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Brettanomyces spp. sont connus pour leur rôle important dans la production de Lambic et spécialisés
bières aigres, avec le conditionnement secondaire d'une bière trappiste belge notamment (Van
Oevelen et al, 1976;. Marten 1996;. Vanderhaegen et al, 2003). Au cours de la dernière
décennie, Brettanomyces spp. ont vu une utilisation croissante dans le secteur artisanal brassage de
l'industrie avec une poignée de brasseries ayant bières produites qui étaient primaire fermentées avec
des cultures pures de Brettanomyces spp. Cela se est produit sur l'expérimentation que très peu
d'information existe quant culture pure capacités fermentaires et les composés aromatiques produites
par diverses souches. Dekkera / Brettanomyces spp. ont fait l'objet de nombreuses études réalisées
au cours du dernier siècle, bien que la majorité de la recherche récente a mis l'accent sur
l'amélioration de la connaissance de l'industrie du vin. Cette thèse vise à fournir une plus grande
connaissance des Brettanomyces souches disponibles dans l'industrie brassicole en mettant l'accent
sur les fermentations spécifiques à la souche et l'identification des principaux composés produits au
cours de la fermentation pur la culture anaérobie dans le moût.
CLASSIFICATION TAXONOMIQUE
La taxonomie du genre Brettanomyces a été débattue depuis sa découverte précoce et a vu de
nombreux reclassements au fil des ans. La classification était basée sur quelques espèces qui
reproduisent de façon asexuée (forme anamorphe) par bourgeonnement multipolaire (Custers,
1940). Peu de temps après, la formation des ascospores a été observée et le genre Dekkera , qui se
reproduit sexuellement (forme téléomorphe), a été introduit dans le cadre de la taxonomie (Van der
Walt, 1984). La taxonomie actuelle comprend cinq espèces dans les genres
de Dekkera / Brettanomyces . Ce sont les anamorphes bruxellensis de
Brettanomyces , Brettanomyces anomalus , Brettanomyces custersianus , Brettanomyces
naardenensis et Brettanomyces nanus , avec téléomorphes existants pour les deux premières
espèces, Dekkera bruxellensis et Dekkera anomala (Kurtzman et Fell, 2000; Cocolin et al 2004;.
Oelofse et al ., 2008). La distinction entre Dekkera et Brettanomyces est défendable avec Oelofse et
al. (2008) citant Loureiro et Malfeito-Ferreira de 2006 quand ils ont affirmé que les techniques
moléculaires actuelles de détection d'ADN ont révélé aucun écart entre les anamorphes et
téléomorphe Etats. L'utilisation moderne dans toute l'industrie comprend deux espèces
de Brettanomycesdisponibles auprès de sociétés de levure. Les deux espèces
sont B. bruxellensis et B. anomalus avec la majorité des souches étant B. bruxellensis . Tous les
autres noms sont des synonymes utilisés provenant de ancienne nomenclature ne sont plus
reconnus. Tout au long de ce texte, les espèces sont désignées comme les auteurs originaux utilisés
dans leurs publications, avec toutes les cultures utilisées dans cette étude désignées par le nom de la
souche désigné par la société de levure qu'ils provenaient de. Comme cette étude porte sur
l'utilisation de ces levures dans l'industrie brassicole et l'accumulation de la biomasse est à travers le
bourgeonnement asexué des cellules de levure, il semble approprié de se référer au genre
commeBrettanomyces , tandis que techniquement incorrect.
DÉCOUVERTE INITIALE ET CARACTÉRISATION
Le compte rendu publié plus tôt venait d'un document présenté à l'Institut of Brewing dans lequel
Claussen (1904) décrit la découverte d'une levure nouvellement isolé qu'il a proposé être
appelé Brettanomyces , et était responsable de la fermentation secondaire et le développement des
saveurs et des arômes de caractéristiques les meilleurs Anglais stock bières. La première enquête
systématique a été menée par Custers et en 1940 il a présenté ses conclusions sur 17 souches
de Brettanomyces spp., qu'il croyait ne se trouve dans les bières belges (Henrici, 1941) et en
anglais. Des études approfondies ont révélé Custers la fermentation du glucose en éthanol a été plus
rapide dans des conditions aérobies puis conditions anaérobies, un phénomène qu'il nomme «l'effet
Pasteur négative" (Henrici, 1941; Skinner, 1947; Barnet et al., 2005). Les résultats figurent Custers
observant des quantités considérables d'acide acétique, produit pendant la fermentation aérobie,
tandis qu'aucune quantité appréciable formés pendant la fermentation anaérobie. D'autres
observations dans des conditions anaérobies conduit Custers à croire cellules est lentement devenu
adaptées aux conditions anaérobies avec une fermentation anaérobie normale qui a suivi (Skinner,
1947).
