Immunohistochimie: Principe Et Technique

ATELIER
Immunohistochimie
Principe et technique
Dr Elh Souleymane SARR
17/03/2021
ATELIER D'IHC 17 - 18 MARS 2021 1

Immunohistochimie
Définition
Une technique
 Mettre en évidence divers Ag cellulaires ou extracellulaires grâce à

des Ac spécifiquement dirigés contre eux, sur préparations
cytologiques ou coupes de tissus congelés ou inclus en paraffine après
fixation au formol.
 Localiser et identifier des constituants cellulaires et tissulaires = Ag
 En utilisant des outils = Ac
Progrès considérables dans le diagnostic morphologique / +++ cancer.

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ATELIER D'IHC 17 - 18 MARS 2021
APPLICATIONS-INTERETS
Applications innombrables en Anapath.
 Intérêt diagnostique: classification des tumeurs par la mise en

évidence d’Ag de différenciation cellulaire (carcinome ? sarcome?,
mélanome?, ou lymphome?),
 Intérêt pronostique: mise en évidence de protéines impliquées dans la

prolifération cellulaire ou de produits d’oncogène
 Intérêt thérapeutique: mise en évidence de cibles thérapeutiques (RO;

RP; Her2)
 identification de l’origine d’une métastase

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Principe
Mettre en évidence certaines protéines cellulaires (cytoplasmiques,

membranaires ou nucléaires), spécifiques pour un type ou une
fonction cellulaire, à l’aide d’une réaction antigène – anticorps, le
complexe formé étant rendu visible, donc localisable, par un marqueur
coloré.

Principe
 Repose reconnaissance d'un Ag par un Ac spécifique et la révélation
de ce complexe Ag-Ac par une réaction chimique grâce à une enzyme
et son substrat.
 Enzyme est :
• la HRP (Horse Radish Peroxidase) / substrat le DAB

(Diaminobenzidine)
• ou l'AP (Phosphatase Alkaline) / substrat le Permanent Red.
 Détection d’une seule protéine (simple marquage) ou + sieurs

protéines sur une même coupe de tissu (marquage multiple).

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RAPPELS SUR IMMUNOLOGIE (support)
• Antigène
• Anticorps
• Liaison Ag-Ac

LES ETAPES DE L’IHC MANUELLE (1)
Matériels requis
 Réactifs
- Un (ou plusieurs) anticorps primaire spécifiques de votre(s) molécule(s)

d'intérêt
- Kit de révélation
- Chromogène: Le DAB (Diaminobenzidine) est le chromogène le plus

utilisé pour une utilisation avec la HRP. Le substrat DAB forme un dépôt
coloré marron lorsqu'il réagit avec la péroxidase en présence
d'hémoglobine 8
 Tampons
- Xylène
- Bains d'alcool à 70%, 80% et 95%
- Peroxyde d'hydrogène (H2O2)
- Tris EDTA, Buffer
 Matériel
- Des pipettes
- Bain-marie
- « Chambre noire »

Mode opératoire
Préparation des lames d’IHC ; Réaliser des coupes de 3 à 4 um de tissus fixés au
formol et inclus en paraffine et les placer sur des lames à charge positive.
FIXATION:
• But/ figer la structure, immobiliser les Ag in situ
• Risque/ modification des épitopes (Dénaturation des Ag), diminuer
perméabilité du tissu
INCLUSION-CONGELATION
• But/ consistance permettant la coupe
• Risque/ Dénaturation des Ag, géner l’acces des Ac aux Ag par
imperméabilité/ hydrophobicité
COUPE
• But/ permettre l’observation des structures intra-cellulaires
• Réaliser des coupes de 3 à 4 um
• Eau distillée, sans albumine
• Placer sur lames à charge positive.
• Incuber à 56-60 degrés (entre 20mn et 6h de tps)

Mode opératoire
 Déparaffinage des coupes dans 3 bains de xylène de 5 minutes

chacun.
 Réhydratation dans des bains d‘alcool décroissant : 100 %, 95 % et

70 % (5 minutes chacun).
 Rincer à l'eau distillée.
 Démasquage de l'antigène : immerger la lame dans du tampon buffer,

pH 9.0, et incuber à 95°C dans un bain-marie pendant 30 minutes.
 Sortir et laisser refroidir à température ambiante dans du tampon

Buffer (15 min).
 Cadrage des coupes de tissu avec stylo hydrofuge (DAKO PEN)
 Bloquer les peroxydases endogènes en incubant le tissu dans du

peroxyde d'hydrogène (H2O2) (10 min).
 Rincer avec du tampon Buffer (3x 5min)
 Appliquer sur le tissu l'anticorps primaire pendant 1 heure en chambre

humide et noire (ou over night).
 Rincer avec du tampon Buffer (3x 5min).

