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Structure des acides nucléiques (AN)

1- Structure des nucléotides


1.1- Constituants élémentaires
1.2- Nucléosides
1.3- Nucléotides
1.4- Liaison phosphodiester

2- Structure spatiale de l’ADN


2.1- Composition en bases
2.2- La double hélice
2.3- Structure tertiaire
2.4- Compaction de l’ADN
2.4.1- Organisation de l’ADN des virus
2.4.2- Organisation de l’ADN des bactéries
2.4.3- ADN mitochondrial
2.4.4- Organisation de l’ADN des eucaryotes

3- Acides ribonucléiques
3.1- Structure
3.2- Différents types d’ARN

4- Propriétés des acides nucléiques


4.1- Solubilité
4.2- Absorption dans l’U.V. : effet hypochrome et effet hyperchrome
4.3- Hydrolyse des acides nucléiques

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Structure des acides nucléiques (AN)
AN = macromolécules présentes dans toutes les cellules vivantes
soit libres, soit combinés à des protéines
AN = polymères constitués d’unités appelées nucléotides
une base hétérocycle azotée, un pentose, un groupement phosphate,

Selon pentose  deux types d’AN :


 ADN ou DNA contenant du désoxyribose
double hélice = support de l’information génétique (information nécessaire à la synthèse des
protéines)
 ARN ou RNA contenant du ribose
– généralement un seul brin,
– copies de fragments d’ADN.

Dogme central de la biologie moléculaire


L’équation « un gène = une protéine » a évolué car un gène peut être composé de plusieurs
séquences, les exons qui codent et les introns qui ne codent pas. L’ARN produit peut alors subir
un épissage alternatif conduisant à plusieurs protéines à partir d’un même gène.
Nouvelle équation : « un gène + des régulations + l’épissage = une ou plusieurs protéines ».

Découverte de régulations dues aux facteurs épigénétiques, protéines régulatrices, structure des
histones...

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1- Structure des nucléotides : constituants de base
 pentose  groupement phosphate  base hétérocycle azotée

5 O 5 O
HOH2C HOH2C
OH OH
4 H H 1 4 H H 1
3 2 3 2
Pentoses H H H H
OH OH OH H

-D-ribose -2-désoxy-D-ribose

O
liaison ester

O P O
O
CH2 OH
Phosphate   O O
O P O

O
H
OH
-D-désoxyribose -5'phosphate

Les bases azotées dérivent toutes de deux bases hétérocycliques : la purine et la pyrimidine

Purine Pyrimidine

6H 4H
1 C 5 7N N
N 3 C 5 N
N C 8 N CH
CH 2 6
HC C N HC CH
2 N3 4 N9 N H N
H 1N

Adénine Guanine Uracile Thymine Cytosine

NH2 O O NH2
O
CH3
N N NH NH
N NH N

N H2N N O N O
N N N N O
H H H H H

NH2 O O O NH2
H3C

A G H2N U O
T O C O

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Bases mineures ou bases modifiées dans l’ADN ou ARN

5-methyl-cytosine 6-methyl-amino-adénine 5,6-dihydro-uracile


NH2 H3 C H O
CH3 N
N HN
H
N
N
O N O N
H H
N N

Signal de régulation de Permet aux enzymes de restriction de la Dérivés hydrogénés ou soufrés des
l’expression des gènes bactérie de reconnaître son ADN dans les ARN

Bases mineures d’intérêt biologique


Produits à usage pharmacologique :
 caféine (stimulant du système nerveux),
 théobromine et théophylline (stimulants cardiaques, relaxant des muscles lisses)

O O O
CH3 H CH3
H3C N H3C N H3C N
N N N

O N N O N N O N N
H
CH3 CH3
caféine théophylline théobromine
1,3,7-tri-methyl-xanthine 1,3-di-methyl-xanthine 3,7-di-methyl-xanthine

Analogues de synthèse
• Molécules de marquage en biologie moléculaire : 5-bromouracile
• Agents thérapeutiques entrent en compétition avec les bases naturelles : bloquent la
multiplication des bactéries
– Antitumoraux ;
– Antiviraux (acyclovir = dérivé de la guanine)

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Nucléosides

pentose base
Condensation d’un pentose avec une base nucléique azotée
par une. liaison N-osidique.
nucléoside

La liaison implique le carbone C1 du pentose et :

