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- données techniques fondamentales pour réaliser des chromatographies en phase liquide sur
couche mince (CCM) ;
- applications à des chromatographies d'adsorption en phase liquide sur phase stationnaire
solide très fortement polaire (phase stationnaire gel de silice).
Un problème classique rencontré en CCM est le suivant : quelle est la quantité à déposer ? Si un dépôt
ne contient pas assez de matière on risque d'être en dessous du seuil de détection de la technique de
révélation. Si un dépôt est trop chargé, on risque de saturer la phase mobile lorsqu'elle atteindra la ligne
des dépôts en début de migration : tout se passera alors comme si on réalisait une suite de dépôts à la
queue leu-leu : on observera un effet de traînée.
Évidemment la performance d'une CCM dépend du choix de la phase stationnaire, de la phase mobile et
de la méthode de révélation face au problème chimique posé.
A l'heure actuelle les CCM sont quasiment toutes réalisées sur le support gel de silice (une phase
stationnaire très polaire). Le support papier (phase stationnaire = cellulose avec sa couche d'eau liée =
phase polaire) est un support historique (mais on peut citer l'analyse œnologique des produits de la
fermentation malolactique toujours pratiquée sur papier buvard).
Les CCM demeurent aussi des techniques « micropréparatives » intéressantes (par exemple la
préparation d'extraits lipidiques) : on « gratte » les spots après migration pour récupérer les analytes qui
seront solubilisés dans un solvant adéquat puis on centrifuge pour éliminer le culot de gel de silice.
Le but du travail proposé est de rechercher une phase liquide adéquate pour une analyse CCM de gel
de silice destinée à la mise en évidence simple de la composition en acides aminés d'un produit
pharmaceutique: le SARGENOR. Ce médicament se présente sous forme d'ampoules buvables de 10
ml d'un mélange d'acide aspartique et d'arginine.
Manipulations à réaliser
Utiliser 2 plaques CCM qui seront préparées à l'identique avec 6 dépôts: 5 acides aminés témoins à
sélectionner et du Sargenor.
Les deux migrations seront réalisées en utilisant des phases mobiles différentes. L'une d'elles devra être
le mélange butanol/acide acétique/eau 70v/20v/10v. L'autre la mélange butanol/acide acétique/eau
Migration : plonger le bord inférieur de la plaque dans le solvant et laisser la migration s'effectuer jusqu'à
ce que le front du solvant soit à quelques mm du bord supérieur de la plaque.
En fin de migration, sortir la plaque, marquer immédiatement le front du solvant au crayon graphite.
Sécher la plaque au four. SOUS UNE HOTTE ASPIRANTE, pulvériser le réactif à la ninhydrine sur la
plaque en position légèrement inclinée, attendre 2 minutes et porter la plaque à l'étuve à 105°C pendant
3 à 4 minutes (il est aussi possible de passer le réactif de révélation au pinceau perpendiculairement à la
direction de migration).
Compte-Rendu :
Pour chaque manipulation réalisée :
- Composition exacte de la phase mobile utilisée ; plan des dépôts, mode opératoire exact de réalisation
des dépôts (en 1, 2, 3, 4 fois ...) ; résultats obtenus (entourer les spots révélés d'un léger trait de crayon
et fournir la plaque ou un calque du résultat. Calculer les Rf (rapport au front de migration) de chaque
tâche)
- Analyse critique. Peut on justifier a posteriori la migration différentielle des acides aminés témoins
testés lors de chaque manipulation (utiliser vos connaissances quant à la nature chimique des chaînes
latérales des acides aminés et éventuellement les données du document annexe)? Quelle phase mobile
est la plus performante? Peut on justifier les différences de migration obtenues par l'analyse de la
composition des 2 phases mobiles différente utilisées? Justification du choix des acides aminés témoins.
Que peut-on dire sur la composition en acides aminés du SARGENOR? Donner la réaction chimique de
révélation.
Document annexe :
Le document expose des résultats publiés par J. Kyte et R. Doolittle dans A simple method for displaying
thé hydropathic character of a protein ; Journal of molecular biology, mai 1982, 157 n°1, 105-132.
Les auteurs on établi une échelle d'hydropathie (hydrophilie ou hydrophobicité plus ou moins
marquée) des chaînes latérales R des aminoacides fondée sur la combinaison de 3 critères :
- un critère enthalpie libre. D'après des données pratiques et des calculs thermodynamiques, l'enthalpie
libre standard de transfert des différentes chaînes carbonées de formule RH depuis la phase solution
aqueuse vers la vapeur condensée est calculée (des valeurs négatives marquent l'hydrophobicité, des
valeurs positives l'hydrophilie) ;
- deux critères statistiques à partir d'une base de données de 12 structures conformationnelles
protéiques globulaires connues. Pour chacune des chaînes latérales des 20 acides aminés, il a été
calculé sa proportion dans la localisation à plus de 95% enfoui dans la structure ainsi que dans la
localisation à 100% enfoui. Plus une proportion est élevée plus l'acide aminé est statistiquement
hydrophobe.
[...
All values in the last 3 columns result from arbitrary normalisation to spread them between -4,5 and +4,5.
The normalization functions where :
a -0,679 ΔG°transfer en kcal/mol + 2,32.
b 48,1 (fraction 100% buried ; Chotia, 1976) – 4,50.
c 16,45 (fraction 95% buried ; Chotia, 1976) – 4,71