POPULATION D ADN COMPLEXE

- ADN gnomique
ou
- copie d ARNm = CDNA
Dtection spcifique

Amplification spcifique

Clonage dans
des vecteurs

Amplification in vitro

- hte cellulaire
- vecteur
- lier le fragment
d ADN au vecteur
- transfert dans
lhte

- polymrase
thermostable
-information sur la
squence permettant
de gnrer des amorces
damplification

PCR

Hybridation molculaire
- Sonde ADN ou ARN
marque

HYBRIDATION MOLECULAIRE

cible
Sonde

hybridation

Sonde
hybride

Complmentarit
3 interactions
hydrogne

N
N
N

Guanine
Guanine

NH

O
NH

Cytosine
Cytosine

NH
N

N
Thymine
Thymine

N
HN

CH3

H NH

2 interactions
hydrogne
Adnine
Adnine

I DEFINITION de la FUSION et de LHYBRIDATION

MOLECULAIRE
sb

db
temprature
Tm
ADN
double brin

Simple brin
ADN
simple brin

Dnaturation
- chauffage > Tm
- agent dnaturant

glace
refroidissement progressif
REAPPARIEMENT
HYBRIDATION

II- FACTEURS DE LHYBRIDATION

-Temprature de fusion
-Facteurs influenant lhybridation
- la C% dADN et le temps
COT ( ADN) et ROT (ARN)
- la temprature
- la complexit des squences
- la force ionique

II- FACTEURS DE LHYBRIDATION

-Temprature de fusion
-Facteurs influenant lhybridation
- la C% dADN et le temps
COT ( ADN) et ROT (ARN)
- la temprature
- la complexit des squences
- la force ionique

III - Les diffrents types dhybridation

Lhybridation peut avoir lieu
1 - en solution
2 - sur support solide :
immobilisation de la cible sur
(nitrocellulose, nylon), sur verre
colonies bactriennes
chromosomes
coupe de tissus...

une

membrane

Objectif : dtecter la prsence d'un acide nuclique d'une

squence donne par lutilisation dun fragment dADN
complmentaire = sonde

IV APPLICATIONS DE LHYBRIDATION
1-Hybridation dADN sur support solide : SOUTHERN BLOT

Procdure

Extraction ADN
Fragmentation
Electrophorse
Transfert
Hybridation, lavages, rvlation

SOUTHERN BLOT

..\Bureau

 Applications
- Recherche daltrations sur un gne
- Empreintes gntiques
-

Southern blot : illustrations RFLP

E

sonde

6 kb

AA BB CC AB AC

2 kb
- 8 kb

E
- 6 kb

8 kb
E

sonde

sonde
5 kb

- 5 kb
E

2 kb

2 -Hybridation dARN sur membrane

Northern Blot
Procdure

Extraction ARN
Electrophorse
Transfert
Hybridation, lavages, rvlation

Application
- Analyse de lexpression dun gne
- Recherche de variants dpissage

E
- 3 kb
- 2 kb

NORTHERN BLOT

3 - Hybridation dADN in situ

Procdure
Hybridation de sondes fluorescentes sur
chromosomes en mtaphase

Applications
Recherche de remaniements du gnome
Localisation dun gne

Hybridation in situ sur chromosome

Objectif : dterminer sur quel chromosome et dans quelle rgion
se trouve le gne dont on possde la sonde.
En pratique:
- prparation des chromosomes
- hybridation directement sur les prparations fixes sur lame
- Sonde marque au tritium (H3): rayonnement trs court, donne
donc une localisation fine de la zone mettant la radioactivit.
- rsultat lu sous microscope : les signaux positifs
apparaissent sous forme de grains noirs disposs
sur les chromosomes.

Dtection d'un
gne de
Drosophile

Localisation chromosomique

Localisation en 2q13

Rouge : sonde gne BCL11A

Vert: sonde centromre chromosome 2

Hybridation in situ

Dtection du virus d'Epstein-Barr
laide dune sonde
reconnaissant lARN (= gnome) du virus
- coloration nuclaire bleu fonce des noyaux infects
- contre coloration verte des autres noyaux

Indications: Syndromes lymphoproliferatifs et lymphomes

Hybridation sur coupe de tissu

Objectif : dterminer quelle sous population du tissu exprime
un ARN donn (un tissu est gnralement constitu de diffrents
types cellulaires, pas toujours faciles sparer)

Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une hybridation

avec une sonde d'un gne impliqu dans le dveloppement
embryonnaire

Hybridation sur colonie de bactries, sur plage de lyse

Objectif: dtecter parmi un grand nombre de bactries ou de phages
recombinants celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherch
--> criblage de banque

Botes avec colonies

-bactries ou phages(milliers millions)

Coussin de NaOH
(clatement cellules +
dnaturation ADN)

Hybridation
Lavages

+ Sonde
Prise
d'empreinte
(nylon ou
nitrocellulose)

Fixation
(cuisson ou UV)

Autoradiographie

Localisation des
clones d'intrt

LES SONDES

LES SONDES
I

Dfinition

II - Les diffrents types de sondes

- les sondes ADN gnomique
- les sondes cDNA
- les oligosondes
- les ribosondes
III- Obtention des sondes
- clonage
- PCR
IV Marquage des sondes

IV Marquage des sondes

1 - lagent de marquage :
- marquage radioactif

32P, 35S, 3H

- marquage froid
- direct nuclotide modifi par un fluorophore
- indirect nuclotide marqu par un reporter qui
sera repr par une molcule affine
2 stratgies de marquage
- nick translation
- multi-amorage au hasard
- marquage des oligonuclotides

Les sondes radioactives

32P, 35S, 3H

Attention : les sondes radioactives prsentent de

nombreux inconvnients :
1. ncessit de se protger contre le rayonnement mis,
maniement des sondes inconfortable
2. dcroissance rapide du 32P, d'o besoin de marquer les
sondes frquemment
Avantage : grande sensibilit

Les sondes froides

Marquage direct avec un fluorophore
Le nuclotide portant le marqueur est incorpor directement,au
cours de la synthse du fragment dADN.
Groupe chimique qui fluoresce quand il est expos une longueur
donde donne : Fluoresceine, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas red,
TAMRA, TET,

Marquage indirect : nuclotide marqu par un reporter qui

sera repr par une molcule affine
- digoxignine

- marquage par la biotine-streptavidine.

MARQUAGE PAR TRANSLATION DE

COUPURE - Nick Translation
Endonuclase utilise dans des conditions
mnages

La DNAse gnre quelques cassures alatoires

simple brin

Au niveau des cassures la DNA polymrase I dtruit

lADN par son activit exonuclasique (5-3).

et le synthtise par son activit polymrase en

prsence de nuclotides dont un est marqu

MARQUAGE PAR MULTI AMORCAGE

AU HASARD
Random priming
Sparation des 2 brins

Ajout dun cocktail doligonuclotides

Hybridation au hasard

Les oligonuclotides servent damorces la

Polymrase (fragment de Klenow de la Pol I)
qui utilise des nuclotides libres dont 1 est
marqu
Brin nosynthtis radioactif

MARQUAGE DUN OLIGONUCLEOTIDE