Dr.

Touaitia R

Université Laarbi Tebessi – Tebessa –

Faculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de

la vie

Département de biologie appliquée

Année 2020-2021

Niveau: Master 1 sciences alimentaires et contrôle de qualité

Matière: utilisation des enzymes dans l'industrie agroalimentaire

Crédit :

Coefficients:

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 Dr. Touaitia R

Introduction :

Depuis plusieurs millénaires, l'homme utilise des micro-organismes générés

naturellement - bactéries, levures et moisissures -, ainsi que les enzymes qu'ils
produisent, pour confectionner des aliments comme le pain, le fromage, la bière et le
vin. Ainsi, l'enzyme utilisée dans la fabrication du pain, à savoir l'amylase, sert à
décomposer la farine en sucres solubles qui sont alors transformés par la levure en
alcool et en gaz carbonique. C'est ce qui fait lever la pâte à pain.

De nos jours, les enzymes ont de plus en plus d'applications - boulangerie-pâtisserie,

fabrication de fromage, transformation de l'amidon et fabrication de jus de fruits et
autres boissons - où elles améliorent la consistance, l'aspect et la valeur nutritive et
peuvent produire les goûts et arômes souhaités. Les enzymes alimentaires utilisées
actuellement proviennent parfois d'animaux et de plantes (par exemple, l'amylase qui
digère l'amidon s'obtient à partir de germes d'orge), mais la plupart sont issues de
micro-organismes bénéfiques.

Dans la fabrication des produits alimentaires, les enzymes présentent un certain

nombre d'avantages :

 dans de nombreux procédés de fabrication, elles remplacent avantageusement les

produits chimiques de synthèse, permettant ainsi de faire de réels progrès dans la
réduction des déchets émanant de ces procédés, grâce à la biodégradabilité et à
une moindre consommation d'énergie;
 étant donné qu'elles ont une action plus spécifique que les produits chimiques de
synthèse, les procédés qui les utilisent ont moins de réactions secondaires et de
sous-produits résiduaires, et donnent des produits de meilleure qualité tout en
diminuant la probabilité de pollution;
 elles permettent d'exécuter certains procédés qui, sans elles, seraient impossibles.
Ainsi, c'est une enzyme, la pectinase, qui permet de fabriquer du concentré de jus
de pomme parfaitement limpide.

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Lorsque les enzymes sont produites à partir de micro-organismes (les principaux types
comprennent les espèces Bacillus Aspergillus, Streptomyces et Kluyveromyces), elles
sont cultivées par fermentation dans de grandes cuves d'une capacité pouvant
atteindre 150 000 litres, où la température, les apports de nutriments et l'air sont
réglés de manière à favoriser un développement optimal des enzymes. Comme en
d'autres points de la chaîne alimentaire, des règles d'hygiène très rigoureuses sont
observées. Une fois le processus achevé, la cuve de fermentation contient un bouillon
avec des enzymes, des nutriments et des microbes que l'on fait ensuite passer par une
série de filtres pour enlever les impuretés et extraire l'enzyme.

Fabriquer de meilleurs produits :

Depuis le début des années 80, les producteurs d'enzymes ont recours au génie
génétique pour améliorer le rendement et la qualité de la production et mettre au point
de nouveaux produits. Il en découle des avantages évidents pour l'industrie comme pour
le consommateur, puisque l'amélioration de la production d'enzymes se traduit par de
meilleurs procédés et de meilleurs produits. Toutefois, les progrès sont ralentis par le
débat qui se poursuit en Europe sur d'autres aspects plus controversés de la
biotechnologie, notamment les manipulations génétiques sur l'animal.

A l'heure actuelle, la biotechnologie moderne permet une série de progrès dans la technique de

production des enzymes :

 Accroissement de la productivité et de la rentabilité des procédés actuels. Dès lors

que les enzymes sont produites de manière plus efficace, la quantité de matières
premières, d'énergie et d'eau nécessaire pour faire un produit peut être réduite de
moitié, en passant d'une souche microbienne classique à une souche génétiquement
modifiée.
 Les fabricants peuvent mieux adapter leurs enzymes aux demandes des clients
désireux d'obtenir des produits présentant certaines propriétés particulières.
 Les fabricants peuvent fournir des enzymes qui, sinon, ne pourraient être produites
en quantités suffisantes, donnant ainsi au consommateur l'accès à une plus grande
diversité de produits. A titre d'exemple, citons le produit à base d'amylase qui
permet au pain de rester frais plus longtemps.

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Historique des enzymes:

 2000 av. J.C.

