Enzymologie Thorique Bio 2 M1

Ph.
Collas 1
Enzymol ogi e t hor i que
I. Introducti on Dfi ni ti ons
A. Enzyme
Protine prsentant des proprits de catalyse spcifiques dune raction chi-
mique du mtabolisme de ltre vivant qui la produit.
Lenzymologie est ltude des enzymes.
Le substantif enzyme est du genre fminin.
Toutes les enzymes sont des protines.
Les protines enzymatiques sont des catalyseurs, cest--dire quen agissant
des concentrations trs petites, elles augmentent la vitesse des ractions chimi-
ques, sans en modifier le rsultat. A la fin de la raction la structure de lenzyme
se retrouve inchange.
Une enzyme donne est spcifique dune raction, cest--dire quelle catalyse
toujours la mme transformation, se produisant sur les mmes corps chimiques
initiaux.
Les protines enzymatiques sont synthtises par des tres vivants. Cette syn-
thse est dtermine gntiquement : sa conservation dans le gnome est favo-
rise par le besoin quprouve cet tre vivant de faire cette raction.
B. Substrat
Molcule qui entre dans une raction pour y tre transforme grce laction
catalytique dune enzyme.
Toutes les molcules qui entrent dans une raction enzymatique et sont dfiniti-
vement modifies sont appeles substrats.
Enzymologie thorique
Ph. Collas 2
C. Produit
Molcule qui apparat au cours dune raction catalyse par une enzyme.
La nouvelle molcule qui rsulte de cette transformation est appele produit.
D. Ligand
Corps chimique ayant une liaison spcifique avec une enzyme
Toutes les molcules ayant une liaison spcifique avec une protine sont
appeles ligands.
Pour chaque ligand, il existe au moins un site de fixation sur la protine qui le
reoit.
E. Cofacteur
Corps chimique intervenant obligatoirement dans une raction enzymatique :
- pour transporter ou complter un substrat ;
- pour accepter un produit ;
- comme participant la structure de lenzyme.
Les cofacteurs peuvent tre des ions comme latome de Zinc de lanhydrase car-
bonique ou de petites molcules minrales habituellement prsentes dans les mi-
lieux biologiques, commencer bien sr par la molcule deau.
Certains cofacteurs sont des molcules plus complexes synthtises par les cel-
lules : nous les appellerons coenzymes.
F. Coenzymes
Molcule biologique intervenant comme cofacteur indispensable dans la cata-
lyse enzymatique dune raction :
- les coenzymes libres interviennent dans la raction de manire
stchiomtrique ;
- les coenzymes lis interviennent dans la raction de manire cata-
lytique.
Ph. Collas 3
Les coenzymes sont des molcules biologiques cest dire que leur synthse
naturelle ne peut tre faite que par des cellules vivantes. Lorsque cette synthse
nest pas inscrite dans le patrimoine gntique dune espce, alors tout ou partie
de la molcule du coenzyme doit tre apport cette espce par son alimenta-
tion : cet aliment indispensable sappelle une vitamine. Les coenzymes sont des
cofacteurs donc des molcules indispensables la catalyse enzymatique.
Lorsque les coenzymes sont lis lenzyme par des liaisons de type lectrostati-
que ou plus faiblement encore, cette liaison est renouvele chaque raction ef-
fectue : en effet, lnergie mise en jeu par la liaison enzyme - coenzyme est du
mme ordre de grandeur que lnergie mise en jeu dans la liaison enzyme-
substrat ; dans ce cas, la concentration des coenzymes doit tre du mme ordre
de grandeur que celle du substrat (on dit stchiomtrique). Ces coenzymes sont
appels coenzymes libres parce quils se dissocient de lenzyme chaque rac-
tion catalyse.
Lorsque au contraire les coenzymes sont lis aux enzymes par des liaisons for-
tes de type covalent, leur concentration est ncessairement la mme que celle de
lenzyme, cest dire trs petite (on dit catalytique). Ces coenzymes sont appels
coenzymes lis parce quils ne se dissocient pas de lenzyme.

Ph. Collas 4
II. Spci fi ci t
A. Notion de spcificit
1. Substrats
Thoriquement, une seule raction possible, sur un seul
substrat
En ralit, il existe une relation structure activit : il faut que la bonne liaison soit
place au bon endroit
accs possible pb de conformation
raction possible pb chimique (grandeur et nature des forces en jeu)
il est frquent quune enzyme intervienne non sur une molcule unique, mais sur
une classe de substrats.
Exemple 1 : Galactose pimre en C4 du glucose, non pris en charge par les en-
zymes de la glycolyse
Exemple 2 : - oxydation des acides gras - Les enzymes prennent en charge
des acyl - CoA. A chaque dgradation, perte dun motif 2 carbones, mais les
mmes enzymes fonctionnent sur le nouvel acyl - CoA le mme motif est re-
connu.
Exemple 3 : RubisCO en fait, les deux ractions ne concernent pas les mmes
sites (rgulation allostrique).
2. Raction
En fonction de lenvironnement atomique du site catalytique, un seul type de raction
sera possible :
acide - base
redox, par change dlectrons avec des ions mtalliques (cytochromes)
transferts de groupements
Ph. Collas 5
B. Classification et nomenclature des enzymes
1. Principe
1961 - 1972 : Enzyme commission codification internationale. Un certain nombre
dappellations traditionnelles subsistent, mais lemploi des numros de code est au-
jourdhui obligatoire dans toutes les publications scientifiques et les documentations
techniques et commerciales.
La nomenclature officielle comporte 6 classes, elles-mmes divises en sous
classes. Le numro de code spcifie :
1 - le type de raction (classe)
2 - le type de fonction du substrat mtabolis (sous-classe)
3 - le type de laccepteur
4 - Le numro dordre (dans la sous-sous-classe).
2. Classes et exemples
1 Oxydorductases : raction redox portant sur diffrents rsidus, associant des
coenzymes, des cytochromes, des accepteurs comme O
2
,
EC 1.1.1.67 Mannitol : NAD oxydorductase = Mannitol DH
Mannitol + NAD = Fructose + NADH
EC 1.1.2.3 L - Lactate : ferricytochrome c oxydorductase = Lactate DH
Lactate + 2 Cyt c Fe
3+
= Pyruvate + 2 Cyt c Fe
2+

