.2.2 Électrophorèse capillaire .................................................................... — 9
3.3 Application à la chimie combinatoire ......................................................... — 9
4. Conclusion .................................................................................................. — 10
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. PE 3 350

L a détermination des masses moléculaires supérieures à 2 000 ou 3 000 dal-

tons (Da) exige l’utilisation d’aimants à haut champ ou de spectromètres
équipés d’analyseurs à temps de vol. Le premier type d’appareillage, fort coû-
teux, fait appel à l’ionisation par LSIMS (Liquid Secondary lon Mass Spectro-
metry) et reste limité à des masses inférieures à 10 000 Da ; dans le deuxième
cas, l’ionisation par les produits de fission du 252Cf (PDMS - Plasma Desorption
Mass Spectrometry) ne permet guère d’aller au-delà de 25 à 30 kDa, avec une
précision souvent insuffisante pour vérifier sans ambiguïté la conformité des
produits analysés.
Deux techniques récentes, le MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption
Ionisation - Time Of Flight) et l’électrospray, ont constitué une véritable révolu-
tion pour l’analyse des composés de haute masse moléculaire, tout particulière-
ment les peptides et les biomolécules (protéines, fragments d’ADN et d’ARN).
L’originalité de l’électrospray réside dans sa capacité à obtenir des molécules
portant plusieurs dizaines de charges. La spectrométrie de masse mesure tou-
jours le rapport de la masse d’un ion, divisé par le nombre de charges qu’il porte
(m/z). Par conséquent, une protéine de 50 000 Da portant 50 charges dues à des
protons est détectée à une masse apparente de 1 001 [(50 000 + 50)/50]. Autre-
ment dit, la zone d’observation des différentes espèces ioniques est ramenée
dans une gamme de rapports m/z tout à fait compatible avec l’utilisation d’ana-
lyseurs quadrupolaires.

