République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de

l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologiques

Module de
ENZYMOLOGIE APPLIQUEE

Présenté par
HAMMOUDI Roukia

Master I Biochimie appliquée

 Ce cours est conçu pour les masters biochimie. Il permet aux étudiants
d’approfondir leurs connaissances sur les notions de base de l'enzymologie et les
applications des enzymes dans différents domaines.

Ce travail comporte cinq chapitres, le premier chapitre présent les propriétés

générales sur les enzymes. Le deuxième chapitre est consacré à l’étude des techniques
d'isolement et de purification des enzymes. Le troisième chapitre se rassemble sur les
méthodes de dosage des métabolites par des enzymes. Le quatrième chapitre présent
l'intérêt des enzymes immobilisées et leurs modes d'utilisation. Le dernier chapitre
illustre quelques applications d’enzymes en agroindustriel ou en médecine.

Afin, d’approfondir les connaissances des étudiants, chaque chapitre est clôturé
par des travaux appliqués (TP) disponibles dans notre faculté. Ses travaux sont intitulés
comme suit :
- Extraction de l’invertase et étude de leur action catalytique.
- Action de l'amylase.
- Coagulation de lait par des enzymes.
- Effet de PH et de température sur la réaction enzymatique.
- Dosage de quelque enzyme médicale.

Table des matières

I. Généralités sur les enzymes 03
I.1.- Structure des enzymes 05
I.2.- Conformation des enzymes 05
I.2.1.-Enzyme monomérique 05
I.2.2.-Enzyme oligomerique 05
I. 3.- Allosterie 05
I.3.1.- Coopérativité positive chez les enzymes oligomerique 05
I.3.2.- Coopérativité négative chez les enzymes oligomerique 06
I.4.- Isoenzymes 07
I.5.- Zymogènes 07
I.6.- Complexe multienzymatique 07
I.7.- Cofacteur 08
I.8.- Classification et nomenclature des enzymes 10
I.8.1.- Nomenclature fonctionnelle. 10
I.8.2.-Nomenclature et classification officielle par I’IUBMB (= 10
International Union of Biochemistry and Molecular Biology)
II. Isolement et purification des enzymes 15
II.1.- Méthodes d’extraction 16
II.2.-Méthode de fractionnement 17
II.3.-Méthode de purification 18

2
II.4.- Contrôle de qualité 18
III. Dosage des métabolites par des enzymes 19
III.1.- Méthodes de dosages enzymatiques 21
III.1.1.- Méthode au point final (End Point) 21
III.1.1.1.- Méthode chimique 21
III.1.1.2.- Méthode enzymatique 22
III.1.2.- Méthode cinétique (méthode de la vitesse initiale) 24
III.2.- Règles à respecter pour réaliser un dosage enzymatique 26
III.3.- Dosages immunoenzymatiques 26
III.3.1.- Méthodes enzymatiques :Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 27
(ELISA)
III.3.1.1.- Types d'ELISA 29
III.3.1.1.1.- ELISA indirect 29
III.3.1.1.2.-ELISA direct (Sandwich) 30
III.3.1.1.3.- ELISA Compétitif 30
III.3.1.2.-Application de technique ELISA 33
III.3.2.-Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) 33
III.3.3. Immunocytochimie (ICC) 35
III.3.3.1.-Enzymes utilisées dans l'immunocytochimie 36
III.3.3.2.-Application des techniques immunocytochimies 37
IV. Enzymes immobilisées 37
IV.1.- Méthodes d'immobilisation des enzymes 37
IV.2.- Propriétés des enzymes immobilisées 38
IV.3.- Domaines d'applications des enzymes immobilisées 38
V.- Quelques applications d’enzymes en agroindustriel ou en médecine 39
Travaux pratiques

3
4
I. Généralités sur les enzymes
Un catalyseur est une espèce qui augmente la vitesse d'une transformation, sans
figurer dans l'équation de la réaction et sans modifier la composition du système à l'état
final. »
Molécule qui, en petite quantité, accélère la vitesse d'une réaction et qui revient à sa
forme initiale à la fin de la réaction. Les enzymes sont des catalyseurs biologiques.
Enzyme : Protéine présentant des
propriétés de catalyse spécifiques d’une
réaction chimique du métabolisme de l’être
vivant qui la produit.
- L’enzymologie est l’étude des enzymes.
-Le substantif « enzyme » est du genre
féminin.
-Toutes les enzymes sont des protéines.
-Les protéines enzymatiques sont des
catalyseurs, c’est-à-dire qu’en agissant à
des concentrations très petites, elles
augmentent la vitesse des réactions
chimiques, sans en modifier le résultat.
A la fin de la réaction la structure de
- l’enzyme se retrouve inchangée.

Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction, c’est-à-dire qu’elle catalyse
toujours la même transformation, se produisant sur les mêmes corps chimiques
initiaux.
Par exemple, le demi-temps de désamination de l'adénosine à 20°C et à pH7 est
d'environ 20000 ans ! Seule l'intervention d'un catalyseur biologique, une enzyme, le
permet. Une enzyme augmente la vitesse de la réaction en abaissant l'énergie
d'activation : à la même température, les substrats franchissent plus facilement et
donc plus fréquemment la barrière d'activation, comme le montrent le tableau suivant:

Tableau : accroissement de vitesse de quelques réactions par les enzymes.

Les protéines enzymatiques sont synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse
est déterminée génétiquement : sa conservation dans le génome est favorisée par le
besoin qu’éprouve cet être vivant de faire cette réaction.

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I.1/Structure des enzymes
Les enzymes sont des protéines globulaires, la forme en globule permet de placer au
cœur de la structure des acides aminés à chaines latérale hydrophobe, donc apolaire et
vers l’extérieur des acides aminés hydrophiles, au contact de l’eau.
L’activité de certains enzymes est uniquement due à la structure protéique
(holoprotéines) exemple : Ribonucléases catalysent la dégradation de l'ARN.
Certains enzymes possèdent une partie protéique (apoenzyme) et une partie non
protéique (cofacteur). Holoprotéines = apoenzyme + cofacteur.
Cette structure globale de la macromolécule permet à une région particulière,
(souvent enfoui au sein de la protéine), d'adopter elle aussi une structure spatiale qui est
reconnue par le ligand spécifique de la protéine (et, le cas échéant, par un petit nombre de
molécules dont la structure est proche de celle du ligand). le site actif.
I.2.- Conformation des enzymes
I.2.1.-Enzyme monomérique : une seule chaine polypeptidique, le nombre d’acide
aminé varie entre 100-300. Exemples : Lysozymes (129résidus), Trypsine (223 résidus),
Ribonucléase (124résidus).
I.2.2.-Enzyme oligomerique (homopolymérique, hétéropolymérique): association de
plusieurs sous unités élémentaires ou protomère le nombre de ces protomère varie de 2 à
60 et leur association ce fait avec des liaisons faibles. Exemples : Lactate
déshydrogénase (4 protomères), Glutamate déshydrogénase (8 protoméres).
I.3.- Allosterie : Propriété de certaines protéines actives qui peuvent changer de structure
spatiales lorsqu’elles se lient à un effecteur en un site différent du site actif, cette liaison
se traduisant par une modification de l’activité. Allos : signifie « autre » : autre site qui
fixe un ligand allostérique capable de moduler la vitesse de la réaction (avec
modification de la conformation de l’enzyme).
I.3.1-Coopérativité positive chez les enzymes oligomerique : La fixation de premier
substrat augmente l’affinité pour un deuxième substrat.
Exp : l’hémoglobine

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 La myoglobine est une protéine qui transporte l'oxygène dans le cytoplasme des
cellules. Elle est constituée d'une seule chaine d'acides aminés. Sa vitesse de transport de
l'oxygène en fonction de la pression de ce gaze, est de type michaélien et la courbe qui la
représente est une hyperbole.
L'hémoglobine est une protéine qui transporte l'oxygène dans les globules rouges.
Elle est constituée de quatre chaines d'acides amines. Sa vitesse de transport de l'oxygène
en fonction de la pression de ce gaze, est allostérique et la courbe qui la représente est
une sigmoide. La coopération entre les protomères confère a l'hémoglobine une grande
affinité pour l'oxygène dans les poumons où il est abondant, et au contraire une faible
affinité pour l'oxygène dans les tissus où il est transmis aux cellules.
L'hémoglobine a donc un comportement différent d'un organe à l'autre lorsque les
pressions d'oxygène sont différentes. Cette protéine s'adapte mieux aux conditions du
milieu grâce à l'allostérie.
La cinétique est non michaelienne car la représentation de leur vitesse en fonction
de la concentration en substrat donne une sigmoïde au lieu de l’hyperbole michaelienne.
I.3.2-Coopérativité négative chez les enzymes oligomerique
La fixation de la première molécule empêche la fixation de la suivante molécule
jusqu'a la formation de produit.

Exp: La phosphatase alcaline de E .coli est formée de deux sous unités identiques du
poids moléculaire 40000 chacune, chaque sous unité comporte un centre actif au quel
participent deux atomes de zinc. L’enzyme catalyse l’hydrolyse des esters phosphoriques
selon un mécanisme de flip-flop (proposé par LAZDUNSKI)

7
I.4. Isoenzymes
Certains enzymes existent sous différentes formes moléculaires ils sont toujours
oligomerique.
Exp: Lactate déshydrogénase : Existe sous cinq formes, le poids moléculaire est
identique avec quatre sous unités (un tétramères), leurs localisations tissulaires et les
cinétiques des réactions quelles catalysent sont différentes.