2 Transfrases : transfert dun groupement carbon, phosphor, azot, etc. dune
molcule une autre.
On distingue parfois les aminotransfrases : transfert dun groupement -NH
2

dune molcule sur un cto-acide, en position : on obtient un nouvel acide ami-
n et les transaminases : le NH
2
nest pas transfr en : le nouveau compos
nest pas un acide amin
EC 2.6.1.20 L - Tyrosine : pyruvate aminotransfrase
L - Tyr + Pyr = p Hydroxyphnyl pyruvate + L - Ala
GOGAT = glutamate oxo-glutarate aminotransfrase
Ph. Collas 6
Glu + Glu = KG + Gln
Kinase = Phosphotransfrases avec transfert dun ATP vers une autre molcule
EC 2.7.1.1 ATP : D - hexose 6 - phosphotransfrase = hexokinase
ATP + D hexose = ADP + D hexose 6 - phosphate
EC 2.7.1.11 ATP : D - Fructose 6 - phosphate 1 - phosphotransfrase =
phospho - fructokinase
ATP + D - Fructose 6 - phosphate = ADP + D - Fructose 1,6 - bis phosphate
3 Hydrolases : liaisons ester, rsidus glycosyle, etc.
EC 3.2.1.4 1,4 (1,3 ;1,4)-D-glucan 4-glucanohydrolase = cellulase
Glucose(n) = Glucose(n-1) + D-glucose
4 Lyases : catalysent lenlvement ou laddition dun groupement autrement que par
hydrolyse
EC 4.1.1.39 3-phospho D glycrate carboxy-lyase [dimerizing] = RubisCO
RuBP + CO
2
= 2 A
3
PG
5 Isomrases :
EC 5.3.1.1 D-glycraldhyde 3-phosphate cto-isomrase = Triose phos-
phate isomrase
Glycraldhyde 3 phosphate = Dihydroxy actone phosphate
6 Ligases : cration dune liaison entre 2 molcules couple avec la dgradation
dune liaison haut potentiel nergtique
EC 6.4.1.1 Pyruvate : dioxyde de carbone ligase (ADP) = pyruvate carboxy-
lase
ATP + Pyr + CO2 + H2O = ADP + Pi + oxaloactate
Ph. Collas 7
III. Ci nti que mi chal i enne
A. Notion de vitesse initiale
P E ES E S + +
Mesure de lapparition du produit au cours
du temps ; Conditions exprimentales :
T, pH, salinit, etc. optimaux
[S] >> [E] et temps court on cherche
rester dans les conditions o [S] >> [P]
Dans ces conditions, [S] et [ES] sont
considrs comme des constantes : cest la phase stationnaire.
On observe deux parties : 1) pente constante vitesse constante, puis 2) apparition
progressive dun plateau vitesse diminue : les conditions initiales ne sont plus vri-
fies, en particulier cause de lpuisement du substrat
B. Influence de la concentration
en enzyme sur la vitesse
On augmente progressivement la concen-
tration en enzyme, toutes choses gales
par ailleurs.
A t1, en condition de vitesse initiale, il y a
proportionnalit entre la [E] et la quantit
de produit form. La courbe V = f ([E]) est
une droite (V = d[P] / dt)
A t2, les conditions initiales ne sont plus vrifies il ny a plus proportionnalit.
Thoriquement, toutes les courbes admettent le mme plateau, mais dans la ralit,
cause de problmes de solubilit, il est trs difficile dobtenir un plateau exprimen-
tal correct.
[P]
Tps
[S]
[ES]
[E]

[P]
Tps
[E] = 1
[E] = 2
[E] = 3
3
2
1
t
1

t
2

Ph. Collas 8
C. Influence de la concentration en substrat
1. Equation de Michaelis - Menten (1913)
Dans la suite du cours, sauf mention
contraire, on considre quon se place en
conditions de vitesse initiale = Vi ou V
0
,
voire V (selon inspiration !)
On trace la courbe V = f([S]) (attention
ne pas confondre avec la courbe [P] =
f(t)!).
Quand [S] augmente, Vi tend vers Vmax
P E
k
k
ES
k
k
S E + +

2
2
1
1

on pose : [E
t
] = enzyme totale, [ES] = complexe enzyme - substrat, donc [E
L
] = [E
t
] -
[ES] = enzyme libre ; [S] = substrat, avec [S] >> [E
t
]
2. Vitesse de formation de ES
On nglige la formation partir de E + P, car [S] >> [E] et on est en Vi [P] est trs
faible : ] ])[ [ ] ([
1
S ES Et
k

3. Vitesse de destruction de ES
] [ ] [
2 1
ES ES
k k
+
4. Etat stationnaire
La vitesse de formation et la vitesse de destruction de ES sont gales. On cherche
isoler [ES]
) ]( [ ] ][ [ ] ][ [ ] [ ] [ ] ])[ [ ] (
2 1 1 1 2 1 1
k k k k k k k
ES ES S S Et ES ES S ES Et + + +