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Une autre caractéristique de l’électrospray vient du fait que le processus
d’ionisation se produit en phase liquide et à la pression atmosphérique. Il est
d’autre part tout à fait adapté à l’étude des composés polaires ou thermosensi-
bles (l’ionisation se produit en effet à température ambiante). Son couplage avec
les techniques chromatographiques en phase liquide était donc logique, sup-
plantant même, tant sa réalisation est aisée, les techniques du thermospray et de
l’interface à courroie mobile, délicates à mettre en œuvre et dont les applications
restent, en comparaison, par trop ponctuelles.
Le nombre de publications dans ce domaine est devenu considérable, que ce
soit pour l’analyse de métabolites, la caractérisation d’impuretés diverses,
l’identification précoce de produits d’origine naturelle, ou encore pour l’étude
de milieux biologiques complexes.
1. Principe
1.1 Description de l’interface
Ce mode d’ionisation s’effectue à la pression atmosphérique et à
température ambiante. L’échantillon en solution est introduit (au
moyen d’un pousse-seringue ou d’une pompe chromatographique)
dans l’appareil par l’intermédiaire d’un capillaire dont l’extrémité
traverse une aiguille métallique portée à un potentiel de plusieurs
kilovolts (typiquement 3 à 5 kV). Il en résulte la formation de goutte-
lettes mono- ou polychargées, qui conduisent, par désolvatation, à
des ions en phase gazeuse (figure 1).
Capillaire contenant Contre-électrode
l'échantillon en solution
Gouttelettes N2
chargées
Orifice
Ions Analyseur
N2 3 à 5 kV
N2
-3 -4
Pression atmosphérique 10 à 10 Pa
Figure 1 – Interface électrospray
On utilise parfois le terme IonSpray quand la nébulisation est
assistée pneumatiquement par un courant d’azote coaxial au débit,
qui permet essentiellement de pouvoir utiliser une gamme de débits
nettement plus importante (5 à 200 ou 300 mL/min), voire parfois
même jusqu’à 1 mL/min, contre quelques mL/min seulement sans
gaz nébulisateur). Dans la suite de cet article, nous nommerons
indifféremment ces deux techniques électrospray, le principe d’ioni-
sation étant rigoureusement identique dans les deux cas.
À quelques millimètres de l’aiguille est placée une contre-élec-
trode qui permet de diriger le faisceau ionique vers l’interface, cons-
tituée généralement d’un orifice conique dont le diamètre est de
l’ordre d’une centaine de micromètres. Un flux d’azote, dirigé le plus
souvent à contre-courant du trajet des ions, joue un rôle prépondé-
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rant dans le processus de désolvatation puisqu’il permet de sécher
les solvants résiduels de façon que seuls les ions en phase gazeuse
puissent traverser l’orifice pour pénétrer dans l’enceinte de l’appa-
reil.
Il existe un certain nombre de variantes, selon les constructeurs.
Certains utilisent un capillaire de transfert chauffé entre l’orifice et
l’analyseur, de façon à optimiser la désolvatation. D’autres propo-
sent, pour des débits supérieurs à quelques dizaines de microlitres
par minute, d’ajouter un courant d’azote chaud, traversant le nébuli-
sat extérieur et dirigé vers l’orifice, afin d’améliorer à la fois la sensi-
bilité et le rapport signal sur bruit.
Le vide dans l’analyseur doit être maintenu en permanence entre
10–3 et 10–4 Pa. Afin de maintenir cette pression, les appareils munis
de pompes turbomoléculaires ou de pompes à diffusion nécessitent
un étage de pompage supplémentaire entre l’orifice et l’analyseur.
Au contraire, les spectromètres équipés d’un système de pompage
cryogénique peuvent s’en affranchir.
1.2 Mécanismes d’ionisation
La formation d’ions directement à partir de la surface d’un liquide,
sous l’action d’un champ électrique intense, a été mise en évidence
par Dole en 1968 [1]. Ce phénomène, appelé nébulisation électros-
tatique, permet de former des gouttelettes ayant une charge nette
élevée. Plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer les diffé-
rents mécanismes qui conduisent à la formation d’ions en phase
gazeuse à partir de gouttelettes liquides chargées [2].
■ Au fur et à mesure de l’évaporation du solvant, la taille des gout-
telettes diminue jusqu’à ce que la limite de Rayleigh soit atteinte, de
façon que les répulsions électrostatiques entre charges de même
signe à leur surface soient telles qu’il y a explosion coulombienne
[3].
■ Le modèle d’Irbane et Thomson [4], pour lequel il a été démontré
qu’il n’explique que la formation d’ions monochargés [5] suggère
qu’il y a désorption de molécules chargées lorsque la valeur du
champ électrique présent dans les gouttelettes multichargées
atteint la valeur de 109 V/m.
■ Le modèle de Fenn [6] est un compromis tenant compte des deux
premiers mécanismes ; la formation d’ions en phase gazeuse à par-
tir de gouttelettes liquides chargées passe par plusieurs étapes
(figure 2) :
— une succession d’explosions coulombiennes provoquent une
diminution de la taille des gouttelettes ;
_______________________________________________________________________________________________________________________
— en deçà de la limite de Rayleigh, la valeur du champ électrique
est telle qu’il y a éjection de nanogouttelettes ou de molécules char-
gées parfois encore partiellement solvatées.
-- --
+ +
+ + -- + +
+ --
+ -- +
+ --
+
+ +
Gouttelettes contenant Réduction de la taille
une espèce chargée des gouttelettes par
majoritaire évaporation du solvant
et explosions du champ électrique
coulombiennes
Figure 2 – Mécanismes d’ionisation en électrospray
1.3 Particularités de l’électrospray
L’obtention par électrospray d’espèces moléculaires portant plu-
sieurs dizaines de charges ramène les rapports m/z de molécules
pouvant atteindre 100 000 Da à des valeurs comprises entre 1 000 et
3 000 unités de masse atomique (uma), compatibles avec l’utilisa-