M4..……………………………..………LDH-5
Foie et
M3H1…………..…..………………….LDH-4
muscle
Cœur,
M2H2…………..……….……………..LDH-3
rein et
MH3……………………………………..LDH-2
cerveau
H4………………………..……………….LDH-1
I.5 Zymogènes
Quelques enzymes sont synthétisé sous forme de précurseurs inactifs appelés
zymogènes ou pro enzyme. Les zymogènes ne deviennent actifs qu’après la coupure
spécifique d’une ou de plusieurs liaisons peptidiques.
Exp: la chymotrypsinogéne (enzyme protéolytique)

Figure : Activation protéolytique de chymotrypsinogéne

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I.6. Complexe multienzymatique
Certains enzymes dune voie métabolique sont réunis et forment un complexe
multienzymatique distinct ou le substrat est séquentiellement modifié en passant d’un
enzyme à l’autre selon le schéma cette organisation présente l’avantage que les
intermédiaire ne peuvent pas se perdre par dilution ou diffusion
Exp: Pyruvate déshydrogénase (PDH)

I.7. Le cofacteur
Certain enzymes nécessitent pour leurs fonctionnement la présence des groupements
non protéiques:
- Ion métallique : exemples : Fe+ (Catalases), Zn+ (carboxypeptidases)
- Coenzyme : Phosphate de pyridoxal, thiamine. Ces cofacteurs se trouvent soit de
type Cosubstrat ou Groupement prosthétique
I.7.1- Caractère communs à tous les coenzymes
- Ne sont pas de nature protéique; - Thermostable; - Molécules organiques de petit poids
moléculaire (composé nucléotidiques, hématinique…..); -Le coenzyme réagit molécule à
molécule avec le substrat ils apparaissent quantativement dans la stœchiométrie de la
réaction; - Beaucoup de coenzymes sont des dérives des vitamines.
I.7.2-Caractère non communs à tous les coenzymes

9
- Le groupement prosthétique est solidement lie à l’apoenzyme correspondant par des
liaisons covalentes; -Le cosubstrat est faiblement lié à l’apoenzyme correspondant et il ne
retrouve jamais sont état initial en restant fixé à l’apoenzyme.
Tableau -Principaux cofacteurs enzymatiques

Cofacteurs Enzymes
Coenzyme
Thiamine pyrophosphate Pyruvate dehydrogenase
Flavin adenine nucleotide Monoamine oxydase
Nicotinamide adenine dinucleotide Lactate dehydrogenase
Pyridoxal phosphate Glycogen phosphorylase
Coenzyme A CoA Acétyl CoA carboxylase
Biotine Pyruvate carboxylase
5 deoxyadenosyl cabalamine Methylmalonyl mutase
Tetrahydrofolate Thymidylate synthase
Métal
Zn2+ Carbonic anhydrase
Zn2+ Carboxypeptidase
Mg2+ EcoRV
Mg2+ Hexokinase
Ni2+ Urease
Mo Nitrate réductase
Se Glutathione peroxydase
Mn Superoxyde dismutase
K+ Propionyl CoA carboxylase

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I.8. Classification et nomenclature des enzymes
Un certain nombre d’appellations traditionnelles subsistent, mais l’emploi des
numéros de code (Enzyme commission, codification internationale) est aujourd’hui
obligatoire dans toutes les publications scientifiques et les documentations techniques et
commerciales.
1) Nomenclature fonctionnelle
L’ordre de la composition du nom:
i) Réaction à 1 substrat
a) Le nom du substrat
b) Le type de réaction catalysée
c) le suffixe ase
Ex. - glucose-6-phosphate isomérase
- isocitrate lyase
- pyruvate carboxylase
ii) Réaction à 2 substrats (→ transférases)
a) Le substrat donneur
b) Le substrat accepteur
c) Le type de réaction
d) Le suffixe ase
Ex.
- ATP-glucose phosphotransférase
- Glutamate pyruvate aminotransférase.
2) Nomenclature et classification officielle par I’IUBMB (= International Union of
Biochemistry and Molecular Biology) http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
Numéro EC : comporte 4 nombres séparés par des points et précédé de EC (Enzyme
Commission numbers : la Commission des enzymes):
EC X1 . X2 . X3. X4
X1 : type de réaction
X2 : sous classe de l’enzyme suivant son mécanisme d’action
X3 : nature du cible (substrat = accepteur/liaison etc)
X4 : identifiant de la cible
X1: Le premier nombre pouvant varier de 1 à 6 indique le type de réactions
1 : Oxydoréductases (transfert d'électrons, d’atomes d’hydrogène ou fixation d’oxygène)
2 : Transférases (transfert d'atomes ou de groupes d'atomes autres que ceux 1)
3 : Hydrolases (Coupure des liaisons avec fixation de radicaux H et OH issus de l’eau)
4 : Lyases (Coupure des liaisons par d'autres modes autres que l'hydrolyse).
5 : Isomérases (réaction conservant la formule brute du composé)
6 : Ligases (formation des liaisons entre molécules en utilisant l'énergie de l'ATP)
X2 : Le deuxième désigne la sous-classe de l'enzyme qui est définie suivant son
mécanisme d'action.
X3 : Le 3e nombre désigne la nature de la molécule qui sert d'accepteur, lorsqu'il s'agit
d'un transfert d'électrons.

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X4 : Le 4e nombre est un numéro d'ordre dans le groupe. Lorsqu'une enzyme se
termine par 99, cela signifie qu'elle est incomplètement caractérisée.
X1 : type de réaction
1 : Oxydoréductases (transfert d’électrons, d’atomes d’hydrogène ou fixation
d’oxygène)
Ex.

Ex. : oxydases (O2 → H2O ou H2O2 est accepteur d’e-), réductases, peroxydases,
oxygénases (transfert d’oxygène sur le substrat), hydrogénases( 2H + → H2),
déshydrogénases (oxydation du substrat par le transfert d'un ou plusieurs ions H+ à un
accepteur (coenzyme NAD+ ou FAD+).
Nom formel: - donneur- accepteur oxydoréductase- donneur déshydrogenase
2 : Transférases (transfert d’atomes ou de groupes d’atomes). Les groupes transportés
sont : le méthyle (-CH3), l'hydroxyméthyle (-CH2OH), Carboxyle (-COOH), groupement
carboné comportant des fonction aldéhydes ou cétones (-CHO) ou (-CO-R), groupe
acyle, groupe osidyle, amine, phosphoryle, etc...

3 : Hydrolases (coupure réversible des liaisons ester, éther, peptidique, glycosique, ou C-

C par hydrolyse (utilisation d’H2O).

4 : Lyases : Coupure des liaisons chimiques par d’autres modes que l’hydrolyse ou
l’oxydation. Ils produisent souvent des liaisons doubles ou des structures cycliques
Ex. carboxylases (fixation d’un groupe CO2 ou d’un groupe carboxyle COOH)
5 : Isomérases : réarrangement structural des isomères.
6 : Ligases : jonction de deux molécules (en anglais ligation) par de nouvelles liaisons
covalentes avec hydrolyse concomitante de l'NTP (ATP ou d’autres)
X1 : Oxydoréductase :
EC 1.1: oxydoréductases qui utilisent le groupe CH-OH group comme donneur
d’électrons (alcool oxydoreductases)
EC 1.1.1 NAD+ ou NADP+ sont les accepteurs d’électrons
EC 1.1.1.1 Alcool déshydrogenase (alcohol:NAD+ oxydoreductase) : ADH
CH3-CH2OH + NAD+ ¬¾® CH3-CHO + NADH,H+
EC .1.1.1.37 Malate déshydrogénase
HOOC-CH2-CHOH-COOH + NAD+ ¬¾® HOOC-CH2-CO-COOH + NADH,H+
EC 1.1.2 les cytochromes sont les accepteurs d’électrons
EC 1.1.2.3 L-Lactate : ferricytochrome C oxydoréductase
Lactate+ 2Cyt Fe+3 ¬¾® pyruvate + 2Cyt Fe+2
EC .1.1.3 avec l’O2 comme accepteur
EC .1.1. 3.4 Glucose oxydase ou D Glucose : oxygène oxydoréductase
D Glucose + oxygène ¬¾® glucono1-5 lactone + H2O
EC 1.2: Oxydoréductases qui utilisent le groupe C=O group (aldéhyde ou cétone)
comme donneur d’électrons.

12
- Aldéhyde déshydrogénase (EC 1.2.1.3.)
R-CHO + NAD+ + H2O ¬¾®R-COOH + NADH,H+
- Glycéraldéhyde 3-è déshydrogénase (EC 1.2.1.12)
è-O-CH2-CHOH-CHO + NAD+ + Pi ¬¾® è-O-CH2-CHOH-COO~è + NADH,H+
- Pyruvate déshydrogénase (EC 1.2. 1. 4)
CH3-CO-COOH + HSCoA + NAD+ ¾® CH3-CO~SCoA + CO2 + NADH,H+
EC 1.3: Oxydoréductases qui agissent sur le groupe CH-CH
- Acyl-CoA déshydrogénase (EC 1.3.99.3)
R-CH2-CH2-CO~SCoA + FAD ¬¾® R-CH=CH-CO~SCoA + FADH2
EC 1.4: Oxydoréductases qui agissent sur le groupe CH-NH
L-Glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.3)
Glutamate + NAD+ + H2O ¾® a-cétoglutarate + NH3 + NADH,H+
EC 2. Transférase
EC 2.1 transférant un groupement monocarboné C1
EC 2.1.1 Méthyl transférase
Protéines -N-méthyl transférase (EC 2.1.1.23) : elles méthylent les résidus basiques
comme arginine et la lysine dans des protéines spécifiques.
- ARNt-méthyl transférases (EC 2.1.1.29) : elles méthylent les résidus cytosine du ARNt.
- ADN-méthyltransférases (EC 2.1.1.37). La méthylation porte sur la cytosine du DNA.
EC 2.1.2 Hydroxyméthyl transférase
EC 2.1.2.1 L Sérine tétrahydrofolate 5,6 Hydroxyméthyl transférase
EC 2.1.3 Carboxyl transférase et carbamyl transférase glycérol 3-phosphate
acyltransférase (EC 2.3.1.1).
acyl-CoA + glycérol 3-è ¾® Acylglycérol 3-è + HSCoA

EC 2.2 aldéhyde ou cétone transférase

EC 2.3 Acyl transférase
EC 2.4 Glycosyle transférase
- Glycogène phosphorylase (EC 2.4.1.1)
glycogène(n) + ATP ¾® glycogène (n-1) + glucose 1-è + ADP

EC 2.6 transférase des groupements azotés

- Aspartate aminotransférase (EC 2.6.1.1)
Aspartate + a-cétoglutarate ¾® oxaloacétate + glutamate
- Alanine aminotransférase (EC 2.6.1.2)
Alanine + a-cétoglutarate ¾® pyruvate + glutamate .
EC 2.7 transférase des groupements phosphate
Glucokinase b/(EC 2.7.1.2)
-Hexokinase (EC 2.7.1.1)
- Phosphofructokinase ou fructose 6-è kinase (EC 2.7.1.4)
Sur les lipides
- Glycérol kinase (EC 2.7.1.30)
Sur les molécules aminées
- Créatine kinase (EC 2.7.3.1)
ATP + créatine ¾® Phosphocréatine + ADP
Sur les nucléosides et les nucléotides

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- Adénosine kinase (EC 2.7.1.20)
ATP + Adénosine ¾® ADP + AMP
- Adénylate kinase (EC 2.7.4.3)
ATP + AMP ¾® 2 ADP
EC 2.7.7 Nucleotidyltransferases
EC 2.7.7.53 ATP adenylyltransferase (ADP:ATP adenylyltransferase)
EC 2.7.13.3 histidine kinase (ATP:protein-L-histidine N-phosphotransferase)
3. Hydrolases
- Hydrolases des glucides
a-glucosidases, ß-glucosidases, ß-galactosidases, les a-amylases.
- Hydrolases des esters phosphoriques d'oses
On y rencontre les phosphatases qui enlèvent le groupement phosphorique. Leur rôle est
inverse de celui des kinases :
- Glucose 6-phosphatase
Glucose 6-è + H2O ¾® Glucose + Pi
- Glucose 1-phosphatase
Glucose 1-è + H2O ¾® Glucose + Pi
- Fructose 1,6 bisphosphatase
Fructose-1,6-bisè + H2O ¾® Fructose 6-è + Pi
- Hydrolases agissant sur les nucléosides, nucléotides et acides nucléiques
Nucléosidases
- Les Nucléosidases (EC 3.2.2.1) Elles clivent les liaisons N-osidiques
N-ribosyl-purine + H2O ¾® purine + ribose
- AMP-nucléosidase (EC 3.2.2.4)
AMP + H2O ¾® Adénine + ribose phosphate
EC 3.4.21 Serine endopeptidase (Serine protéase) :
120 enzymes différents connus : EC 3.4.21. 1..120
Ex. : EC 3.4.21.1. chymotrypsine: Coupure des protéines au niveau de la liaison
carboxylique de la Tyr, Ser, Phe et Leu. Ces acides aminés non-polaires créent une poche
hydrophobe nécessaire à l'activité enzymatique. La serine sert comme acide aminé
nucléophilique (groupe "riche" en électrons) dans le site actif.
Les lipases pancréatiques exercent leurs actions au niveau de l’interface eau-huile
(enzymes hydrosolubles) et libèrent des AG et un glycerol.
- Phospholipase A1 (EC 3.1.1.32) enlève l'acide gras lié à la fonction alcool primaire du
glycérol
- Phospholipase A2 (EC 3.1.1.4) enlève l'acide gras lié à la fonction alcool secondaire
du glycérol
- Phospholipase C (EC 3.1. 4.11) intervient sur la fonction ester liant le glycérol et le
Phosphate.
- Phospholipase D (EC 3.1.4.4.) sépare l'acide phosphatidique de l'alcool.