L’azote N1 des pyrimidines Ou l’azote N9 des purines

NH2 NH2
NH2
NH2 N
N H2O N N
cytosine adénine N
1 N 9
N O N N
N N
HO H HO
H N O
CH2 CH2
HO CH2 OH HO O OH O
O O
H H H H 1 H H
1 H H
H H2O
H H H H H
H H OH OH OH OH
OH H OH H

-desoxy--D-ribose 2'-désoxy-cytidine -D-ribose adénosine

Nucléotides

Les nucléotides = esters-phosphates de nucléosides. (phosphate)n pentose base


azotée
La phosphorylation se fait le plus souvent en position 5’ du pentose
(ribose 5-P, désoxyribose 5-P).
nucléoside
nucléotide-n-P

Liaison ester N Adénosine triphosphate (ATP) N


N NH2 N NH2
O 5' C O O
5'
O C

O P O CH2 O N O P O P O P O CH2 O N
N N
O 1' O O O 1'

HO OH HO OH

Les quatre désoxynucléotides triphosphates ou dNTP (dATP, dGTP, dCTP et dTTP) servent de précurseurs
dans la biosynthèse de l’ADN.
Les 4 ribonucléotides triphosphates ou NTP (ATP, GTP, CTP, UTP) sont des précurseurs des ARN. Ils jouent
aussi un rôle important à l’état libre dans les cellules (le plus connu est l’ATP).

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Liaison phosphodiester

extrémité 5'P libre :


Les AN sont des polymères de nucléotides nucléotide 1 O

reliés entre eux par des liaisons O P O
phosphodiester entre le carbone 3’ d’un O 5' B1
nucléotide et le carbone 5’ du nucléotide CH2 O
suivant. H H 1'
Ces liaisons donnent un sens à la molécule H 3' H
O H
d’acide nucléique avec une extrémité 5’P

libre et une extrémité 3’OH libre. O P O
B2
O 5'
Par convention : CH2 O
─ Le début est le nucléotide dont le H H 1'
phosphate en C5 est libre
H 3' H
─ La fin correspond au nucléotide dont la O H
liaison 
fonction alcool en C3 n’est pas phosphodiester O P O
O 5' B3
estérifiée
CH2
O
5' 3'
extrémité 3' libre : H H 1'
5' ATGCTC 3'
nucléotide n H 3' H
H
OH

Représentations simplifiées de polymères


Ribonucléotide Désoxyribonucléotide Exemple d’une séquence d’ADN
Base Base Base Base
1 1
A T C G G C A
ou ou
2 OH 2 5'P

P P P P P P 3'OH
P 3 OH P P 3 OH P
5 5
4 4

2- Structure spatiale de l’ADN

Composition en bases (CHARGAFF 1940 ) :


[Pur] = [Pyr]
─ le nombre de purines est toujours égal au nombre de
ou [A] + [G] = [T] + [C]
pyrimidines :
─ les fractions molaires des bases sont telles que : [A] = [T] et [G] = [C]

Ainsi, il apparaît une complémentarité par des liaisons hydrogène entre (A et T) et (G et C)


hybridation.
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L’hybridation entre guanine et cytosine (3 liaisons H) est plus stable que celle adénine-thymine (2 liaisons H).

H H
O H N N H O

H3C N N
NH N N HN

N N N O H N N N
N O H H
H H
thymine (T-A) adénine cytosine (C-G) H guanine

La composition en bases de l’ADN est caractéristique d’un organisme :


Toutes les cellules d’un même organisme ont un ADN de même composition A+T A=T
en bases. On caractérise les ADN des différentes espèces par la valeur du avec
rapport (A+T) / (G+C). Ce rapport est en général supérieur à un (> 1) chez les G+C G=C
animaux et les végétaux. ( E. Coli : 1 ; Homme : 1,50 ; Mouton : 1,36 )

La double hélice (WATSON et Crick 1953)