Dans une étude ultérieure réalisée par Wiken et al. (1961), l'existence d'un effet Pasteur négative a
été observée chez les jeunes cellules de tous les Brettanomyces spp., comme le métabolisme du
glucose est produit à un taux plus élevé en présence d'oxygène pendant une diminution de la
consommation de glucose a été mesurée lors de la commutation des cultures à des conditions
anaérobies . Dans la même année, Scheffers (1961) ont trouvé fermentation anaérobie peut être
stimulée par des quantités infimes de O 2 ou de l'addition de H + -acceptors tels que l'acétaldéhyde,
l'acétone, l'acide pyruvique et d'autres composés carbonylés. Le terme «effet Custers" a été introduit
plus tard pour l'effet Pasteur négatif dans Brettanomyces spp. par Scheffers et Wiken (1966; 1969), et
encore élargi par Scheffers et Misset en 1974 qui a proposé effet Custers a eu lieu à la suite de la
réduction nette de NAD + en NADH et était due à une réaction oxydative côté provoquant la formation
d'acide acétique (Scheffers, 1979). Le métabolisme de l'acétaldéhyde dans Brettanomyces spp. dans
des conditions anaérobies n'a pas été étudié à fond, tandis que dans des conditions aérobies
Carrascosa et al. (1981) ont constaté support pour le mécanisme de l'effet Custers étant liée à la
formation d'acide acétique par la conversion par oxydation de l'acétaldéhyde. Custers effet peut alors
mieux être interprété en termes d'activité glycolytique, que les cellules sont passés de aérobiose
d'anaérobiose, la glycolyse est temporairement statique comme en témoigne de l'absence de la
consommation de glucose et de CO 2 la production (Wijsman et al., 1984).Se appuyant sur des études
antérieures Scheffers, Wijsman et al. (1984) ont constaté lorsque Brettanomycescellules ont été
introduites dans un environnement anaérobie une phase de latence transitoire d'un maximum de dix
heures a été observée avant la dissimulation lente du glucose et la production ultérieure de
CO 2reprend. Le mécanisme responsable de la lente adaptation du métabolisme ne est pas comprise,
bien que ces résultats sont en accord avec d'autres études qui ont suggéré fermentation anaérobie est
possible avec une activité atone ou lent survenant (Custers, 1940; Scheffers, 1961; Martens, 1996;
Ciani et Ferraro, 1997; Aguilar Uscanga, 2003; Passoth et al, 2007;.. Garcia Alvarado et al, 2007).
GLYCÉROL PRODUCTION
La phase de latence et l'effet ultérieur Custers est créé par l'écoulement continu de NAD + au moyen
de la conversion irréversible de l'acétaldéhyde en acide acétique glycolyse mise à l'arrêt en raison de
l'absence de NAD + (Wijsman et al., 1984). Wijsman (1984) a également conclu que l'effet observé
dans Custers Brettanomycesspp. a été provoquée par l'incapacité des cellules à rétablir l'équilibre
d'oxydoréduction par l'intermédiaire de la production de métabolites réduits, en particulier le
glycérol, éventuellement attribuée à l'absence d'activité de la phosphatase glycérol 3-phosphate. La
production de glycerol a été montré pour être important dans le métabolisme de NADH et de rétablir
l'équilibre redox pendant la fermentation anaérobie dans d'autres levures (Oura, 1977). En outre, il
est connu que le glycérol produit par la levure a un rôle secondaire dans l'amélioration de la
perception du corps et la sensation en bouche de la bière lors de 2/1 g / l sont présents (Boulton et
Quain, 2006, p.120). Des rapports anecdotiques de bières corps et bouche manquent lorsqu'elle
fermenté avec des souches de cultures pures de Brettanomyces ont été un problème et peut être
provoquée par le manque de glycérol produit pendant la fermentation. Une étude récente de Aguilar
Uscanga et al. (2003) ont observé une légère production de glycérol se produisant dans des conditions
anaérobies dans une seule souche deBrettanomyces bruxellensis . la production de glycérol peut alors
être variable entre les souches indiquant la capacité du redox à restaurer plus rapidement, dans
lequel les souches de cas seraient probablement capable de fermentation entier avec une diminution
du temps nécessaire.