Les Egyptiens et les Sumériens mettent au point la fermentation et l'utilisent
pour fabriquer la bière, le pain et le fromage.
 800 av. J.C.
Des panses de veau et une enzyme, la chymosine, servent à la fabrication de
fromage.
 1878 ap. J.C.
Les éléments constitutifs des cellules de levure qui provoquent la fermentation
sont identifiés. Le terme "enzyme", du grec en sumê "dans le levain", est
employé pour la première fois.
 1926
Pour la première fois, il est démontré que les enzymes sont des protéines.
 Années 80
Des préparations enzymatiques sont élaborées pour améliorer la digestibilité et
la disponibilité des nutriments de certains aliments pour animaux.
 1982 Première application d'un produit du génie génétique, l'alpha-amylase.
 1988 La chymosine recombinante est homologuée et introduite en Suisse. Il
s'agit de l'une des premières homologations d'un produit du génie génétique à
usage alimentaire.
 1990 Deux auxiliaires de transformation alimentaire obtenus par la génétique
sont homologués. Il s'agit d'une enzyme destinée à la fabrication de fromage
aux Etats-Unis et d'une levure de boulanger utilisée en Grande-Bretagne

Quelques utilisations des enzymes dans la production alimentaire

 Enzymes du commerce produites par la technologie génique

Marché Enzyme But ou fonction

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Produits laitiers présure (protéase) coagulant pour la fabrication de

fromage

lactase hydrolyse du lactose pour obtenir

des produits sans lactose

protéase hydrolyse des protéines du

lactosérum

catalases extraction du peroxyde

d'hydrogène

Brasserie cellulases, bêta- liquéfaction, clarification;

glucanases, alpha- compléments des enzymes de malt
amylases, protéases,
amylases maltogènes

Production d'alcool amyloglucosidase transformation de l'amidon en

sucre

Boulangerie alpha-amylases décomposition de l'amidon;

production de maltose

amyloglycosidases saccharification

amylase maltogène retarde le processus par lequel le

(Novamyl) pain devient rassis

protéase décomposition des protéines

pentosanase décomposition du pentosane,

conduisant à une réduction de la
production de gluten

glucose-oxydase stabilité de la pâte

Vins et jus de fruit pectinase augmentation du rendement et de

la clarification du jus

glucose-oxydase extraction de l'oxygène

bêta-glucanases

Viande protéase attendrissage de la viande

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papaïne

Protéines protéases, trypsine, décomposition de différents

aminopeptidases constituants

Amidon alpha-amylase, modification et transformation

glucoamylases,
hémicellulases,
amylases maltogènes,
pullulanases,glucose-
isomérases,

dextranases, bêta-
glucanases

Inuline Inulinases production de sirops de fructose

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Chapitre I- Utilisation des enzymes en industrie agroalimentaire

1. Définition Une enzyme

L'enzyme est une protéine possédant de propriétés catalytiques. Pratiquement

toutes les biomolécules capables de catalyser des réactions chimiques dans les

cellules sont des enzymes.

2. Production industrielle des enzymes

Les enzymes, biocatalyseurs utilisé dans la bio-industrie ou dans les industries divers

(agroalimentaire, …..) peuvent avoir plusieurs sources et tout particulièrement :

A- Une origine végétale:

Les enzymes d’origine végétale et spécialement les protéases sont par ordre

d’intérêt décroissant en technologie :

 la papaïne en provenance d’une plante tropicale (Carica papaya L.)

 la broméline extraite de l’ananas (Ananas comosus Merr),

 la ficine issue de la figue ( Ficus globrata)

B- Une origine animale:

Les enzymes d'origine animale incluent des protéinases comme la pepsine et la

présure.

C- Une origine microbienne:

Dés que le développement de la microbiologie a permis de mieux comprendre les

systèmes qui président à la synthèse des enzymes chez les micro-organismes, la

production industrielle d’enzymes s’orientée vers les processus fermentaires. La

plupart des enzymes industrielles sont produites par un nombre limité de

microorganismes tels que les moisissures Aspergillus, Trichoderma et Streptomyces,

le genre bactérien Bacillus (Tableau I).

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Les levures ne sont pas de bons producteurs d'enzymes extracellulaires et sont

rarement employées à cette fin.

Exemples de quelques microorganismes utilisés pour la production d’enzymes

destinées aux industries alimentaires.

3. Processus général de production des enzymes par fermentation

Le processus général de production des enzymes peut être résumé dans les phases

suivantes:

 Choix d'une enzyme ;

 Choix d'une souche productrice ;

 Construction d'une souche surproductrice par génie génétique ;

 Optimisation du milieu de culture et des conditions de production ;

 Optimisation du processus d'extraction (et de purification si nécessaire)

 Formulation d'un produit stable.

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4. Production d'enzymes par fermentation microbienne

4.1. Critères utilisés dans le choix d'une enzyme industrielle:

Les critères utilisés dans le choix d'une enzyme industrielle incluent la spécificité, le

taux de réaction, les valeurs optimales de pH et de température, la stabilité de

l'enzyme, l'effet des inhibiteurs et l'affinité aux substrats. Les enzymes utilisées

dans des applications industrielles doivent tolérer l'action des métaux lourds et

n'avoir aucun besoin de cofacteurs. Elles devraient être déjà à leur activité maximale

en présence de basses concentrations de substrat de sorte que la réaction désirée

s'accomplisse dans un délai de temps réaliste.

4.2. Choix des souches productrices:

En choisissant la souche productrice plusieurs aspects doivent être considérés.