3'
H OH – les molécules d’ADN sont
H H
formées de deux chaînes
H H
dont les nucléotides
O- O
H2C O complémentaires sont
- sens 3'-5'
O P O A T -
5' O P O hybridés deux à deux sur
O CH2
O toute la longueur ;
H H H O
H H
H H – les deux chaînes sont
O H H H
O antiparallèles, c’est à dire
H2C
-
O P O
C
que l’extrémité 5’ de l’une
G O
O CH2
est du côté de l’extrémité 3’
O O P O- de l’autre ;
H H
H H H O – les bases azotées liées par
O H H H
les liaisons hydrogènes
- H H
O P O
O
sont tournées vers
H2C O
l’intérieur, tandis que les
O G C
sens 5'-3' O P O- riboses et les acides
CH2
O phosphoriques, hydrophiles
H H H O
H H sont tournés vers
H H
O H H H l’extérieur.
O 5'
H2C
-
O P O T A
– les charges négatives des
O
O CH2 groupements P se
O O P O-
repoussent et provoquent
H H O-
l’enroulement en double
H H
OH H hélice
3'

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Des protéines forment des liaisons avec l’ADN au fond des sillons.

Structure tertiaire
• Palindromes : mots qui se lisent de gauche à droite ou de droite à gauche : Radar ; Kayak ; été ; ..
• Séquence d’ADN pouvant se lire de la même façon dans les deux sens
- soit sur le même brin  ATTGC – CGTTA - soit sur les deux brins  AACGTT – TTGCAA
TTGCAA – AACGTT
• Certains segments d’ADN palindromiques peuvent produire des structures cruciformes

Structures cruciformes ADN-H (triplex) ADN-G4 (quadriplex)

brin riche en purines

brin riche en pyrimidines

Conditionnement de l’ADN

Organisation de l’ADN des virus

ADN des virus généralement de taille


nucléocapside matrice
modeste:
acide nucléique
 double ou simple brin, protéine de
surface
 circulaire ou linéaire ; capside
 souvent associée à des protéines qui
forment une capside enveloppe
virale

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Organisation de l’ADN mitochondrial
 4 à 6 molécules d’ADN bicaténaire et circulaire,
 composition nucléotidique différente de celle du noyau avec un taux de GC faible.
 essentiel au bon fonctionnement de ces organite (code pour certaines protéines mitochondriales).
 dans la plupart des cas il est transmis par la mère.

Organisation de l’ADN des bactéries


 un ou plusieurs chromosomes d’ADN double brin
 généralement circulaire,
 compacté par surenroulement pour former le nucléoïde attaché à la membrane
 éventuellement des plasmides : copies d’ADN double brin circulaire de petite taille.

Organisation de l’ADN des eucaryotes dans le noyau


ADN associé à des protéines histones formant la chromatine
Les histones protéines chargées positivement s’associent étroitement à l’ADN..
Le nucléosome = premier niveau de compaction de l’ADN composé d’ADN et d’histones (enroulement de
l’ADN : 1,65 tour sur une longueur de 146 pb). Cette structure est ensuite régulièrement répétée pour former le
nucléofilament qui lui-même, adopte des niveaux d’organisation plus compacts. Le niveau de condensation le
plus élevé est atteint au sein du chromosome métaphasique.

Chromatine et hétérochroatine
L’hétérochromatine est une structure qui ne change Euchromatine Hétérochromatine
pas d’état de condensation au cours du cycle
- Déroulée - Compacte
cellulaire tandis que l’euchromatine apparaît
décondensée pendant l’interphase. - Acétylée - Hypo acétylée
- Transcrite - Non transcrite

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3- Acides ribonucléiques
ARN issus de la transcription des gènes : polymères de ribonucléotides (bases A U G C)
 longueur variable (en fonction du gène) : de 20b à plusieurs dizaines de kb

NH2 O

N N
N NH

O N N
N N NH2

O P O CH2 O O
P O
- H
O H H H
H H H
H
OH OH OH OH
AMP GMP
NH2 O

N NH

N O N O

P O O P O O
H H H H
H H H H
OH OH OH OH
CMP UMP

ARN : molécules simple-brin mais très structurées


Appariements A-U et G-C  formation de structures secondaires : segments « double brin »
motifs structuraux définis et reproductibles : boucles internes ; boucles externes ; tiges ; etc.