) ] [ ]( [ ) ]( [ ] ][ [ ] ][ [
2 1 1 2 1 1
1 k k k k k k k
S ES ES S ES S Et + + + +

V=d[P]/dt
[S]
Vm
Vm/2
Km

Ph. Collas 9
,
_
+
+
+ +

k
k k k k k
k
S
S E
S
S E
ES
t t
1
2 1 2 1 1
1
] [
] ][ [
] [
] ][ [
] [ , or
K S
S E
ES Vi
t
k
k
+

] [
] ][ [
] [
2
2
, vitesse initiale de for-
mation de P.
On pose
k
k k
m K
1
2 1
+

(car on nglige k
-2
) et ] [
2
max t E V
k
car la vitesse est maximale
quand toutes les molcules denzymes (thoriquement) prennent en charge chacune
une molcule de substrat, donc
] [
] [ max
S K
S V
Vi
m+

max max
2
1
] [ ] [
] [
] [ Si V
S S
S
V Vi S Km
+

Ph. Collas 10
D. Reprsentations graphiques
Exprimentalement, il nest pas possible de dterminer Vmax on ne connat
quune valeur approche. On peut retrouver les deux valeurs importantes Vmax et
Km grce diffrents traitements mathmatiques, parmi lesquels la reprsentation
en double inverse.
1/V
1/[S]
1/Vm
-1/Km

[ ] [
] [
] [
] [
1
] [
] [
max max max
max
V
K
S V
S
S V
K S
V K S
S V
V
m
m
m
+
+

+

max max
1
] [
1 1
V V
K
S V
m
+
1. Lineweaver et Burk
Reprsentation en double inverse : 1/V =
f ( 1/S )
Le problme principal de cette mthode est
la prpondrance accorde aux valeurs les
plus faibles de S et de V, pour lesquelles
lincertitude est pourtant la plus grande. Elle
peut conduire des estimations fausses. Elle
ne devient intressante que pour des valeurs
de [S] leves, donc dans des conditions
saturantes .

[S]/V
[S]
Km/Vm
-Km
pente= 1/Vm

2. Hanes Woolf
Vm
S Km
S Km
Vm
S
V
S Km
S Vm
V
] [
V
[S]
: soit ,
] [ ] [ ] [
] [ +
+

+

On utilise alors la relation :
Vm
Km
S
Vm
+ ] [
1
V
[S]

La droite a une pente de 1/Vm, dont
lextrapolation donne Km lintersection
avec laxe des abscisses.
Ph. Collas 11
V/[S]
V
pente= -1/Km
Vm/[S]
Vm

3. Eadie Hoftsee
La relation utilise est linverse de la prc-
dente :
] [ ] [ ]) [ (
] [
] [
Vm S V VKm S Vm S Km V
S Km
S Vm
V + +
+

Km
V
Km
Vm
S
V
Vm V Km
S
V
+
] [ ] [

La pente est 1/Km, les intersections avec
les axes donnent Vm/[S] et Vm.
V
S
Vm
Km
S1 S2 S3
V3
V2
V1

4. Reprsentation de Schwarzenbach
Mthode purement graphique : on reporte sur
laxe des abscisses les valeurs de [S] et sur
celui des ordonnes celles de V (pour des
couples S
(i)
/V
(i)
de rsultats exprimentaux),
et les droites se coupent en un point
dabscisse Km et dordonne Vm.
Ph. Collas 12
E. Signification de Km
Rechercher Vmax ou 1/2 de Vmax correspond la mme dmarche intellectuelle,
sauf quune est possible exprimentalement, pas lautre (cf. demi-vie des atomes
marqus).
Km a la grandeur dune concentration et reprsente laffinit de lenzyme pour son
substrat. On compare 2 substrats possibles dune enzyme. Leurs Km respectifs sont
diffrents (Km2 > Km1). Cela signifie que, pour atteindre Vmax2, il faut une concen-
tration en S2 suprieure la concentration en S1 ncessaire pour atteindre Vmax1 :
a marche moins bien avec S2. Caricature : si une substance nest pas un substrat
de lenzyme, V = 0, mme avec [S]
On envisage 3 cas.
1. [S] <<Km
] .[ ] .[
] [
] .[
S A v S
Km
Vm
S Km
S Vm
v
+
La concentration en substrat est limitante.
2. [S] Km
2 ] [ ] [
] [
.
] [
] .[
Vm
v
S S
S
Vm
S Km
S Vm
v
+
+

3. [S] >>Km
Vm v
S
S
Vm
S Km
S Vm
v
] [
] [
.
] [
] .[
a
+

Ph. Collas 13
F. Constante catalytique Kcat
Kcat = nombre de moles de P formes par seconde et par mole denzyme.
Si lenzyme possde plusieurs sites catalytiques, lunit change et sexprime par
mole de sites.
Kcat = Vmax / mole denzyme = Vmax / [Et]
Le rapport Kcat/Km est souvent donn comme mesure de l'efficacit catalytique, car
il correspond une constante de vitesse pour de basses concentrations de substrat
(S) << Km, donc (E) = (ET)
Km
S E Kcat
S Km
S Vm
v
] ][ [
] [
] .[
+