tion d’analyseurs quadrupolaires. En mode positif, les ions sont du
type (M + nH)n+, où M est la masse moléculaire, n le nombre de
charge porté par l’ion considéré, et H la masse du proton. Ils ont
donc une masse apparente de mn = (M + nH)/n.
Des cations du type (M + aH + bX)(a + b )+ peuvent également être
observés (où X est la masse du cation, et a et b sont respectivement
le nombre de protons et de cations portant des charges positives).
En mode négatif, ce sont le plus souvent des ions du type (M – nH)n–
qui sont détectés.
Nota : dans tout ce qui suit, M, H, X, (Na, K) représentent aussi bien l’ion considéré que
sa masse.
L’ionisation dépend de paramètres physico-chimiques [7] [8] tels
que le pKa, le pH, la nature du solvant, le nombre de sites protona-
bles et leur accessibilité, de même que de la différence d’affinité pro-
tonique entre le soluté et la phase éluante. C’est la raison pour
laquelle il convient d’éviter d’utiliser seuls des solvants organiques
apolaires (dichlorométhane, cyclohexane, etc.). Il est d’autre part
recommandé, en ions positifs, de travailler en milieu acide (en ajou-
tant le plus souvent 0,1 % d’acide acétique ou trifluoroacétique) ou
encore en présence d’acétate d’ammonium (de 2 à 50 mM), de façon
à favoriser dans ce cas des adduits du type [M + NH4]+. Les phases
éluantes doivent être relativement volatiles : les solvants les plus
fréquemment utilisés sont des mélanges eau/acétonitrile ou eau/
méthanol. Enfin, quand la phase mobile contient trop de sels ou
d’électrolytes, tels que des perchlorates ou des tampons phospha-
tes, le rendement d’ionisation des solutés diminue à leur profit
(sélectivité d’ionisation), entraînant des pollutions importantes ; ils
peuvent même se déposer et s’accumuler au niveau de l’orifice
jusqu’à le boucher.
Signalons enfin que la réponse du signal est sensible à la concen-
tration du soluté ; contrairement à toute logique, la dilution de
l’échantillon peut entraîner une bien meilleure réponse, tandis que
des concentrations plus importantes peuvent se caractériser par
l’absence totale de signal. En règle générale, la concentration idéale
est de l’ordre de quelques dizaines de picomoles par microlitre.
L’allure des spectres dépend d’un paramètre essentiel : la diffé-
rence de potentiel entre la tension au niveau de l’orifice et le pre-
mier potentiel appliqué dans l’enceinte de l’appareil ; c’est tout
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ÉLECTROSPRAY
particulièrement vrai lorsque l’on a affaire à des ions monochargés
et (ou) de rapport m/z inférieur à 1 000-1 500 uma.
■ Pour une différence de potentiel de quelques volts, les ions n’ont
pas une énergie suffisante pour que soient totalement éliminés
d’éventuels adduits avec le solvant.
+
+ ■ Pour une différence de potentiel de 30 V, l’énergie est suffisante
pour que ces adduits disparaissent au profit d’ions moléculaires
-- +
+
protonés [M + H]+ ou sous forme [M + Na]+.
+ --
+
■ Pour une différence de potentiel encore plus élevée (de l’ordre de
+ 120 V), l’énergie est telle que des fragments dus à des collisions
+
avec l’azote qui circule au niveau de l’interface deviennent prépon-
dérants. Les spectres, sans toutefois être aussi sélectifs, sont com-
Désorption d'ions parables à ceux obtenus par spectrométrie de masse en tandem
de la surface du
(SM/SM). Il est possible de fragmenter ultérieurement ces ions dans
liquide sous l'effet
une cellule de collision et de caractériser ainsi des ions petits-fils
(SM/SM/SM).
■ Au-delà de 120 V, les fragments sont toujours présents, mais la
sensibilité diminue rapidement.
2. Interprétation des spectres
2.1 Espèces multichargées
2.1.1 Calcul de la masse moléculaire
Les spectres de molécules multichargées se présentent comme
une distribution statistique autour d’une valeur qui représente l’état
de charge moyen du composé. Pour un composé pur, chacun des
pics du spectre représente la même molécule possédant des états
de charge différents, deux ions adjacents se différenciant toujours
par une seule charge [9]. Il est ainsi très facile de calculer le nombre
de charges d’un pic, puis d’en déduire celui de tous les autres, pour
enfin calculer la moyenne statistique de la masse moléculaire à par-
tir de chacun des états multichargés (figure 3). Notons que tous les
appareils sont équipés d’algorithmes qui effectuent ces calculs auto-
matiquement.
2.1.2 Précision de la mesure
Les limites dans la précision de la mesure tiennent à deux para-
mètres essentiels : les limites de résolution spectrale et de précision
imposées par les techniques de mesures physiques ainsi que la
composition isotopique du composé à analyser.
Un ion monochargé comporte en effet plusieurs pics séparés
d’une unité de masse correspondant à la répartition statistique des
différents isotopes qui le constituent. On parle de profil isotopique
et le pic contenant les isotopes les plus abondants est appelé pic
monoisotopique. La complexité du profil isotopique s’accroît avec la
masse moléculaire. Au-delà de 10 000 Da, le pic monoisotopique
devient inexistant, et la perte de signal engendrée par le gain en
résolution nécessaire à la séparation des différents isotopes est éga-
lement trop importante.
Cela devient encore plus délicat lorsque l’on a affaire à des ions
multichargés : l’écart entre deux isotopes diminue quand le nombre
de charges portées par la molécule augmente (il peut même être
directement corrélé au nombre de charges), nécessitant des résolu-
tions encore plus importantes pour les séparer. C’est la raison pour
laquelle la mesure de la masse moyenne obtenue à plus faible réso-
lution s’avère plus facile, et souvent plus efficace, particulièrement
pour des composés de masse moléculaire supérieure à 3 000 Da. En
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Ions positifs Ions négatifs

