Électrophorèse capillaire

Principe
par Myriam TAVERNA
Maître de conférences en chimie analytique
Laboratoire de chimie analytique
Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry)
Isabelle LE POTIER
Maître de conférences en chimie analytique
Laboratoire de chimie analytique
Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry)
et Philippe MORIN
Professeur de chimie analytique
Institut de chimie organique et analytique
Université d’Orléans

1. Principe général et grandeurs fondamentales ................................ P 3 365 – 2

1.1 Électromigration .......................................................................................... — 2
1.2 Électroosmose ............................................................................................. — 2
1.3 Efficacité ....................................................................................................... — 3
1.4 Résolution .................................................................................................... — 3
2. Principaux modes de l’électrophorèse capillaire............................ — 4
2.1 Électrophorèse capillaire libre ou de zone ................................................ — 4
2.1.1 Principe ................................................................................................ — 4
2.1.2 Paramètres .......................................................................................... — 4
2.2 Chromatographie électrocinétique micellaire (CEM) ............................... — 4
2.2.1 Principe ................................................................................................ — 4
2.2.2 Paramètres .......................................................................................... — 5
2.3 Électrochromatographie capillaire ............................................................. — 6
2.3.1 Principe ................................................................................................ — 6
2.3.2 Colonnes.............................................................................................. — 7
2.3.3 Paramètres .......................................................................................... — 7
2.3.4 Applications ........................................................................................ — 7
2.4 Électrophorèse capillaire en gel (ECG) ...................................................... — 8
2.4.1 Principe ................................................................................................ — 8
2.4.2 Mécanismes ........................................................................................ — 8
2.4.3 Paramètres .......................................................................................... — 9
2.4.4 Applications à la séparation de protéines ........................................ — 9
2.5 Isoélectrofocalisation capillaire .................................................................. — 9
2.5.1 Principe ................................................................................................ — 9
2.5.2 Méthodes particulières....................................................................... — 10
2.5.3 Exemples de séparations ................................................................... — 11
Références bibliographiques ......................................................................... — 12

’électrophorèse capillaire (EC) est une technique complémentaire des

L méthodes chromatographiques qui permet la séparation d’un grand nombre
de molécules. Tout comme la chromatographie liquide haute performance qui
regroupe de nombreux modes de séparation selon la nature des phases station-
naire et mobile utilisées (échange d’ions, partage en phases normale et inverse,
adsorption, exclusion...), l’EC regroupe un grand nombre de modes selon la
nature de l’électrolyte de séparation et du capillaire utilisé (électrophorèse de

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zone, électrophorèse micellaire, électrophorèse sur gel, isoélectrofocalisation,
électrochromatographie). L’EC est une méthode d’analyse désormais reconnue
en raison de ces qualités intrinsèques : efficacité et résolution élevées, rapidité et
automatisation des séparations, conditionnement aisé du capillaire de sépa-
ration, faible consommation d’échantillons et de tampons de séparation (en
général dénués de solvants organiques), compatibilité avec de nombreux détec-
teurs.
Cet article sur l’électrophorèse capillaire se compose de trois fascicules :
[P 3 365] : Électrophorèse capillaire. Principe ;
[P 3 366] : Électrophorèse capillaire. Appareillage ;
[P 3 367] : Électrophorèse capillaire. Applications.
Pour un exposé sur la théorie générale de l’électrophorèse, le lecteur pourra consulter l’article
[P 1 815], référence [15], dans ce traité.
1. Principe général et
grandeurs fondamentales
La séparation des composés par électrophorèse capillaire résulte
de deux mécanismes de transport, l’électromigration et l’électro-
osmose.
1.1 Électromigration
L’électromigration résulte du déplacement d’une espèce chargée
lorsqu’elle est soumise à un champ électrique. La vitesse linéaire
acquise (ou vitesse électrophorétique) est alors fonction du champ
électrique et de la mobilité électrophorétique de l’ion selon la rela-
tion suivante :
vep = mepE (1)
avec vep vitesse électrophorétique (cm · s−1),
E champ électrique (V · cm−1),
mep mobilité électrophorétique (cm2 · V−1 · s−1).
L’électromigration s’effectue dans le sens du champ électrique
(mobilité électrophorétique positive) pour les cations et dans le sens
opposé pour les anions (mobilité électrophorétique négative). Cette
notion de mobilité électrophorétique a déjà été décrite en détail
dans ce traité (article [P 1 815], référence [15]), aussi seuls les para-
mètres dont dépend ce phénomène sont-ils rappelés brièvement.
La mobilité électrophorétique d’une espèce chargée est fonc-
tion de sa charge électrique et de sa taille. Un ion sera donc
d’autant plus mobile que sa charge est élevée et que sa taille (ou
son rayon ionique) sera faible.
D’un point de vue expérimental, la mobilité électrophorétique
d’un ion dépend principalement du pH et de la force ionique du tam-
pon, de l’ajout d’une espèce complexante au tampon et, enfin, de la
température.
1.2 Électroosmose
Le phénomène d’électroosmose correspond à l’écoulement d’un
liquide remplissant un capillaire (dont la paroi interne possède une
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charge de surface) lorsque celui est soumis à un champ électrique
tangentiel. Dans le cas d’un capillaire en silice fondue, les charges
de surface sont dues à l’ionisation négative des groupements sila-
nols dès que le pH est supérieur à 2.
Lorsque le capillaire est rempli d’un tampon électrophorétique,
les cations du tampon sont attirés vers les charges négatives de la
surface du capillaire, formant ainsi une double couche électrique,
caractérisée par un potentiel de surface ou potentiel zéta (ζ) :
δσ
ζ = -------
ε
avec δ épaisseur de la double couche,
σ densité de charges par unité de surface,
ε constante diélectrique du milieu.
Lors de l’établissement d’un champ électrique tangentiel à cette
interface, les cations de charge opposée à celles de la surface du
capillaire de silice fondue et présents en excès dans la couche de dif-
fusion migrent vers la cathode et entraînent avec eux les molécules
de solvant, créant ainsi un écoulement de toutes les espèces présen-
tes au sein du capillaire, nommé électroosmose. La vitesse linéaire
de cet écoulement (veo) est alors proportionnelle à l’intensité du
champ électrique E et à la mobilité électroosmotique meo :
veo = meoE (2)
La mobilité électroosmotique est égale à :
meo = ζε/η
avec η viscosité du liquide dans la couche de diffusion.
L’écoulement électroosmotique dépend des caractéristiques
du potentiel zéta, de la viscosité et de la constante diélectrique
du tampon électrophorétique. Il s’exercera dans le sens du
champ électrique ou dans le sens opposé selon le signe de la
charge surfacique du capillaire.
D’autre part, le taux d’ionisation des groupements silanols, et
donc la densité de charge surfacique, dépend du pH et de la force
ionique du tampon et, aussi, de la nature des cations du tampon
(figure 1). Ainsi, à pH et force ionique identiques, le potentiel zéta
généré par l’intermédiaire d’un tampon phosphate de sodium est
différent de celui obtenu à partir d’un tampon phosphate de potas-
sium. Enfin, la présence de solvants organiques dans le tampon
modifie le flux électroosmotique en raison de son impact sur la vis-
cosité et sur le potentiel zéta.
En électrophorèse capillaire, le flux électroosmotique (FEO) joue
un rôle fondamental en raison de son profil d’écoulement plat, qui
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Ainsi, en substituant cette relation dans l’expression du nombre