Ph. Collas 14
IV. Infl uence des facteurs physi co-
chi mi ques
A. Influence du pH
Le pH joue sur lionisation des molcules :
conformation de la protine enzymati-
que ;
disponibilit des fonctions chimiques de
lenzyme et / ou du substrat (i.e. le subs-
trat rel doit tre sous une certaine forme,
qui nest pas ncessairement la forme de
la neutralit).
En gnral, 2 units du pH optimum, lactivit est rduite 100 fois, mais parfois la
gamme est beaucoup plus restreinte.
Valeurs extrmes : il faut les atteindre pour quil y ait une dnaturation de lenzyme
par attaque acide ou basique, sinon, le plus souvent, cest une inhibition rversible.
B. Influence de la tempra-
ture
1) Augmentation de la temprature :
on fournit de lnergie au systme.
Q10 = facteur daugmentation de
lactivit quand on augmente de 10C
Q10 # 2
2) Dnaturation : la temprature
laquelle elle intervient peut varier,
mais seules quelques exceptions sloignent vraiment de la gamme 40 - 60 C (pro-
tines thermostables).
pH Optimum
Activit enzymatique

Activit enzymatique
TC

Ph. Collas 15
V. Inhi bi ti on
Il ne sagit pas ici des poisons, inhibiteurs irrversibles de lenzyme.
Un inhibiteur dune enzyme est un ligand, non transform par lenzyme, qui modifie
le comportement de cette enzyme. De nombreux types dinhibitions ont t dcrits.
Nous prendrons trois exemples : linhibition comptitive, linhibition non comptitive
et linhibition incomptitive.
[E
t
] = enzyme totale, [S] = concentration initiale en substrat, [ES] complexe enzyme -
substrat,
[E
L
] = enzyme libre
[S] >> [E
t
] ([E
t
] - [ES]) [S] dans les conditions initiales.
k2[ES] = Vi / k2[E] = Vmax
[I] = inhibiteur total, [EI] complexe inhibiteur - enzyme
[I] >> [E
t
] ([E
t
] - [EI]) [I] pendant toute la raction, puisque I nest pas consom-
m.

A. Inhibition comptitive
Linhibiteur ne peut se combiner avec
lenzyme en mme temps que le subs-
trat. Nous considrerons, bien que ce ne
soit pas toujours le cas, que linhibiteur et
le substrat sexcluent mutuellement, pour
des raisons striques, au niveau du site catalytique de lenzyme. Ils ont souvent des
structures analogues.
EI I E P E ES S E + + + et
On a :
] ][ [ ]) [ ] ]([ [ ] [ ] ][ [ ] [ ] ][ [ o d' ,
] [
] ][ [
] [ L t t
t
E S ES E S Km ES S E Km ES S ES
Km S
S E
ES +
+

1/[S]
1/V
Vm = Vm
Km > Km
+ I

Ph. Collas 16
o :
] [
] ][ [
ES
E S
Km
L
, soit encore
] [
] [
] [
S
Km ES
EL
De la mme faon :
] [
] ][ [
EI
E I
Ki
L
, on obtient donc :
Ki
I
S
Km
ES
Ki
I
E EI L
] [
] [
] [
] [
] [ ] [
1. Equation de conservation
Cette quation exprime le fait que toute lenzyme est conserve au cours de la rac-
tion.
)]
] [
1 (
] [
1 ][ [ )
] [
] [ ] [
1 ]( [ ] [ ] [ ] [ ] [
Ki
I
S
Km
ES
Ki
I
S
Km
S
Km
ES EI ES E E L t + + + + + +
2. Equation de vitesse
On a Vi = k2 [ES] et Vmax = k2 [E
t
], do :
)
] [
1 (
] [
1
1
] [
] [
max
Ki
I
S
Km
E
ES
V
vi
t
+ +
, do :
)
] [
1 ( ] [
] [
max
Ki
I
Km S
S
V vi
+ +

et )
] [
1 (
] max[ max
1 1
Ki
I
S V
Km
V vi
+ +
Quand on fait varier [I], les droites obtenues en double inverse se coupent, aprs
extrapolation, en un point dordonne 1/Vmax. ([I] = 0).
On peut lever linhibition par un excs de substrat.
En prsence dinhibiteur, la constante de Michaelis pour le substrat semble augmen-
ter, linhibiteur entrant en comptition avec lui. Laffinit semble diminuer.
Lintersection de la droite avec laxe des 1/[S] a pour abscisse :
)
] [
1 ( '
)
] [
1 (
1 1
'
1
Ki
I
Km m K
Ki
I Km m K
+
+

Ph. Collas 17
B. Inhibition non comptitive
Linhibiteur se combine avec lenzyme
indpendamment du substrat : les deux
peuvent donc se fixer simultanment. La
fixation de I sur lenzyme ne modifie pas
Km. La fixation de S sur lenzyme ne
modifie pas Ki.
E
L
+ S
L
ES E
L
+ P
] [
] ][ [
ES
S E
Km
L

] [
] [ ] [
S
Km
ES EL
E
L
+ I EI
] [
] ][ [
EI
I E
Ki
L

Ki
I
S
Km
ES EI
] [
] [
] [ ] [

ES + I EIS
] [
] ][ [
EIS
I ES
Ki
Ki
I
ES EIS
] [
] [ ] [

EI + S EIS
] [
] ][ [
EIS
S EI
Km
Km
S
Ki
I
S
Km
ES
Km
S
EI EIS
] [
)
] [
] [
] ([
] [
] [ ] [

)
] [
1 )(
] [
1 ]( [ )
] [ ] [
] [
1
] [
]( [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [
Ki
I
S
Km
ES
Ki
I
Ki
I
S
Km
S
Km
ES EIS EI ES E E L t + + + + + + + +
Ki
I
S
Km
S
Km
ki
I
Ki
I
S
Km
Vm
vi
] [
] [ ] [
] [
1
1
)
] [
1 )(
] [
1 (
1
+ + +
+ +