- Dans le meilleur des cas l'enzyme est sécrétée à l'extérieur de la cellule. Ceci

rend l'extraction et la purification beaucoup plus faciles comparées à la production

des enzymes intracellulaires, qui doivent être purifiées des milliers de protéines

cellulaires et d'autres composants.

- Deuxièmement, l'organisme producteur doit répondre aux exigences de

confinement (c’est-à-dire faire partie des souches GRAS « generaly recognized as

safe »). Ce qui est particulièrement important lorsque l'enzyme produite est

employée en industrie alimentaire. Troisièmement, l'organisme devrait pouvoir

produire un montant élevé de l'enzyme désirée dans un délai de temps raisonnable.

Les souches industrielles produisent typiquement plus de 50 g/l d'enzymes

extracellulaires. La plupart des microorganismes industriellement utilisés ont été

génétiquement modifiées pour surproduire l'activité désirée et éviter les activités

secondaires peu désirées.

4.3. Optimisation du milieu de culture et des conditions de production :

 Composition du milieu de culture :

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Le milieu de culture doit contenir la source de carbone, la source d’azote et les

principaux facteurs de croissance nécessaires à la souche microbienne. Certains

facteurs peuvent être ajoutés pour raccourcir la phase latence. Toutefois, la

production d’enzymes peut ne pas avoir dans un milieu convenant pour une bonne

croissance. Il faut tenir compte du besoin en inducteur, des répressions possibles

pour un composé du milieu, de la répression catabolique produite par le glucose. Cette

répression peut être évitée en remplaçant le glucose par des glucides lentement

fermentescibles ou par de l’amidon partiellement hydrolysé.

 Conditions de production:
Préparation d’Inoculum Concernant la préparation de l’inoculum (figure 01), dans

cette étape de préparation de l’inoculum, la capacité de production de la souche doit

être préservée et tout risque de contamination doit être éliminé. Pour cela, il faut

éviter un trop grand nombre de cultures successives. Il est préférable d’ensemencer

un flacon de milieu gélosé directement à partir de la souche lyophilisée puis, à partir

de cette culture, d’ensemencer un seul fermenteur qui servira luimême d’inoculum

pour le fermenteur industriel. Le volume de l’inoculum représente généralement 3 à

10% du volume de fermenteur de production et la composition du milieu pour la

préparation de l’inoculum se rapproche souvent de celle du milieu de production. Le

temps de séjour dans le fermenteur de préparation varie de 10 à 80 heures selon les

procédés, la souche, les conditions de culture…

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Les étapes de préparation d'inoculum.

 Paramètre physiques à contrôler :

a- Température: Les quantités de chaleur libérée peuvent atteindre 2.106 k

cal/heure, par fermenteur. Le refroidissement se fait pas serpentin interne, double

paroi, ruissellement.

b- pH : Il doit être régulé en continu par des électrodes fiables et stérilisables. Il

est maintenu par des alcalis : soude, amoniaque, ou par des acide minéraux :

phosphorique, sulfurique… dans certains cas, une évolution spontanée du pH est

préférable à condition de tamponner suffisamment le milieu (phosphates).

C. Moussage : Dans les milieux utilisés riches en protéines, l’agitation et l’aération

provoquent l’apparition de mousse, qui est réduite par l’addition d’antimousse. Ce sont

des composés à base d’huiles animales ou végétales et de silicones. Ces produits ont

en général un effet défavorable sur le transfert d’oxygène, ils peuvent être toxiques

pour le micro-organisme. De plus, ils doivent satisfaire aux normes alimentaires en

vigueur.

D. oxygénation : C’est un paramètre critique, particulièrement difficile à maitriser

au niveau industriel. De nombreuses études ont été réalisées pour essayer de cerner

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les aspects complexes liés à la solubilisation de l’oxygène dans la phase aqueuse, puis

à son transport dans des cellules dont la physiologie est en continuelle évolution.

La difficulté provient du fait que les composantes de l’ensemble « fermentation-

fermenteur » obéissent à des lois de nature différente : physiques pour ce qui

concerne les transferts de masse, physiologiques pour les micro-organismes, mixtes

lorsqu’il y a interaction entre les deux premières catégories.

E . Aptitude à l’extraction : L'ingénieur devra poser les questions suivantes : est-

ce que le produit est sécrété dans le milieu extracellulaire, comment rompre la

cellule si le produit est intracellulaire, est-ce que certains composants de la matière

première ou des produits inhibent l'activité du microorganisme et enfin, comment

récupérer, épurer et préserver le produit.

5. Différents méthodes de fermentation :

On distingue trois types de procédés de fermentation :

 le procédé batch ou fermentation discontinue ;

 le procédé fed-batch ou fermentation discontinue alimentée ;

 le procédé de culture continue.

5.1. Procédé discontinu (batch):

Le fermenteur est un système clos, fermé. Au temps zéro de la fermentation, la

solution de nutriment stérile est inoculée avec des microorganismes (bactéries,

levures). L’incubation se réalise dans des conditions d'agitation, de température, de

pression partielle en oxygène et de régulation de PH. Au cours de l'incubation, la

quantité de micro organismes dans le fermenteur, la concentration en biomasse, en

substrat et en produit varie constamment, conséquence du métabolisme microbien.