5 de plateaux théoriques N, on aboutit à l’équation suivante :
meo (10 – 4cm2 · V–1 · s–1)

Ld 2 ( m eo + m ep ) L d
4
N =  ------ = ---------------------------------- ⋅ ------ ⋅ V (5)
Pyrex  σ L 2D M LT
3
avec LT longueur totale du capillaire,
2 Ld longueur de l’injection à la détection,
Silice
1
V tension.
Téflon Selon cette équation, l’efficacité d’une séparation augmente avec
0 la tension appliquée, puisqu’une tension élevée permet de faire
2 3 4 5 6 7 8 migrer les espèces plus rapidement et de limiter ainsi leur diffusion.
pH Cependant, une augmentation de la tension ne reste intéressante
que tant que la dissipation de la chaleur produite par effet Joule
Figure 1 – Influence du pH de l’électrolyte sur la mobilité demeure efficace. D’autre part, l’efficacité d’un pic électrophoréti-
électroosmotique obtenue pour différents types de capillaires que est inversement proportionnelle au coefficient de diffusion de
l’espèce séparée. Ce sont en général les espèces possédant une
grande mobilité qui produiront les séparations les plus efficaces
(c’est le cas des ions), cependant l’efficacité sera limitée en raison de
contraste avec le profil parabolique rencontré en CPL, ce qui induit leur plus grand coefficient de diffusion. Ces deux notions de diffu-
des efficacités de pics bien supérieures à celles obtenues en CPL sion et de mobilité s’opposant, il sera possible de séparer une large
(chromatographie en phase liquide). gamme de composés allant des composés de faible masse molaire
Par ailleurs, il est possible de modifier ou d’inverser le flux électro- jusqu’aux macromolécules diffusant peu mais possédant en revan-
osmotique de façon dynamique en ajoutant au tampon d’analyse che une mobilité faible.
certains tensioactifs cationiques (bromure de cétyltrimé-
thylammonium, polybrène) ou des surfactants fluorés qui réduisent
ou inversent la charge de surface par interaction avec les groupe-
ments silanols. Le but est soit d’améliorer la résolution soit de dimi-
1.4 Résolution
nuer le temps d’analyse. Le flux électroosmotique peut, dans
certains cas, être complètement supprimé en utilisant des capillaires
greffés chimiquement par du polyacrylamide, des greffons alkylés En électrophorèse capillaire, la résolution entre deux espèces est
semblables à ceux utilisés pour les phases stationnaires de CPL en égale à :
phase inverse, du polyéthylèneglycol ou un polyvinylalcool. Ces
capillaires modifiés permettent souvent de réduire l’adsorption des 1 ∆m ep
R s = --- --------------------------------- N (6)
molécules analysées sur les parois du capillaire et sont utilisés lors (
4 m eo + m ep )
de l’analyse des solutés basiques ou des protéines.
Enfin, on utilise assez souvent la vitesse de migration vM d’une avec ∆mep différence des mobilités électrophorétiques des
espèce définie selon la relation : deux espèces,
m ep mobilité électrophorétique moyenne.
vM = mappE
En reportant l’expression (5) de l’efficacité de pic due uniquement
avec mapp mobilité apparente égale à : à la diffusion axiale, on obtient :

mapp = meo + mep (3) ∆m ep V Ld

Cette mobilité apparente est la mobilité mesurée et indique si
l’espèce ionique se comporte dans les conditions électrophoré-
tiques choisies comme un cation ou un anion.
1.3 Efficacité
Les grandes efficacités obtenues en électrophorèse capillaire pro-
viennent du profil d’écoulement plat du flux électroosmotique et
d’une réduction importante du nombre de mécanismes de disper-
sion des bandes (résistance au transfert de masse, anisotropie
d’écoulement) en raison de l’absence de phase stationnaire. Seul
demeure le phénomène d’élargissement σL d’un pic électrophoré-
tique par diffusion axiale, dont la variable spatiale σ L2 est décrite par
l’équation d’Einstein :
σ L2 = 2D M t M
R s = --------------- ------------------------------------------ ⋅ ------ (7)
4 2 D M ( m eo + m ep ) L T
Cette équation montre que l’augmentation de la tension n’induit
pas une augmentation significative de la résolution, d’autant plus
qu’on atteint très rapidement les limites dues à l’effet Joule (tension
maximale sur les appareils commercialisés : 30 kV).
La résolution peut être améliorée plutôt en jouant sur les valeurs
de ∆mep (composition du tampon) et surtout en minimisant la valeur
de la somme algébrique ( m eo + m ep ) .
■ Dans le cas de séparations difficiles, on privilégiera la résolution
en cherchant à minimiser cette somme. Ainsi, dans le cas de la sépa-
ration d’anions, on modifiera le pH du tampon de telle sorte que la
valeur absolue de meo soit très proche (mais légèrement supérieure)
à celle de mep, pour permettre la migration des molécules en direc-
tion de la cathode. Le temps d’analyse est alors très important.
■ Dans le cas de séparations aisées, on privilégiera le temps d’ana-
lyse au détriment de la résolution. Ainsi, dans le cas de la séparation
(4) d’anions, on inversera le flux électroosmotique.

avec DM coefficient de diffusion du composé, Pour une revue plus détaillée concernant le principe de l’électro-
phorèse capillaire et 20 paramètres caractéristiques, consulter les
tM temps de migration de ce composé. ouvrages en références [1] [2].