ARN de transfert ARN ribosomal

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Différents types d’ARN
Les gènes codants sont transcrits en ARNm codant pour des protéines
 ARNm : ARN messagers de taille très variable (jusqu’à plusieurs dizaines de kilobases)
 assurent le transfert de l’information génétique des chromosomes vers le cytoplasme où ils sont traduits
en protéines

Les gènes non codants sont transcrits en différents types d’ARN


 ARN ribosomiques ARNr entrent dans la composition des ribosomes
- ARNr 28S, 18S, 5.8S et 5S chez eucaryotes (de ≈120 à ≈5000 bases)
- ARNr 23S, 16S et 5S chez procaryotes
 ARNt : ARN de transfert, petites molécules de 70 à 95 bases qui assurent le transport et le positionnement
des acides aminés au cours de la synthèse des protéines. Malgré la diversité de leur séquence, tous les ARNt
ont une conformation en “feuille de trèfle”

ARN liés à des protéines formant des RNP (ribonucléoparticules)


 snARN : « small nuclear » ARN (petits ARN nucléaires) ont des fonctions variées (épissage, maturation
d’autres ARN, maintien des télomères …)
 miARN : « micro » ARN (régulation expression des gènes),
et de nombreux autres ....

4- Propriétés des acides nucléiques


Solubilité
Les groupements phosphate donnent un caractère acide à ses acides nucléiques. De ce fait, ils sont solubles
dans l’eau en formant des solutions visqueuses.
Une forte concentration saline (NaCl 0,15M) empêche la séparation des deux brins de l’ADN (Na+ neutralise
les charges négatives des groupements phosphate). On obtient la formation de sel d’ADN ou d’ARN qui
peuvent être précipités par l’éthanol, l’isopropanol (diminution de l’hydratation des molécules et précipitation).
Ils sont récupérés sous forme d’un long filament translucide (méduse).

Absorption dans l’U.V. : effet hypochrome et effet hyperchrome


Absorbance
Les bases azotées absorbent dans l’ultraviolet avec une
absorption maximale entre 250 et 270 nm. Cette propriété permet
ADN dénaturé
de doser les AN à 260nm. (simple brin)
ADN natif : 1 DO = 50 ng/µL
ADN natif
(double brin)

 nm
260
Spectre d'absorption d'ADN

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Effet hyperchrome
L’ADN dénaturé par la chaleur (100°C) ou par l’urée ou encore à pH très alcalin a une absorption à 260 nm
plus élevée que l’ADN natif : effet hyperchrome ou hyperchromicité.

La courbe de fusion (A en fonction de la température) est


une sigmoïde dont le point d’inflexion définit la
température de fusion Tm (melting temperature = 50% de
Absorbance
dénaturation) de la molécule.
simple brin
La température de fusion Tm dépend : 160%
- de la force ionique du milieu : plus la concentration en chauffage
ions augmente plus la Tm diminue (en milieu refroidissement
rapide
NaCl>1M). Les ions affaiblissent les liaisons hydrogène,
donc la dénaturation est plus facile refroidissement
- de la composition en bases : plus le pourcentage de lent
100%
bases GC est grand, plus la Tm est élevée (plus le double brin
nombre de liaisons hydrogène est grand est plus la (°C)
molécule est stable (dénaturation plus difficile) Tm
Température
E.coli G+C = 50%  Tm = 65°C
P. aeruginosa G+C = 68%  Tm = 76°C

Après dénaturation de l’ADN par la chaleur :


refroidissement
lent
Quand on refroidit lentement la solution, l’ADN se
chaleur
« renature » par appariement AT et GC et retrouve sa
conformation native
Si le refroidissement est rapide, le réappariement est refroidissement
incomplet et l’ADN est partiellement renaturé rapide

Hydrolyse des acides nucléiques


La dégradation d’un polynucléotide peut se faire par voie chimique ou enzymatique et concerne :
l’enchainement phosphodiester et les unités nucléotidiques : composants et liaisons osidiques

Hydrolyse chimique
L’ADN et l’ARN réagissent différemment au traitement alcalin

Produits d’hydrolyse
Traitement chimique
ARN ADN
Hydrolyse alcaline Nucléosides monophsphate ADN intact

Hydrolyse acide pH 1 Pentoses + Phosphate + Bases azotées


pH 4 Bases puriques + AN apuriques

Caractéristique utilisée pour éliminer les ARN d’un milieu sans dégrader l’ ADN.
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Hydrolyse enzymatique
Les nucléases sont des enzymes qui permettent l’hydrolyse des liaisons phosphodiester entre nucléotides
(phosphodiesterases spécifiques). On trouve chez les bactéries des endonucléases très spécificiques
(recnnaissance de séquences très précises) appelées enzymes de restriction.