4. Lyases ou Synthases
On y trouve les enzymes suivantes : décarboxylases, lyases proprement dites, synthases,
hydratases, déshydratases, etc...
- Décarboxylases Le produit de réaction après le départ de CO 2 est un carbonyle ou une
amine

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- Acétoacétate décarboxylase (EC 4.1.1.4)
Acétoacétate ¾® Acétone + CO2
- Lysine décarboxylase (EC 4.1.1.18)
Lysine ¾® cadavérine + CO2
- Aldéhydes-lyases Les enzymes font apparaître une liaison aldéhyde à la suite du clivage
d'une liaison -C-C dont l'un des carbones porte une fonction alcool secondaire.
Fructose 1-6 bisphosphate aldolase EC 4.1.2.13
fructose 1-6 bisè ¾® 3-èdihydroxyacétone + 3-èglycéraldéhyde
- Acyl-lyases ou Acylsynthase
3-Hydroxy 3-méthyl glytaryl-CoA lyase (EC 4.1.3.4)
3-Hydroxy 3-méthyl glytaryl-CoA Acétoacétate + Acétyl-CoA
- Citrate synthase (EC 4.1.3.7) On l'appelle aussi enzyme condensante.
Oxaloacétate + acétyl-CoA + H2O ¾® Citrate + HSCoA
- Hydratases et déshydratases
Elles fixent ou enlèvent une molécule d'eau, à ne pas confondre avec une hydrolase
R-CHOH-CH2-R' ¬¾® R-CH=CH-R' + H2O
On trouve dans ce groupe :
- la fumarase ou fumarate hydratase (4.2.1.2) fumarate en L-malate
HOOC-CH=CH-COOH + H2O ¬¾® HOOC-CH2-CHOH-COOH
- l'énolase (4.2.1.11)
2-phosphoglycérate ¬¾® Phosphoénolpyruvate + H2O
5. Isomerases
Elles catalysent des changements de structure dans une même molécule sans changer sa
formule globale (isomérisation Cis-trans, épimérisation, déplacement de radicaux, etc.
- Epimérisation
- Ribulose 5P 3-épimérase (EC 5.1.3.2) enzyme de la voie des pentoses phosphate
D-ribulose 5-è ¬¾® D-xylulose 5-phosphate
- UDP glucose 4-épimérase ¬¾® UDP galactose
UDP glucose 4¬¾® UDP galactose
- Oxydoréduction intramoléculaire
- triose phosphate isomérase (EC 5.3.1.1)
dihydroxyacétone phosphate ¬¾® D-glycéraldéhyde-3-phosphate
- Glucose 6-phosphate isomérase (EC 5.3.1.10)
D-Glucose-6-phosphate ¬¾® D-fructose-6-phosphate.
- Transport de radicaux
Phosphoglycérate mutase (EC 5.4.2.1)
3-phosphoglycérate ¬¾® 2-phosphoglycérate.
Méthyl malonylCoA carboxymutase (EC 5.4.99.2)
L-méthylmalonyl-CoA¬¾® succinyl-CoA
6. Ligases (Synthétases)
Elles forment des liaisons C-C, C-N, C-S, C-O, O-P grâce à l'utilisation de l'énergie
fournie par l'hydrolyse concomitante d'un groupement phosphate ou pyrophosphate de
l'ATP
- Ligases formant les liaisons C-O
On connaît les ligases des synthèses protéiques et des acides nucléiques.
- Ligase formant des liaisons C-C
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 - Pyruvate carboxylase (EC 6.4.1.1)
Pyruvate + CO2 + ATP ¾® Oxaloacétate + ADP + Pi
- Acétyl CoA carboxylase
- Propionyl CoA carboxylase (EC 6.4.1.3)
- Ligases des liaisons C-S
- Acétyl CoA synthétase (EC 6.2.1.1)
ATP + Acétate + HSCoA ¾®Acétyl CoA + AMP + P-P
- Acyl CoA synthétase (EC 6.2.1.2) agit sur les acides gras à longue chaîne de
carbone.
R-COOH + ATP + HSCoA ¾® R-CO-SCoA + AMP + P-P
- Ligases des liaisons C-N
- Glutamine synthétase (EC 6.3.1.2)
ATP + glutamate + NH3 ¾® ADP + H3PO4 + Glutamine
- 5-phosphoribosylamine synthétase (EC 6.3.4.7)
ATP + ribose 5-phosphate + NH3 ¾® 5-phosphoribosylamine + ADP + H3PO4

II. Isolement et purification des enzymes

1- Purification des enzymes

 Les enzymes se sont les catalyseurs les plus efficaces
 Ils sont plus cherchés dans différentes domaines : biocatalyse, industrielle,
synthèse des antibiotiques, fermentation, technologie alimentaire, chimie de
bioconcervation et application pharmaceutique
 L’objectif de produire des protéines définis, il est d’une part indispensable de
disposer : méthodes spécifique et sensible pour mesurer l’activité catalytique
 L’enzyme doit être isolé et de trouver la matière première (la plus riche). Il est
nécessaire de déterminer :
- La connaissance des caractéristiques de la matière première (sa structure "liquide,
solide", son type général « animal, végétal, microbien » et sa structure biologique
(cellulaire ou tissulaire)
- La localisation du produit cherché (mitochondrie, cytoplasme…) et ses
principales propriétés structurale et physico-chimique (PH, T optimale, poids
moléculaire, constant cinétique, activateurs, inhibiteurs…).
- La libération sous forme soluble sans détérioration.
- Le travail à des températures 4°C, les appareils réfrigérés et les réactifs froids,
dans les milieux tamponnés contenant ou non des agents protecteurs (E DTA, substrat, 2
mercaptoéthanol…)

Dans la majorité des cas, la matière première est extrêmement hétérogène et il est
pratiquement impossible d’isoler une molécule suffisamment purifie en une seule étape.
Il faut faire appel à certaines opérations adaptées.

1er étape : Extraction :

16
Donnant un mélange de molécule sous forme soluble possédant un même comportement
physico-chimique.

2ème étape : Fractionnements :

On jouant sur la différence de solubilité pour obtenir une famille moléculaire.

3ème étape: Purification :

Par des méthodes physico-chimique ou bio spécifique plus fines conduisant à une
molécule pure.

II.1.-Méthodes d’extraction

Les principales sources d’enzymes sont d’origine microbienne, végétale ou animale. Mais
les cellules microbiennes sont les plus utilisées. Il faut choisir une bonne souche, un bon
milieu de culture avec ou non des additifs nutritifs, bien détermine et les conditions (PH,
T, O2, lumière), Cherche des mutants ne produisent pas des répresseurs.

- Selon la localisation dans la cellule, les enzymes sont classées :

Extracellulaire (exo enzyme):Synthétisée à l’intérieur, puis secrètée à l’extérieur
de la cellule.
Intra enzyme (endo enzyme):Synthétisée à l’intérieur des cellules sous forme des
agrégats. Leur extraction est plus difficile.

- L’extraction consiste à la libération des enzymes des cellules ou constituant

cellulaire, nécessitant donc un éclatement de la paroi ou de la membrane cellulaire
par procèdes mécaniques ou physico-chimiques

1-1 - Procèdes mécaniques ;

Sonication : bain ultrasons, l’application des ultrasons dans un liquide crée le phénomène
connu des cavitations, des chocs constituent les éléments de destruction des tissus
cellulaire: attaque de la structure cellulaire + lyse.

Congelation_décongelation : Suite à un refroidissement brusque et à la concentration du

soluté intra et extracellulaire, la formation des cristaux extra et intra cellulaire entraine
des cassures dans la cellule (limité par faible rendement)

Broyage ou agitation : utilisé pour les trois sources d'enzymes.

Homogénéisation à haut pression : exemple de homogénéiseur APV Manton Gaulin :

French press.

1 2- Procédés non mécaniques :

17
Lyse enzymatique : protéolyse ou lysozyme, catalysant l'hydrolyse des liaisons beta 1-4
glycosidique des peptidoglycanes, responsible de la régidité de la cellule bactérienne
(Gram + et -), permet l'extraction de phosphatases alcaline inductible de E. coli.

Lyse chimique : traitement alcalin (EX : L. Asparaginase extraite à PH 12 pendant 20

min) permet l’hydrolyse de la membrane mais tout dépend de la stabilité de l’enzyme
cherchée à ces PH.

Utilisation des détergents ioniques (Laurylsulfate de sodium), ou non (Tween, Tritons),

faible force ionique, se combine avec les lipoprotéines, constitues des membranes
biologiques, pour former des micelles

Choc osmotique

Extraction par solvant : les solvants les plus utilisés sont les alcools, butanol, acétone,
les solvants lipidiques.

Les solvants affaiblissent les liaisons entre les protéines et l’eau, donc provoque
l'agglomération et précipitation des protéines. Mais ces solvants sont toxiques.

II.2.-Méthode de fractionnement : Divers techniques sont utilisées :

II.2.1. Précipitation : Ces méthodes reposent sur la différence de la solubilité des

protéines. C’est un procédé par le quelle l’addition d’un réactif ou un changement de
condition provoque le passage des protéines de l’état soluble à l’état insoluble. Divers
techniques de précipitations sont utilisées :

Précipitation aux PHi

Ultrafiltration

Traitement par chaleur

Précipitation par sel : les sels à forte concentration EX : sulfate d’ammonium à 4M agit
sur les molécules entourant l protéine d’échange les forces électrostatistique assurant leur
sensibilité, l’inconvénient provoque la corrosion de matériel utilise

Précipitation par solvant organique ; l’alcool et l’acétone

Précipitation par des polymères : PEG

Précipitation par l’acide trichloracétique

II.2.2- Méthode d'extraction liquide –liquide: Si l’espèce à extraire est initialement

contenue dans une solution aqueuse (dans de l’eau), on ajoute un solvant organique dans
lequel elle est plus soluble. L’espèce chimique est extraite de la solution aqueuse et se

18
retrouve majoritairement dans le solvant d’extraction. Le solvant doit être non miscible
avec l’eau. L’extraction est réalisée dans une ampoule à décanter. Les 2 phases sont
disposées l’une sur l’autre en fonction de leur densité. La phase la moins dense constitue
la phase supérieure et la plus dense la phase inférieure.