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Détection

meo  mep
 
mep 

  

Injection
 cation
 
 anion
molécules non chargées
Figure 2 – Principe de séparation en électrophorèse capillaire libre
(ECZ)
2. Principaux modes de
l’électrophorèse capillaire
L’électrophorèse capillaire regroupe plusieurs modes de sépa-
ration qui permettent de différencier les espèces chimiques selon
leur charge électrique et leur masse (électrophorèse libre), leur
hydrophobie (électrophorèse micellaire), leur masse (électropho-
rèse sur gel) ou leur point isoélectrique (isoélectrofocalisation).
Enfin, elle est bien adaptée à la séparation d’énantiomères de molé-
cules chirales et il est possible de réaliser des séparations sur des
capillaires remplis de particules de phase stationnaire (électrochro-
matographie).
2.1 Électrophorèse capillaire libre
ou de zone
2.1.1 Principe
L’électrophorèse capillaire libre (ou de zone ECZ) constitue le
mode de séparation le plus simple à mettre en œuvre et le plus uti-
lisé. Son principe a été décrit dans l’article [P 1 815], référence [1], de
ce traité concernant l’électrophorèse et ne sera donc pas détaillé ici.
La séparation des espèces est réalisée dans un capillaire rempli par
un tampon (aqueux, hydroorganique ou organique) de pH et de
force ionique fixés. Les espèces chimiques migrent à des vitesses
différentes selon leur charge apparente et leur rayon hydrodynami-
que. La vitesse de migration d’un composé est la somme algébrique
de sa vitesse d’électromigration et de la vitesse du flux électroosmo-
tique (figure 2).
Prenons l’exemple le plus fréquent où l’injection des échan-
tillons est réalisée du côté anodique dans un capillaire en silice non
modifiée (tension de séparation positive). Dans le cas d’un cation,
les deux mobilités électrophorétique et électroosmotique sont de
même signe et provoquent un mouvement de migration rapide du
cation vers le détecteur. Pour un anion, la mobilité électrophoréti-
que est de signe opposé à celle du flux électroosmotique ; ainsi, un
anion ne migre vers la cathode que si sa mobilité électrophoréti-
que est inférieure en valeur absolue à la mobilité électroosmoti-
que. Dans le cas contraire, il est possible d’analyser cet anion en
inversant le signe de la tension de séparation (tension négative).
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Les molécules non chargées migrent toutes à la vitesse du flux
électroosmotique et ne sont pas séparées entre elles.
Dans certains cas, il est possible de séparer des molécules neu-
tres en électrophorèse capillaire libre en leur communiquant une
charge apparente, soit par complexation avec des anions (cas des
carbohydrates ou des flavonoïdes glycosylés complexés par les
anions borates) ou en les incorporant dans des molécules chargées
(exemple des cyclodextrines ioniques).
La mobilité apparente de chaque espèce à analyser peut être cal-
culée d’après les équations (4) et (5) par la relation suivante :
Ld LT
m app = m ep + m eo = ------ ------ (8)
V tM
avec tM temps de migration (s),
V tension appliquée (V),
LT et Ld longueurs totale et effective du capillaire (cm),
mapp mobilité apparente (cm2 · V−1 · s−1).
2.1.2 Paramètres
En électrophorèse libre, les principaux paramètres d’optimisation
de la séparation sont liés à la composition du tampon (pH, force
ionique, nature et concentration d’un agent complexant, ajout d’un
solvant organique).
Le pH du tampon est le paramètre le plus important puisqu’il
détermine l’état d’ionisation des espèces analysées ainsi que
l’amplitude du flux électroosmotique.
La force ionique influe aussi de façon importante sur le flux élec-
troosmotique ainsi que sur la mobilité électrophorétique des ions
analysés. Si des tampons de force ionique faible (5 à 20 mM) per-
mettent de réaliser des séparations rapides, des tampons de force
ionique élevée (50 à 120 mM) sont aussi intéressants car ils offrent
l’avantage d’améliorer la résolution de la séparation, au détriment
toutefois du temps d’analyse et de l’effet Joule plus difficile à dissi-
per.
Indiquons enfin la possibilité d’utiliser une phase hydroorganique
pour améliorer la solubilité des analytes, moduler la sélectivité et
améliorer la forme des pics électrophorétiques.
Enfin, la tension appliquée et la température représentent des
paramètres secondaires dans l’optimisation d’une séparation.
2.2 Chromatographie électrocinétique
micellaire (CEM)
2.2.1 Principe
La chromatographie électrocinétique micellaire (CEM) est une
technique électrophorétique qui permet la séparation de solutés
neutres et/ou chargés. La séparation est réalisée à l’aide d’un tam-
pon électrophorétique auquel est ajouté un tensioactif anionique ou
cationique à une concentration supérieure à sa concentration micel-
laire critique (cmc). Le tensioactif le plus utilisé est le dodécylsulfate
de sodium (SDS) et les micelles formées ont une mobilité électro-
phorétique négative.
La vitesse de migration d’un soluté est fonction de son coefficient
de partage entre le cœur hydrophobe des micelles (phase dite pseu-
dostationnaire) et la phase aqueuse ionique. Dans le cas d’une injec-
tion à l’anode, un soluté neutre atteint le détecteur si le flux
électroosmotique est supérieur à la vitesse électrophorétique néga-
tive du soluté. L’ordre de migration des solutés correspond à une
échelle d’hydrophobie croissante. Ce mécanisme de séparation,
___________________________________________________________________________________________________________ ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE

Le facteur de rétention k′ d’un soluté chargé est alors donné par

 l’expression suivante :
mep mic
( tm * –t )
m
meo k′ = --------------------------------------------
-
tm [ 1 – ( tm * ⁄t
mc ) ]

avec *
tm temps de rétention du soluté en présence de
tensioactif micelles,
soluté neutre tm temps de migration du soluté en l’absence de
micelles,
micelle
tmc temps de migration d’un marqueur de micelles.