 Appliquer l'anticorps secondaire (HRP-Peroxyde-DAB).
 Rincer avec du tampon Buffer (3x 5min).
 Ajouter le chromogène (DAB) (10 min)
 Rincer à l'eau distillée.
 Contre-coloration à l'hématoxyline (2 à 4 min)
 Laver à l'eau (10 min)
 Déshydrater le tissu dans 2 bains d‘alcool (5 min)
 Laver le tissu dans 2 bains de xylène (2 min)
 Monter la lame pour lecture.
Résultat
Un signal coloré
 Réaction colorée pas suffisante pour prouver la spécificité du

marquage: Le « bon » Ag à la « bonne » place (cellule)
 Marquage faussement (+): cause immunologique ou non (bruit de

fond)
 Marquage faussement (-) : Ag inaccessible ou modifié/ détruit durant

pré-analytique

Lecture
• Raisonnement logique, indissociable de l’examen morphologique
ayant justifié la demande d’IHC
• Apprécier marquage + ou -: intensité, localisation, nbre de cellules

marquées
!!! Temps pré-analytique.

!!!!!
IHC, technique complémentaire
• Priorité à la morphologie: HES, colorations
spéciales
• Utilisation sélective et justifiée
• Confrontation anatomoclinique
• Prescription médicale anatomopathologique.

LIMITES
Les limitations de la technique sont d’ordre purement pratique, d’où

l’importance cruciale d’une formation adéquate des techniciens dans
la manipulation et l’utilisation des anticorps d’une part, et d’une
expérience minimale du pathologiste dans l’interprétation des images
d’autre part.
a) Exigences techniques
b) Pièges lors de l’interprétation
c) Le prix
CONCLUSIONS
La possibilité de pouvoir recourir à l’immunohistochimie, lorsque
cela s’avère nécessaire, représente non seulement un atout
considérable pour le pathologiste, mais encore un avantage non
négligeable pour le médecin traitant et son patient. Idéalement, cette
technique devrait donc être accessible à tous les laboratoires de
pathologie.

CI NOS (HES, x40)

Image Hôpital Principal de Dakar
[CI NOS; RE + x10]

[CI NOS; RE+ x 40]
22
ATELIER D'IHC 17 - 18 MARS 2021 Image Hôpital Principal de Dakar
CITNS (Her2 +++, x10)

CI NOS (Her2 +++, x40)
24
CI NOS (Ki67, x10) 15%
25
Cours aux DES présenté sur IHC par Dr Sarr

Technique IHC manuelle par Margot et Khémesse
2021
Préparation de l’atelier par Dr Sarr

Explication de la technique manuelle et manipulation par Khémesse

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 Mettre en évidence divers Ag cellulaires ou extracellulaires grâce à

 Localiser et identifier des constituants cellulaires et tissulaires = Ag

 En utilisant des outils = Ac

Progrès considérables dans le diagnostic morphologique / +++ cancer.

 Intérêt diagnostique: classification des tumeurs par la mise en

 Intérêt pronostique: mise en évidence de protéines impliquées dans la

 Intérêt thérapeutique: mise en évidence de cibles thérapeutiques (RO;

 identification de l’origine d’une métastase

Mettre en évidence certaines protéines cellulaires (cytoplasmiques,

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• la HRP (Horse Radish Peroxidase) / substrat le DAB

 Détection d’une seule protéine (simple marquage) ou + sieurs

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- Un (ou plusieurs) anticorps primaire spécifiques de votre(s) molécule(s)

- Chromogène: Le DAB (Diaminobenzidine) est le chromogène le plus

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 Déparaffinage des coupes dans 3 bains de xylène de 5 minutes

 Réhydratation dans des bains d‘alcool décroissant : 100 %, 95 % et

 Rincer à l'eau distillée.

 Démasquage de l'antigène : immerger la lame dans du tampon buffer,

 Sortir et laisser refroidir à température ambiante dans du tampon

 Cadrage des coupes de tissu avec stylo hydrofuge (DAKO PEN)

 Bloquer les peroxydases endogènes en incubant le tissu dans du

 Rincer avec du tampon Buffer (3x 5min)

 Appliquer sur le tissu l'anticorps primaire pendant 1 heure en chambre

 Rincer avec du tampon Buffer (3x 5min).

 Réaction colorée pas suffisante pour prouver la spécificité du

 Marquage faussement (+): cause immunologique ou non (bruit de

 Marquage faussement (-) : Ag inaccessible ou modifié/ détruit durant

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• Apprécier marquage + ou -: intensité, localisation, nbre de cellules

!!! Temps pré-analytique.

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Les limitations de la technique sont d’ordre purement pratique, d’où

b) Pièges lors de l’interprétation

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