II.2.3- Méthode chromatographique : de colonne et d’adsorption, chromatographie

filtration sur gel : ces méthodes ne fait pas appel à la propriété physicochimique, mais a
une interaction moléculaire de constituants c'est-à-dire la capacité de fixé d'une façon
réversible et spécifique (liaison entre ligand et enzyme est fragile non covalente pour les
séparations a une autre molécule appelé ligand. Se ligand attaché covalentiellement avec
le support.

II.3-Méthode de purification

On utilise la méthode à haute résolution EX : filtration sur gel, chromatographie

d’échange d’ion, d’affinité, HPLC, électrophorèse et cristallisation

II.4- Contrôle de qualité

D’autre application il est souvent nécessaire d’utiliser les enzymes extrêmement pures,
dans ce cas une qualité de préparations dépend de la pureté, stabilité et activité

La pureté enzymatique : sera vérifier par la mesure de l’activité spécifique de l’enzyme

(activité biologique/ poids en protéine). Il faut donner des informations sur les activités
des enzymes contaminants et exprime en pourcentage de l’activité spécifique de
l’enzyme pure.

La stabilité : la forme de commercialisation de l’enzyme est se forme de concentré

liquide stabilisé ou un solide stable. Cette formulation pour minimiser la perte d’activité
enzymatique durant le transport, le stockage et l’utilisation. Certains producteurs
d’enzyme ajoutent à l’enzyme sèche des sucres, alcool poly hydrique, des sels pour
s’associer avec l’eau qui hydrate la surface de la protéine et rendre la protéine plus rigide
donc plus stable.

Le meilleur moyen de combattre l’inactivation du site actif est d’ajouter à la

formule un cofacteur ou un inhibiteur réversible qui s’associent au site actif et limitent sa
transformation essentiellement par oxydation.
Une standardisation du produit industriel est nécessaire pour garder la même
qualité d’une même préparation enzymatique.

On peut ajouter aussi des agents protecteurs de groupement SH fragile, des substrats
analogues EX : glycérokinase est stable à 4°C pendant un an en présence d’éthylène
glycol 1%.

19
Le plus souvent l’enzyme est conserve à 4°C en suspension dans le sulfate d’ammonium
3 ou 2 M ou de glycérol 50% ou PH légèrement acide ou neutre.

La lyophilisation (séchage à froid) est moins utilisée car on observe une perte d’activité
par les changements de concentration en sel pendant l’opération

Il faut assurer la préservation contre les contaminants microbiens, la formation des

poussières, précipitation et optimisation des critères esthétique (structure).

En fin on contrôler l’adaptation de produits à son utilisation ultérieur.

Les mesures de l’activité enzymatique :

- Activité (A) : nombre de moles de substrat transformé (ou de produit apparu) par
unité de temps.
- Unité internationale (UI) : quantité d’enzyme susceptible de transformer 1
micromole de substrat par minute (mole.min-1).
- Activité spécifique (AS) : nombre de micromoles de substrat transformé par
minute, par mg de protéine (UI.mg-1).
- La cinétique enzymatique peut être suivie par des méthodes de détection optiques,
électrochimiques ou radio-actives.
- La quantité en protéines (PE) est déterminée essentiellement par des méthodes
spectrophotométriques: concentration. volume
- Facteur de purification ou enrichissement ou degré de purification (E) :
E:AS après/AS avant purification où AS:CAC/PE
- Rendement de purification R : A après/A avant purification x 100.
- Activité totale : AT
AT: CAC.Ve

- Concentration d'activité catalytique (CAC) =Abs.fd/.t.V

fd : facteur de dilution;  : Coefficient; t : temps de réaction; V : volume d’enzyme

III. Dosage des métabolites par des enzymes

De nombreux traits du métabolisme sont communs à toutes les cellules (végétales,

animales et bactériennes). Le métabolisme peut être défini comme étant l’ensemble des
transformations de matière et d’énergie dont tout organisme est le siège, qui permettent
toutes les manifestations de l’activité vitale. Toutes les réactions métaboliques sont
déclenchées ou accélérées par des enzymes, dont la plupart sont communs à tous les êtres
vivants (Binet et Brunel, 1968).

Les enzymes donc sont des molécules biologiques qui possèdent une activité
catalytique, c'est-à-dire qu'elles augment des vitesses réactionnelles, in vivo et in vitro

20
(Durant et Beaudeux, 2008). Elles être utilisées pour doser divers composées biologiques
parmi eux les métabolites (Sine, 2010).

Les métabolites sont les produits intermédiaires des réactions métaboliques et qui se
produisent naturellement dans des cellules. Ce terme est habituellement employé pour
décrire des petites molécules, bien qu'une application plus grande soit souvent pratiquée.
Elles sont divisées en deux classes, les métabolites primaires qui sont synthétisées par la
cellule parce qu'elles sont indispensables pour leur accroissement (Les lipides, les
carbohydrates et les protéines, des alcools, des vitamines, des polyols...), et les métabolites
secondaires sont des composés produits par un organisme qui ne sont pas exigés pour des
procédés métaboliques primaires (les médicaments, les toxiques, des pesticides et des
additifs alimentaires...). La mise en évidence dans l'organisme de ces métabolites
intermédiaires a pu être réalisée grâce a une méthode d'analyse biologique se basant sur les
conditions d'édification naturelle de ces corps dans les cellules vivantes a savoir, une
méthode de dosage utilisant les enzymes spécifiques qui catalysent leur transformation
suivant des voies métaboliques normales (Etienne et Daubresse, 1961).

Ce méthode de dosage enzymatique est une analyse simple et rapide (Gonnet,

1979), qui permet une détermination rigoureusement exacte des métabolites (Etienne et
Daubresse, 1961). De sorte qu'elle autorise de doser un substrat avec une grande
spécificité (Hainque el al, 2008), où est la précision des résultats obtenus est satisfaisante
et en tout cas suffisante pour être exploitée dans le domaine pratique. L’analyse
enzymatique est très précisément adaptée au dosage sélectif des substrats (Gonnet, 1979).
En particulier par comparaison aux méthodes chimiques qui utilisent souvent des réactifs de
groupes (Hainque el al, 2008), car elle n’a pas toujours un caractère très spécifique
(Gonnet, 1979).

Dans certains cas, le dosage des métabolites se fait de manière indirect, en évaluent
une propriété proportionnelle à la concentration de d'autre substrat chromogène pour
l'enzyme, par l'intervention de complexe antigène-anticorps, ces méthodes sont appelées les
méthodes immunoenzymatiques.

21
 De plus, un dernier défi doit être relevé pour les enzymes analytiques, car il faut
trouver un moyen pour quantifier avec exactitude des produits de la réaction. C'est pour
cela qu'un spectrophotomètre, doit être utilisé (Charnock et McCleary, 2005).

III.1. Méthodes de dosages enzymatiques

Le dosage colorimétrique est le plus utilisé où la formation d’un compose coloré capable
d'absorber la lumière par spectrophotomètre et la densité optique est proportionnel à la
concentration de produit. Donc l’activité enzymatique est dépend de la concentration de
produit.

III.1.1. Méthode au point final (End Point)

Les méthodes au point final consistent à mesurer la transformation totale du

substrat en produit. Elles sont nombreuses, la plus courante est basée sur l'absorptiomètre
moléculaire lorsque l'un des substrats ou produit possèdent un pic d'absorption spécifique
(Audigié et al, 1995).

On réalise deux mesures : l’une à t0 (déclenchement du chronomètre après ajout

de l’enzyme, ici jouant le rôle de starter) et l’autre après un temps déterminé (t x) avec
éventuellement ajout d’un réactif de révélation. On calcule la différence des mesures
(Hainique et al., 2008) (∆DO) de densité optique entre le temps zéro, qui correspond au
démarrage de la réaction et le temps t qui correspond à la fin de la réaction. Si la
transformation du substrat en produit est totale, ΔDO est proportionnelle à la
concentration du substrat (Audigié et al, 1995).
Les méthodes «point final» sont utiles pour des dosages uniques ou pour de
petites séries, elles ont le défaut d'être lentes, de 15 à 75 minutes, car elles nécessitent que
l'on attende la fin de la réaction.

La plupart des réactions enzymatiques étant équilibrées, il est souvent nécessaire

de recourir à un artifice pour rendre la transformation total :
III.1.1.1. Méthode chimique : cette méthode consiste à ajouter au milieu une substance
qui élimine le produit au fur et à mesure de sa formation et déplace totalement l'équilibre
dans le sens de la transformation du substrat (Audigié et al, 1995). On peut citer à titre
d'exemple le dosage suivant:

22
EX. Dosage des corps cétoniques dans le plasma

Il s'agit de l'acétone, de l'acètoacètate et du β-hydroxybutyrate qui sont produits de

façon excessive à partir des acides gras en cas de jeune ou lors d'un diabète
insulinodépendant. Ils peuvent être dosés indépendamment les uns des autres ou
recherchés ensembles dans le sang ou l'urine. Compte tenu de la volatilité de ces
composés et de la décarboxylation spontanées de l'acètoacètate, les prélèvements doivent
être placés dans des récipients fermés, conservés au froid (glace pour le transport) et
rapidement analysés.

Le sang est prélevé à jeun sur héparine ou fluorure-héparine, dans un tube bien
rempli et bouché; placé dans la glace. L'acétone peut être dosée par chromatographie en
phase gazeuse dans le sang totale (valeurs usuelles < 0,85 mmol/L). Mais les composés
quantitativement les plus importants sont le β-hydroxybutyrate (≈70%) et l'acètoacètate
(≈30%) qui peuvent être dosés dans le plasma par spectrophotométrie à 340 nm selon les
réactions ;

+¿ α −HBDH ' pH 7 ¿
ac é toac é tate + NADH , H β−h ydroxybutyrate + NAD
→

ac é toac é tate + NADH α −HBDH (pH 8.5+ h ydrazine) β−hydroxybutyrate+ NAD

←

En excès de NADH, H+ et à pH 7, on dose l'acètoacètate en mesurant la

disparition du NADH. En excès de NAD et à PH 8.5, en dose le β-hydroxybutyrate en
+ ¿¿
suivant l'apparition du NADH , H , l'hydrazine capte l'acètoacètate qui préexistant et au
fur et à mesure de sa formation.

Les valeurs usuelles pour l'acètoacètate vont de 30 à 55 µmol/L et pour le β-

hydroxbutyrate de 80 à 140 µmol/L.
L'intérêt de connaitre de ces dérivés et que l'on peut calculer le rapport β-
hydroxybutyrate sur acètoacètate qui varie normalement entre 2.5 et 3 (Béraud, 2004).

