Ecole supérieure des sciences et techniques de la

Santé de Tunis

Rapport de stage :

Stage de pharmacologie au centre national de

pharmacovigilance

Elaboré par : ZRIBI NADE

Durée de stage : 15/01/2024 ---- 18/01/2024

Lieu de travail : SERVICE DE PHARMACOLOGIE CLINIQUE

Filière : 3ème ANNEE BIOLOGIE MEDICALE

Année universitaire : 2023 /2024

Plan

Phase préanalytique

- Prescription
- Prélèvement
- Acheminement
- Réception
- Prétraitement

Phase analytique

- Indications
- Technique de dosage selon les différents paramètres mesurés
- Dosage immunologique par chimiluminescence sur l’ARCHTECT
- Dosage immunoenzymatique en phase homogène sur INDIKO
- Dosage immunologique et turbidimétrique sur l’INDIKO
- Contrôle qualité
- Chromatographie en phase liquide à haute performance « HPLC »
Phase préanalytique

La phase préanalytique regroupe l’ensemble des étapes qui se déroulent depuis la prescription
médicale jusqu’à l’analyse de l’échantillon au laboratoire.

La prescription : les modalités de prélèvement, le mode d’acheminement et l’interprétation

des résultats sont propres à chaque situation clinique d’où l’obligation d’accompagner chaque
demande de dosage par une fiche de renseignements spécifique. Elle doit comprendre :

- L’identification du malade
- Identification du l’analyse
- Information sur le médicament (nom, date du début de traitement, posologie, voie
d’administration, dernière prise, date de prélèvement…)
- Médicaments associés
- Tolérance du médicament (présence ou absence d’effets indésirables)
- Médecin prescripteur

Lieu de prélèvement: dans d’autres services (bon de commande) ou au sein du laboratoire.

Milieu de prélèvement: sur tube EDTA, hépariné ou sec selon nature de médicament à doser
Acheminement : le plus rapidement possible à + 4°C

Le technicien de laboratoire affecté au paillasse « réception des prélèvements sanguins » doit :

- vérifier que le prélèvement répond au critères de conformité établis , correctement

étiqueté et accompagné d’une fiche de renseignement remplie et signée par le médecin
demandeur
- Vérifier que le transport a été fait rapidement à température adéquate
- Vérifier que le prélèvement est fait sur le milieu adéquat
- Si le prélèvement est conforme, il est enregistré selon le dernier numéro utilisé dans le
cahier

Prétraitement :

- Centrifugation
- Décantation du plasma (pour HPLC, dosage par série)
Phase analytique

Le service de pharmacologie assure le dosage des médicaments dans le cadre

- Du suivi thérapeutique : (adaptation / posologie)

Pour certains médicament l’adaptation du traitement peut se faire sur la base
d’éléments biologiques et/ou clinique (glycémie, TA…). Pour d’autres, seul le dosage
des médicaments peut assurer la surveillance de l’efficacité et les risques
Le dosage des médicaments permet de vérifier si la concentration sanguine est
dans la zone d’efficacité (intervalle) thérapeutique ou non
- De recherche de toxicité
- Des études de bioéquivalence : (sécurité et efficacité)
Les études de bioéquivalence (obligatoires avant la commercialisation des
médicaments) constituent une garantie pour le prescripteur et le consommateur que les
médicaments génériques disponibles sur le marché sont équivalents au produit
princeps de référence.
- D’expertises médico-légales

Technique de dosage selon les différents paramètres mesurés

 Dosage immunologique par chimiluminescence sur l’ARCHTECT

Paramètres sanguins : Ciclosporine / Tacrolimus / Sirolimus : nécessitent une étape de

prétraitement manuelle « Extraction »

- Homogénéisation du l’échantillon sanguin

- Précipitation : ajout du réactif de précipitation + agitation par le vortex
- Incubation 10 minutes à 42°C (pour le Sirolimus)
- Centrifugation 4 minutes pour Ciclosporine et Sirolimus et 6 minutes pour
Tacrolimus à 4000tr/min
- Prélever et distribuer le surnagent dans un tube puis vortexer pendant 10secondes
- Analyser l’échantillon dans l’automate

Paramètres plasmatiques : Méthotrexate / Acide valproique / Carbamazépine /

Phénobarbital / Phénytoine /Vancomycine / Gentamycine / Digoxine / Théophylline.
Principe de dosage :

- Mise en contact de l’échantillon, le diluant de dosage et les microparticules

paramagnétiques recouvertes d’anticorps anti-molécule recherchée. La molécule
présente dans l’échantillon se lie aux microparticules recouvertes d’anticorps
spécifique
- Après lavage, le conjugué de la molécule marqué à l’acridinium est ajouté pour former
un mélange réactionnel
- Après un autre cycle de lavage, les solutions d’activation sont ajoutées au mélange
réactionnel
- La réaction chimiluminescente résultante est mesurée en unités relatives de lumière
(URL). Cette lumière est proportionnelle à la quantité de molécule recherchée dans
l’échantillon.