Figure 3 – Principe de la chromatographie électrocinétique

micellaire (CEM) Ainsi, le calcul du facteur de rétention d’un soluté chargé en
chromatographie électrocinétique micellaire requiert la
détermination du temps de migration de ce soluté en électro-
phorèse libre, dans les mêmes conditions de pH et de force ioni-
schématisé figure 3, rappelle celui de la chromatographie liquide à
que.
polarité de phases inversée. Il est bien sûr possible d’utiliser un ten-
sioactif cationique (en général, le bromure de cétyltrimé-
thylammonium ou CTAB) mais, dans ce cas, le flux Pour des concentrations en tensioactif faibles, le facteur de
électroosmotique est inversé. rétention k′ d’un soluté varie linéairement avec la concentration Ct
du tensioactif dans l’électrolyte selon l’expression suivante :
■ Pour un soluté neutre, la vitesse de migration VM est égale à :
k′ = P ν [ C t – cmc ]
V M = [ 1 ⁄ ( 1 + k′ ) ]V eo + [ k′ ⁄ ( 1 + k′ ) ]V mc
avec ν volume molaire partiel du tensioactif (L · mol−1),
avec k′ facteur de rétention du soluté, P coefficient de partage du soluté entre les phases
aqueuse et micellaire,
veo vitesse du flux électroosmotique,
cmc concentration micellaire critique (mole/L).
vmc vitesse électrophorétique des micelles. La résolution entre deux solutés neutres est donnée par l’équa-
Le facteur de rétention k′ peut être calculé selon l’expression tion suivante :
suivante :
N 2 α – 1 k 2′  1 – ( t eo ⁄ t mc ) 
R s = ----------- ------------- -----------------  ---------------------------------------------
( t m – t eo ) 4 α 1 + k ′ 1 + (t ⁄ t ) k ′
2 eo mc 1
k′ = ----------------------------------------------
t eo [ 1 – ( t m ⁄ t mc ) ]
avec α sélectivité entre les deux pics,
avec tm temps de rétention du soluté en présence de N2 efficacité du second pic,
micelles, k 1′ , k 2′ facteurs de rétention des solutés 1 et 2,
respectivement.
teo temps de rétention nulle (correspondant à un
composé neutre non inclus dans les micelles, par La principale différence entre les expressions de la résolution en
exemple le méthanol), CEM et en CPL [16] provient du dernier terme f ( k′ ) , qui témoigne de
l’existence en CEM d’une fenêtre de migration [t0, tmc] limitée par
tmc temps de migration des micelles (correspondant les temps de migration d’un composé neutre et hydrophile (souvent
à un composé très hydrophobe totalement inclus le méthanol) d’une part et celui des micelles d’autre part (souvent
dans les micelles, par exemple l’anthracène). l’anthracène). La résolution en CEM est améliorée pour une fenêtre
de migration plus large (rapport t0/tmc diminué). La résolution est
′
optimale pour un facteur de rétention k opt égal à :
Cette expression du facteur k′ deviendrait identique à celle
utilisée en chromatographie en phase liquide si l’on considérait ′ = ( t mc ⁄ t 0 ) 1 / 2
k opt
la phase micellaire stationnaire (vmc = 0).

■ Pour un soluté chargé, le phénomène de migration électrophoré- 2.2.2 Paramètres

tique se superpose à celui de la rétention chromatographique dans
la phase pseudostationnaire. La vitesse de migration v M * d’un Un grand nombre de paramètres indépendants influent sur la
soluté chargé est égale à : résolution, à savoir la concentration en micelles, la nature du ten-
sioactif, la nature et la concentration de divers additifs (solvant
* = [ 1 ⁄ ( 1 + k′ ) ] ( v
vM eo + v ep ) + [ k′ ⁄ ( 1 + k′ ) ] v mc organique, cyclodextrines, urée), sans oublier les paramètres carac-
téristiques du tampon électrophorétique (pH, force ionique et nature
avec k′ facteur de rétention du soluté, du tampon) et les paramètres physiques de la séparation (tempéra-
ture, tension).
veo vitesse du flux électroosmotique, D’un point de vue pratique, les paramètres les plus importants
vmc vitesse électrophorétique des micelles, sont la concentration en micelles, l’ajout d’un solvant organique
(méthanol, 2-propanol) et le pH du tampon. Le but recherché est
vep vitesse électrophorétique du soluté en milieu d’améliorer la résolution grâce à de meilleures sélectivités et une
libre. fenêtre de migration plus étendue.

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(0)

Tableau 1 – Liste de quelques tensioactifs utilisés en chromatographie électrocinétique micellaire capillaire (CEM)
cmc
Tensioactif Nombre d’agrégations (1)
(M)

Anionique
Dodécylsulfate de sodium (SDS) 8,1 × 10−3 62
Tétradécylsulfate de sodium (STS) 2,2 × 10−3 138
Taurocholate de sodium (STC) 10 à 15 × 10−3 5
Cholate de sodium (SC) 14 × 10−3 2à4
Taurodéoxycholate de sodium (STDC) 3 à 9 × 10−3 8
Déoxycholate de sodium (SDC) 6 × 10−3 4 à 10
Cationique
Chlorure de dodécyltriméthylammonium 1,5 × 10−3 55
Chlorure de cétyltriméthylammonium (CTACl) 1,3 × 10−3 −
Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) 0,9 × 10−3 61
Bromure de tétradécyltriméthylammonium (TTAB) 3,5 × 10−3 75
Non ionique
Octylglucoside 25 × 10−3 27
Triton X100 (2) 0,3 × 10−3 140
Brij-35 (2) 9,0 × 10−5 40
Tween 80 (2) 1,0 × 10−5
Zwitterionique
N-dodécyl-N,N-diméthylammonium-3-propanesulfonate (sulfobétaïne SB12) 3,3 × 10−3 55
3-(3-cholamidopropyl)diméthylammonium-3-propanesulfonate (CHAPS) 4,2 à 6,3 × 10−3 9 à 10
(1) Nombre de monomères de tensioactifs présents dans la forme agrégée
(2) Triton X100 : t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol
Brij-35 : polyoxyéthylène (23) dodécanol
Tween 80 : polyoxyéthylène (20) sorbitane monooléate.