Le volume reste constant et la productivité est relativement faible. En fin de

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fermentation, le fermenteur est vidé et son contenu est remplacé. On l’utilise dans le

cas de faibles volumes.

5.2. Procédé fed-batch (discontinu alimenté):

Le substrat est apporté au fur et à mesure de sa consommation par les

microorganismes. La croissance démarre plus vite étant donné que le volume de

culture peut être réduit. La concentration obtenue peut alors être plus élevée qu’en

mode batch. Quand la croissance est en phase stationnaire, du milieu de culture

stérile est ajouté. Le volume dans la cuve augmente alors au cours du temps. Le débit

est réglé de façon à ce que la concentration en substrat soit constante dans la cuve

et que l’effet de dilution ne soit pas inhibiteur de la production de biomasse. Lorsque

la cuve est remplie, l’alimentation est coupée : la conduite est alors en mode

discontinu.

Le fedbatch permet en pratique un gain de temps, une augmentation de productivité

et une possibilité de modification du milieu en cours de culture. Mais le risque de

contamination est élevé.

6. Méthodes d'extraction et de purification des enzymes

L'enzyme souhaitée produite peut être excrétée dans le milieu de culture (enzymes

extracellulaires) ou peut être présente dans les cellules (enzymes intracellulaires).

Selon l'exigence, l'enzyme commerciale peut être brute ou très purifiée. En outre, il

peut être sous forme solide ou liquide. Les étapes impliquées dans le traitement en

aval, c'est-à-dire que les étapes de récupération et de purification utilisées dépendront de

la nature de l'enzyme et du degré de pureté souhaité.

6.1. L'Extraction:

L'Extraction désigne l’action de séparer une enzyme du composé dont elle fait partie.

Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou

de la membrane cellulaire par des procédés physique ou chimique. En général, le

rétablissement d'une enzyme extracellulaire présente dans le bouillon est

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relativement plus simple par rapport à une enzyme intracellulaire. Pour la libération

d'enzymes intracellulaires, des techniques spéciales sont nécessaires pour la

perturbation cellulaire. Les cellules microbiennes peuvent être décomposées par des

moyens physiques (sonication, haute pression, perles de verre) ou chimiques (solvants

organiques). Les parois cellulaires des bactéries peuvent être lysées par l'enzyme

lysozyme. Pour les levures, on utilise l'enzyme β-glucanase. Cependant, les méthodes

enzymatiques coûtent cher.

6.2. La purification :

La purification est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes les impuretés

d’un extrait brut contenant l’enzyme d’intérêt. En principe, n'importe quelle méthode

destinée au fractionnement de protéines peut être employée pour la purification

d'enzymes.

Les étapes de récupération et de purification (brièvement décrit ci-dessous) seront

les mêmes pour les enzymes intracellulaires et extracellulaires, une fois que les

cellules sont perturbées et que les enzymes intracellulaires sont libérées. La

considération la plus importante est de minimiser la perte de l'activité enzymatique

souhaitée.

- Enlèvement des débris cellulaires: La filtration ou la centrifugation peuvent

être utilisées pour éliminer les débris cellulaires.

- Enlèvement des acides nucléiques: Les acides nucléiques interfèrent avec la

récupération et la purification des enzymes. Ils peuvent être précipités et

éliminés en ajoutant des substances spécifiques comme les polyamines et la

polyéthylèneimine.

- Précipitation enzymatique: Les enzymes peuvent être précipitées en utilisant

des sels (sulfate d'ammonium) ou solvants organiques (isopropanol, éthanol et

acétone). La précipitation est avantageuse puisque l'enzyme précipitée peut être

dissoute dans un volume minimal pour concentrer l'enzyme.

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7. Préparation enzymatiques commerciales:

Après extraction, purification et concentration par évaporation ou ultrafiltration, les

solutions sont mises au titre et conditionnées. Les formes en poudre préparées par

atomisation sont généralement d’une très bonne conservation sans précautions

particulières. Les solutions sont stabilisées par des conservateurs qui doivent être

conforme aux normes en matière d’alimentation. Les plus utilisés NaCl, le glycérol, le

sorbitol, le benzoate. Ces produits agissent par hydratation du milieu, en diminuant le

taux d’eau libre nécessaire à la croissance microbienne.

Les produits finis sont contrôlés pour :

 Leur activité enzymatique ;

 Leur qualité microbiologique (absence des germes pathogène) ;
 Leur stabilité à la conservation

8. Application des enzymes:

8.1. Domaine agroalimentaire:

L’alimentation humaine et animale est le troisième grand domaine d’utilisation des

enzymes. Les biocatalyseurs sont effectivement les outils de choix pour catalyser la

transformation (hydrolyse principalement) des molécules végétales et animales :

protéines, polyosides, lipides.