 Dosage immunoenzymatique en phase homogène sur INDIKO :

Paramètres dosés : AmiKacine / Teicoplanine

Principe de dosage : le test se base sur la compétition entre la molécule marqué par une
enzyme G6PDH et la molécule de l’échantillon pour se fixer sur un nombre déterminé de site
de liaison de l’anticorps spécifique. Si l’échantillon ne contient pas de molécule recherchée, la
molécule marquée se lie à l’anticorps et l’activité enzymatique est inhibée. Si la molécule est
présente dans l’échantillon, elle occupe les sites de liaison de l’anticorps et laisse la molécule
marqué à la G6PDH libre et active. L’activité enzymatique est déterminée par
spectrophotométrie à 340nm en mesurant sa capacité à convertir le NAD en NADH.

 Dosage immunologique et turbidimétrique sur l’INDIKO

Paramètres dosés : tricyclique / benzodiazépine

Principe de dosage : le dosage est basé sur la compétition entre le médicament présent dans
l’échantillon et la substance médicamenteuse enrobant une microparticule pour les sites de
liaison de l’anticorps spécifique du réactif. La microparticule réactive enrobée de molécule
recherchée s’agglutine rapidement en présence de l’anticorps du réactif et en absence de tout
médicament concurrent. La vitesse de changement du facteur d’absorbance se mesure par
photométrie. Si la molécule recherchée est présente dans l’échantillon, la réaction
d’agglutination est partiellement inhibée, ralentissant ainsi la vitesse de changement du
facteur d’absorption.
Contrôle qualité

 Même réactif ou nouveau réactif de même lot :

Passer un premier contrôle passer un 2ème contrôle passer un 3ème contrôle
(Si hors limite) (Si hors limite) (Si hors limite)
Faire une calibration puis passer les 3 contrôles
 Un nouveau réactif de lot différent :
Faire une calibration passer les 3 contrôles

Règles générales :
- S’il ya modification du lot du contrôle ou de réactif, inscrire la date et le numéro du lot
sur le cahier.

- Si le résultat d’un paramètre dépasse la limite supérieure de détection, il faut réaliser

une dilution et introduire le facteur de dilution dans l’automate.
  Chromatographie en phase liquide à haute performance « HPLC »

Méthode de référence : plus précise, plus sensible et pas d’imperfection

Principe : l’échantillon à analyser est injecté puis transporté au travers du système

chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre
la phase mobile (poussée par une pompe à haute pression) et la phase stationnaire (colonne).
En sortie de la colonne et grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés
par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme

Etalonnage :

Un étalonnage est nécessaire pour chaque série d’analyse afin de déterminer la

concentration exacte d’un composé dans l’échantillon à l’aide d’une courbe d’étalonnage.

Principe : l’étalonnage consiste à préparer à partir d’une substance pure une gamme
d’étalonnage (STD0 STD8) par dilution qui couvre la plage du travail (concentration
infra thérapeutique -[intervalle thérapeutique] – concentration supra thérapeutique). La
gamme d’étalonnage est ensuite analysée à l’aide d’une technique dans les mêmes conditions
que l’analyse des échantillons. La mesure de l’intensité du signal ; hauteur, aire de pic… est
mise en relation avec la concentration de substance présente dans différentes solutions de la
gamme d’étalonnage. L’équation mathématique qui relie la concentration de substance et le
signal est une droite qui va ensuite être utilisée pour convertir le signal mesurée en une
concentration lors de l’analyse d’échantillons inconnus

Méthode d’étalonnage utilisée : Etalonnage interne

Ce type d’étalonnage est utilisé lorsque l’analyse présente des problèmes de répétabilité ou de
reproductibilité
 Un étalon interne : est une substance, non contenue à priori dans un échantillon,
possédant des propriétés physicochimique aussi proche que possible de celle de
l’analyte qui doit être quantifié. Cette substance est ajoutée à l’échantillon dans
l’objectif de corriger les pertes et les effets potentiels liés à la préparation de
l’échantillon et son analyse.
 Dans ce cas, la courbe d’étalonnage est établie par le rapport des signaux (aire de la
substance d’intérêt / aire de l’étalon interne) en fonction de rapport des concentrations
(concentration de la substance d’intérêt / concentration de l’étalon interne).
Exemple :

Les différents paramètres dosés :

metronidazole / acide mycophénolique / azathioprine / isoniazide / lamotrigine / levetiracetam

/glimepiride / glibenclamide / glyclazide / glibornuride / clozapine…

Chaque série d’analyse est accompagnée par une fiche de travail qui doit comprendre :

 le nom de l’opérateur, la date d’analyse, la molécule à doser, le nombre de

prélèvement ainsi que les conditions opératoires (type de la colonne et sa longueur, la
composition de la phase mobile, le tampon et son pH, la température, la longueur
d’onde, le débit et la pression)