Le tableau 1 indique les paramètres caractéristiques (cmc, nom-
bre d’agrégations ou nombre moyen de molécules de tensioactif
par micelle) de quelques tensioactifs. En particulier, si le SDS (à une
concentration de 10 à 150 mM) qui constitue une pseudophase sta-
tionnaire proche des phases stationnaires octadécyle de la CPL est
souvent employé en CEM, d’autres tensioactifs anioniques possé-
dant des chaînes alkylées plus courtes tels que le décylsulfate (STS)
peuvent être préférés pour limiter la rétention de composés trop
hydrophobes. Les acides biliaires constituent également une classe
intéressante de tensioactifs, surtout pour la séparation de composés
faiblement retenus. La grande stabilité des micelles d’acides biliai-
res en présence de solvants organiques permet de les utiliser pour
les composés très hydrophobes possédant une trop faible solubilité
en milieu aqueux.
La figure 4 montre une séparation d’un mélange de
13 benzodiazépines réalisée en tampon phosphate pH 7,0 avec
l’addition de deux tensioactifs, le cholate de sodium et le
déoxycholate de sodium. L’utilisation de micelles mixtes permet
d’aboutir à la séparation des 13 composés en 24 min. Les tensioac-
tifs zwitterioniques ayant l’avantage de ne pas augmenter la
conductivité du tampon peuvent être employés ; ils sont, par
ailleurs, utiles dans l’analyse des protéines puisqu’ils peuvent aug-
menter leur solubilité. Enfin, les tensioactifs cationiques constituent
également une classe de molécules intéressante, certains d’entre
eux tels que le CTACl ont la propriété de s’adsorber sur les parois du
capillaire et, à certaines concentrations, de s’organiser sous forme
de bicouche provoquant une inversion des charges au niveau des
parois du capillaire, ce qui aboutit à une inversion du flux électroos-
motique. L’utilisation de mélanges de tensioactifs conduit à la for-
mation de micelles mixtes qui permettent d’apporter de nouvelles
sélectivités.
2.3 Électrochromatographie capillaire
2.3.1 Principe
L’électrochromatographie capillaire (ECC) est une technique
hybride entre l’électrophorèse capillaire et la chromatographie en
phase liquide qui s’est développée rapidement ces dernières
années. En ECC, un tube capillaire de silice est rempli de particules
de phase stationnaire (exemple : silices greffées de faible granulo-
métrie) utilisées en chromatographie en phase liquide. La phase
mobile est constituée par un mélange d’un tampon électrophoréti-
que et d’un solvant organique (méthanol, acétonitrile). Une forte
tension est appliquée aux extrémités de ce capillaire générant un
flux électroosmotique. Les solutés se déplacent alors vers le détec-
teur selon deux processus, l’un de migration électrophorétique et
l’autre de rétention chromatographique. Ainsi, cette technique peut
être présentée de façon simple comme étant de l’électrophorèse
capillaire réalisée dans un capillaire rempli de phase stationnaire ou
de la chromatographie en phase liquide réalisée dans une colonne

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Plusieurs solutions ont été proposées pour le remplissage des

0,006 colonnes capillaires mais différents problèmes pratiques tels que la
Absorbance

réalisation des deux frittés in situ, le remplissage homogène des

0,005
4 12 14
0,004 3 13
1 2 9
0,003
0,002
0,001
0 pression en présence de la phase mobile pendant plusieurs heures
6 9 12 15 18
Capillaire : silice fondue 87 cm  75 µm de diamètre intérieur ;
tampon : 20 mM borate-phosphate pH 7 contenant 15 mM
cholate de sodium, 35 mM déoxycholate de sodium ;
tension : + 20 kV ;
détection UV : 214 nm ;
température : 35 °C ;
injection hydrodynamique 2 s (0,5 psi);
concentration des benzodiazépines à analyser : 5 µg · mL–1.
Solutés : 1 : bromazépam ; 2 : flunitrazépam ; 3 : nitrazépam ;
4 : clonazépam ; 6 : témazépam ; 7 : lorazépam ;
8 : lormétazépam ; 9 : clobazam ; 10 : chlordiazépoxide ;
11 : flurazépam ; 12 : diazépam ; 13 : halazépam ;
14 : nordazépam.
1 psi = 6,894 757  103 Pa
Figure 4 – Séparation de benzodiazépines par CEM [3]
capillaire de silice soumise à un champ électrique. Toutefois, les
solutés neutres se sépareront uniquement en fonction de leur sélec-
tivité vis-à-vis du matériau de remplissage et seront élués par le flux
électroosmotique. Du fait du profil plat de cet écoulement, comparé
au profil parabolique généré par un écoulement hydrodynamique,
l’ECC présente de meilleures efficacités de pics que la CPL. D’autre
part, aucune perte de charge n’existe dans une colonne en ECC.
colonnes, leur fragilité mécanique et la formation de bulles lors des
séparations ont freiné le développement de cette technique.
8
7 11
10
6 La plus commune est la méthode hydrodynamique dans laquelle
une suspension de particules de phase stationnaire dans un solvant
(acétone, méthanol) est introduite dans le capillaire en utilisant des
pressions élevées. Une fois rempli, le capillaire est conditionné sous
21 24 afin de stabiliser les particules aux conditions d’analyse et d’élimi-
Temps (min) ner les bulles d’air. Puis, le capillaire rempli est installé dans l’appa-
reil d’électrophorèse et conditionné sous tension en présence de la
phase mobile.
2.3.3 Paramètres
Les principaux paramètres d’optimisation sont la nature et le
pourcentage du solvant organique, le pH et la force ionique de
l’électrolyte, la tension et la température.
Pour des solutés neutres, si la force ionique et la température
influent essentiellement sur le comportement électrophorétique, la
teneur en solvant organique influe sur le comportement chromato-
graphique.
Par contre, pour des molécules chargées, l’influence des diffé-
rents paramètres sur la migration est plus complexe à interpréter.
La figure 6 montre la séparation de plusieurs benzodiazépines
neutres sur un capillaire rempli avec de la silice greffée phényle.
2.3.4 Applications

À ce jour, les applications rapportées dans la littérature sont

essentiellement axées sur l’analyse de molécules neutres mais
2.3.2 Colonnes l’électrochromatographie tend à se développer pour la séparation
de composés ionisés.
Les colonnes remplies consistent en un tube capillaire de 25 à La figure 7 montre la séparation d’un mélange standard de cinq
100 µm de diamètre interne et environ 50 cm de longueur, rempli en nucléosides sur un capillaire rempli de silice greffée phényle (3 µm)
totalité avec des particules de 0,5 à 5 µm de diamètre. Le matériau avec des efficacités de pics supérieures à 85 000 plateaux théori-
de remplissage, correspondant à des particules de silices greffées ques par mètre.
(0,5 à 5 µm de diamètre), est contenu entre deux frittés et la
détection UV se fait directement sur le capillaire après le fritté de À pH 5, les solutés uridine (U), guanosine (G) et thymidine (T)
fenêtre (figure 5). sont neutres et leur comportement en ECC reflète exclusivement un
processus de rétention chromatographique. Pour des molécules
ionisables telles que l’adénosine (A) et la cytidine (C), leur ordre
d’élution comparée indique une prédominance du processus chro-
Phase stationnaire matographique pour la première et de migration électrophorétique
(0,5 à 5 µm de diamètre) pour la seconde molécule.
Fritté Fritté
d'entrée de fenêtre À pH 5, la cytidine de charge apparente positive est non retenue
Fenêtre sur la phase stationnaire et migre avant le flux électroosmotique
de détection quel que soit le pourcentage d’acétonitrile présent dans la phase
mobile.
50 à 100 µm