Enzymes employées dans l’industrie laitière

 Enzymes de coagulation : la production du caillé à partir du lait provient de

l’hydrolyse spécifique de la қ-caséine, par la présure, enzyme traditionnellement

extraite de la caillette de veau et constituée d’un mélange de chymosine et de

pepsine. Cette présure naturelle est en compétition, suivant les traditions

fromagères et les coûts respectifs, avec des substituts microbiens produits par des

cultures fongiques (Cryphonectria parasitica, Mucor pusillus Lindt, …) ;

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 Les protéases et les lipases sont utilisées pour la production d’arômes de

fromage. Le lysozyme, extrait de blanc d’œuf, a été employé comme antibactérien

naturel pour éviter le développement de bactéries propioniques dans certains

fromages. La β-galactosidase (« lactase ») catalyse l’hydrolyse du lactose, principal

glucide des laits maternels, en D-glucose et D-galactose. Il est ainsi possible de

préparer des laits diététiques pour les personnes présentant des problèmes

d’intolérance au lactose, et d’éviter les problèmes de cristallisation de ce produit

dans les produits laitiers, notamment les glaces, dus à sa faible solubilité.

Enzymes employées pour la panification

 Les α-amylases fongiques (moins thermostables que les α-amylases

bactériennes, donc plus facilement dénaturées au cours de la cuisson) sont utilisées

pour accélérer la croissance des levures et la production de dioxyde de carbone

(levée de la pâte) en complémentant cette activité naturellement présente dans les

farines.

 L’action des oxydases (glucose, hexose, sulfhydryl oxydases et lipoxygénases)

libère du peroxyde d’hydrogène, ce qui conforte la formation de ponts disulfure

entre les molécules de gluten et améliore les qualités de la pâte et de la mie.

8.2. Les Détergents :

L’utilisation des enzymes dans l’industrie des détergents représente l’application

industrielle la plus importante à la fois en termes de valeur et de quantité. Les

enzymes les plus utilisées sont les protéases, mais beaucoup d’autres hydrolases

peuvent également être ajoutées aux préparations pour aider à l’élimination de

taches très diverses.

Les marques de lessive les plus performantes combinent protéases, amylases, lipases

et cellulases pour augmenter l’efficacité du lavage. Chacune de ces enzymes est

capable d’attaquer un type particulier de tache ou de salissure. Le fait d’inclure

plusieurs types d’activité enzymatique dans le détergent permet ainsi d’éliminer des

salissures contenant différentes substances.

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Par exemple, une tache alimentaire peut contenir des protéines, des lipides (gras) et

de l’amidon, nécessitant pour son élimination totale l’action combinée d’une protéase,

d’une lipase et d’une amylase (les enzymes sont utilisées en relativement faible

quantité dans les lessives, environ 0,4 à 0,8 % de préparation enzymatique par

rapport au poids, ce qui représente environ 1 % du coût total).

Un développement récent concerne l’introduction dans les détergents d’une cellulase

d’origine fongique stable en milieu alcalin. Elle permet l’élimination de petites fibres

de coton qui apparaissent à l’usage à la surface des vêtements modifiant ainsi le «

toucher » ainsi que la couleur : les cellulases en enlevant ces fibres sans endommager

les autres permettent de remettre à neuf les vêtements.

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Chapitre II- immuno-enzymologie

I- Généralités :

1- L'antigène :

On appelle antigène toute substance naturelle ou synthétique étrangère à l'organisme

qui, introduite par voie parentérale, est susceptible d'induire la formation d'anticorps

avec lesquels elle s'unira spécifiquement.

Ces substances sont principalement d’origine exogène. 2 propriétés essentielles

distinctes qui se confondent parfois, définissent les antigènes:

 L’immunogénicité :

Est la capacité à induire une réponse immunitaire humorale et/ou à médiation cellulaire.

Cellule B + Antigène Cellule B effectrice + Cellule B à mémoire

Plasmocyte

Cellule T + Antigène Cellule T effectrice + Cellule T à mémoire

CTL + th

 L’antigénicité :

Est la capacité à se combiner spécifiquement avec les produits finals des réponses :

Anticorps et / ou récepteurs de surface cellulaire

Bien que toutes les molécules qui possèdent la propriété d’immunogénicité aient aussi la

propriété d’antigénicité, l’inverse n’est pas vrai. Quelques petites molécules appelées

Haptènes sont antigéniques mais sont incapables par elles mêmes, d’induire une réponse

immunitaire spécifique.

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 Les haptènes:

Les haptènes sont des sels de métaux lourds (nickel, chrome, mercure), des quinones

végétales, des molécules de synthèse (médicaments, colorants, etc.), ou encore des

molécules naturelles (hormones peptidiques ou stéroïdes). Ces substances, d'un poids

moléculaire inférieur à 1 kDa, ont des propriétés antigéniques, mais ne sont pas

immunogènes. Elles deviennent immunogènes lorsqu'elles sont couplées de manière

stable à une molécule porteuse (carrier) qui est immunogène.