)
] [
1 ( )
] [
1 ]( [
] [
] [ ] [
] [ ] [
] [
ki
I
Km
ki
I
S
S
ki
I
Km Km
ki
I
S S
S
Vm
vi
+ + +
+ + +

)
] [
1 (
'
] [
] [
)
] [
1 (
] [
)
] [
1 (
] [
ki
I
Vm
m V
S Km
S
ki
I
Vm
v
S Km
ki
I
S
Vm
v
i
i
+

+
+

+
+

Quand on fait varier [I], les droites se coupent en un point dabscisse -1/Km :
linhibiteur ne modifie pas laffinit du substrat pour lenzyme.
1/[S]
1/V
Vm < Vm
Km = Km
+ I

Ph. Collas 18
En prsence dinhibiteur, la vitesse maximum, Vmax, semble diminue. Les droites
coupent laxe des ordonnes en un point :
)
] [
1 (
max
1
max '
1
Ki
I
V V
+
C. Inhibition incomptitive
E + S ES P

Km
S
E ES
ES
S E
Km L
L ] [
] [ ] [
] [
] ][ [

ES + I EIS
Ki Km
I S E
Ki
I ES
EIS
EIS
I ES
Ki
L
.
] ][ ][ [ ] ][ [
] [
] [
] ][ [

[E
t
] = [E
L
] + [ES] + [EIS], on remplace par les valeurs correspondantes :
)
.
] ][ [ ] [
1 ]( [ ] [
Ki Km
I S
Km
S
E E L t + +
] [
] [ ] [ : or ,
.
] ][ [ ] [
1
] [
] [
S
Km
ES E
Ki Km
I S
Km
S
E
E L
t
L
+ +

On peut donc exprimer [ES] par rapport [E
t
] :
Ki
S I
S Km
S E
Ki
I
S
Km
E
Ki Km
I S
Km
S
S
Km
E
ES
t t t
] ][ [
] [
] ][ [
] [
1
] [
] [
)
.
] ][ [ ] [
1 (
] [
] [
] [
+ +
+ +
+ +

] [
] [
1
)
] [
1 (
] ][ [
)
] [
1 ]( [
] ][ [
] [
S
Ki
I
Km
Ki
I
S E
Ki
I
S Km
S E
ES
t
t
+
+
+
+ +
or Vi ES k ] [ 2 et max ] [ 2 V V E k t , do
)
] [
1 (
] [
)
] [
1 (
max
] [
Ki
I
Km
S
Ki
I
V
S
Vi
+
+
+

Ki
I
Km
m K
Ki
I
V
V
S Km
S V
v
] [
1
' et
] [
1
max
max '
] [
] max[
+
+

+

En prsence dun inhibiteur incomptitif, le substrat a une affinit apparente sup-
rieure. Ici, Vmax et Km changent.
1/[S]
1/V
Vm < Vm
Km > Km
+ I

Ph. Collas 19
D. Inhibition par excs de substrat
Soit la raction E + S ES P. On a :
] [
] ][ [
ES
E S
Km
L
, soit encore
] [
] [
] [
S
Km ES
EL
Supposons quune deuxime molcule de substrat puisse se fixer sur le complexe
ES et le rendre inactif : cette molcule se fixe sur un site diffrent du premier, et
nous lappellerons site inhibiteur. Cette molcule se comporte comme un inhibiteur :
ES + S ESS
] [
] ][ [
ESS
S ES
Ki , soit encore
Ki
S
ES ESS
] [
] [ ] [
)
] [
] [
1 ]( [ ] [ ] [ ] [ ] [
Ki
S
S
Km
ES ESS ES E E L t + + + +
)
] [
] [
1 (
max
1 1
] [
] [
1
max
] [
] [
max Ki
S
S
Km
V vi
Ki
S
S
Km
V
vi
E
ES
V
vi
t
+ +
+ +

Si [S] est grand, 0
1
soit )
] [
] [
1 ( donc
] [
a a a a V
vi Ki
S
S
Km
Km
S
+ +
1/[S]
1/V
1/Vm
-1/Km
[S]
1/V
1/Vm
-1/Ki

Quand on porte 1/Vi en fonction de 1/[S], on obtient une hyperbole dont
lasymptote oblique, de pente Km/Vmax, coupe laxe en un point -1/Km.
Quand on porte 1/Vi en fonction de [S], on obtient une hyperbole dont lasymptote
oblique, de pente 1/Vmax. Km coupe laxe des [S] en un point dabscisse -Ki.
Dans les deux cas, Vi passe par un maximum pour Ki Km S . ] [
Ph. Collas 20
VI. Al l ostri e
A. Considrations gnrales
1. Dfinition
Lallostrie dsigne une variation de conformation de protines sous leffet de la fixa-
tion dun substrat ou dune molcule effectrice, do lacquisition de proprits parti-
culires (changement dactivit.) On dcrit cela comme des effets coopratifs. Ceux-
ci sont concevables si et seulement si la macromolcule est sous forme oligomri-
que.
Forme relche
Forme compacte