Les nucléases présentent des niveaux de spécificité et sont classées par :

– Le mode d’attaque de la chaîne : extrémité (exo) ou intérieur


5' 3'
(endo) A G
– la spécificité vis-à-vis du substrat : ADN, ARN ou les deux et exo exo
de la structure, simple ou double brin 5'-3' 3'-5'
– la spécificité de reconnaissance des sites : bases ou leur
enchaînement P
P OH
– le type de coupure de la liaison phosphodiester

Les enzymes de restriction (ER)


Les ER sont des endonucléases produites par des bactéries pour se défendre contre les infections par les
bactériophages (virus spécifiques des bactéries). Lorsque le virus injecte son ADN dans le micro-organisme,
celui-ci est coupé par l’enzyme de restriction au niveau de ses sites spécifiques, bloquant ainsi l’infection.
Pour éviter que l’enzyme de restriction ne coupe l’ADN de son propre génome, la bactérie modifie le site de
restriction par méthylation sur un ou plusieurs nucléotides.
Les ER hydrolysent l’ADN à des sites spécifiques de 4 à 6 paires de bases (parfois plus).
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes : - la coupure à extrémités franches dites
aussi bouts francs, la coupure a lieu au milieu du palindrome ; - la coupure à extrémités sortantes dites aussi
cohésives, on parle aussi de coupures décalées, la coupure a lieu de part et d’autre du centre de symétrie.
Selon les sites de reconnaissance, on distingue trois types d’endonucléases.
1- Enzymes de type I : l’enzyme reconnaît un site particulier sans symétrie, et coupe l’ADN à environ 1000
jusqu’à 5000 nucléotides plus loin en libérant plusieurs dizaines de nucléotides.
2- Enzymes de type II : les plus nombreuses et les plus utilisées en génie génétique. Leurs sites de restrictions
de 4 à 8 paires de bases sont des séquences palindromiques (se lisent de droite à gauche et inversement : radar).
Elles coupent au niveau de leurs sites de restriction.
3- Enzymes de type III : L’enzyme reconnaît une séquence mais coupe à une vingtaine de paires de bases plus
loin.
Exemples d’enzymes de restriction

Hydrolyse par l’enzyme de restriction EcoRI Hydrolyse par l’enzyme de restriction : HaeIII
Site : GAATTC (coupure débordante) Site : GGCC (coupure franche)

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Principales méthodes d’étude

1- Purification d’ADN
2- Dosage de l’ADN et contrôle de qualité
3- Enzymes : Couper - Copier – Coller
4- Séparation des fragments
5- Hybridation moléculaire
6- Southern Blot
7- RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism
8- Amplification de l’ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction)
9- PCR – RFLP
10- Séquençage

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Principales méthodes d’étude

1- Purification d’ADN (http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/ )


Les principales étapes de l’extraction d’ADN peuvent se résumer comme suit

Etapes
Traitement mécanique
Lyse des cellules nucléées Lyse par détergent
Lyse hypotonique...
Déprotéinisation Traitement par protéinase K
Solvants : phénol-chlorophorme
Extraction des AN
Chromatographie par échange ions
Alcool
Précipitation des AN
Sels

2- Dosage de l’ADN et contrôle de qualité


La quantité et la qualité de l’ADN extrait sont évalués par spectrophotométrie

Dosage à 260 nm : – Si 1,8 <  < 2 ADN de bonne qualité


1DO = 50 ng/mL
– Si  < 1,8  trop de protéines
Contrôle qualité par le rapport :
– Si  >2  trop d’ARN
 = DO260/DO280

3- Enzymes : Couper - Copier – Coller


Nucléases
Couper
Les nucléases permettent l’hydrolyse des liaisons Exonucléases Endonucléases
(5'-3' ou 3'-5')
phosphodiester entre nucléotides sont des
phosphodiesterases spécifiques.
ARNases ADNases
Enzymes de restriction

Exonucléases Endonucléases Enzymes de restrictions


5’3’ – ADNase I ; (Endonucléases bactériennes)
ou 3’5’
– Nucléase S1; EcoRI  Escherichia coli de type 1
– ARNase A (ARN) ou H (hybride Site de reconnaissance séquence de 4 à 10
ARN/ADN) nucléotides (palindrome)