 L'épitope :

Un épitope, aussi appelé déterminant antigénique, est une molécule qui peut être

reconnue par un paratope (partie variable d'un anticorps ou d'un récepteur

membranaire des lymphocytes B : BCR), pour déterminer si elle appartient au domaine

du soi ou au domaine du non-soi. Un antigène est caractérisé par ses épitopes, si ses

épitopes sont reconnus comme appartenant au non-soi alors il est lui-même

immédiatement reconnu comme appartenant au non-soi. Cette reconnaissance

épitope/paratope est donc à la base de la réponse immunitaire spécifique : elle permet

la sélection clonale, c’est-à-dire la sélection des acteurs capables de s'attaquer

spécifiquement à l'antigène correspondant à un épitope particulier.

On distingue deux types d'épitopes

● Les épitopes linéaires ou séquentiels, qui correspondent à un enchaînement continu de

monomères (acides aminés ou oses) adjacents. Dans ce cas, pour les protéines, c'est la

seule séquence de la molécule qui est impliquée dans la reconnaissance ;

● Les épitopes conformationnels ou discontinus qui sont formés par un groupe de sites

éloignés dans la séquence, mais rapprochés les uns des autres suite au repliement

spatial de la molécule. Les épitopes B peuvent être linéaires ou conformationnels. En

revanche, les épitopes T, restreints à des peptides de 8 à 18 acides aminés présentés

par les molécules du CMH, sont de fait des épitopes linéaires.

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2. L'anticorps :

Un anticorps (Ac) est une glycoprotéine complexe produite par le système immunitaire

(par des plasmocytes) en réponse à une stimulation par un composant habituellement

étranger, (antigène). Les anticorps sont capables de se fixer spécifiquement aux

antigènes pour les neutraliser, mais aussi de recruter des effecteurs du système

immunitaire, tels que les macrophages, les cellules NK ou encore le système du

complément afin d’éliminer les microorganismes ou les cellules qui expriment ces

antigènes.

 Structure d'anticorps

Les anticorps sont des immunoglobulines, glycoprotéines de structure complexe (figure

2),

réparties en plusieurs classes et sous-classes avec des activités biologiques

spécialisées.

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 Dr. Touaitia R

Ces molécules bi-fonctionnelles possèdent à la fois une capacité de fixation directe à

l’antigène (portion Fab) et une capacité d’interaction avec le système immunitaire

(portion Fc). À l’extrémité des Fab, le repliement des chaînes peptidiques des régions

VH et VL assure un rapprochement spatial des six CDR, constituant le site de liaison de

l’antigène, aussi appelé paratope. Le paratope de l’anticorps reconnait sur l’antigène un

motif qui lui est spécifique, l’épitope. Il faut aussi distinguer l’affinité de l’avidité d’un

anticorps, désignant respectivement la force de liaison antigène-anticorps, et la force

avec laquelle un anticorps multivalent se fixe à un microorganisme ou une cellule

exprimant plusieurs antigènes.

II- Principe général des réactions d’immunoenzymologie:

Ce sont des réactions de type essai immuno-enzymatique EIA (Enzyme Immuno Assay),

Ag-Ac, spécifiques permettant de mettre en évidence un complexe Ag-Ac en utilisant

une enzyme directement fixée ou indirectement fixée sur les complexes immuns.

Lorsque l’on ajoute ensuite le substrat de l’enzyme, il y a libération d’un composé coloré

que l’on peut doser par spectrométrie. Le substrat de l’enzyme est encore appelée «

substance chromogène ». Ces techniques sont encore appelées la technique de dosage

d’immunoabsorption par enzyme liée (en anglais Enzyme-Linked Immuno Assay) ou

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 Dr. Touaitia R

ELISA pour Enzyme. Ces techniques possèdent de nombreuses variantes : ELISA

indirecte, ELISA sandwich, ELISA compétitif.

1. Principe :

La technique ELISA est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de

visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par

l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.

2. Méthodes des Tests ELISA

2.1. ELISA direct :

Cette technique est la technique ELISA "vraie". Elle permet de détecter directement

les antigènes on l'appelle aussi (ELISA compétition)

Dans ce cas on utilise des antigènes ou des haptènes marqué par une enzyme qui entre

en compétition avec l'ag à doser

Ces méthodes nécessitent une étape de lavage pour éliminer l'excès de marqueur qui ne

s'est pas fixé.

2.2. ELISA indirect:

Ce test permet de détecter ou doser des anticorps. il se réalise en 4 étapes:

 Etape 1: "coating" de l'antigène:

Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps

recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement.

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Les plaques sont incubées à 4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour

éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage.

 Etape 2 : fixation de l'anticorps à doser:

On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ 30

minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits

sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de

lavage.

 Etape 3:fixation de l'anticorps de détection :

On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ

30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent spécifiquement sur les

anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection

en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont couplés

à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction

détectable et mesurable grâce à l'apparition d'une coloration.

 Etape 4 : révélation des anticorps fixés :

On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une solution

révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une coloration dans le

substrat indique la présence de l'anticorps à doser. L'intensité de celle-ci est

proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps

recherché.