Exemple : un ttramre constitu de 4 sous-units (monomres) activit biologique
et de 4 sous-units de liaison.
La fixation dun substrat entrane une modification de lensemble de la structure.
Toutes les sous-units reproduisent lunisson la variation de conformation subie
par lune delles.
2. Proprits dune molcule allostrique
Il existe une structure quaternaire (en pratique, entre un dimre et un ttramre)
La variation de conformation de la structure dpend du taux doccupation des sites
de liaison.
Pour toutes les enzymes allostriques, la cintique nest pas michalienne.
Ces molcules jouent des rles clef dans la rgulation du mtabolisme.
Ph. Collas 21
3. Types
Il y a deux types denzymes allostriques :
Systme K : la rgulation se traduit par la variation de la fixation du substrat ou par la
variation de laffinit du substrat pour lenzyme, do une variation du Km
Systme V : la rgulation porte sur la vitesse maximale. Dans ce cas, cela corres-
pond une variation de la constante k
2
des enzymes michaliennes.
B. Structure et fonction de lATCase
Laspartate transcarbamylase (ATCase) est implique dans la rgulation des bases
pyrimidiques.
Raction :
N H
2
O
O
P
-OOC
NH
3
+
COO-
-OOC
COO- N
H
O
NH
2
+
Carbamyl-P
Aspartate
ATCase
Carbamyl-aspartate
+ Pi

On suit la cintique dapparition du produit par mesure de DO
465
.
1. Cintique de lATCase
V
[S]
1
2
3
4
1 - ATCase

2 - ATCase + CTP

3 - ATCase + ATP

4 - ATCase
dsensibilise

Les courbes sont des sigmodes : laspartate joue un rle deffecteur coopratif posi-
tif sur lactivit de lenzyme : faible concentration en substrat, la vitesse nest pas
Ph. Collas 22
leve ; plus on lve la concentration, plus la vitesse prend lallure dune courbe de
Michaelis.
Le CTP joue un rle ngatif sur lATCase : inhibition de lactivit.
En prsence dATP, il y a activation de lATCase : cest un effecteur positif.
Quand lATCase est dsensibilise (par un agent chimique), il ny a plus de rgula-
tion : les proprits allostriques sont perdues.
2. Interprtation
La rgulation allostrique correspond au frein moteur de lactivit enzymatique :
avec le CTP, la vitesse diminue comme quand on lve le pied ; avec lATP, elle
augmente comme quand on acclre.
CTP : la molcule de base est la cytosine. Quant trop de cytosine est produite, le
produit de fin de chane va rguler lenzyme en amont de la voie de synthse : rtro-
contrle ngatif.
ATP : quand il y a beaucoup dadnine (base purique), il y a activation de la syn-
thse des bases pyrimidiques : rtrocontrle positif.
Lallostrie est donc un outil de rglage fin, de rgulation directe, instantane, qui
nest pas du mme ordre que, par exemple, lactivation de lopron Lactose qui est
un systme trs lourd.
3. Structure de lATCase

Lenzyme est forme de 2 trimres qui sont le support
de lactivit catalytique et de trois dimres qui sont les
sous-units rgulatrices.
Domaine
allostrique
Zn

La sous-unit rgulatrice possde un domaine allostri-
que et un site de fixation du zinc qui permet linteraction avec les trimres.

Ph. Collas 23
La sous-unit catalytique possde un domaine quatorial pour la fixation de
laspartate et un domaine polaire pour la fixation du carbamyl-phosphate.
Loligomre prsente deux formes, la forme T inactive (compacte) et la forme
R active (relche).
4. Effets homotropes ou htrotropes
[ T ] [ R ] avec K
q
.
En prsence de substrat :
R + S RS R + P
Mais, quand on augmente [S], on induit la formation de RS, et donc une diminution
de [R] libre, do un passage de la forme T la forme R, do une diminution de T
dans la cellule : Le substrat S joue un rle homotrope positif.
En prsence dun effecteur positif (ATP) :
On a toujours quilibre entre les formes T et R, mais cette fois R se lie aussi E :
T R + E RE + S
Donc [R] diminue, donc transition T R, donc diminution de [T] libre. Effet htro-
trope positif.
En prsence dun effecteur ngatif (CTP)
Leffecteur se lie la forme T pour former un complexe TE, do une diminution de la
forme T libre, transition de R vers T et diminution de la forme R, ce qui correspond
une inactivation de lenzyme. Effet htrotrope ngatif sur lenzyme.
Ph. Collas 24
C. Approche thorique de la cooprativit
1. Cas dune enzyme 2 sous-units catalytiques
Deux sous-units distinctes ont permis la
fixation du substrat sur lenzyme.
1
1
. .
k
S E
SE ES
SE
E.S
ES
S E
k

2 1 2
2
.
. . .
k k
S E
k
S
SE SES
SES
S SE
SES
S ES
k
v = k
+2
.ES + k
+2
SE + 2 k
+2
SES
Et = E + ES + SE + SES
En remplaant les valeurs par les ex-
pressions trouves prcdemment, on obtient :
1
]
1
+
+
k k k
k
S S
E v
2 1 1
2
2 et [ ]
2 1 1
2 2
.
2
1 . 2 2
k k
S
k
S
E k Et k Vm + + + +
Do :
2 1 1
2 1 1
.
2
1
.

k k
S
k
S
k k
S
k
S
Vm
v
+ +
+

On envisage alors deux cas :
La fixation du premier substrat est sans effet sur celle du second : il ny a donc
pas de diffrence entre k
1
et k
2
.
S K
Vm.S
v : o d' , k k K avec ,
D
2 1 D
+

+
S K
S
Vm
v
D
et si k
+2
est trs faible, K
D
= Km : il ny
a pas de rgulation allostrique, cest une enzyme michalienne.
La fixation du premier substrat modifie celle du second : k
1
# k
2
.
. 2 .
.
2 2 1
2
S S k k k
S S k
Vm
v
+ +
+

Quand k
2
<< k
1
, la fixation du second substrat est facilite par celle du premier, et
que k
2
< S < k
1
:
.
.
2 1 S k k
S Vm
v
+

2. Gnralisation de lquation
Dans le cas dune rgulation allostrique, on a :
E
ES
E + 1P
SE
E+1P
SES E+2P
k
1

k
1

k
2

k
2

k
+2

k
+2

k
+2

Ph. Collas 25
n 2 1 k ... x k x k Kh et es catalytiqu sites de nombre n avec ,

.