23
III.1.1.2. Méthode enzymatique : Cette méthode consiste à éliminer le produit au fur et
à mesure de sa formation à l'aide d'une réaction enzymatique auxiliaire (Audigié et al,
1995). On peut citer à titre d'exemple les dosages suivants:

EX. Dosage des triglycérides

Toutes les techniques sont basées sur le dosage spectrophotomètrique, en point
final, du glycérol libéré par hydrolyse des triglycérides. Elles utilisent essentiellement les
trois principes suivants :
Tr é glyc é rides TG lipase glyc é rol +acide gras
→

glyc é rol + ATP glyc é rokinase glyc é rol−3 P+ ADP

→

Glyc é rol 3−P+O 2 Glyc é rol−3−P oxydase dihydroxyac é tone−P+ H 2 O 2

→

H 2 O2+ chromog é ne peroxydase quinone−imine (Trinder, 500 nm)

→

+¿¿
Glyc é rol 3−P+ NAD Glyc é rol−3−P DH D HAP+ NADH , H (Wieland , 340 nm)
→

NADH +∫ diap h orase Formazan (m è thode ∫ , 500 nm)

→

ADP+ phospho é nolpyruvate pyruvate kinase ATP+ pyruvate

→

+¿ LDH lactate+ NAD¿

pyruvate+ NADH , H → (Kreutz ,340 nm)

La méthode de Trinder, avec des variantes sur le chromogène employé, est la plus
utilisée (80% des LABM; laboratoire d'analyse de biologie médical), alors que les
méthodes de Kreutz (10% des LABM) ou à l’INT (chlorure de iodophènyl-
nitrophènyltètrazolium) ont tendance à être abandonnées. La technique de Wieland est
peu utilisée en biologie médicale (4% des LABM) que dans d’autres domaines
(agroalimentaire, recherche en biologie).

Toutes ces méthodes dosent le glycérol plasmatique en même temps que les
triglycérides, ce qui entraine leur surestimation. On peut consommer le glycérol
plasmatique en déclenchant le dosage des triglycérides par la lipase seul ajoutée après un

24
temps d’attente, ou mesurer en parallèle la glycèrolemie avec des réactifs sans lipase puis
effectuer une correction. Dans la pratique, on se contente souvent d’une correction a
priori de 0,15 mmol /L, valeur usuelle de la glycèrolèmie.
Les valeurs usuelles de l’adulte sont de 0,4 à 1,6 mmol/L chez la femme et de 0,5
à 2 ,0 mmol/L chez l’homme. Elles sont plus faibles chez les nouveau-nés et le sujet âgé
(Béraud, 2004).

EX. Dosage des phospholipides

Le dosage des phospholipides est basé sur la réaction de Trinder, après production
d’eau oxygénée ; la mesure, automatisable, se fait par spectrophotométrie en point final.

phospholipides p h osp h olipase choline+acides phosphatidiques

→

choline +O2 c h oline oxydase B é taine+ H 2 O2

→

H 2 O 2+ chromog é ne peroxydase quinone−imine

→

Les phospholipides diminuent lors de la malnutrition (déficit en choline) et

augmentent au cours des rétentions biliaires. Concernant les pathologies du métabolisme
lipidique, la phospholipidèmie varie dans le même sens que la cholestérolémie. Les
phospholipides augmentent donc dans les hyperlipidèmies de type II et III et diminuent
dans les hypolipidèmies. Les valeurs usuelles vont de 2,1 à 3,2 mmol/L, elles sont plus
faibles chez le nourrisson.
Le rapport cholestérol, dont la valeur normale est voisine de 1,7, ne change
pratiquement pas lors d’une hypercholestèrolèmie. Si le rapport diminue, c’est que les
phospholipides sont augmentés pour une cause non lipidique (rétention biliaire, par
exemple). Si le rapport augmente, c’est que les phospholipides sont réellement diminués,
comme dans la maladie de Tangier par exemple (Béraud, 2004).
III.1.2. Méthode cinétique (méthode de la vitesse initiale)
Elle est possible pour les systèmes enzymatiques à Km élevée, ce que l’on peut
d’ailleurs réaliser artificiellement en ajoutant au milieu réactionnel un inhibiteur
compétitif (Hainque et al, 2008).

25
 [S ]
La relation de michaelis v=V M Montre que si la concentration de
K m +[ S]

(VM)
substrat [S ]est faible, donc négligeable devant Km on a v= ×[S]. La vitesse initiale
Km
est proportionnelle à la concentration de[S ], la réaction est d'ordre 1. En pratique, on
admet que ceci est vérifié si [S ]<0.1 Km (Audigié et al, 1995).
Donc la vitesse est proportionnelle à la concentration de [S ]tant que celle-ci n’est
pas trop élevée (S<0.1Km). On va mesurer la vitesse entre deux temps d’incubation
rapprochés et la comparer à celle obtenue avec une concentration connue de [S ]. En fait,
on peut travailler en cinétique utilisant la vitesse initiale (uniquement sur automates) ou
en cinétique en deux temps préfixés (cinétique d’ordre 1) bien adaptée aux auto-
analyseurs rapides ; il sera important de bien choisir les temps de mesure (Hainque et al,
2008).
Le principe de la méthode est donc de mesurer la vitesse initiale de la réaction
enzymatique dans les conditions de concentration pour les quelles la réaction est d'ordre 1
par rapport au substrat. La mesure se fait en enregistrant la DO en continu, sitôt la
réaction déclenchée. La vitesse, c’est-à-dire la pente à l'origine de la courbe (P)= f(t) ou
DO=f(t) est proportionnelle à la concentration du substrat (Audigié et al, 1995).

Les avantages de la méthode cinétique par rapport à la méthode au point final

sont ; la rapidité et la possibilité d'automatisation (Audigié et al, 1995). Elle est moins
coûteuse car on utilise moins d’enzyme, et particulièrement rapide, donc bien adaptées
aux automates de biochimie, en particulier dans des systèmes ou l’enzyme est
immobilisée sur une membrane (électrodes à enzymes) (Hainque et al, 2008).

EX. Dosage de l'ammonium (NH4+) plasmatique: La méthode la plus courante fait

intervenir le glutamate déshydrogénase (GLDH) selon la réaction suivante:
α −c é toglutarate + N H 4 + NAD ( P ) H GLDH NAD ( P ) + glutamate+ H 2 O
→

L'utilisation de NADPH plutôt que NADH, H + augmente la spécificité de la

réaction .la disparition de NAD(P)H est lue à 340 nm, ce qui rend la méthode adaptable
sur un analyseur automatique (Béraud, 2004).

26
D'autres exemples sur le dosage de quelques métabolites ont été présentés dans le tableau
suivant:

Tableau: dosage de quelques métabolites par voie enzymatiques.

Longueur
Enzyme Substrat Technique Référence
d'onde
Glucose oxydase Glucose Méthode point final 340 nm (Sine, 2010)
Β-fructosidase Fructose Spectrophotométrique 340 nm (Sine, 2010)
Cholestérol cholestérol (Heuillet,
Méthode point final 512 nm
oxydase total 2013)
(Beriala et
Méthode cinétique 510 –
Créatine Kinase Créatinine Mammadi,
colorimétrique (Jaffé) 530nm
2006)
(KARBOUE
Ascorbate L’acide L- Dosage et
578 nm
oxidase (AAO) Ascorbique fluorimétrique NESRALLAH,
2013)
Phospholipase D Phosphatidyl (TAKAYAMA
Spectrophotométrique 500 nm
Choline oxydase choline et al, 1977)

III.2. Règles à respecter pour réaliser un dosage enzymatique

1.Toutes les enzymes utilisées doivent avoir une activité potentielle excédentaire, tous les
substrats secondaires doivent être en excès.
2.On peut calculer la concentration du substrat à doser en transformant ΔDO à l'aide du
coefficient d'extinction molaire ε. Si ce dernier n'est pas connu, on utilise une solution
étalon pour réaliser un essai étalon.
3. On peut travailler en DO croissante (apparition du produit) ou DO décroissante
(disparition du substrat) (Audigié, 1995).

III.3. Dosages immunoenzymatiques

Les méthodes immuno-enzymatiques sont devenues les principales méthodes de

dosage avec marquage ; en particulier, elles ont supplanté les méthodes radioactifs avec
marquage isotopique (type RIA; Radio-immunologie assai, en particulier) (Hainque el
al, 2008).

27
 Dans la plupart des cas, les immuno-analyses utilisent un réactif (antigène ou
anticorps) associé à un traceur détectable permettant de révéler la liaison antigène
anticorps spécifique. Trois grands types de traceurs sont utilisables, des enzymes, des
fluorochromes et des radio-isotopes. Elles augmentent la sensibilité d'une immunoanalyse
et permettent de déceler des quantités plus faibles de cible que les méthodes qui ne les
utilisent pas (Béné et al, 2014).

L'utilisation d'enzymes comme traceurs a été introduite dans la seconde moitié du

XXe siècle pour offrir une alternative aux radio-isotopes. Pour être efficaces en tant que
traceurs. Les enzymes candidates doivent privilégier des contraintes michaeliennes avec
un faible KM pour leur substrat, catalyser des réactions irréversibles, être stables,
résistantes aux interférences et faciles à conjuguer sans perte d'activité (Béné et al, 2014).

L'activité enzymatique en présence d'un substrat adapté et d'un chromogène

génère un produit coloré proportionnellement à la quantité d'enzymes et donc de la
molécule à laquelle elle est conjuguée. La mesure est réalisée à l'aide d'un
spectrophotomètre et le résultat est exprimé en unités arbitraires de densité optique (DO).
En métabolisant plusieurs molécules de substrat, les enzymes amplifient le signal,
permettant la détection de très faibles quantités de cibles. Le substrat et le chromogène
non dégradés ne doivent pas perturber la lecture et le produit coloré doit être facilement
détectable. De plus, il est préférable que l'enzyme, le substrat et le produit soient absents
dans les préparations à analyser (Béné et al, 2014).

En raison de leur très grande spécificité, les anticorps sont souvent utilisés dans
des réactions immuno-enzymatiques qualitatives ou quantitatives visant à détecter des
antigènes. Le couplage du traceur sur les anticorps ne doit pas altérer leur
immunoréactivité ni la capacité du traceur à générer un signal (Béné et al, 2014). Elles
sont très utilisées pour le dosage des analytes en biologie médicale, surtout sous forme de
tests ELISA, et en immuno-enzymoflourimétrie (Hainque el al, 2008).

III.3.1.- Méthodes enzymatiques : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

La technique ELISA aussi appelée EIA (Enzyme Immuno Assay) a été mise au
point au début des années 1970 par deux chercheurs de l'université de Stockholm, Eva

28
Engvall et Peter Perlmann. Comme son nom l'indique, la technique ELISA repose sur une
réaction immunologique se déroulant sur un support solide et révélée par une réaction
enzymatique en phase liquide (Béné et al, 2014).