Ainsi, l’électrochromatographie apporte à l’électrophorèse

20 à 100 cm 5 à 10 cm
capillaire la sélectivité des phases stationnaires de la chromato-
Capillaire Capillaire
rempli vide
graphie en phase liquide, et à la chromatographie en phase
liquide, les efficacités élevées rencontrées en électrophorèse
capillaire.
Figure 5 – Schéma d’une colonne capillaire utilisée en ECC

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Absorbance
1
2
0,015 3
4
5 0,007
0,011
FEO
0,007
0,003
– 0,001
0 2 4 6 8 10
Temps (min)
Capillaire : silice greffée phényle 27 cm  75 µm de diamètre intérieur ;
phase mobile : Tris/HCl (pH 8) / 60 % MeCN (force ionique
totale 5 mM) ;
tension : + 15 kV ;
détection UV : 220 nm ;
température : 20 °C ;
injection électrocinétique 4 s (+10 kV) ;
concentration 100 mg · L–1.
Solutés : 1 : oxazépam ; 2 : lorazépam ; 3 : temazépam ; 4 : diazépam ;
5 : tofisopam.
FEO flux électroosmotique
Figure 6 – Séparation de benzodiazépines par ECC en utilisant un
capillaire rempli de phase stationnaire Hypersil Phenyl (3 µm) [4]
2.4 Électrophorèse capillaire en gel (ECG)
2.4.1 Principe
Le principe de l’électrophorèse capillaire en gel [6] repose sur
la séparation de macromolécules en fonction de leur taille. Ce
mode de séparation s’applique essentiellement à la séparation
d’oligonucléotides, d’oligosaccharides, de fragments d’ADN sim-
ple brin ou double brin ou à la séparation de protéines et gly-
coprotéines possédant des densités de charge très proches et qui
peuvent ainsi être difficilement séparées en électrophorèse capil-
laire de zone sur la base de leur rapport charge sur masse. L’ECG
est directement comparable aux méthodes d’électrophorèse
conventionnelle, l’utilisation d’un capillaire offrant l’avantage de
pouvoir appliquer des tensions de 10 à 100 fois supérieures à cel-
les utilisées en électrophorèse classique sans avoir les effets
néfastes provenant de l’effet Joule (dégagement de chaleur). Par
ailleurs, la détection de molécules au sein du capillaire rend
l’analyse quantitative possible. Des capillaires greffés, in situ, par
du polyacrylamide ont été d’abord employés, cependant la diffi-
culté de produire des capillaires reproductibles et l’absence de
stabilité de ceux-ci ont conduit peu à peu à abandonner cette stra-
tégie. Actuellement, l’agarose ou les polymères linéaires hydro-
solubles dits « remplaçables » tels que le polyacrylamide
linéaire, la méthylcellulose, l’hydroxypropylméthylcellulose,
l’alcool polyvinylique, les dextranes ou les polyéthylèneglycols
sont préférés. Ils permettent, en effet, de créer des réseaux enche-
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0,009
Absorbance
U
C
FEO G
0,005
A
T
0,003
0,001
– 0,001
0 5 10 15
Temps (min)
Capillaire : Hypersil Phényle 27 cm  75 µm de diamètre intérieur
(20 cm rempli de particules 3 µm);
phase mobile : acide acétique/ammoniaque (pH 5)/
acétonitrile (95/5 v/v ; force ionique 10 mM) ;
tension : + 20 kV ;
détection UV : 254 nm ;
température : 20 °C ;
marqueur de flux : thiourée ;
concentration des nucléosides : 50 mg · L–1 ;
injection électrocinétique 4 s (+10 kV).
FEO flux électroosmotique
Figure 7 – Séparation de nucléosides par ECC sur une phase
stationnaire de silice greffée phényle [5]
vêtrés au sein du capillaire qui peuvent être facilement éliminés
par simple rinçage du capillaire. La présence de ces polymères
permet également de réduire considérablement, et même d’élimi-
ner, le flux électroosmotique. Ils offrent l’avantage de posséder,
en solution, des propriétés de tamis moléculaire et peuvent être
remplacés à chaque analyse assurant une meilleure reproductibi-
lité des résultats et limitant le risque de contaminations croisées.
2.4.2 Mécanismes
■ Deux théories sont actuellement décrites pour expliquer les
mécanismes de séparation en EGC et il est vraisemblable que le
mécanisme réel se situe quelque part entre ces deux modèles ; il
s’agit du modèle d’Ogston et du modèle dit « de reptation ».
● Dans le premier cas (modèle d’Ogston), les molécules ou
macromolécules sont assimilées à des particules sphériques qui
vont traverser le tamis moléculaire constitué d’un réseau aléatoire
de pores interconnectés de diamètres variables mais centrés autour
d’une moyenne. Ainsi, les molécules de petite taille traversant plus
facilement le réseau de polymère migreront plus rapidement au tra-
vers de ce réseau. La mobilité d’une molécule sera fonction princi-
palement de la concentration en polymère du tampon d’analyse.
● Le modèle de reptation considère que la taille des macromolé-
cules flexibles est très grande par rapport à la distance entre deux
liens du réseau polymérique et que celles-ci vont « serpenter » à tra-
vers le gel pour migrer, leur mobilité devenant inversement propor-
tionnelle à la longueur de la chaîne.
___________________________________________________________________________________________________________ ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE

1 746 pb – 4,6
lg mep
1 mUA

– 4,7

– 4,8

800 pb – 4,9

634 pb
–5
303 pb
279 pb
249 pb
222 pb 0 0,5 1 1,5 2
POE (%)
88 pb
α-Lactalbumine Ovalbumine