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5'P-AGGTC-3'OH P-CTGCAA-3'OH
Coller 3'P-TCCAG-5'P HO-GACGTT-5'P
Les ligases catalysent la formation d’une liaison
Ligase + ATP
phosphodiester entre un 5’P et le 3’OH de deux brins
voisins 5'P-AGGTCCTGCAA-3'OH
3'HO-TCCAGGACGTT-5'P

Copier
Les polymérases sont les enzymes capables de copier les AN dans le sens 5’  3’

Produit : ADN
ADN polymérases Matrice : ADN simple brin + amorces ARN ou ADN
ADN polymérases modifiées : (Taq Pol thermostable)
Produit : ARN
ARN polymérases
Matrice : ADN simple brin
Produit : ADN
ADN polymérases ARN dépendante (RT)
Matrice : ARN + amorce (RT réverse transcriptase)

4- Séparation des fragments


Les fragments d’ADN de différentes tailles doivent être séparés pour être étudiés
Electrophorèse http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html
Séparation des molécules chargées par migration le long d’un support poreux sous l’action d’un champ
électrique. A charge égale, les petites molécules migrent plus vite (plus loin).
AN polyanions  migrent vers l’anode (+)
Supports : gel d’agarose (fragments >100 pb), gel de polyacrylamide (fragments [10-1000] pb)

Nombreuses variantes de l’électrophorèse pour l’étude des AN


E. sur gel de polyacrylamide des produits d’amplification par PCR ; E. en champ pulsé (fragments > 50000pb) ;
E. capillaire ; E. sur gel dénaturant etc.
Chromatographie : Chromatographie échangeuse d’ions ; hromatographie d’affinité ; HPLC

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5- Hybridation moléculaire
Hybridation moléculaire : Association qui peut se faire entre deux acides nucléiques simples brins de
séquences complémentaires et qui conduit à la formation d’un duplex.
Sonde : Séquence d’AN simple brin complémentaire et antiparallèle d’une séquence cible (séquence
recherchée) à laquelle elle s’hybride de façon spécifique par réassociation entre bases complémentaires.

5'-
GA sonde monobrin
TT *
C-
3'O
H
5'-GATTC-3'OH
*
HO3'-TAACGGCTAAGAGCTACGGA-5'P HO3'-TAACGGCTAAGAGCTACGGA-5'P

– Principaux types de sondes : oligonucléotides de synthèse (oligosondes) ; sondes ARN (ribosondes) ; ADNc
– Taille très variable: 20-30 nucléotides ou plusieurs centaines de nucléotides.
– Intérêt : repérer spécifiquement une ou quelques séquences d’acide nucléique dans un mélange complexe
d’acides nucléiques

Marquage : pour visualiser l’hybridation il faut « marquer » la sonde ou la séquence cible.


On distingue :
– le marquage « chaud » utilisant des isotopes radioactifs (Isotopes : 32P ; 33P, 35S)
– les marquages « froids » de plus en plus employés, utilisent des molécules fluorescentes, luminescentes
(biotinylation ; fluorophores, etc.)

6- Southern Blot
Le Southern blot est une technique mise au point par Edward M. Southern en 1975 pour rechercher des
fragments de DNA (http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_southernblotting.htm)

Electrophorèse
sur gel d'agarose
– 1ère étape : Séparation des fragments d’ADN par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide
Fragments
d'ADN

– 2ème étape : Dénaturation (ouverture de la double hélice par


Fragments d'ADN membrane de
NaOH + NaCl) nitrocellulose
transférés
– 3ème étape : Transfert des fragments séparés sur une
membrane de nitrocellulose. La position relative des Gel d'agarose
fragments d’ADN est préservée durant le transfert tampon

– 4ème étape : Hybridation avec une sonde complémentaire


marquée (par un dNTP radioactif ou fluorescent)

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Dispositif du transfert par buvardage Résultat après autoradiographie

Applications du Southern blot

7- RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism


http://gen-net-pop.univ-lyon1.fr/cours/chap2/animation22.htm
En utilisant une enzyme de restriction, le génome d’un individu est découpé en plusieurs fragments selon le
nombre de sites de restriction présents dans l’ADN. Le nombre de ces sites et leurs positions diffèrent en
fonction des individus : polymorphisme de longueur des fragments de restriction. Ainsi on pourra différencier
deux individus.