Ce test emploie des anticorps pour révéler et doser une très faible quantité
d'antigène. Les protéines contenues dans l'échantillon sont adsorbées sur la paroi en
plastique des puits d'une plaque de microtitration. La plaque est lavée avec une solution
protéique (albumine, gélatine, caséine, sérum ….) qui a pour but de saturer tous les sites
de fixation disponibles. La surface est ensuit traitée avec une solution contenant un
anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, c’est-à-dire l'antigène. Ces anticorps portent
le nom d'anticorps primaire. Après une période d'incubation et élimination des anticorps
libres par lavage, la plaque est traitée avec une solution d'anticorps (anticorps
secondaires) reconnaissant les anticorps primaires. Les anticorps secondaire couplés à
une enzyme (peroxydase, β-galactosidase ou phosphate alcaline) permettent de quantifier
l'antigène grâce à une réaction colorée (SINE, 2010). La mesure de la réaction colorée
finale se fait à l'aide d'un spectrophotomètre (Béné et al, 2014).

ELISA peut être réalisé à visée qualitative ou quantitative selon que l'on utilise ou
non une courbe d'étalonnage. Cette dernière doit être réalisée avec une solution de
concentration connue de la molécule que l'on cherche à doser. Le seuil de détection des
ELISA quantitatifs est de l'ordre du pmol/L ou du ng/mL (Béné et al, 2014).

Les antigènes d'intérêt ou les anticorps spécifiques sont immobilisés sur le support
solide selon le type ELISA utilisé.

29
 Antigéne Anticorps primaire Anticorps secondaire couplé à l'antigéne

Figure: Principe du test ELISA (Sine, 2010).

III.3.1.1.-Types d'ELISA

On distingue plusieurs types ELISA en fonction de la nature de la molécule à

doser et de la technique de révélation : ELISA direct, indirect, sandwich ou compétitif
(Béné et al, 2014).

III.3.1.1.1.-ELISA indirect :

Un anticorps peut être détecté ou sa concentration déterminée grâce à un ELISA

indirect. Le sérum, ou tout autre échantillon, contenant un anticorps primaire (Ac1) est
déposé dans un puits d'une plaque de microtitration où est adsorbé l'antigène, et permet la
réaction avec cet antigène fixé au puits.

Après que l'Ac1 ait été éliminé par lavage, l'anticorps lié à l'antigène est détecté en
ajoutant un anticorps (Ac2) secondaire, anti-isotype, couplé à une enzyme qui se lie à
l'Ac1. L'Ac2 libre est éliminé par lavage et un substrat de l'enzyme ajouté. La quantité de
produit coloré, fluorescent ou chimioluminescent, de la réaction est mesurée par un
spectrophotomètre lecteur de plaque et est comparée avec le taux de produit généré quant
la même série de réactions est faite en utilisant une courbe standard de concentration
d'Ac1 connu. (Un ELISA direct permet de détecter le taux d'antigène sur une plaque en
utilisant une enzyme couplée à des anticorps, et est rarement utilisé).

30
 ELISA indirect est une méthode de choix pour détecter la présence d'anticorps
sériques dirigés contre le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Dans ce dosage,
les protéines recombinantes de l'enveloppe et du corps du VIH sont adsorbées en tant
qu'antigène dans les puits d'une plaque de microtitrtion. Les individus infectés par le VIH
produisent des anticorps sériques contre les épitopes de ces protéines virales.
Généralement, les anticorps sériques contre le VIH peuvent être détectés par ELISA
indirect dans les six semaines qui suivent l'infection (Owen et all, 2014).

III.3.1.1.1.2-ELISA direct (Sandwich)

Un antigène peut être détecté ou sa quantité mesurée par un ELISA sandwich.

Dans cette technique, l'anticorps (et non pas l'antigène) est immobilisé dans un puits
d'une plaque de microtitration. Un échantillon contenant des taux inconnus d'antigène est
ajouté pour permettre la réaction avec l'anticorps immobilisé. Après lavage des puits, un
second anticorps lié à une enzyme, spécifique d'un épitope différent de l'antigéne est
ajouté et permet la réaction avec l'antigène lié. Après un lavage pour éliminer le second
anticorps, on ajoute le substrat et on mesure la quantité de produit coloré.

Une variation commune de ce test utilise un anticorps secondaire couplé à la

biotine et nécessite l'ajout d'une enzyme liée à l'avidine dans un second temps. Les
ELISA sandwich ont particulièrement prouvé leur utilité pour la mesure de concentration
de cytokines solubles dans des surnageants de tissus de culture, ainsi que dans les fluides
corporels et le sérum. A noter que, pour ce test, les deux anticorps utilisés respectivement
pour l'immobilisation de l'antigène (capture) et la phase de détection doivent se lier aux
différents déterminants (épitopes) sur l'antigène. Les ELISA sandwich utilisent donc en
routine une paire d'anticorps monoclonaux spécifiques pour les différentes régions de
l'antigène (Owen et all, 2014).

III.3.1.1.3.-ELISA Compétitif

L'ELISA compétitif constitue une autre variante très sensible de mesure des
quantités d'antigène. Dans cette technique, l'anticorps est tout d'abord incubé en solution
avec un échantillon contenant l'antigène. Le mélange antigène-anticorps est ensuite
déposé dans un puits de plaque de microtitration où est adsorbé l'antigène. Plus il y a

31
d'antigène présent dans l'échantillon, moins d'anticorps libres seront disponibles pour se
lier au puits où est adsorbé l'antigène. Après avoir éliminé par lavage l'anticorps non lié,
un anticorps secondaire Ac2 couplé à une enzyme, spécifique de l'isotype de l'Ac1 est
ajouté pour déterminer la quantité d'Ac1 liée au puits. Dans le dosage compétitif, plus la
concentration de l'antigène est élevée dans l'échantillon original, plus le signal est faible
(Owen et all, 2014).

Figure: Représentation schématique des différents types d'ELISA

(Béné et al, 2014).

III.3.1.2.-Enzymes utilisées dans le teste ELISA

Les enzymes utilisées doivent posséder un ensemble de caractéristique les

rendant utilisables dans ces méthodes : on doit pouvoir les obtenir a un degré de pureté
élève, a prix raisonnable ; elles doivent être stables, leur activité doit être élevée et non
altérée par le couplage covalent. Pour les méthodes de dosage en phase hétérogène, on
utilise le plus souvent un substrat chromogène donnant un produit coloré soluble. Pour les
méthodes de microscopie, dont la microscopie électronique, le produit doit être insoluble
et d’une couleur foncée ou opaque aux électrons. Le produit peut aussi être fluorescent

32
(emploi de substrats fluorogénes ou luminogénes), comme dans les méthodes de dosages
immuno-enzymofluorimétriques.

Les principales enzymes marqueuses sont : la peroxydase de raifort

(EC.1.11.1.17) avec comme substrat la phényléne 1,2-diamine ou la tétraméthyl-
benzidine ; la phosphatase alcaline (EC.3.1.3.1) utilisant le nitro-4-phénylphosphate ; la
glucose oxydase (EC.1.1.3.4) avec une peroxydase ; la β-D-galactosidase (EC.3.2.1.23)
utilisant le substrat devenant la méthyl-4-ombelliféryl-β-D galactoside devenant la
méthyl-ombelliférone fluorescente.

Les procédés de couplage sont variés ; leur rendement, dans l’idéal, devrait être
proche de 100% et donc laisser intactes les activités fonctionnelles des partenaires ;
quelques exemples sont donnés dans le tableau (Hainque el al, 2008).

EX. Dosage de thyroxine

Le sérum contient une quantité inconnue de T 4. On pipette ce sérum et une solution

contenant une quantité fixe de conjugué : thyroxine lié à une enzyme (T 4 ̶ POD) dans un
tube à essai, sur la paroi duquel sont fixés des anticorps spécifiques. Les molécules de T 4
entrent en compétition avec les molécules de T 4 ̶ POD, lors de la fixation sur l'anticorps.
Après élimination de la T 4 libre, il ne reste plus que la T 4 et de la T4 ̶ POD liées à
l'anticorps. Le rapport T4/T4 ̶ POD fixées dépend du rapport de leurs concentrations dans
le milieu réactionnel. On ajoute les substrats de la POD, H 2O2 et un chromogène. Le produit
est coloré :

H 2 O 2+ chromog é ne POD H 2 O+complexe ¿ ¿

→

On mesure la variation d'absorbance, par unité du temps dans les conditions initiales
pour mesurer l'activité de l'enzyme.

La courbe d'étalonnage permet le dosage des échantillons traités dans les conditions
standardisées du mode opératoire (Audigié et all, 1999)

EX. Dosage des protéines membranaires de virus HTLV

33
 Il existe un test de détection immunoenzymatique pour la détection qualitative, des
anticorps spécifiques des virus HTLV I et II dans le sérum ou le plasma. Il s'agit d'un test
ELISA de configuration «sandwich» séquentiel, utilisant à la fois des protéines
recombinantes dérivées des protéines transmembranaires HTLV I et II et des peptides de
synthèse représentatif des protéines d'enveloppe des deux types de virus.
Des microplaques standards sont revêtues des protéines d'enveloppe et d'une
protéine transmembranaire HTVL I et II. Après saturation des puits, les échantillons
(sérum ou plasma) et les témoins sont incubés. Les anticorps spécifiques HTLV I et II
présents se fixent aux antigènes de la cupule. Lors de l'étape suivante, le conjugué
(mélange des antigènes peptidiques et de protéines transmembranaires de HTLV I et II
couplés à la peroxydase) est ajouté et se lie aux anticorps spécifiques déjà fixés à la
cupule. Après lavage, l'addition du substrat de l'enzyme et d'une chromogène donne une
réaction colorée dont l'intensité est proportionnelle à la concentration en anti-HTLV de
l'échantillon.
A l'aide des contrôles négatifs, on détermine une valeur seuil. Les échantillons
dont l'absorbance est égale ou supérieur à la valeur seuil sont considérés comme réactifs
avec le test et doivent être testés à nouveau en double. Ceux qui sont encore positifs sont
présumés contenir des anticorps spécifiques de l'HTLV I et II (Béraud, 2004).
III.3.1.3.-Application de technique ELISA
L'ELISA est une technique très couramment développée dans le domaine du
diagnostic biologique ou en recherche fondamentale.
• En recherche : le dosage de protéines d'intérêt dans des surnageants ou lysats cellulaires
est réalisé fréquemment en ELISA.
• Applications industrielles et vétérinaires : ces techniques sont également appliquées
dans le contrôle qualité des produits finis ou en cours de production, ainsi qu'en
épidémiologie et contrôle vétérinaire.
• En clinique : l'ELISA est très utilisée pour le sérodiagnostic des maladies infectieuses
et pour le diagnostic et le suivi de maladies auto-immunes. (Béné et al., 2014)

De manière générale l'ELISA est une technique sensible, rapide, adaptée à la

réalisation de grandes séries de dosage et offre la possibilité d'une automatisation totale

34
(Béné et al, 2014). Mais leur limite de détection est moins bonne que la technique RIA,
et la réaction enzymatique dépendante de la température, du pH et de l'éclairement.