Trypsine inhibiteur Sérum albumine bovine

14 348 pb
Anhydrase carbonique Phosphorylase B

4 6 8
POE poly(oxyde d'éthylène) de masse moléculaire M = 300 000
Temps (min)
ajouté au tampon
Tampon 0,16 M tris-acétate-EDTA mep mobilité électrophorétique
Capillaire : 50 µm  30 cm
Tension appliquée 407 V/cm
pb paires de bases Figure 9 – Calibrage des masses molaires de protéines en ECG [8]
UA unité d'absorbance

trations croissantes en polymère. Une relation linéaire entre le loga-

Figure 8 – ECG de fragments d’ADN doubles brins réalisé
en présence d’un gel d’agarose méthoxylé (1 %) [7]
2.4.3 Paramètres
Les principaux paramètres à optimiser lors de séparations de
macromolécules par ECG sont la nature et la concentration du
polymère ajoutés au tampon d’analyse. Des gels prêts à l’emploi
permettant d’effectuer des séparations par ECG de protéines ayant
des masses moléculaires entre 14 kDa et 200 kDa sont actuellement
commercialisés. Les capillaires généralement utilisés pour ce mode
de séparation sont traités de manière à éliminer le flux électroosmo-
tique. Il peut s’agir selon les cas de capillaire de silice revêtu avec
par exemple du polyacrylamide ou du polyéthylèneglycol. La
figure 8 montre la séparation de petits fragments d’ADN doubles
brins réalisée à l’aide de gel d’agarose ajouté à une concentration de
1 % dans un tampon constitué de 160 mM de tris-acétate-EDTA. Le
capillaire utilisé ici est de 30 cm de longueur et est revêtu de poly-
acrylamide.
2.4.4 Application à la séparation de protéines
rithme de la mobilité électrophorétique d’une protéine en présence
de gel meo,g et la concentration en polymère (T, exprimée en pour-
centage) permet d’estimer le coefficient de retardement Kr de cette
protéine par le calcul de la pente de la droite représentée par
lgmeo,g = f(T) :
lgmeo,g = lgmeo - Tb(Rg + r)2
et
Kr = b(Rg + r)2
avec meo mobilité du composé en l’absence de gel,
b constante,
Rg rayon de giration de la macromolécule,
r rayon moyen des pores du réseau polymérique.
Ainsi, en réalisant cette représentation pour des protéines de
masse moléculaire connue, il sera possible de calculer, pour cha-
cune d’elles, son Kr. Une droite de calibrage pourra alors être obte-
nue en représentant le logarithme de la masse moléculaire des
protéines standards en fonction de la racine carrée de Kr permettant
une estimation de la masse moléculaire de la protéine analysée
(figure 10).

Pour les protéines, les séparations peuvent être réalisées en con-

ditions dénaturantes ou non.
En présence de SDS, il est possible d’effectuer des séparations de
protéines en fonction de leur masse et d’estimer la masse molécu-
laire de celles-ci en effectuant un calibrage à l’aide de protéines
standards. En effet, une relation linéaire est obtenue entre la mobi-
lité des protéines et le logarithme de leur masse moléculaire
(figure 9). Les glycoprotéines et les protéines basiques possédant
un comportement marginal en présence de SDS ne fixent pas le
SDS dans un rapport constant en fonction de leur masse, ce qui con-
duit à des estimations erronées de leur masse moléculaire. La
méthode de Fergusson est alors employée et consiste à réaliser des
analyses de ces protéines dans des tampons contenant des concen-
2.5 Isoélectrofocalisation capillaire
2.5.1 Principe
L’isoélectrofocalisation capillaire (IEFc) [10] constitue un mode de
séparation particulièrement adapté à la séparation de composés
amphotères tels que les peptides ou les protéines possédant des
points isoélectriques (pI) différents. La séparation est réalisée dans
un capillaire en général greffé afin d’éliminer le flux électroosmo-
tique et rempli par un mélange constitué de protéines, d’une solu-
tion d’ampholytes et d’électrolyte. Un polymère hydrosoluble est

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5,4 Mélange de protéines,

lg M ampholytes et gel

5,2 Fenêtre de
détection
5

Anolyte Catholyte
4,8

Focalisation
4,6

4,4 + Anolyte Catholyte –

4,2
Mobilisation

4
+ Anolyte
0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 Catholyte –
Kr

Protéines standards : α-lactalbumine (14 000), anhydrase carbonique Zones de protéines focalisées
(29 000), ovalbumine (45 000), sérum albumine
bovine (66 000), phosphorylase B (97 000) ; a mode « two-step »
β-galactosidase (116 000), myosine (205 000)
employées pour la détermination de la masse
moléculaire de glycoprotéines.
TEMED
Glycoprotéines analysées Mélange de protéines, ampholytes et gel

Figure 10 – Représentation de Fergusson entre la racine carrée Catholyte Anolyte

du coefficient de retardement Kr obtenu pour différentes protéines
standards et le logarithme de leur masse moléculaire (M) [9]
souvent ajouté à ce mélange afin d’éliminer le flux électroosmoti-
que résiduel et d’éviter la trop grande diffusion des molécules. Les
réservoirs à la cathode et à l’anode contiennent respectivement des
solutions acide (anolyte), typiquement de l’acide phosphorique
dilué (10 mM à 100 mM), et basique (catholyte), en général une solu-
tion d’hydroxyde de sodium. Lors de l’établissement d’une tension,
les ampholytes migrent jusqu’à atteindre une zone où ils ne possè-
dent plus de charge nette et permettent ainsi d’établir, au sein du
capillaire, un gradient de pH dont la gamme est directement
dépendante du type d’ampholyte présent dans le mélange. Les pro-
téines vont ainsi se focaliser et se concentrer dans une zone de pH
où elles possèdent une charge nette nulle. Théoriquement, des pro-
téines possédant des valeurs de pI différentes de plus de 0,05 unité
de pH peuvent être séparées par cette méthode. Lorsque cet état
d’équilibre est atteint, une mobilisation des zones est réalisée soit
par voie chimique ou en appliquant une pression. Les zones de pro-
téines peuvent ainsi être détectées lors de leur passage au niveau
de la fenêtre de détection (méthode « two-step »).
2.5.2 Méthodes particulières
Il est également possible de réaliser simultanément les étapes de
focalisation et de mobilisation par la méthode dite « one-step »
[11]. La figure 11 compare les mécanismes de séparation selon la
méthode « one-step » ou « two-step ». La séparation est réalisée en
présence de flux électroosmotique soit à partir d’un capillaire de
silice vierge, soit à partir d’un capillaire greffé mais possédant un
flux électroosmotique FEO non négligeable. De la même manière
que précédemment, un gradient de pH est établi au sein du capil-
laire, mais uniquement sur la portion du capillaire située après la
cellule de détection, la partie située entre l’extrémité de l’injection
et la fenêtre de détection étant bloquée par l’addition d’une base
forte, le TEMED ( N, N, N′, N′ -tétraméthyléthylènediamine ) . Ainsi,
les protéines focalisées entre la fenêtre de détection et l’extrémité
Mobilisation + focalisation
– Catholyte TEMED Anolyte +
FEO
Zones de protéines focalisées
b mode « one-step »
Figure 11 – Représentation schématique des modes « two-step »
et « one-step » en IEFc
cathodique vont sous l’influence du FEO repasser devant la fenêtre
de détection en direction de l’anode. L’avantage de cette technique
par rapport à l’IEFc « two-step » est la rapidité des analyses.
Les ampholytes commerciaux sont en général des acides polycar-
boxylés, polyaminés, qui peuvent couvrir les gammes de pH entre 3
et 10. Mais il existe également des ampholytes permettant de tra-
vailler sur des gammes de pH plus restreintes. Le choix de l’ampho-
lyte constitue donc un critère important à prendre en compte, d’une
part afin de sélectionner la gamme de pH adaptée au mélange de
protéines à séparer et d’autre part afin d’éviter une perte de sensibi-
lité due à une absorbance trop importante des ampholytes. Géné-
ralement, les molécules d’ampholyte absorbent dans l’UV et ne
permettent la détection des protéines qu’à 280 nm. Ces ampholytes
doivent posséder, en outre, un grand pouvoir tampon, une forte
solubilité en milieu aqueux et une conductivité suffisante. Des
polymères hydrosolubles tels que la méthylcellulose (0,1 %) sont
quelquefois ajoutés à l’échantillon de manière à minimiser la diffu-
sion des bandes mais aussi à éliminer le flux électroosmotique
résiduel. L’addition de tels composés est importante en IEFc « two-
step » où le FEO doit impérativement être totalement supprimé pour
une bonne focalisation des protéines.