3. Applications
M+ni X M-n X
mi = mi = n i
ni i

1 - Détermination du nombre de charges

3.1 Étude des biomolécules
portées par un ion, deux pics adjacents
étant toujours séparés par une charge
(n1 = n2+1)

Intensité relative (%)

n1 m1 - X m +X
n2 = n2 = 1
m1 m2 - m1 m2 - m1
100
2 - Extrapolation à tous les autres états
n2 multichargés et moyenne statistique de
75 m2 la masse moléculaire calculée à partir
de chacun d'eux
50 M = ni (mi - X) M = ni (mi + X)
25
0
800 1 000 1 200 1 400 1 600 m/z
M masse moléculaire
n nombre de charges
X masse de l'élément responsable de la charge (généralement X=1,
les charges étant le plus souvent dues à des protons)
Figure 3 – Interprétation des spectres d’ions multichargés
règle générale, la moyenne de la masse moléculaire calculée à partir
de tous les états multichargés donne une précision excellente, très
souvent supérieure à 0,01 %.
Notons que pouvoir travailler à haute résolution, avec des analy-
seurs magnétiques ou, mieux encore, grâce à la spectrométrie de
masse à résonance cyclotronique [10], peut se révéler utile dans cer-
tains cas pour déterminer, à partir de son profil isotopique, le nom-
bre de charges d’un ion (et donc la masse moléculaire du composé),
lorsqu’il est seul présent dans le spectre.
2.1.3 Spectres SM/SM d’ions multichargés
La double spectrométrie de masse (SM/SM) permet de fragmen-
ter, par collision avec un gaz neutre, un ion préalablement sélec-
tionné, et d’obtenir ainsi des informations quant à sa structure. Si le
nombre global de charges reste constant, dans le cas d’espèces
multichargées, elles se répartissent inégalement sur les différents
fragments issus de coupures de liaisons interatomiques : les ions
fils ont donc généralement un nombre de charges inférieur à celui
de l’ion parent et peuvent ainsi être détectés à une masse apparente
supérieure à celui-ci (parfois même au point d’être en dehors de la
gamme de masse de l’analyseur utilisé). Au-delà de trois charges,
l’interprétation des spectres SM/SM devient extrêmement
complexe : ils présentent des fragments ayant un nombre de char-
ges variables qu’il est difficile a priori de déterminer.
2.2 Espèces monochargées
Lorsque l’on a des espèces monochargées, l’interprétation des
spectres est tout à fait similaire à celle des spectres FAB (Fast Atom
Bombardment) ou LSIMS (Liquid Secondary lon Mass
Spectrometry) : on rencontre des espèces [M + H]+, [M + Na]+ ou
[M + K]+, [M + solvant + H]+, [2M + H]+, etc.
Historiquement, l’électrospray doit sans doute ses premiers suc-
cès à la possibilité de mesurer la masse moléculaire de peptides et
de protéines intactes jusqu’à environ 100 000 Da [11]. Auparavant,
caractériser de tels composés nécessitait de procéder au préalable à
une hydrolyse enzymatique, de séparer et d’isoler les différents pep-
tides de coupure, et enfin de combiner microséquençage et détermi-
nation de leur masse moléculaire par LSIMS.
La précision des mesures, liée à la sensibilité de la technique, en
fait maintenant un outil incontournable pour l’étude de conformité
des peptides et des protéines [12], de même, en ions négatifs, pour
les oligonucléotides. Dans le cas des protéines, endogènes ou
recombinantes, les biochimistes sont souvent confrontés à des pro-
blèmes de conformité et de modification post-traductionnelles qui
ne sont pas toujours détectables par dégradation d’Edman (séquen-
çage d’acides aminés) ou par analyse d’acides aminés. Quand les
séquences d’acides aminés sont connues, la seule détermination de
la masse moléculaire, combinée aux techniques plus classiques de
chimie des protéines, permet notamment, parfois même au sein de
mélanges :
— d’identifier l’extrémité C-terminale de polypeptides dont
l’extrémité N-terminale a été déterminée par séquençage ;
— de montrer des inhomogénéités C- et N-terminales [13] ;
— de caractériser certaines modifications post-traductionnelles
[14] : l’écart entre la masse expérimentale et la masse calculée
d’après sa séquence permet d’identifier ou de réduire le nombre
d’hypothèses sur la nature chimique des modifications (phospho-
rylations, glycosylations, liaisons avec des lipides ou des acides
nucléiques) ;
— de confirmer la bonne maturation des ponts disulfures ou de
caractériser la formation de dimères covalents. Signalons à ce pro-
pos que si le nombre maximal de charges observées pour des pep-
tides ne contenant pas de pont disulfure est en général proche du
nombre de résidus basiques (arginine, lysine, histidine, NH2 termi-
nal), la présence de ponts disulfures dans la molécule limite l’accès
aux sites protonables ; la charge globale de la molécule est, dans ce
cas, inférieure à celle de la même molécule dénaturée. D’autre part,
l’attribution de la position des ponts disulfures est possible en com-
binant les résultats obtenus par séquençage et par spectrométrie de
masse après hydrolyse enzymatique [15] (figure 4a) ;
— de mettre en évidence différents états d’oxydation : l’oxyda-
tion de certains résidus sensibles (tryptophane, méthionine) peut
être responsable de la perte d’activité biologique de certains pepti-
des. Le nombre d’atomes d’oxygène excédentaires d’un peptide
peut être déduit de la confrontation des masses moléculaires expé-
rimentales et théoriques ;
— enfin, dans le cas où l’extrémité N-terminale est bloquée, seule
la spectrométrie de masse permet de caractériser rapidement le pro-
duit.
Toutefois, plus la masse moléculaire est importante, plus il
devient difficile d’analyser des mélanges de composés de masses
proches (2 à 10 Da pour des masses moléculaires supérieures à 20
ou 30 kDa) ou de caractériser les différents types d’adduits souvent
rencontrés (Na, K...). Il n’est pas rare que les états multichargés
d’une protéine soient en fait une superposition d’espèces protonées
et cationiques : dans ce cas, la masse expérimentale est légèrement
excédentaire par rapport à la masse théorique (figure 4b). Au-delà
de 50 à 60 kDa, la pureté devient un paramètre essentiel pour mesu-
rer avec précision la masse de protéines intègres par électrospray.