III.3.2.-Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT)

Les immunoassay en phase homogène furent décrites pour la première fois en
1972 et des applications au dosage de médicaments dans les urines furent
commercialisées dés 1973 sous le siège EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay
Technique). Cette technique est appliquée au dosage des petites molécules, e.g. hormones
de faible masse moléculaire, toxiques (Durant et Beaudeux, 2008). et surtout largement
utilisée pour détecter de nombreux médicaments dans l'urine et pour mesurer les
anticonvulsivants dans le sang, diffère des tests radio-immunologiques en ce qu'un
médicament marqué par une enzyme (c'est-à-dire un médicament covalemment attaché à
une enzyme) plutôt qu'un médicament marqué par un isotope est utilisé comme antigène
qui rivalise avec le médicament non marqué à analyser. Ainsi, il n'est pas nécessaire de
séparer le médicament marqué du médicament non marqué (Rosenthal et al, 1976)

Dans cette technique, le format de dosage est de type compétitif : l'Ag (ou
hapténe) à doser entre en compétition avec le traceur Ag-enzyme pour se fixé sur l'Ac de
capture. L'activité enzymatique (AE) du traceur est modulée (inhibée ou activée par sa
liaison à l'Ac).

Supposons que l'AE du traceur libre soit inhibée par sa liaison à l'Ac. Donc

Ag−Enz inactif − Ac ⟺ Ag−Enz actif + Ac + Ag ⟺ Ag Ac

En absence d'Ag à doser le nombre de molécules de traceur fixées à l'Ac est

maximal et donc l'AE est minimale. En conséquence l'AE du milieu augmentera avec le
nombre de molécules d'Ag à doser par déplacement du traceur fixé à l'Ag (Durant et
Beaudeux, 2008).

Mais parmi leurs inconvénients, les applications concernent principalement les

haptènes car au-delà d'une certaine taille pour l'analyte à doser, le contrôle précis de la
modulation de l'AE est mois évident (Durant et Beaudeux, 2008).

35
 Figure: principe d'EMIT (Helmut, 1998)

III.3.3.-Immunocytochimie (ICC)
L'immunocytochimie, par définition, est l'identification d'un constituant tissulaire
dans l'endroit même au moyen d'une interaction antigène-anticorps spécifique où
l'anticorps a été marqué avec une étiquette visible (enzyme, chloroforme, ferritine, les
particules d'or colloïdal..).

La coloration cellulaire est une méthode puissante pour démontrer à la fois la

présence et l'emplacement sous-cellulaire d'une molécule particulière d'intérêt, les
étiquettes enzymatiques sont détectées par addition de substrat à la fin de la réaction
antigène-anticorps. Les réactions enzyme-substrat produisent des produits finis de
couleur intense qui peuvent être visualisés sous un microscope optique. (Javois et al,
1999)

On parle de réaction directe quand le marqueur est directement couplé à

l'anticorps primaire, et de réaction indirecte quand on utilise un anticorps secondaire
(fabriqué chez l'espèce B) couplé au marqueur dirigé contre l'anticorps primaire (fabriqué

36
chez l'espèce A). La méthode directe est moins sensible que la méthode indirecte
(Helmut, 1998).

Figure: schéma illustrant le principe d'une réaction immunocytochimique (Helmut,

1998).

III.3.3.1.-Enzymes utilisées dans l'immunocytochimie

Plusieurs enzymes sont couramment utilisées dans l'immunocytochimie, y

compris la peroxydase, la phosphatase alcaline et la glucose oxydase. La peroxydase
catalyse une réaction enzymatique avec un taux de roulement très élevé, offrant une
bonne sensibilité en peu de temps. C'est l'enzyme de choix pour l'immunocytochimie. Si
deux enzymes différentes sont requises, comme dans la coloration double immuno-
enzymatique, la phosphatase alcaline a généralement été utilisée comme deuxième
enzyme. La phosphatase alcaline est relativement peu coûteuse, stable et donne un
étiquetage important avec plusieurs substrats, offrant ainsi un choix de produits de
réaction de couleur différente. La glycose oxydase a également été utilisée pour
l'étiquetage double immuno-enzymatique. Cette enzyme présente l'avantage par rapport à
la peroxydase ou à la phosphatase alcaline en ce qu'il n'existe pas d'activité enzymatique
endogène dans les tissus de mammifères. Cependant, en pratique, l'activité enzymatique
endogène de la peroxydase et de la phosphatase alcaline peut être facilement inhibée.
(Javois et al, 1999)

37
III.3.3.2.-Application des techniques immunocytochimies

Les labels enzymatiques sont préférés par la plupart des chercheurs car ils sont
moins coûteux, très sensibles et peuvent être utilisés pour la coloration permanente sans
exigences particulières d'équipement. (Javois et al, 1999).

Les méthodes immunocytochimiques sont devenues une partie intégrante du

laboratoire clinique, ainsi que le cadre de recherche. Les spécimens cliniquement
pertinents, allant des sections congelées et des préparations cellulaires aux échantillons
entiers, peuvent être analysés. Des panneaux d'anticorps ont été développés pour faciliter
le diagnostic différentiel des tumeurs, et l'instrumentation automatisée a été conçue pour
accélérer la Manipulation de nombreux spécimens. (Javois et al, 1999).

IV. Enzymes immobilisées

Pour utiliser les enzymes en biotechnologie, il est nécessaire de les immobiliser
artificiellement. Ce sont certains groupements chimiques réactifs dans leur structure
protéique qui sont accessibles (OH, COOH, NH2, SH …) et vont permettre leur fixation.
Ainsi immobilisées, sur des supports solubles ou insolubles, ces catalyseurs offrent la
possibilité d'une utilisation répétée dans des domaines très variés.
IV.1.-Méthodes d'immobilisation des enzymes

Les méthodes d'immobilisation des enzymes sont au nombre de trois:

IV.1.1.- Inclusion: il s'agit de retenir l'enzyme à l'intérieur du réseau tridimensionnel

d'une matrice ou dans des billes, schématisé comme suit:
Enzyme
Dispersion dans une solution de monomère
Phase homogène "émulsion"
Polymérisation du polymère
Réseau à l'intérieur duquel l'enzyme est emprisonnée

Les matières les plus utilisées sont les gels: de polyacrylamide, d'alginates, d'amidon, de
carraghénanes; les fibres de polyacétate de cellulose et les microcapsules de nylon.
Cette méthode présente un certain nombre d'avantages et d'inconvénients présentés dans
le tableau ci-dessous:

38
 Avantages
- Elle permet en une seule étape
d'immobiliser la totalité de l'enzyme
- Elle ne présente aucun caractère de
spécificité et est applicable à n'importe
quelle enzyme.
- Elle ne met pas en jeu les groupements
actifs de l'enzyme.
Inconvénients
- La localisation de l'enzyme à l'intérieur du
polymère pose des problèmes stériques
(efficacité limitée par accès délicat du
substrat vers l'enzyme et du produit en
dehors du polymère).
- Les conditions de polymérisation (ex.: pH
élevé) peuvent s'avérer dénaturantes pour
l'enzyme.

IV.1.2.- Adsorption: il s'agit de retenir l'enzyme à la surface d'un support insoluble, par
l'intermédiaire d'interactions de type secondaire (Interactions électrostatiques de Van Der
Waals, Interactions hydrophobes, liaisons hydrogène …). Les matières utilisées sont
organiques (collagène, échangeurs d'ions: CM et DEAE cellulose, albumine, chitine,
dextrane, amidon) ou minérales (argiles, verre et silice poreux, quartz …). Les avantages
et inconvénients majeurs de cette méthode sont :
Avantages Inconvénients
- L'adsorption est facile à mettre en oeuvre, - Vu que les liaisons sont de type non
il suffit de mettre en contact l'enzyme et le covalent, il y a risque de désorption de
support. l'enzyme.

IV.1.3.- Immobilisation par liaison covalente : Il s'agit d'établir des liaisons covalentes
entre l'enzyme et le support utilisé, tout en préservant l'activité catalytique de l'enzyme.
Les principaux supports utilisés sont les suivants:
- Polyosides (dextrane, agarose, cellulose).
- Protéine (collagène).
- Polymères synthétiques (polyacrylamide).
- Silice et verre poreux.

Avantages
- solidité de la liaison enzyme-substrat.
- L'établissement de pontage entre les
molécules d'enzymes leur confère une
résistance aux facteurs dénaturants.
Inconvénients
- L'immobilisation est plus complexe à
réaliser (choix des groupements
à activer...).
- Les quantités d'enzymes immobilisées
sont inférieures par rapport aux deux
précédentes méthodes.

IV.2.-Propriétés des enzymes immobilisées:

On peut citer trois principales propriétés des enzymes immobilisées:
A/ stabilité et résistance aux conditions du milieu (pH, T°, acidité, …).
B/ activité catalytique préservée (site actif bien orienté).
C/ fixation solide au support, permettant des lavages répétitifs sans perte de l'enzyme.

IV.3.-Domaines d'applications:

39
Grâce à leur grande spécificité d'action (biospécificité), les enzymes constituent un outil
de fabrication et d'analyse irremplaçable dans de nombreux secteurs de la recherche, du
contrôle et de la production industrielle de métabolites.
IV.3.1.-Analytique:
- En médecine, des papiers imprégnés de solutions enzymatiques sont utilisés dans
certains tests cliniques (dosage du cholestérol, de l'acide urique, des hormones…).
- Les techniques ELISA utilisent également des enzymes fixées (liées à des anticorps
eux-mêmes fixés par adsorption sur les parois de petites cuvettes en plastiques), destinées
à des dosages cliniques.
IV.3.2.-Thérapeutique:
- Le traitement de certains troubles pathologiques (dus à une déficience enzymatique) par
l'administration d'enzymes se heurte à des difficultés: destruction par les protéases ou
capture et hydrolyse par les macrophages. Pour y remédier, l'enzyme est associée à une
molécule protectrice (albumine, dextrane, polyéthylène glycol), ou alors incluse dans des
microcapsules ou des globules rouges.
- Pour faire du lait sans lactose : traitement thermique du lait écrémé est passé à travers
une colonne contenant le lactase immobilisée (désigné pour les gants a une intolérants au
lactose.).
• Aspartase : acide fumarique acide aspartique
• Glucose isomérase sirop à fort teneur en fructose
• -Aldolase pour le diagnostic des troubles musculaires
• -Iso-citrate déshydrogénase pour le diagnostic de l’hépatite
• -Production de L-DOPA par la β-tyrosinase immobilisée (traitement de la maladie
de Parkinson)

IV.3.3.-Synthèse chimique:
- Il s'agit essentiellement d'unités de fabrication de substances pharmaceutiques: acides
aminés, acides organiques, antibiotiques, hormones stéroïdes…. Ainsi, la L aminoacylase
extraite d'Aspergillus oryzae est fixée par liaisons ioniques sur DEAE Sephadex et
utililisée pour la production en continu de la L aminoacide (comme la L mét, la L Ala, L
Phe, L Trp, L Val…).
IV.3.4.-Agro-alimentaire:
- Glucoserie: l'α-amylase fongique transforme l'amidon en sirop sucrant.
- Industrie laitière: la lactase fongique ou de levures transforme le lactose du lait ou du
lactosérum en glucose et galactose.
- Sucre interverti: l'invertase de levure produit un sucre interverti ayant un pouvoir
sucrant plus élevé et qui cristallise moins. Aux Etats-Unis, d'importantes quantités de
sirops de fructose et glucose sont préparées par voie enzymatique à partir d'amidon de
maïs. Le mélange obtenu, l'isoglucose, présente des avantages par rapport aux solutions
de saccharose: la solubilité élevée du fructose permet, notamment, de préparer des sirops
très concentrés, ne présentant pas de phénomènes de cristallisation.
L'hydrolyse du saccharose permet de produire un sirop équivalent à l'isoglucose
(contenant 42% de fructose), utilisé comme édulcorant en biscuiterie, pâtisserie, glaces,
boissons, ou pharmacie. Cette hydrolyse peut se faire soit par voie chimique acide, soit
par voie enzymatique, à l'aide de l'invertase. Dans ce dernier cas, on évite la formation de