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(0)

Tableau 2 – Exemples de protéines standards utilisées

Absorbance (280 nm)

comme marqueur de pI en IEFc

β-Lactoglobuline A
β-Lactoglobuline B
MAb
Protéines ou peptides standards pI 0,02

Myoglobine
Cholscystokinin flanking peptide (CCK) 2,75
Amyloglucosidase 3,6
Inhibiteur de la trypsine (soybean) 4,6 0,01

Myoglobine
β-Lactoglobuline A et B 5,3 et 5,15 respective-
ment
Anhydrase carbonique II (érythrocytes 5,9
bovins) 0
Anhydrase carbonique I (érythrocytes 6,6
humains)
Myoglobine (cœur de cheval) 6,8 et 7,2 12 14 16 18 20
Temps (min)
Variants d’hémoglobine C, S, F, A 7,5 ; 7,25 ; 7,15 ; 7,10 res-
pectivement
a 2 minutes de focalisation à 10 kV,
Lectine (Lens Culinaris) 8,2 ; 8,6 et 8,8 mobilisation à 10 kV

Lysozyme (œuf de poule) 9,1

Absorbance (280 nm)

MAb4
Trypsinogène (pancréas bovin) 9,3 0,06

β-Lactoglobuline A
Myoglobine
Ribonucléase A (pancréas bovin) 9,45

β-Lactoglobuline B
Cytochrome C (cœur de cheval) 10,6

MAb3
0,04

MAb2

MAb5
L’un des principaux problèmes de la IEFc est la précipitation des

Myoglobine
protéines lorsqu’elles se trouvent concentrées dans un milieu dont 0,02
le pH est proche de leur point isoélectrique (ce qui se produit au

MAb6
MAb1
cours de leur focalisation). Ainsi, l’addition de solubilisants est sou-
vent nécessaire et l’optimisation des conditions opératoires consis-
tera non seulement à choisir la gamme d’ampholyte adéquate pour 0
les protéines analysées mais également à tester différentes classes
de solubilisants ainsi que les concentrations en polymère hydro-
soluble ou en TEMED. 12 14 16 18 20
Temps (min)

2.5.3 Exemples de séparations b 2 minutes de focalisation à 10 kV,

mobilisation à 20 kV

Une analyse par IEFc permet en outre d’estimer le pI d’une pro-

téine ou glycoprotéine grâce à un étalonnage par des marqueurs de
pI. Ces marqueurs doivent répondre à plusieurs exigences : les
composés doivent absorber en UV puisque, en IEFc, la longueur
d’onde de détection est très souvent fixée à 280 nm en raison de
l’absorption non négligeable aux plus basses longueurs d’onde des
ampholytes utilisés. Les composés doivent être stables et très solu-
bles. Les protéines sont couramment utilisées bien que leur instabi-
lité peut conduire à l’apparition de pics satellites. Le tableau 2
donne une liste des protéines standards commercialisées, les plus
fréquemment utilisées comme marqueurs de pI. Il est également
possible d’avoir recours à des aminophénols synthétiques substi-
tués (couvrant la gamme de pH entre 5,3 et 10,4) [12] ou des pepti-
des synthétiques [13].
La figure 12 présente une séparation des glycoformes obtenue à
partir d’un anticorps de souris monoclonal. À cette glycoprotéine
ont été ajoutées en mélange des protéines standards telles que la
myoglobine, la β-lactoglobuline A et B dont les points isoélectriques
sont connus et serviront ainsi à calculer le pI de la glycoprotéine
analysée. L’étape de mobilisation réalisée par mode hydrodyna-
mique, c’est-à-dire ici sous une faible pression appliquée entre les
deux extrémités du capillaire (0,5 psi), montre l’intérêt d’appliquer
Capillaire : µSIL DB-1, 27 cm
Ampholyte : 4 % pharmalyte 3-10
1 % TEMED, contenant 0,8 % méthylcellulose
Protéines standards 50 ng/µL
MAb anticorps monoclonal
Figure 12 – IEFc en mode « two-step » d’un anticorps monoclonal
de souris (500 ng/µL) [14]
en outre une tension relativement élevée pour maintenir une bonne
résolution des différentes glycoformes.
Nota : on rappelle que 1 psi = 6,894 757 × 103 Pa
Lorsque l’on représente le pI des protéines standards en fonction
du temps de migration de celles-ci, une droite est obtenue à partir
de laquelle les estimations de pI pour des protéines ou glyco-
protéines analysées peuvent être effectuées. Lorsque la mobilisa-
tion des protéines est réalisée au moyen du FEO, comme cela est le
cas en IEFc mode « one-step », la linéarité n’est plus observée et on
obtient alors une courbe.

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