Chapitre II.

Techniques et instrumentations
Méthodes d’étude des biomolécules
Chromatographie

Plan du cours
1. Historique
2. Définition et principe
3. Classification
3. 1. Classification selon la disposition de la phase stationnaire
3. 1. 1. Colonne
3. 1. 2. Surface plane
a. Chromatographie sur papier
b. Chromatographie sur couche mince
3. 2. Classification selon la technique utilisée
3. 2. 1. Chromatographie d’adsorption
3. 2. 2. Chromatographie de partage
3. 2. 3. Chromatographie d’échange d’ions
3. 2. 4. Chromatographie d’exclusion
3. 2. 5. Chromatographie d’affinité
3. 3. Classification selon la nature de deux phases
3. 3. 1. Chromatographie en phase liquide
1
3. 3. 2. Chromatographie en phase gazeuse
 Définition et principe général

Phase mobile

Enregistreur

Echantillon Phase stationnaire Détecteur

Séparation et purification des composés Analyse des composés

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 Classification
Classification selon la technique utilisée

Classification selon la nature de Phase Phase

deux phases Phénomène Type
mobile stationnaire
Phase Phase
Type
mobile stationnaire Adsorption Liquide Solide SL

Liquide Liquide LL Adsorption Gaz Solide GS

Partage Liquide Liquide LL

Liquide Solide LS
Partage Gaz Liquide GS

Gaz Liquide GL Liquide Échangeur Echange

Échange ions
ionique d’ions ions

Gaz Solide GS Exclusion Liquide Gel LS

Affinité Liquide Ligand LS

3
4
 Chromatographie sur colonne

Colonne cylindrique

Colonne verticale

Séparation des colorants de paprika 5

Séparation d’un extrait d’épinard
 Chromatographie sur papier

Phénomène de capillarité
Le sirop de menthe

Les chlorophylles et les caroténoïdes sont solubles dans des

solvants organiques et peuvent donc être séparés à l'aide de
solvants ou de mélanges de solvants des lipides. Ces
molécules sont dites liposolubles.
Extraction

On dépose une goutte de pigments bruts sur une feuille de

papier. On place la feuille de papier dans un récipient
hermétique dans lequel on a placé un solvant approprié. Le
solvant monte dans la feuille par capillarité en entraînant les
pigments de manière différentielle selon leur affinité avec le
solvant. On peut distinguer ainsi deux catégories principales de
pigments: les chlorophylles (vertes) et les caroténoïdes (jaunes).
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Séparation des pigments photosynthétiques
 Chromatographie sur couche mince (CCM)

L’adsorption est un phénomène de surface, sous l’effet de la force d’entraînement de l’éluant, les molécules à
séparer migrent en glissant à la surface de la phase stationnaire et, à aucun moment, elles n’y pénètrent.
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 Chromatographie d’adsorption
Chromatographie liquide/solide ou gaz/solide
sur couche mince (CCM) ou sur colonne (CLC)

Ce qu’il faut retenir !

La chromatographie d’adsorption est basée sur la répartition des solutés entre
l’adsorbant (phase stationnaire solide) et l’éluant (phase mobile liquide).
Chaque soluté est soumis à une force de rétention par adsorption (ponts
hydrogènes ou interactions électrostatiques : liaison dipôle-ion, dipôle-dipôle ou
liaison de Van der Waals) et à une force d’entraînement par élution.
L’équilibre entre ces forces détermine la migration différentielle des solutés du
mélange et donc leur séparation.
8
 Groupe silanol (Si-OH)

Surface structure of silica gel, dry and hydrated

Le gel de silice est un adsorbant polaire

En surface, des groupes silanol (Si–OH) subsistent et sont responsables de la très

forte polarité du gel de silice. En présence d'eau, cette surface s’hydrate ce qui provoque
une diminution de la polarité.

La silice peut être rendue hydrophobe en greffant des groupes hydrophobes

sur les fonctions silanol présentes à la surface. Par exemple, la silice dite "C18"
est un gel de silice sur lequel on a greffé des groupes octadécyle (18 atomes de
carbone). Dans ce cas, on parle de chromatographie en phase inverse car les
produits les plus polaires sont élués en premier alors que les produits les plus
hydrophobes restent fixés plus longtemps sur la silice.
9
 Les grains de gel de silice
sont poreux et la taille des
grains et des pores dépend
très fortement de la méthode
de préparation utilisée.

Perles de gel de silice

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 Chromatographie de partage
Chromatographie liquide/liquide ou gaz/liquide

Molécules dans la phase mobile

Phase stationnaire liquide greffé

sur un support solide
Support solide

Les solutés se partagent entre la phase mobile et la phase stationnaire liquide. La

répartition des produits dans les deux phases se fait suivant un équilibre
thermodynamique pour lequel il existe un coefficient de partage:

K = [soluté dans la phase stationnaire]/[soluté dans la phase mobile]

La phase stationnaire doit avoir une polarité voisine de celle des solutés afin de
les solubiliser.