40
produits d'oxydation colorés, qui sont obtenus lorsque l'hydrolyse est effectuée par voie
acide, nécessitant un traitement ultérieur des sirops.
- Amylases fongiques : Production de sucres à partir d'amidon : fabrication de sirops.
Boulangerie : fermentation de sucres par les levures pour produire le dioxyde de carbone
qui lève la pâte
- Protéase :
Les fabricants de biscuit les utilisent pour baisser la teneur en protéines de la farine.
Prédigestion des aliments pour bébés.
- Cellulases et ligninases :
• Hydrolyse de la cellulose dans les sucres fermentables lors de la production
d'éthanol à partir de la cellulose.
- Amylases, xylanases, cellulases et ligninases :
• Hydrolysent l'amidon pour baisser la viscosité du papier et aider à sa découpe et à
son surfaçage.
• Les xylanases réduisent la quantité d'agents chimiques nécessaires au
blanchiment; les cellulases lissent les fibres, améliorent le drainage de l'eau et
facilitent l'enlèvement de l'encre; les ligninases hydrolysent la lignine pour
adoucir le papier.
• Rennine extraite de l'estomac de jeunes animaux ruminants (exemple : veaux,
agneaux) Enzymes produites par voie microbienne Lipases lactases.
Hydrolyse des protéines dégradation de k caséine lors de la fabrication de fromage.
Utilisation croissante dans l'industrie laitière.
IV.4.-Réacteurs enzymatiques:
L'enzyme fixée à un support peut très facilement être récupérée en fin de réaction et être
réemployée plusieurs fois et même fonctionner en continu dans des installations
industrielles appelées "réacteurs enzymatiques". Les divers types de réacteurs employés
en génie chimique sont également utilisables en génie biochimique avec toutefois des
différences de fonctionnement : température ne dépassant pas 70 – 80°C, pression
normale et milieu stérile.
Dès lors que la manipulation s’effectue à une autre échelle que celle du laboratoire, les
problèmes posés deviennent très originaux. Le choix du réacteur dépend, en fait, du type
de réaction, du support et de l’utilisation désirée.
Dans un premier type de réacteur, les enzymes insolubilisées, attachées à des particules,
sont brassées dans le substrat. Cette technologie primitive, utilisée dans les industries
agro-alimentaires, est simplement dérivée de celles utilisées pour les enzymes solubles.
La récupération de l’enzyme insoluble reste délicate et s’opère au prix de grandes pertes.
Aussi cette technique est-elle peu utilisée.
Les autres types de réacteurs reposent sur le passage lent du substrat, à une vitesse
déterminée par l’expérience, au travers d’une colonne d’enzyme immobilisée.
Essentiellement, le produit de réaction circule X fois à travers la même colonne, jusqu’à
l’obtention du rendement adéquat. De ce fait, le problème de la couche non agitée le long
du support solide est atténué.
Une variante technique consiste à ultrafiltrer en permanence, le long d'une membrane
semi-perméable, les produits de la réaction, l'enzyme insolubilisée restant à l'intérieur du
réacteur. Diverses variantes existent, qui ont toutes en commun que le substrat est

41
soustrait et que l’enzyme n’a pas à être récupérée, parce qu’elle est isolée du reste du
processus dans une colonne ou dans un réacteur spécifique.

Référence bibliographique
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Tome 1, DION, paris, p 203-205.
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42
 TP °1 ENZYMOLOGIE Faculté Des Sciences de la Nature
er
année master Biochimie 1 Et de la vie

Dégradation in vitro des molécules d'amidon par des enzymes

Réactifs : Matériels :
- Germes de Blé - Micropipette
- Solution d'iode - Bécher
- Amidon - Boites de pétri

Préparation de l’amylase des germes de Blé : Prendre 05 g de germes de Blé en poudre

et faire l'extraction par l'eau distillée pendant 30 min. Filtrer après avoir mouillé ce
dernier. Récupérer le filtrat jaune-verdâtre qui contient l'enzyme.

Amylase de la salive : Récupérer de la salive dans un petit verre et ajouter un grain de

sel. Laisser se séparer la mousse de la partie liquide et récupérer cette dernière avec une
micropipette.

Mise en évidence de l'activité : Préparer une solution d'amidon : remplir environ 100 ml
de l'eau dans un bécher et porter à ébullition. Pendant ce temps, prendre 1 g d'amidon et
la mélanger avec 5 ml d'eau froide dans un autre bécher. Lorsque l'eau arrive à ébullition,
baisser le chauffage et verser le mélange amidon-eau froide dans l'eau bouillante (avec
agitation). Laisser refroidir et laisser décanter les particules non dissoutes.

Récupérer la solution sans particules et la colorer par une goutte de teinture d'iode
aqueuse.

Verser de la solution d'amidon coloré en bleu dans deux boites de pétri. Avec un compte-
gouttes, déposer au centre, délicatement, une dizaine de gouttes de chaque enzyme de
façon à obtenir une tache claire circulaire. Observer et interpréter.

43
Faculté Des Sciences de la Nature TP °2 ENZYMOLOGIE
Et de la vie er
année master Biochimie 1

Extraction et étude de l’activité de la b-fructofuranosidase (invertase)

de la levure

Le saccharose est le plus répandu des diholosides, Il est extrait de la betterave et de la

canne à sucre. C'est un sucre non réducteur dextrogyre ([ ] = +66,5 a 20°) qui par
hydrolyse chimique ou enzymatique, libère un mélange équimolaire de glucose et de
fructose, tous deux réducteurs. On donne ainsi à ce mélange le nom de sucre Inverti.
(Inversion du pouvoir rotatoire).

L'inverstase ou ß-fructofuranosidase est une hydrolase capable de scinder le saccharose

en glucose et fructose par rupture des liaisons ß-fructofuranosiques.

L'activité enzymatique de l’invertase peut être étudiée en dosant les sucres réducteurs
libérés après hydrolyse par déférentes méthodes.

Extraction de la fraction soluble de la levure de boulangerie

L’invertase est une enzyme intracellulaire, son extraction nécessite obligatoirement la

rupture de la membrane cellulaire.

1 - Matériel et réactifs

Réactifs : Matériels :
- levure de boulangerie (S. cerevisiae) - pipettes
- bicarbonate de sodium à 0,1M - éprouvettes
- la liqueur de Fehling - centrifugeuse
Butanol- Acide acétique- Eau : 2-1-1. - la cuve chromatographique
Isopropanol- Acétate d'éthyle- Eau:6-3-1. - plaque chromatographique

2 - Mode opératoire

- Suspendre 10g de levure de boulangerie dans 40 ml de bicarbonate de sodium à 0,1M ;

Incuber à 35-40°C pendant 24H ; Centrifuger à 5000 tr/min pendant 5 min
44
- Après centrifugation, récupérer le surnageant contenant les molécules solubles entre

autres l’invertase ; Jeter le culot formé de débris cellulaire ; Noter le volume total de
surnageant (éprouvette) ; Conserver le surnageant au froid pour les manipulations
ultérieures.

- Pendre 1ml de saccharose dans un tube à essaie puis ajouter 3 gouttes d'enzyme pour
favoriser l'hdrolyse.

- verifier l'hydrolyse par la liqueur de Fehling ou;

- realiser la plaque chromatographique en gel de silice avec deux phases mobiles :

* Le 01 système: Butanol- Acide acétique- Eau, dans les proportions de 2-1-1.

* Le 02 système: Isopropanol- Acétate d'éthyle- Eau, dans les proportions de 6-3-1.

Le réactif de révélation des spots est le réactif de Nigrum. Après chauffage à

l'étuve à 105°C pendant 10 à 15 min les aldohexoses donnent une coloration bleuâtre, et
Les cétoses donnent une coloration rougeâtre.

- Préparer deux solutions A et B:

A; 4g de diphénylamine dans 100 ml d'acétone.

B; 96 ml d'acétone complété jusqu'à 100 ml par l'aniline.

- Après mélangé les deux solutions A et B, on ajoute 20 ml d'acide

orthophosphorique à 85%.
Analyser les chromatogrammes et Calculer les Rf. Observer et interpréter.

45
 TP °3 ENZYMOLOGIE Faculté Des Sciences de la Nature
er
année master Biochimie 1 Et de la vie

Coagulation de lait par présure

Réactifs : Matériels :
- La poudre de lait - Série des tubes à essai
- CaCl2,2H2O 0,01 M - Éprouvettes
- HCl (0,1 M)
-NaOH (0,1 M)

-La pressure

Des échantillons de lait reconstitué sont obtenus par dissolution de 6 g de poudre de lait
dans 100 ml de CaCl2, 2H2O 0,01 M et à différents pH (5 à 7) du substrat standard obtenu
par addition de HCl (0,1 M) ou NaOH dilué (0,1 M).

La reconstitution du lait a été faite à la température ambiante (≈20 °C), les équilibres ont
été atteints sur ces échantillons de lait après 2 h environ.

Les tubes à essaie sont remplis de 10 ml de chaque lait et de 0,2 ml de présure.

La présure (force 1/10.000; 99,5% d’activité due à la chymosine), Le temps de

floculation est celui qui s’écoule entre le moment de l’introduction de l’extrait coagulant
et celui où un mince film se forme à l’intérieur des parois du tube à essai.

Toutes les expériences ont été répétées 3 fois.

- Noter pour chaque expériences le temps de floculation.

- Observer et interpréter.

46
 TP °4 ENZYMOLOGIE Faculté Des Sciences de la Nature
er
1 année master Biochimie Et de la vie

Effet de la température sur la coagulation de lait par chymotrypsine

Réactifs : Matériels :
- La poudre de lait - Série des tubes à essai
- CaCl2,2H2O 0,01 M - Eprouvettes
- Solution enzymatique - pipettes
- thermomètre

Des échantillons de lait reconstitué sont obtenus par dissolution de 6 de poudre de lait
dans 100 ml de CaCl2, 2H2O 0,01 M et à pH (5.5).

Les tubes à essaie sont remplis de 10 ml de lait.

La reconstitution du lait a été faite à la température de 4, 15, 20, 37, 45, 70, 90°C).

Ajouter 0,2 ml de solution enzymatique de chymotrypsine dans chaque tube.

Le temps de floculation est celui qui s’écoule entre le moment de l’introduction de

l’extrait coagulant et celui où un mince film se forme à l’intérieur des parois du tube à
essai.

- Noter pour chaque expérience le temps de floculation.

- Observer et interpréter.

47