CROISSANCE FACTEURS LIÉS
Le rôle de l'oxygène sur la croissance et la production d'acide acétique
par Dekkera / Brettanomyces spp. a été soigneusement étudié dans le vin et les fermentations
alcooliques industrielles (Ciani et Ferraro, 1997;. Abbott et al, 2005a, b). Modérée à de faibles
quantités d'oxygène a été montré pour encourager la production de biomasse cellulaire, des
conditions semi-aérobie produisant la plus grande croissance cellulaire (Aguilar Uscanga et al.,
2003). Les niveaux de l'éthanol et de l'acide acétique produit pendant la culture de lot aérobie
dépendent des niveaux d'aération avec des concentrations accrues de taux de croissance de l'oxygène
abaissement (Aguilar Uscanga et al., 2003). Brettanomyces spp. ont été observés à utiliser à la fois du
glucose et de l'éthanol dans la production d'acide acétique sous des niveaux accrus d'oxygène, bien
que plus libre (2002) a montré pas toutes les souches peuvent utiliser à la fois comme source de
carbone, avec une forte variabilité vu dans les niveaux d'acide acétique produites par différentes
souches. La température a été également montré pour avoir un impact sur la croissance, avec des
températures plus élevées en diminuant le temps nécessaire pour atteindre la concentration
maximale de cellules, avec des taux de croissance optimales observées entre 25 et 32 ° C (Brendam
et al., 2008). Une analyse plus poussée par Brendam et al. (2008) ont montré que l'augmentation de
la température a changé la vitesse à laquelle les composés métaboliques ont été produits, mais ne
ont pas changé la quantité de métabolites produits.
CAPACITÉS DE FERMENTATION ET LES ENZYMES IMPLIQUÉES
Brettanomyces spp. sont associés avec des bières très atténués et sont connus comme plus levures
atténuantes (Shantha Kumara et al., 1993). Toutes les souches semblent pas être capable de plus
atténuation en Custers observé souches de Brettanomyces anomalus qui étaient incapables de
fermenter le maltose (Gilliland, 1961).Gilliland (1961) observe en outre un assortiment
de Brettanomyces souches capables de fermenter monosaccharides simples et quelques disaccharides,
mais incapables de fermenter le maltose, affirment ces souches étaient plus comme Brettanomyces
anomalus de comportement. Dans un tableau fourni par Gilliland (1961), étroitement liés
les Brettanomyces claussenii souches se sont révélées être capable de fermenter le maltose et
partageaient une composante commune avec les de Brettanomyces dans les souches que les deux
étaient capables de fermenter le lactose et le cellobiose. Le système taxinomique actuelle ne fait
aucune distinction entre ces espèces, et il semblerait actuelles de Brettanomyces les souches
diffèrent dans leur capacité à fermenter le maltose. Spindler et al. (1992) ont observé un custersii
Brettanomyces souche capable de fermenter en éthanol cellobiose, présentant une plus grande
utilisation puis d'autres Brettanomycesclaussenii souches utilisées dans l'étude. La présence de B-
glucosidase, l'enzyme responsable de l'hydrolyse de la cellobiose en Brettanomyces spp. il a été
démontré par Daenen et al. (2007) pour être présent à des concentrations variant
en Brettanomyces spp. Cette même enzyme est également capable d'hydrolyser les composés actifs
de saveur à partir des glycosides présents dans la bière de houblon ou de fruits et montre un grand
potentiel pour une utilisation dans bioflavoring (Daenen, 2007). Brettanomyces spp. sont le plus
souvent cultivé de la bière conditionnée en fûts de chêne et une relation symbiotique a été adoptée
compte tenu de la longévité de leur existence dans les barils, mais la plupart
des Brettanomyces spp. qui dominent pendant Lambic brassage ne ont pas l'enzyme B-glucosidase
présent nécessaire pour hydrolyser le cellobiose (Vanderhaegen, 2003). Un Lambicus
Brettanomyces souche isolée à partir d'un type plus atténué bière Lambic a été montré pour posséder
à la fois un extracellulaires et intracellulaires-glucosidase (Shantha Kumara et al., 1993). Les enzymes
a-glucosidase de B. Lambicus était capable d'hydrolyser les dextrines de moût avec un maximum de 9
degrés de polymérisation alors que les deux enzymes extracellulaires et intracellulaires ont montré
une activité similaire pour une gamme de glucides (Shantha Kumara et al., 1993). Ces enzymes
semblent être en partie responsable de l'atténuation de plus observé par Brettanomyces levure.