11
 Chromatographie échangeuse d’ions
Chromatographie liquide/solide
Groupements fonctionnels anioniques
Groupements fonctionnels cationiques

Résine cationique Résine anionique

Echangeuse de cations Echangeuse d’anions
1. Phase stationnaire échangeuse de cations : M se fixe, C
R-X la phase stationnaire
est élué avec B A un anion connu
C un cation connu
2. Phase stationnaire échangeuse d'anions : B se fixe, A est M et B les constituants du mélange.
élué avec M

Les échangeurs d'ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements
ionisables (X), qui ont la propriété d'échanger de façon réversible certains de leurs ions (A
ou C), au contact d'autres ions provenant d'une solution (B ou M). 12
 (assurant l’électoneutralité)

Exemple: Résine

Résine cationique : qui échange réversiblement des Résines anioniques : qui échange réversiblement
cation. Une résine cationique est chargée des anions. Une résine anionique est chargée
négativement. positivement.
Résine-G- / X+ + cation+ Résine-G- / cation+ + X+ Résine-G+/Y- + anion- <=> Résine-G+ /anion- + Y-

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Le système peut s'écrire : Br + As Ar + Bs (r = fixé sur la résine; s = en solution)

La constante de sélectivité est donnée par la relation :

si > 1 la résine a une affinité préférentielle pour le soluté A

si < 1 la résine a une affinité préférentielle pour le soluté B

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 Les résines sont classées d'après leurs aptitudes à l'ionisation

Résines anioniques Résines à groupements aminés quaternaires

fortes Résines à groupements aminés tertiaires

Résines anioniques Résines à groupements aminés secondaires et primaires

faibles
Résines cationiques Sulfoniques: Résines à groupement SO3- (très fortement ionisées quelque soit le pH)
fortes • Résine sous forme acide : Résine-SO3- / H+
(contre-ion : H+
• Résine sous forme sodique : Résine-SO3- / Na+
(contre-ion : Na+)

Résines cationiques Résines à groupements phosphore

intermédiaires • Résine-H2PO4- / H+
• Résine-H2PO4- / Na+
Résines cationiques Résines à groupement
faibles • Carboxyméthyl Résine-CH2-COO- / H+ Résine-CH2-COO- / Na+
• Carboxyliques Résine-COO- / H+ Résine-COO- / Na+
(non ionisées en milieu fortement acide)
Résines cationiques très phénoliques (uniquement ionisées en milieu alcalin)
faibles
Résine-O- / H+ Résine-O- / Na+

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 Application 1 : chromatographie échangeuse d’ions
Adoucissement d’eau

Eau dure (chargée d’ions entartrant Ca++ et Mg++)

Le tartre va obstruer les conduites d'eau chaude et
encrasser les chaudières

(Chromatographie cationique)
2 RNa + Ca++ R2Ca + 2 Na+

Adoucissement (eau chargée de Na++)

Adoucissement (échange Na+) dans une bille de résine

Cet échange de cations ne peut avoir lieu de façon efficace que parce que la résine échangeuse de
cations a une affinité plus grande pour les cations formant la dureté (Ca++ et Mg++) que pour le
sodium. En termes simples la résine préfère le calcium et le magnésium au sodium. Le résultat de
l'opération d'adoucissement n'est pas une élimination nette des ions “durs” de l'eau, mais
simplement leur remplacement par des ions sodium.

Cet échange n'est pas illimité : après un certain temps, la résine a enlevé tant d'ions calcium et
magnésium de l'eau qu'il n'y a plus de place pour en accueillir d'autres. La phase dite
d'épuisement (ou de saturation) est alors terminée, et il faut remplacer la résine par une charge
neuve, ou la régénérer (par une solution de NaCl de concentration très élevée 10%)
16
 Application 2 : chromatographie échangeuse d’ions
Déminéralisation

Résine échangeuse de cations

2 R'H + Ca++ R2Ca + 2 H+
R'H + Na+ R'Na + H+

Résine échangeuse d’anions

R’’OH + Cl– R’’Cl + OH–
2 R’’OH + SO4= R’’2SO4 + 2 OH–
Décationisation
(tous les cations sont remplacés par H+)
La déminéralisation en une
seule image !