+
S
S
n
n
Kh
Vm
v
( ) ( )
Kh
S
n
v Vm
v
Kh v Vm
v
Vm v vKh log . log .
S
S S
n
n n
+
n = 1 : pas de rgulation al-
lostrique
ou rgulation allostrique
par cooprativit ngative du
substrat
n = 2 : rgulation allostrique
avec 2 sous-units catalyti-
ques.
Remarque :
n = nombre de Hill = nombre
de sous-units rgulation
allostrique. Exemples :
Phosphofructokinase : n = 4
Lactate DH : il y a 4 sous-units, mais n = 1 : pas de rgulation allostrique.
On prend les pentes des droites au niveau des valeurs nulles sur les axes.
log [v/(vm-v)]
log (S/Kh)
pente = 1
n = 1
n = 2
0
0

Ph. Collas 26
VII. Racti ons deux substrats
A. Fixation alatoire
E
A
EA
B
EB
A
B
EAB
P
EQ
Q
Q
EP
P
E EPQ
ka
kb
kb
ka kc

ka et kb sont diffrents de ka et kb : lenzyme est modifie par sa liaison A ou B.
En conditions de vitesse initiale, la vitesse de retour est ngligeable. Comme ltape
limitante est la formation de EPQ partir de EAB, on se contente dexprimer V par-
tir de la concentration en EAB : v = kc. [EAB].
[Et] = [E] + [EA] + [EB] + [EAB] et Vm = kc. [Et].
1. Dmonstration de lquation
1)
ka
A
E EA
EA
A E
ka
] [
] [ ] [
] [
] ].[ [

2)
kb
B
E EB
EB
B E
kb
] [
] [ ] [
] [
] ].[ [

3)
a k kb
A B
E
a k
A
EB EAB
EAB
A EB
a k
' .
] ].[ [
] [
'
] [
] [ ] [
] [
] ].[ [
'
4)
ka b k
A B
E
b k
B
EA EAB
EAB
B EA
b k
. '
] ].[ [
] [
'
] [
] [ ] [
] [
] ].[ [
'
En conditions de vitesse initiale, [EAB] = constante, do :
5) ka.kb = ka.kb
kb a k
B A
kb
B
ka
A
Et
E
kb a k
B A
kb
B
ka
A
E Et
. '
] ].[ [ ] [ ] [
1
] [
] [
. '
] ].[ [ ] [ ] [
1 ] [ ] [
+ + +

,
_
+ + +
or, daprs la relation 4 : b k ka
B A
EAB
E ' . .
] ].[ [
] [
] [ , do :
Ph. Collas 27
1
*
*
] [
'
] [
'
] ].[ [
' .
] [
. '
] ].[ [ ] [ ] [
1
] ].[ [
' .
] [
] [
+ + +
,
_
+ + +
A
a k
B
b k
B A
b k ka
Et
kb a k
B A
kb
B
ka
A
B A
b k ka
Et
EAB (NB : * daprs la relation 5)
soit :
] ].[ [
. '
] [
'
] [
'
1
ou
] ].[ [
' .
] [
'
] [
'
1
B A
kb a k
B
b k
A
a k
Vm
v
B A
b k ka
B
b k
A
a k
Vm
v
+ + +
+ + +

Signification des constantes : ka et kb sont les constantes de formation des com-
plexes EA et EB, ka et kb sont les constantes de dissociation. En prenant diffrents
cas, on a :
1)
K
A
m
a k
Vm Vm
v '
2
1 1
a k' [A] saturant, [B]
0 0

+ + +

+ +

2) Rciproque : kb=K
m
B
] [ ]. [
.
] [ ] [
1
B A
ka
B A
Vm
v
K K K
B
m
B
m
A
m
+ + +

2. Reprsentation graphique
a 1/v = f(1/[A])
] [
1
] [
1
] [
1
1
] [ ] [ ] [ ] [
1
1 1
] [ ] [ ] [ ] [
1
A B
kb
Vm
K
B
K
Vm B
kb
A
K
B
K
A
K
Vm v
B
kb
A
K
B
K
A
K
Vm
v
A
m
B
m
A
m
B
m
A
m
A
m
B
m
A
m

,
_
+ +
,
_
,
_
+ + +
+ + +

[B] = constante : y = ax + b
[B] saturante :
] [
1 1 1
A Vm Vm v
K
A
m
+
[B] limitante : expression complte

,
_
+
] [
1
1 1
0
] [
1
B
K
Vm v A
B
m

cste 1/v , [B]
] [
1
1
] [ ] [ ] [ ] [
1
1 1
] [
,
_
,
_
+ + +
A Vm B A
ka
A B Vm v
ka A
K K K K
A
m
B
m
A
m
B
m

Ph. Collas 28

-1/Km(A)
-1/Ka 1/[A]
[B] diminue
[B] saturante
1/Vm
1/V

On peut donc dterminer ka, K
m
A
, K
m
B
, Vm, mais pas kb !
Pour dterminer kb, on ralise un graphique secondaire : on prend les valeurs de
1/v pour les diffrentes [B] quand 1/[A] = 0 (les intersections de laxe des ordon-
nes) :