Technique utilisée pour étudier le devenir


d’un gène au cours des générations,
diagnostiquer des maladies génétiques,
cartographier le génome humain, prendre
l’empreinte génétique d’un individu et
dans les tests de paternité...

Etapes d’une étude RFLP


1- Extraction de l’ADN des différents individus à analyser
2- Digestion de l’ADN par ER  obtention de fragments d’ADN de longueurs différentes selon les individus.
3- Visualisation des différents fragments d’ADN obtenus par une électrophorèse sur gel d’agarose.
4- Southern blot : Dénaturation des fragments (NaOH) et transfert (sous forme monobrin) sur une membrane de
nylon.
6- Incubation de la membrane en présence d’une sonde marquée. La sonde s’hybride avec le ou les fragments
d’ADN contenant la séquence complémentaire.
L’endroit, ou les endroits, ayant fixé la sonde sont révélés en plaçant la membrane au contact d’un film sensible
à la radioactivité (autoradiographie),

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Amplification de l’ADN par PCR (Polymérase Chain Reaction)
http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
La PCR, ou Réaction en Chaine par Polymérase, est une technique de réplication ciblée in vitro. Elle permet
d’obtenird’importantes quantités d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie.
La PCR consiste en l’amplification exponentielle d’une séquence d’ADN double brin effectuée in vitro par
extension de deux amorces situées de part et d’autre du fragment cible à l’aide d’une polymérase thermostable
(Taq polymérase : Thermus aquaticus).
On distingue trois étapes qui définissent un cycle qui sera répété n fois :
1ème étape : Dénaturation (généralement 0 à 1 minute à 95 °C)
 Déshybridation de l’ADN et homogénéisation du milieu réactionnel.
ème
2 étape : Hybridation (généralement 2 à 60 secondes à 56-64 °C)
 Hybridation des amorces sens et anti-sens aux ADN matrice.
ème
3 étape : Elongation (généralement 4 à 120 secondes à 72 °C)
 La polymérase synthétise (sens 5’3’) le brin complémentaire d’ADN matrice à 72°C

Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3


5' 3'
5' 3' 5'
5'
5' 3' 3' 5' 5'
3'
3' 5' 5'
5' 3' 5' 3'
3' 5' 5'
3' 5'

5' 3'
Dénaturation

5' 3'
3' 5'
95 °C

5' 3'
3' 5'
3' 5'

5' 3'
5' 3' 5'
Hybridation

5'
5' 5'
60°C

3'
5'
5' 5' 3'
3' 5' 5'
3' 5'

5' 3'
5' 3' 5'
Elongation

5'
5' 5'
73°C

3'
5'
5' 5' 3'
3' 5' 5'
3' 5'

Contrôle des produits de PCR


Après cette amplification, on contrôle les produits PCR par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
en présence de marqueurs de taille pour vérifier si on a obtenu l’amplification du fragment cible.

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PCR – RFLP
La technique PCR-RFLP est l’association entre les techniques d’amplification et d’observation de
polymorphismes sur des fragments digérés par des enzymes de restriction.
L’amplification permet de ne pas analyser l’ADN total, mais juste un segment d’ADN. L’utilisation d’une
enzyme de restriction donnera ainsi un nombre réduits de fragments. La visualisation des fragments de
restriction ne nécessite donc pas l’utilisation de sonde radioactive.

Séquençage
http://www.dnalc.org/resources/animations/sangerseq.html
http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html
Deux méthodes de séquençage de l’ADN ont été développées indépendamment dans la deuxième moitié des
années 1970 : l’une par l’équipe de Gilbert (États-Unis) et l’autre par celle de Sanger (Royaume-Uni). Ces deux
méthodes sont fondées sur des principes diamétralement opposés : l’approche de Sanger est une méthode par
synthèse enzymatique sélective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation
chimique sélective (prix Nobel chimie 1980).