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 Dr. Touaitia R

2.3. ELISA sandwich:

Cette technique utilisée afin de détecter un échantillon d'antigène dans le sérum ou

tout autre échantillon. Dans ce cas de figure, l'antigène se trouve entre 2 anticorps

spécifiques Dans ce cas de figure, l'antigène se trouve entre 2 anticorps spécifiques.

L'utilisation de la DAS ELISA nécessite de posséder 2 anticorps monoclonaux

reconnaissant des épitopes différents sur l'antigène.

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 Dr. Touaitia R

Chapitre III: Immobilisation des enzymes

1. Définition d'enzyme immobilisée:

Une enzyme immobilisée est une enzyme liée par des moyens physico-chimiques en

surface ou à l’intérieur d’un support solide.

2. Propriétés des enzymes immobilisées

L’immobilisation des enzymes conduit souvent à un changement de leurs propriétés

physiques, chimiques et cinétiques

2.1. Propriétés physico-chimiques:

Une des propriétés importantes et caractéristiques de l’immobilisation est

l’amélioration de la stabilité dans le temps et de la résistance vis-à-vis de la

dénaturation. La stabilité de l’enzyme immobilisée dépond beaucoup du

microenvironnement imposé par le support. Ainsi, les enzymes fixées par la liaison

sulfonamide sont moins stables que celles fixées par liaison azo.

2.2. Propriétés cinétiques:

L’immobilisation des enzymes affecte leurs propriétés cinétiques. En effet, à la vitesse

de la réaction enzymatique proprement dite, il faut ajouter l’effet du

microenvironnement qui conditionne toute l’activité catalytique. Ainsi, les phénomènes

de diffusion l’accès du substrat au niveau du site actif. Ceci a pour conséquence une

variation de la vitesse maximale VM et de la constante de Michaelis KM de l’enzyme ;

cette dernière constante pouvant avoir une valeur 10 fois supérieure. De même, le pH

de l’enzyme peut être modifié, en particulier lorsque la réaction enzymatique met en

jeu une libération ou une consommation de protons.

3. Techniques d'immobilisation

Les enzymes présentent un fort intérêt dans le domaine de la biocatalyse. Cependant,

leur coût et leur stabilité limitée dans le temps sont des facteurs limitant leur

utilisation industrielle. Afin de palier ces inconvénients, une stratégie fut proposée :

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 Dr. Touaitia R

l’immobilisation des enzymes qui permet de stabiliser celles-ci au cours de leur

utilisation, de pouvoir les réutiliser et de séparer l’enzyme des produits de la réaction

enzymatique. En 1916, Nelson et Griffin seront les premiers à démontrer qu’une

enzyme, en l’occurrence l’invertase, conserve son activité catalytique et ce même après

avoir été immobilisée par adsorption sur du charbon actif. Cette technique connaîtra un

véritable essor à partir des années 1950 avec les premières applications dans divers

domaines. Il existe différentes techniques d’immobilisation pouvant être aussi bien

chimiques que physiques.

 Immobilisation par liaison

 Inclusion

 Réticulation

Les différentes techniques d’immobilisation découlant des trois principales méthodes

d’immobilisation sont résumées par le schéma suivant:

Les différentes techniques d'immobilisation

4. Techniques d'immobilisation:

4.1. Immobilisation par liaison:

Elle consiste en la rétention d'enzyme sur une phase insoluble dans l'eau par une liaison

chimique ou physique. Dans cette méthode la quantité d’enzyme retenue et l'activité

sont extrêmement variables et sont évidement fonction de la nature de support. Selon

le mode de couplage, ce procédé peut être classifié de trois manières :

 Immobilisation par adsorption physique.

 Immobilisation par liaison ionique.

 Immobilisation par liaison covalent.

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 Dr. Touaitia R

Immobilisation par liaison

a) Adsorption physique :
L'adsorption physique demeure la méthode la plus simple et la plus rentable. Dans ce

procédé, l’enzyme est retenue à la surface d'un corps adsorbant minérale ou organique

grâce à différents types de liaison : interactions de Vander Wals, interactions

hydrophobes, liaisons hydrogènes, transfert de charge, échange de ligands, chimio-

sorption.

Différents supports ont été exploités pour l'immobilisation des enzymes (chitosane,

kaolin, la celite, carbonate de calcium).

Cette technique est simple, réversible, mais la fixation n'est pas spécifique et les

risques de désorption sont importants.

b) Immobilisation ionique:
Les enzymes portent, par leurs résidus d'acide aminé, des charges ioniques. Elles

peuvent donc se prêter aux phénomènes d'échange d'ion. Ces interactions seront très

dépendantes du pH du milieu en raison du caractère amphotère des résidus d'acide

aminés. La différence principale entre l'immobilisation par adsorption et

l’immobilisation ionique est que la force de liaison entre le support et l'enzyme est

beaucoup plus forte pour cette dernière.

Différents polysaccharides et polymères synthétiques ayant des centres d'échange

d'ion sont habituellement utilisés comme supports.