1/v
1/[B]
1/Vm
-1/K
m
B

] [
1
.
1 1
B Vm Vm v
K
B
m
+

b 1/v = f(1/[B])

)
] [ ] [
... ou
] [
.
] [ ] [ ] [
1
1 1
B
kb
A B A
ka
B A Vm v
K K K K
A
m
B
m
B
m
A
m
,
_
+ + +

)
] [
1 (
] [
)
] [
1 (
1 1
A
ka
B A Vm v
K K
B
m
A
m
+ + +
Si [A] est saturante Michaelis
Menten un substrat
Si [B] = - kb [A] , ) 1 (
1 1

kb Vm v
K
B
m

Il faut l aussi faire un graphique secondaire pour obtenir tous les paramtres.
1/[B]
1/V
-1/kb
1/v=1/Vm(1-K
M
B
/kb)

Ph. Collas 29
c Remarques particulires
Quand on fait varier [A] et que [A] = -ka, 1/V > 0 ;
Quand on fait varier [B] et que [B] = - kb, 1/V < 0, donc :
K
M
A
/ ka < 1 : la fixation de A est facilite quand B est dj fix (laffinit est sup-
rieure) ;
K
M
B
/ kb > 1 : la fixation de B est meilleure sur lenzyme libre
la fixation de substrats dpend de ltat de lenzyme.
d Fixation indpendante des substrats
K
M
A
= ka et K
M
B
= kb : la fixation dun substrat nest pas affecte par la fixation de
lautre. Dans ce cas :
,
_
+ + +
] [ ] [ ] [ ] [
1
1 1
B A B A Vm v
K K K K
B
M
A
M
B
M
A
M

: t dveloppan en
] [
1
] [
1
] [
1
1
] [
1
] [
1
] [
1
1 1
B A Vm A Vm A B Vm B Vm v
K K K K K K
A
M
B
M
A
M
B
M
A
M
B
M
,
_
+ +
,
_
,
_
+ +
,
_
+
1/V
1/[A]
[B] saturante
1/v=1/Vm(1+K
M
B
/[B])
-1/K
M
A

Faire le graphique secondaire.
Ph. Collas 30
B. Mcanisme ordonn
1. Equation
E EA EAB=>EPQ EQ E
A B P Q
ka kb
k

ka
A
E EA
EA
A E
ka .
.

kb
B
ka
A
E
kb
B
EA EAB
EAB
B EA
kb . . .
.

kb ka
B A
ka
A
Et
E
kb ka
B A
ka
A
E EAB EA E Et
.
.
1
)
.
.
1 (
+ +
+ + + +
)
.
.
1 (
.
.
.
. .
.
or
kb ka
B A
ka
A
B A
kb ka
Et
B A
kb ka
E
EAB
B A
kb ka
EAB E
+ +

B A
kb ka
B
kb
Vm
v
.
.
1 + +

Si A et B = kb v=Vm / [ 1 + 1 + 0
+
] # Vm/2 kb=K
m
B

KmA = 0 : A ne peut quitter le complexe ternaire EAB tant que B est en place.
2. Reprsentations graphiques
a 1/v=f(1/A)
,
_
+ +
A B
ka
B Vm v
K K
B
m
B
m 1
.
.
1
1 1

,
_
+
B Vm v A
K
B
m
1
1 1
0
1

Ph. Collas 31
B
Vm B B Vm v
ka A
K K
B
m
B
m

,
_
+ ,
1
1
1 1
1/v
1/[A]
1/Vm
-1/ka
[B] saturante
[B] diminue

A partir des valeurs de V pour 1/A = 0, on trace un graphique secondaire, qui re-
prsente la droite 1/v = 1/Vm (1 + K
m
B
/B), qui a lallure des droites michaliennes :
1/v
1/[B]
1/Vm
-1/K
m
B

b 1/v=f(1/B)
( )
B A
ka
Vm Vm B A
ka
B Vm v
K K K
B
m
B
m
B
m 1
1
1
.
.
1
1 1
+ +
,
_
+ +
Ph. Collas 32
1/v
1/[B]
[A] saturante
[A] diminue

B Vm Vm v
A
K
B
m 1
.
1 1
+ a , cf. Michaelis Menten
Vm B
A
1
v
1
0
1
quand , , donc il ny a pas de graphique secondaire, puisque 1/v =
constante.
Ph. Collas 33
C. Mcanisme alternatif
E EA E EB E
A P
1
B P
2

2
4
2
2
1
3
1
1
' ' ' P E B E B E P E EA A E
k
k
k k
k
k
+ + + +

1. Equations
Dmonstration en conditions de vitesse initiale, donc avec toutes les concentrations
constantes.
On obtient finalement une relation symtrique par rapport A et B (donc on ne traite
quun seul cas ci-dessous) :
A B
Vm
v
K K
A
m
B
m
1 + +

2. Reprsentation graphique
A Vm
v
B Vm B A Vm v
K K K K
A
m
B
m
B
m
A
m 1
. 1
1
1
1 1
+
,
_
,
_
+ +
Menten) - Michaelis (cf.
1
.
1
v
1
, B Si
A Vm Vm
K
A
m
+ a
,
_
+
B
K
B
m
1
Vm
1
v
1
0
A
1
Si
,
_
+
B
K
B
m
1
1
-
A
1
0
v
1
si
K
B
m

Ph. Collas 34
1/[A]
1/v
[B] saturante
[B] diminue
1/Vm
-1/K
m
A

Pente = K
m
A
/ Vm

Enzymologie Thorique Bio 2 M1

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Enzymologie Thorique Bio 2 M1

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Ph.

Vous aimerez peut-être aussi