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10+
(M+10H)
masse théorique = 10792,8 1888,87
masse mesurée = 10790,6

D = 2, d'où l'existence probable d'un pont disulfure

entre les deux cystéines de la séquence

11+
(M+11H)
901,99 9+
(M+9H)
1199,95

8+
(M+8H)
1349,83

a spectre électrospray de l'angiogénine

Forme dimère
M=21580,6
7+
(M+7H)
983,40 19+ 17+ 1542,44
(M+19H) (M+17H)
1030,52 1278,27 1427,00 1474,69

1000 1200 1400 1600

m/z

43+
(M+43H)
1546,5
masse théorique = 66438
masse mesurée = 66460
D = 22 uma
Position
54+
théorique
(M+54H)
1231,5 51+
(M+51H)
1303,8
48+
(M+48H)
1384,9
1545 1550 1555 1560 1565 1570 1575
47+
(M+47H)
Agrandissement
1414,9
57+
(M+57H) 45+
b spectre électrospray de l'albumine (M+45H)
humaine recombinante 1166,9
1477,2

44+
(M+44H)
1512,9

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
m/z

Figure 4 – Spectres électrospray de deux protéines

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3.2 Couplage avec les différentes D’autre part, déterminer en ligne la masse moléculaire des consti-
tuants d’un mélange permet d’élaborer rapidement des hypothèses
techniques chromatographiques quant à leur structure, en faisant appel si nécessaire aux techniques
SM/SM. En outre, certains produits sont difficiles à isoler ou, encore,
se dégradent en cours de purification. Cela est tout particulièrement
3.2.1 Chromatographie liquide vrai dans des mélanges aussi complexes que les milieux biologi-
ques.
Le couplage chromatographie liquide/spectrométrie de masse
(CL/SM) est particulièrement utile pour l’analyse de composés polai-
res, peu volatils ou thermiquement instables.

