Toxicologie analytique

1. Définition

La toxicologie analytique c’est la mise en œuvre des techniques spécifiques pour détecter,
identifier et doser un xénobiotique à partir d’une matrice biologique ou non biologique.

(Toxicologie= la science qui étudie les substances toxiques)

2. Types de produits toxiques

Les substances toxiques comprennent les médicaments, les drogues, les gaz, les produits
chimiques, les plantes, les champignons, les aliments et le venin de certains animaux.

3. Intoxication médicamenteuse

L’intoxication médicamenteuse est une intoxication causée par la prise d’une dose élevée
d’un ou plusieurs médicaments d’une façon volontaire (suicide) ou accidentelle.

L’identification du toxique constitue un élément de la démarche diagnostique, un élément

décisionnel dans la prise en charge thérapeutique pour sauver la vie du patient.

Deux situations d’intoxication peuvent être suspectées soit par un toxique de nature connue ou
par un toxique de nature inconnue. Dans ce cas une démarche repose sur un examen clinique
puis sur des examens complémentaire des plus simples aux plus sophistiqués.

3.1. Intoxication au paracétamol

Le paracétamol est un composé chimique entièrement synthétique, aussi appelé

acétaminophène. Il est utilisé pour traiter la douleur (anti-douleur, antalgiques
ou analgésiques) et à faire baisser la fièvre (antipyrétique). Les médicaments contenant du
paracétamol sont: Dafalgan, Doliprane, Efferalgan… Un surdosage de paracétamol peut
provoquer une insuffisance hépatocellulaire, un saignement gastro-intestinal, une acidose
métabolique, une encéphalopathie, un coma et le décès. Une intoxication hépatique est
causée par un surdosage oral aigu correspond à une dose ≥ 150 mg/kg chez l'adulte en 24 h
(une boite c'est 8 grammes) et 200 mg/kg chez l’enfant.

La posologie thérapeutique du paracétamol :

Adulte : 500 à 1000 mg toutes les 6 heures sans dépasser 4 g/jour.

Enfant : 10 à 15 mg/Kg toutes les 6 heurs (ou dose poids x 4 fois/jour) sans dépasser 60
mg/Kg/jour.

90% de la dose est éliminée par les reins. Il est recommandé de ne pas dépasser 3 grammes
par jour en cas d'insuffisance rénale sévère.

3.2. Dosage sanguin du paracétamol (paracétamolémie)

Plusieurs méthodes sont utilisées pour la détection et le dosage du paracétamol parmi
lesquelles on trouve :

3.2.1. Méthodes immuno-enzymatiques :

Les méthodes immuno-enzymatiques reposent sur l’utilisation des anticorps spécifiques à la

molécule recherchée.

ELISA par compétition

La technique ELISA (enzyme-linked immunoassay) se repose sur le dosage d’un antigène en

utilisant le principe de compétition de liaison.

1. Préparation de la plaque sur laquelle sont fixés des anticorps (en défaut).
2. Mélanger et déposer les antigènes marqués et les antigènes à doser (non marqués) sur
la plaque.
3. Rincer la plaque de sorte que les antigènes non liés aux anticorps sont éliminés.

La compétition joue donc entre les antigènes marqués (en quantité connue) et non marqués
(en quantité à déterminer) pour leur liaison aux anticorps. Dans le cas où les antigènes non
marqués sont nombreux, le signal sera faible. Inversement, si la concentration initiale de
l'antigène non marqué est faible, le signal sera fort. En ajoutant le substrat, ce dernier sera
transformé en produit coloré par l’enzyme.

Figure 1 : ………………………………………………………………………….

Technique immunologique par polarisation de fluorescence

La méthode immunologique par polarisation de fluorescence est une méthode
d’immunodosage basée sur le principe d’immunocompétition (Figure 2). Le dosage est
effectué par la mesure de la fluorescence qui augmente lorsque l’antigène marquée par un
fluorophore est lié à l’anticorps. La révélation du complexe antigène-anticorps est basée sur la
différence de rotation de la lumière induite par la forme libre ou liée de la molécule marquée.
À l’état libre, la molécule marquée tourne librement et rapidement induisant une polarisation
faible. Lorsqu’il n’y a pas de molécule à doser, la molécule marquée se fixe sur l’anticoprs,
formant une grosse molécule à rotation faible, induisant une polarisation élevée de la lumière
incidente. La sensibilité de la méthode est de 0,7 mg/L.

Figure 2 : ………………………………………………………………………………

Méthodes chromatographiques

La chromatographie est une technique séparative analytique. Elle consiste à faire migrer les
constituants à séparer sur une phase stationnaire immobile, à l'aide d'une phase mobile,
liquide ou gazeuse, de nature différente

Deux types de méthodes chromatographiques existent pour le dosage du médicament :

chromatographie gazeuse et chromatographie liquide

Méthodes en chromatographie gazeuse

L’étape séparative est réalisée sur une colonne contenant une phase stationnaire liquide ou
solide tandis qu’un flux de gaz vecteur réalise l’élution des composés et les entraîne vers un
détecteur (Figure 3). Après introduction des molécules à séparer dans la colonne, les
molécules vont se répartir entre la phase stationnaire et la phase gazeuse. La séparation des
molécules va reposer sur un gradient de température appliquée à la colonne. Les molécules
ayant le plus d’affinité pour la phase stationnaire y séjournent plus longtemps, atteignant le
détecteur plus tardivement. Celui-ci produira alors un signal proportionnel à la quantité de
molécule à doser. Dans des conditions prédéfinies de chromatographie, chaque produit sera
caractérisé par un temps de rétention caractéristique de ce composé.