PRODUCTION DE MÉTABOLITES SECONDAIRES
La capacité des Brettanomyces spp. d'influencer la saveur et l'arôme de la bière est bien connu
(Gilliland, 1961), bien que les composés caractéristiques produites pendant la fermentation de
culture pure ont été relativement sous étudié. Beaucoup de descripteurs organoleptiques sont utilisés
pour décrire les arômes souvent piquantes de Brettanomyces spp. Ceux-ci incluent le clou de girofle,
épicé, chevalin, basse cour, smokey, médical, bande-aide, métallique, biscuit biscuit, de chèvre
comme, pomme, fleurs, de fruits exotiques et d'agrumes. Bien que ces descripteurs sont
généralement associés à Brettanomyces levure, la recherche de l'industrie du vin a expliqué l'origine
de quelques-uns de ces composés. Ils ont montré que ces composés sont formés à partir de
composants spécifiques présents base de matières premières, et leur production
par Brettanomyces spp. peut varier considérablement.
Composés phénoliques volatils sont responsables de certaines des caractéristiques aromatiques les
plus reconnus associés à Brettanomyces espèces. Heresztyn (1986b) a trouvé 4-éthylgaïacol et 4-
éthylphénol formé pendant la fermentation du moût de raisin avec Brettanomyces spp. en même
temps que des traces de 4-vinylguaiacol. Les vins épicés et de clou de girofle contenaient arômes
forts tout en GC sniffing effluents révélé, arômes épicés de clou de girofle et d'épices, des arômes de
fumé qui correspondaient aux temps de rétention de 4-éthylgaïacol et 4-éthylphénol (respectivement
Heresztyn, 1986b). Il a été noté lors de l'étude que dans les régions du chromatogramme où l'odeur
épicée se estompait, un caractère de cidre de pomme comme était souvent perçu.Des recherches
plus poussées par Heresztyn (1986b) a montré les acides hydroxycinnamiques, acide p-coumarique et
acide férulique, ont été métabolisés à 4-vinylphénol, 4-vinylguaiacol et 4-éthylphénol, 4-éthylgaïacol
respectivement par Brettanomyces spp. Chatonnet et al. (1995) ont
observé Brettanomyces spp.étaient capables de produire des composés phénoliques 4-éthyl dans des
conditions avec peu de sucre résiduel au cours du processus de maturation plus tard. Récemment,
deux enzymes responsables des arômes phénoliques liés à Brettanomyces spp. ont été caractérisés. La
première est une résine phénolique (cinnamique) décarboxylase d'acide, responsable de la
decarboxilation d'acides hydroxycinnamiques en le dérivé 4-vinyl respective et la seconde, une
réductase responsable de la réduction du dérivé 4-vinylique en son dérivé 4-éthyl respectif
vinylphénol (Godoy et al., 2008).