Tableau 1 – Valeurs optimales de débit et quantités d’échantillon requises selon le type de colonne utilisé
Chromatographie liquide Interface Spectromètre de masse

Diamètre de la colonne Quantité totale

Débit Division du débit Débit
(mm) de produit injecté
4,6 1 mL/min 1/25 à 1/5 40-200 mL/min 0,5 à 1 nanomole
2,1 200 mL/min avec ou sans 40-200 mL/min
1 50 mL/min sans 50 mL/min ¯
Capillaire 5 mL/min sans 5 mL/min subpicomole

La difficulté majeure dans sa mise en œuvre concerne l’obtention
d’ions en phase gazeuse à partir des solutés en phase liquide, ce qui
nécessite des interfaces très spécifiques permettant le passage de la
phase liquide à des débits élevés vers l’enceinte du spectromètre
sans en affecter la pression. Aussi l’électrospray, technique pour
laquelle le processus d’ionisation se produit à la fois en phase
liquide, à la pression atmosphérique et à température ambiante, est-
il le mieux adapté à sa réalisation [16] [17] [18]. Il s’agit même pro-
bablement à l’heure actuelle de la plus universelle des techniques
dans ce domaine, au point qu’elle est par ailleurs en train de sup-
planter le thermospray.
■ Plusieurs conditions sont à réunir :
● compatibilité de solvant : nous l’avons vu, il faut que la phase
éluante soit relativement volatile et exempte de sels ou de tampons
(notons toutefois que des travaux récents ont montré qu’il est possi-
■ Les applications sont extrêmement nombreuses : études méta-
boliques, qualitatives [21] et quantitatives [22], caractérisation de
produits d’origine naturelle, cartographies peptidiques [23], étude
de modifications posttraductionnelles, caractérisation de formes
glycosylées de protéines naturelles ou recombinantes [24] [25], etc.
Exemple : La figure 5 montre le chromatogramme obtenu par CL/
SM d’un hydrolysat d’albumine humaine recombinante (d’une masse
moléculaire de 66 438, composée de 585 acides aminés, ayant 17
ponts disulfures et une cystéine libre), qui a permis à la fois de couvrir
plus de 90 % de sa séquence primaire et de montrer la bonne
conformité des ponts disulfures [23].

Intensité relative (%)

ble d’éliminer la majeure partie des phosphates de la phase éluante, 100
au moyen d’une membrane située entre la colonne et l’interface
électrospray [19]). La phase inverse, qui utilise généralement des
mélanges eau/acétonitrile est de loin la plus utilisée ;
75
● compatibilité de débit : généralement les débits doivent être
compris entre quelques microlitres et quelques centaines de micro-
litres par minute. L’utilisation de microcolonnes est donc particuliè-
rement aisée [20]. Au-delà de 200-300 mL/min, la sensibilité diminue 50
généralement, même si les spécifications de la plupart des appareils
signalent maintenant la possibilité d’atteindre des débits de 1 mL/
min, qui sont les plus fréquemment utilisés dans des conditions 25
analytiques classiques. Il est alors recommandé d’installer en sortie
de colonne un diviseur de débit, réalisé simplement à l’aide d’un té
connecté à deux capillaires de même diamètre et de longueurs
différentes : le rapport des pertes de charge, c’est-à-dire des lon- 0
1 251 501 751 1 001 1 251 1 501 1 751 2 001 2 251 2 501 m / z
gueurs, est inversement proportionnel au rapport des débits. Même 0,0 13,3 26,5 39,8 53,1 66,7 80,1 93,5 106,9 120,4 134,0 Temps
si, dans ce cas, les quantités de produit nécessaires sont plus impor- (min)
tantes (de l’ordre de la nanomole, comme le montre le tableau 1), la
plus grande partie des composés peut être récupérée au moyen Figure 5 – Chromatogramme obtenu par CL / SM -électrospray
d’un collecteur de fractions (pour donner un exemple, un débit au d’un hydrolysat d’albumine humaine recombinante
niveau du nébulisat de 40 mL/min permet de récupérer les 24/25e de
la phase éluante).
Il est dans tous les cas recommandé d’avoir en série ou en paral- 3.2.2 Électrophorèse capillaire
lèle (selon les débits) un autre système de détection (détecteur ultra-
violet, fluorimètre, radiodétecteur, etc.) afin d’être encore plus spéci- En ce qui concerne le couplage avec l’électrophorèse capillaire, il
fique. est souvent nécessaire d’ajouter un solvant afin de maintenir, au
niveau de l’interface, des débits de l’ordre de quelques microlitres