- Disparition complète des contaminants ionisés

(fixation de Na, Ca et Mg sur l'échangeur de cations
et Cl, SO4 et HCO3 sur l'échangeur d'anions)

- Les résines sont entièrement saturées

L’eau a été complètement

Les billes de résine sont saturées. déminéralisée
Des ions H+ et OH– ont été relâchés dans l'eau

La régénération de la résine anionique s’effectue par des acides forts: l'acide chlorhydrique (HCl) ou l'acide sulfurique (H2SO4)
La régénération de la résine cationique s’effectue par des bases fortes: la soude caustique NaOH 17
 Exemples d’applications industrielles de la
chromatographie échangeuse d’ions

Modification de la composition: Décalcification

élimination d’ions gênants, Décarbonatation d’eaux de boissons
correction de pH sans ajout de Elimination de composés amers de jus de fruits
sels Désacidification de jus d’agrumes
Acidification du lait en caséinerie
Purification de solution Déminéralisation du lactosérum
Décoloration de sirop en raffinerie
Récupération de solutés Extractions de protéines du lactosérum
Extraction de colorants tel que les anthocyanes de vins
rouges
Extraction d’antibiotiques (streptomycine)
Séparation de soluté Séparation d’acides aminés ou d’acides organiques
(lactique, citrique) de milieu de fermentation
Séparation de sucres

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 Chromatographie d’exclusion
1 2 3

1 : Dépôt d'un mélange de deux molécules (des grosses et des petites) sur une colonne remplie d'un gel de
Sephadex.
2 : Les petites molécules peuvent pénétrer dans les billes de Sephadex car leur diamètre est inférieur à celui des
pores du gel. Les grosses molécules ne le peuvent pas en raison de leur grande taille; elles sont donc exclues du gel
(d'où le nom de chromatographie d'exclusion).
3 : Les grosses molécules ont donc un trajet plus court à parcourir pour arriver en bas de la colonne; elles sont donc
éluées les premières.
4 : Les petites molécules sont éluées ensuite car elles ont une plus grande distance à parcourir pour arriver en bas de
la colonne. 19
1 : Les molécules de masse molaire faible sortent toutes à Vt

2 : Les molécules de masse molaire intermédiaire sortent à des Ve intermédiaires

et sont effectivement séparées

3 : Les molécules de masse molaire élevée sortent toutes à Vo

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 Exemples d’applications de la
Chromatographie d’exclusion
Cette technique est très utilisée pour la séparation ou l'élimination de sels ou de petites molécules
dans les solutions protéiques :
* Dessalage (élimination des sel de l’eau de mer)
* Echange de tampons
Cette technique est également appliquée au:
* Fractionnement de mélange de macromolécules
* Détermination (approximative) de la masse molaire des protéines.
Dans ce dernier cas, il faut d'abord étalonner la colonne avec des protéines de masse molaire connue,
tracer la courbe Ve = f(logM), puis effectuer une détermination graphique.

Détermination de masses moléculaires en chromatographie par

filtration sur gel. Le graphique montre le volume d’élution relatif
en fonction du logarithme de la masse moléculaire de plusieurs
protéines sur une colonne de dextran réticulé (Sephadex G-200)
à pH 7,5.

21
 Chromatographie d’affinité

Matrice en résine
Macromolécules liée spécifiquement
au ligand ancré à la matrice
Ligand ancré à la matrice

Macromolécules possédant d’autres

sites de liaison au ligand

Chromatographie d’affinité. Un ligand (en jaune) est ancré par

des liaisons covalentes à une matrice poreuse. Le mélange à
purifier est chargé sur la colonne.

Cette technique est utilisée pour la séparation des enzymes, des

protéines de transport, des anticorps, des récepteurs hormonaux
etc.
22
Chromatographie Liquide à Haute performance
HPLC

23
Le pic de gauche correspond au soluté qui n'est pas retenu par la phase stationnaire et qui at
teint le détecteur à la même vitesse que celle de l'éluant. Son temps de rétention tM est
le temps nécessaire pour qu'une molécule de la phase mobile traverse la colonne.
*tM=temps mort = t0 = temps nécessaire pour que le pic d'un constituant non retenu par
la PS apparaisse (retention time of an unretained peak or solvent front)
*tR = temps de rétention d'un constituant retenu par la PS (retained peak)
= temps écoulé entre l'injection et le moment où le constituant sort de la colonne.
*T’R= tR- tM= temps de rétention réduit ou corrigé (adjusted retention time)
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*v = L / tR = vitesse moyenne de déplacement du soluté (L=longueur de la colonne)
*u = L / tM = vitesse moyenne des molécules de la phase mobile (cm.s-1)
*v = u.f (fraction de temps passé par le soluté dans la phase mobile)
*VM= V0= volume de la PM dans la col. = vol. interstitiel accessible (=vol. mort).
Il est mesuré par introduction d'un soluté non retenu par la PS.
VM = tM . D D est le débit de la phase mobile (flow rate)
c'est un volume par unité de temps: cm3.s-1ou mL.s-1

u = D / S (S= section de la colonne) ( cm3.s-1/cm2).

*VS = volume de la PS = V (colonne vide) - VM
*VR= volume d'élution ou de rétention du soluté = volume de la PM nécessaire

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Effet de la modification de la composition du solvant sur la séparation des solutés
26
Pouvoir d’élution de la phase mobile en HPLC

27
Chromatographie en phase Gazeuse/Spectroscopie de Masse
(GC/MS)

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29