Figure 3 : …………………………………………………………………………………..

Méthodes en chromatographie liquide

En chromatographie liquide, appelée chromatographie liquide haute performance HPLC, une

phase mobile constituée par un mélange de solvants traverse une colonne contenant la phase
stationnaire constituée de billes de faible diamètre (le plus souvent inférieur à 5 µM) (Figure
4). La séparation des composés de l’échantillon peut être améliorée en appliquant un gradient
de solvants au sein de la phase mobile au cours de la chromatographie.

Les détecteurs les plus utilisées sont le détecteur UV-visible, à fluorescence, électrochimique,
à barrette de photodiodes permettant l’acquisition du spectre UV complet de la molécule
détectée et donc une meilleure spécificité et la spectrométrie de masse alliant là encore
spécificité et sensibilité. La sensibilité de cette technique est de l’ordre de 0,1 mg/L.
Figure 4 : ……………………………………………………………………………………..
Spectrométrie UV

Ce dosage spectrophotométrique du paracétamol repose sur la capacité qu'a le 3-nitro 4-

hydroxyacétanilide, produit par la réaction du paracétamol en milieu acide avec les ions
nitrites, de prendre une teinte jaune orangé en milieu alcalin (Figure 5) et d'avoir un maximum
d'absorption spécifique à 405 nm. Cette méthode longue est assez sensible (5 mg/L). La
paracétamolémie est déterminée par référence à une courbe d'étalonnage obtenue grâce à une
gamme de solutions de paracétamol pur de concentrations connues.

Figure 5 : Réaction du paracétamol avec les ions nitrites et du 3-nitro 4-hydroxyacétanilide

produit avec les ions hydroxydes
3.3 Evaluation du risque hépatotoxique
Le nomogramme de Rumack et Matthew constitue le principal outil d’évaluation du risque
d’hépatotoxicité en cas d’intoxication aiguë (Figure 6). Elaboré rétrospectivement à partir
d’observations cliniques pédiatriques, le nomogramme prédit le risque d’hépatotoxicité en
fonction des concentrations sériques de paracétamol et de l’intervalle de temps depuis
l’ingestion. Deux lignes obliques partagent le graphique en trois zones (risque probable,
possible et non toxique).
Trois conditions sont requises pour utiliser le nomogramme et apprécier le risque
d’hépatotoxicité : dans le cas d’une surdose de ; connaître exactement l’heure de l’ingestion ;
disposer d’une paracétamolémie mesurée au-delà de 4ème heure.

-Risque d'hépatite mortelle si la paracétamolémie est supérieur ou égal à 300 mg/l à la 4 ème
heure et 45 mg/l à la 15èmeheure ;
-Risque d'hépatite grave si la paracétamolémie est supérieure ou égale à 200 mg/l à la 4 ème
heure et 30 mg/l à la 15èmeheure ;
-Absence de risque si la paracétamolémie à la 4 ème heure est inférieur à 150 mg/l est inférieur
à 25 mg/l la 15èmeheure.
 Intérêt thérapeutique : Cela permet de poser l'indication du traitement.
 Figure 6: Nomogramme de Rumack-Matthew

Exercice 1 :

Définir les termes suivants : toxicologie analytique, xénobiotique, paracétamol,

paracétamolémie,

Exercice 2 : Définir le nomogramme de Rumack-Matthew et citer les conditions de son

utilisation

Exercice 1 :

Le dosage spectrophotométrique du paracétamol a été effectué sur le sang de 2 patients. Nous

désignons par C1 la concentration en paracétamol dans le sang du patient N°1 et par C2 la
concentration en paracétamol dans le sang du patient N°2. Les prélèvements du sang ont été
réalisés à 5 h après ingestion du paracétamol pour le patient N°1 et 10h après ingestion du
paracétamol pour le patient N°2.

1) Tracer une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la concentration (Tableau

1) (Figure 7)

2) Déterminer les concentrations en paracétamol C1 et C2 dans les sérums de 2 patients à

partir de la courbe d’étalonnage (Figure 7).

3) Evaluer le risque hépatotoxique chez les deux patients selon le nomogramme de

RUMACK-MATTHEWS

Tableau 1 : Résultats des absorbances mesurées à 405 nm.

Gamme étalon Echantillon

Concentration (mg/l) 0 50 100 200 400 C1 C2
Absorbance à 405 nm 0 0,04 0,1 0 ,2 0,5 0,7 0,02

0.8
0.7
0.6
Absorbance (405nm)

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentration en paracétamol (mg/l)

Figure 7: Courbe d'étalonnage du paracétamol

dans le sang des deux patients