Méthode de Sanger
Le principe de cette méthode consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l’aide d’un petit oligonucléotide
(amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée
par une ADN polymérase thermostable.
dATP ddATP
NH2 NH2

La méthode est basée sur l’utilisation de N N N N


didésoxyribonucléotides (ddNTP : ddATP, ddCTP, N N N N
ddGTP ou ddTTP). P P P O O P P P O O

OH H

NH2

N
- N
O A
-
O P O
Les didésoxyribonucléotides agissent comme des N N

NH2
«poisons» terminateurs de chaîne : une fois incorporés O
O
H H
dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent la H H C
N
O H
poursuite de l’élongation. Cette terminaison se fait O P O-
N O

spécifiquement au niveau des nucléotides correspondant O


O
au didésoxyribonucléotide incorporé dans la réaction. H H

H H
H H
O

Lorsqu’une ADN polymérase utilise un ddNTP au lieu N


P NH
d’un dNTP, elle n’est plus capable de rajouter le moindre G

P N NH2
nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d’ADN s’arrète N

P O
O
H H

H H
OH H

Les quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’une faible concentration
de l’un des quatre ddNTP
Pour le séquençage complet d’un même fragment d’ADN, on répète cette réaction quatre fois en parallèle, avec
les quatre didésoxyribonucléotides différents.

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Mode opératoire : Soit l’ADN à séquencer

4 mélanges sont préparés:


– le fragment qui doit être séquencé
– une amorce : petit morceau d’ADN dont la séquence est complémentaire à l’extrémité 3’ du fragment à
séquencer
– les 4 dNTP’s (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)
– un didésoxynucléotide en faible quantité (ddCTP, ou ddATP, ou ddGTP, ou ddTTP)
– une ADN polymérase I (dépourvue d’activité exonucléase 5’→3’)

ADN à séquencer
+ amorce
+ ADN polymérase
Après une étape de dissociation de l’ADN (formaldéhyde,
+(dCTP, dGTP, dATP, dTTP)
chauffage) et hybridation avec l’amorce, une ADN polymérase
I (Taq) va incorporer un à un les désoxynucléotides
complémentaires de la séquence modèle dans le sesns 5’-3’
Quand un didésoxynucléotide est incorporé, la synthèse est
interrompue.
ddCTP ddGTP ddTTP ddATP
L’utilisation d’un ddNTP permet ainsi d’obtenir un ensemble
de fragments d’ADN de différentes tailles, correspondant aux
emplacements d’un nucléotide donné.
C G T A

Exemple ci-dessous :
Synthèse du brin complémentaire, et arrêt aléatoire par un ddGTP quand il y a une Cytosine sur la séquence :

3' 5'
A T G G T A C G T C A A C T A brin d'ADN à séquencer
T A C C A T G C A G T T G*
T A C C A T G C A G*
T A C C A T G* incorporation d'un ddGTP
arrêt de synthèse

synthèse du brin ADN


complémentaire incorporation d'un dGTP
G la synthèse continue
dTTP
dGTP
dATP
dCTP
ddGTP

Conclusion : on obtient un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, qui se terminent tous au
niveau d’un des G dans la séquence (complémentaire de C du brin codant). Ces fragments sont ensuite séparés
par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, ce qui permet de repérer la position des G dans la séquence.
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Lecture des résultats
Le contenu de chaque tube est soumis à électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

AT CG
La détection des fragments ainsi synthétisés se fait en incorporant un traceur dans
l’ADN synthétisé. Initialement ce traceur était radioactif et les fragments
apparaissent sur l’autoradiographie du gel.
Aujourd’hui, on utilise des traceurs fluorescents différents, attachés aux
didésoxyribonucléotides.

La séquence lue est limitée à 200 - 300 nucléotides environ : au-delà, les bandes
sont trop tassées... Leur ordre n’est plus déterminable.
D’après le sens de polymérisation, la séquence est lue horizontalement de bas en
haut :
ATCGA…
Le plus petit fragment correspond au fragment obtenu par le premier
didesoxynucléotide incorporé en 5’

La très grande majorité des séquences réalisées et publiées aujourd’hui sont réalisées sur des séquenceurs
automatiques. Ceux-ci sont capables de réaliser les réactions de séquence, puis de les lire.
Dans ce cas chaque didésoxyribonucléotide est marqué par un fluorochrome différent (de couleur différente) et
la réaction peut se faire dans un seul tube réactionnel. Un détecteur relié à un ordinateur fournit un résultat
direct.
Les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu’à 1000
pour les appareils les plus performants.

Animations
Enzymes : Couper - Copier – Coller
http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html
Electrophorèse
http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html
Southern
http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_southernblotting.htm
PCR
http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
RFLP
http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
Séquençage
http://www.dnalc.org/resources/animations/sangerseq.html
http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html

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