Deux formes de tétrahydropyridines substitués, le 2-ethyltetrahydropyridine (ETHP) et de 2-acétyl-
3,4,5,6-tétrahydropyridine (ATHP), peuvent être produits par Brettanomyces spp. Leur métabolisme
implique l'acide aminé L-lysine et de l'éthanol avec de l'oxygène ayant un effet stimulant dans leur
production (Heresztyn, 1986a;. Snowdon et al, 2006; Oelofse et al., 2008). Les arômes associés à
ATHP sont semblables à cracker biscuit, bien que les conditions de pH sous faibles peuvent être
décrits comme métallique ou amer (Oelofse et al., 2008). On sait peu de ces composés et leur
production par Brettanomyces spp.
Estérases présentes dans Brettanomyces spp. se sont révélés avoir une activité de synthèse d'ester
ainsi que la capacité observée de ces levures pour accumuler des concentrations élevées de C 8 à
C 12 d'acides gras (Spaepen et al., 1978; et Spaepen Verachtert, 1982). Dans bière Lambic les acides
gras supérieurs deviennent estérifiés en esters éthyliques pendant la même
période Brettanomyces spp. dominer que la levure active la plus importante (Spaepen et al.,
1978). Une analyse plus approfondie a confirmé que les esterases présentes
dans Brettanomyces spp. sont responsables de la formation de l'acétate d'éthyle, le lactate d'éthyle
et l'acétate de phénéthyle, le long de l'hydrolyse avec de l'acétate d'isoamyle (Spaepen et Verachtert,
1982). Ces esters représentent les arômes et les saveurs typiques de Lambic et sont influencés
par Brettanomyces levure pendant la levure mixte et fermentation bactérienne. Pendant la
fermentation de culture pure de l'acide acétique et moins acide lactique sont présents donc la
fraction d'ester pourrait être moins typique ensuite décrit pendant les fermentations microbiennes
mixtes (Van Oevelen et al, 1976;. Martens, 1996).
PORTÉE DU PROJET
Plus récemment, les descripteurs de fruits délicats sont devenus prisés arômes ayant anecdotique été
signalés dans les fermentations de moût en utilisant des cultures pures de Brettanomyces spp. On ne
sait pas quelles souches créer des caractéristiques d'ester les ananas-like, même si elle est devenue
l'objectif d'une poignée de brasseurs de recréer techniques qui ont abouti à ces attributs de fruits
légers. Une poignée de théories existent pour la source possible de les arômes uniques sans aucune
étude précédemment en se concentrant sur une grande variété de métabolites secondaires produits
par Brettanomyces levures. Il est bien entendu que les matières premières présentent une grande
influence sur le comportement des levures et pour cette raison cette étude se concentre sur la
performance globale de ces levures en association avec du malt à base de moût utilisé dans le
brassage. Le but de cette étude était d'accroître la connaissance de la Brettanomyces genre en
fournissant des informations concernant les performances de fermentation et la production de
métabolites pendant la fermentation anaérobie. Il fallait d'abord étudier différents médias d'agar qui
pourraient être utilisés pour la détection de la culture et le dénombrement des souches pendant
toute l'étude. La prochaine étape était d'observer la croissance pendant la culture de lot de prévoir
les méthodes de propagation correctes utilisées pour maximiser la production de cellules. Deux
variables ont été observées au cours de la fermentation pur la culture anaérobie, le taux et la
concentration initiale de l'acide lactique tangage. Trois vitesses de tangage différents ont été
étudiés: 6 x 10 6 , 12 × 10 6 et 18 x 10 6 cellules / ml et cinq concentrations initiales d'acide lactique:
0, 100, 500, 1000, et 3000 mg / l, afin d'évaluer leur influence sur le rendement sur l'ensemble de la
fermentation. Les informations fournies au cours de cette étude sur les souches disponibles auprès de
sociétés de levures commerciales permet conclusions à effectuer sur la meilleure utilisation de
chaque souche et les méthodes qui pourraient maximiser leur capacité de produire divers composés
aromatiques, y compris l'ananas parfois décrit et les caractéristiques de fruits tropicaux. Meilleure
connaissance de la Brettanomycesgenre permettra d'améliorer l'utilisation de cet organisme, que ce
soit pour l'utilisation de culture pure, l'utilisation de la culture mixte, ou comme une levure de
conditionnement secondaire.