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 Dr. Touaitia R

c) Immobilisation par liaison covalente

L'immobilisation par liaison covalente a été développée dans le souci d'obtenir des

liaisons très solides entre enzyme et support. Pour la réalisation de la liaison covalente

il faut une activation préalable soit du support, soit de l'enzyme, car les groupes

fonctionnels de l'enzyme ne sont généralement pas suffisamment réactifs. Mais c'est

surtout l'activation du support qui a fait l'objet des nombreuses études, car

l'activation des groupes fonctionnels de l'enzyme est délicate et peut conduire à la

dénaturation de l’enzyme.

Différentes supports tels que la silice, résine adsorbante, carboxy-methyl-cellulose ont

été exploités pour cette technique.

4.2. La Réticulation:

En traitant un enzyme par un agent chimique hydrosoluble bi fonctionnel et susceptible

de réagir sur les groupements fonctionnels libres de celui-ci, on obtient un réseau

enzymatique tridimensionnel insoluble.

Le glutaraldehyde est un agent de réticulation parmi les plus utilisés.

Immobilisation par réticulation

Cette méthode a l'avantage de fournir des dérivés insolubles constitués presque

exclusivement d'enzyme. Malheureusement les produits sont gélatineux et difficile à

filtrer et leurs propriétés mécaniques sont médiocres. En outre une très importante

perte d'activité enzymatique accompagne la réticulation.

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 Dr. Touaitia R

4.3. Inclusion:

Le principe de l'inclusion est de retenir l'enzyme prisonnière dans la matrice d'un

polymère ou dans une micro capsule. Plusieurs polymères, entre autre l’alginate, le

chitosane, le gel de polyacrylamide et le gel d'amidon sont utilisés.

a) Immobilisation par encapsulation

L’enzyme en solution aqueuse est enfermée dans des microcapsules sphériques, dont la

paroi est une membrane semi-perméable qui peut être liquide ou solide. Cette

membrane retient l'enzyme mais laisse passer le substrat et le produit.

Immobilisation par Micro-encapsulation

b) Emprisonnement sur une matrice:

L'enzyme est dissoute dans une solution aqueuse d'un monomère et d'un réticulant .la

polymérisation est ensuite effectuée à des conditions moins dénaturantes possibles, on

obtient un réseau macromoléculaire tridimensionnel dans les mailles duquel l'enzyme se

trouve retenu de façon plus ou moins efficace. Cette technique est simple et très

utilisée pour diverses enzymes, mais les risques de fuite ne sont pas négligeables, si les

mailles du réseau sont larges.

De plus on observe souvent une dénaturation importante de l'enzyme due à une réaction

du polymère avec les groupes fonctionnels responsables de la protéine

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 Dr. Touaitia R

Emprisonnement dans une matrice

5. Les avantages et les inconvénients des méthodes d'immobilisation

méthode avantages inconvénients

1. C’est une méthode très simple à
mettre en œuvre nécessitant seulement
de mettre en contact l’enzyme et le
support dans des conditions de pH,
température et de force ionique
Adsorption données.
2. Possibilité de régénérer
complexes enzyme-support (si l’enzyme
perd son activité en cours de son
fonctionnement, il est possible de la
remplacer par une préparation active).
3. Méthode économique et ne requiert
aucun réactif chimique pouvant
dénaturer l’enzyme.
1. Réaction de polymérisation et de
gélification bien connues.
2. Réaction chimiques avec l’enzyme
limitée (inclusion dans des gels
naturels). 3. Application à toutes les
Encapsulation enzymes (utilisation de mélanges).
4. Obtention de supports de forma
adaptables (films, billes, fibre…)
5. Elle permet en une seule étape
d'immobiliser la totalité de l'enzyme
6. Elle ne présente aucun caractère de
spécificité et est applicable à n'importe
quelle enzyme.
7. Elle ne met pas en jeu les
groupements actifs de l'enzyme.
1. La fragilité de la fixation (les
enzymes peuvent facilement se
désorber sous l’action de variation
de pH, température…
2. L’orientation de l’enzyme et
mauvaise accessibilité au site actif
les
1. La localisation de l'enzyme à
l'intérieur du polymère pose des
problèmes stériques (efficacité
limitée par accès délicat du substrat
vers l'enzyme et du produit en
dehors du polymère).
2. Les conditions de polymérisation
(ex: pH élevé) peuvent s'avérer
dénaturantes pour l'enzyme.
3. Certaines polymérisations font
appel à des agents dénaturants ou à
des radicaux

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 Dr. Touaitia R

1. Stabilité accrue à cause de la liaison 1. Mise en œuvre de réactions

covalente chimiques souvent complexes
2. Grand choix de méthodes 2. Longueur des expériences (étape
différentes de l’activation du support)
Réticulation 3. Grande variété de support minéraux 3. Risques de modifications
(verre, silice, céramique…) et organiques chimiques de l’enzyme (perte
(cellulose, polymère synthétiques…) d’activité)
4. Possibilité d’effectuer 4. Nécessité de purifier l’enzyme
l’immobilisation en présence de substrat préalablement
pour éviter l’inactivation (protection du 5. Immobilisation plus complexe à
site actif) réaliser (choix des groupements a
5. Solidité de la liaison enzyme- activer...).
substrat.

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