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par minute. Les limitations de cette technique tiennent notamment

aux faibles quantités d’échantillon introduites et à l’obligation d’uti-

Intensité relative (%)

liser des tampons volatils. Si cette technique de couplage est facile
à mettre en œuvre dans le cas des peptides, des protéines, des oli-
gonucléotides [26] et des composés ioniques [27], l’analyse de com- 750
posés non chargés, qui nécessite l’adjonction de micelles pour
779
assurer une migration électrophorétique, est nettement plus problé- 722
matique.
822

694
3.3 Application à la chimie combinatoire

La chimie combinatoire connaît un essor important dans le

domaine pharmaceutique.
Dans le principe, il s’agit de synthétiser puis de tester l’activité
biologique de mélanges contenant plusieurs centaines, voire plu-
sieurs milliers de produits [28] de façon à cibler le plus rapidement
possible de nouvelles sources thérapeutiques.
Appliquée tout d’abord à la synthèse peptidique (banques de pep- 600 650 700 750 800850 900 950
tides), elle s’étend maintenant à d’autres types de synthèse. Il est Masse moléculaire
facile de calculer la population théorique des différents constituants a spectre théorique
du mélange en fonction de leur masse moléculaire (spectre théori-
que). La comparaison du graphique obtenu avec le spectre électros- Intensité relative (%)
pray du mélange se révèle extrêmement utile pour en vérifier la 750
conformité (figure 6). 100

722
4. Conclusion 75 779

822
La technique électrospray connaît un succès au moins compara-
ble à celui du FAB au début des années 80, tant par le champ d’appli- 694
50
cations qui s’est considérablement élargi depuis son apparition que
par les limites de détection qu’elle permet d’atteindre.
Sa gamme de masse est très étendue puisqu’il est possible de
déterminer la masse moléculaire de biomolécules jusqu’à
100 000 Da et plus avec une précision encore supérieure à ce jour à 25
celle obtenue avec des analyseurs à temps de vol (MALDI). La
mesure de la masse moléculaire d’un ADN de 108 Da, avec un appa-
reil à résonance cyclotronique, a même été rapportée [29].
La sensibilité est approximativement 100 fois supérieure au FAB 0
ou au LSIMS : quelques dizaines de picomoles suffisent en général 600 650 700 750 800
850 900 950
pour déterminer la masse moléculaire d’un peptide (notons néan- Masse moléculaire
moins que les limites de détection restent supérieures au MALDI, b spectre obtenu en électrospray
qui atteignent quelques femtomoles).
Particulièrement adaptée aux composés polaires et thermosensi- Figure 6 – Vérification de la conformité d’un mélange synthétique de
bles, elle a permis, en outre de réaliser un souhait qui tenait particu- 6 800 hexapeptides
lièrement à cœur à tous les spécialistes depuis longtemps :
interfacer, pratiquement en routine, la spectrométrie de masse avec
la chromatographie liquide ou, encore, avec l’électrophorèse capil-
laire.
Développée à ses débuts sur des spectromètres équipés d’analy-
seurs quadrupolaires, elle existe maintenant sur tous les types de
spectromètres, magnétiques, cyclotrons et trappes ioniques.

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Électrospray
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Doc. PE 3 350 - 1
P ÉLECTROSPRAY ________________________________________________________________________________________________________________________
O
U Constructeurs
R Tous les constructeurs développent maintenant ce type d’interface. Les pro-
grès réalisés en ce qui concerne l’instrumentation scientifique ont en même
temps considérablement réduit le prix des appareils avec des performances
encore accrues.

E Les principaux fabricants sont :

— Brucker
— Finnigan Mat

N — Micromass
— Perken Elmer Sciex

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A
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L
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