UDP-glucuronosyltransférases (UGTs)

Ouzzine Mohamed
DR INSERM
 PLAN

LES UDP-GLUCURONOSYLTRANSFERASES

1. Propriétés générales

1.1. Réaction catalysée et mécanisme réactionnel

1.2. La famille multigénique des UDP-glucuronosyltransférases

1.3. Organisation génomique et régulation

1.4. Rôle fonctionnel

1. 5. Déficiences génétiques / Polymorphismes

1.6. Adressage et topologie membranaire

2. Etude-Structure-fonction
 Biotransformation des xénobiotiques
Substances naturellement présentes dans l’environnement ou synthétisées
(xénobiotiques, dont les médicaments, polluants, additifs alimentaires, toxiques)
généralement hydrophobes.

Metabolized principally in
Absorption (voies orale, nasale, percutanée…) distribution, distribution dans Lung, Liver, kidney, Intestine
différents compartiments et organes de l’organisme

L’organisme a développé de multiples systèmes enzymatiques chargés de

les transformer et souvent de les neutraliser afin de limiter l’accumulation de
ces molecules dans l’organisme

Ces mêmes enzymes sont également impliquées dans le métabolisme

de substances endogènes et participent aux grandes fonctions biologiques.

La nature et l’intensité de la biotransformation d’un xénobiotique varient d’une espèce

à l’autre, ce qui explique les différences de toxicité constatées entre espèces.
 Principal biotransformation pathway of xenobiotics and endogenous molecules
Réactions de biotransformation : deux phases
Réaction séquentiel conversion molécule-mère en métabolites hydrophiles
Phase I: Reactions include oxidative, reductive
Natural substances Xenobiotics and hydrolytic reactions, the polar group is
Hormones Drugs
either introduced or unmasked
Bilirubin Pollutants
Polyphenols Toxic substances
R

Absorption
Monooxygenases
Phase I Oxydation (P450…)

R OH

Transferases
Phase II Conjugaison (UGT,ST,GST…)
R’=
Glucuronic acid
SO 3H
R O R’ Glutathion
Phase II: reactions involve covalent
Transport attachment of small polar endogenous molecule
Phase III
Transporters like glucuronic acid, sulphate, glycine etc. to
Export form highly water soluble substances
Excretion : bile, urine
Phase III: Transport step
 Propriétés des enzymes du métabolisme des xénobiotiques

- Familles multigéniques d’enzymes avec l’expression de nombreuses isoformes

- Contribuent généralement à l’augmentation de l’hydrophilie du xénobiotique

- Responsables de réaction de détoxication

- Impliquées dans le métabolisme de substances endogènes (hormones, ligands, sérotonine,

bilirubine)

- Niveau d’expression est augmenté (induction) ou diminué (répression) par des médicaments ou des
facteurs environnementaux (tabac, poluants).

- Expression varie au cours du développement (UGT1A1)

- Présentent généralement un polymorphisme génétique (métaboliseur lent/rapide, AINS, Irinotecan)

 Principal biotransformation pathway of xenobiotics and endogenous molecules

Phase II: reactions involve covalent attachment of small polar endogenous molecule like glucuronic acid,
sulphate, glycine etc. to form highly water soluble substances

La sulfoconjugaison est catalysée par les sulfotransférases (ST).

- Le substrat donneur est le PAPS (3’-phospho-adénosine-5’-phospho-sulfate).
- Aglycones : phénols, alcools aliphatiques et amines aromatiques

Paracétamol

L’acétylation est catalysée par les N-acétyltransférases.

- Le substrat donneur est l’acétyl coenzyme A.
- Aglycones : amines aromatiques primaires, des hydrazines, des sulfonamides et certaines amines aliphatiques primaires
 Principal biotransformation pathway of xenobiotics and endogenous molecules

La conjugaison au glutathion est catalysée par les glutathion S-transférases (GST) en présence de glutathion comme
cofacteur. Les conjugués subissent ultérieurement une coupure enzymatique et une acétylation pour former des dérivés
N-acétylcystéine (acides mercapturiques), facilement excrétés dans l’urine

R-

La glucuronoconjugaison est catalysée par les UDP-glucuronyltransférase (UGTs), en

présence de l’acide uridine-5’-diphospho-α-D-glucuronique (UDP-GlcA) comme substrat
donneur
 Pharmacological, toxicological and physiological importance of UGTs
Glucuronoconjugaison est quantitativement la plus importante des réaction de phase II
voie de détoxication puissante développée par l’homme et les autres espèces animales afin de
neutraliser et d’éliminer de l’organisme les composés toxiques

Pollutants, Pesticides,
Food additive
Glycosphingolipids Glycosaminoglycans
Neutralization, elimination

Odorant substances
Biosynthesis
Enzymes membranaire du RE (borneol, eugenol…)
Signal termination
Endobiotics Xenobiotics

Metabolism Hormons Drugs

(NSAIDs, hypolipidaemics, antivirotics)
Bilirubin Nuclear receptor ligands Toxic effects (adducts)

(retinoic acid, hormones …) Increase of the pharmacological properties

(morphine)
Mantient de l’homéostasie
Neutralization of pharmacological effect
(AZT)
 Glucuronidation (phase II reaction)

4
COOH O
H
UGT 4
COOH O
HO 1
a
+ O HO 1 O
+ UDP
HO HO b
HO
O UDP HO

Phénol b-D-glucuronide
Acide UDP-a- D-glucuronique
“Sucre nucléotidique” hydrosoluble

Substrat donneur Substrat accepteur

UDP = Uridine-diphosphate

Réaction de type SN2 par attaque du groupement nucléophile de l ’aglycone sur le C1 de l’acide glucuronique

Acceptor substrate : aglycone, xenobiotics (drugs), endogenous substances;

Formation of O-glucuronides, N-glucuronides, C-glucuronides and S-glucuronides
LES SUBSTRATS ACCEPTEURS

Glucuronides stables

Anxiolytique

Glucuronides instables
AINS formation d’adduits
The mammalian UGT gene superfamily

ØCurrently has 117 members

ØDivided into four families, UGT1, UGT2,

UGT3 and UGT8

Ø>20 functional UGTs in human, divided

into 3 subfamilies (UGT1A, UGT2A and
UGT2B)

ØAll about 530 amino acids long

ØA rather variable N-terminal domain

(aglycone)

ØA more conserved C-terminal domain

(UDP-GlcA)

UGT1A
 MODELE D’EVOLUTION DES GENES D’UDP-GLUCURONOSYLTRANSFERASES ET
DE CERAMIDE-GALACTOSYLTRANSFERASES

Clonage de différents ADNc : Famille multigénique plusieurs membres

Evolution par duplication Gène ancestral des glycosyltransférases

Glycosyltransferase
conversion d’un gène
ancestral

Chromosome 4
1A13

Chromosome 2
 UGT1A family

Exon 1 Exons
1A12P 1A11P 1A8 1A10 1A13P 1A9 1A7 1A6 1A5 1A4 1A3 1A2P 1A1 2 34 5

5’ 3’

Primary Transcripts UGT1A1

UGT1A6

UGT1A1
Isozymes
UGT1A6

ØThe human UGT1 gene on chromosome 2q37

ØSpans approximately 200 kb
ØContains 13 individual promoters/first exons and a shared set of exons 2–5
ØUGT 1A : phenols, quinones, bilirubine
ØPolymorphism of UGT1A : 1A1, 1A6, 1A7 and 1A9
 UGT2 family

2B29P 2B17 2B15 2B10 2A3 2B27P 2B26P 2B7 2B11 2B28 2B25P 2B24P 2B4 2A1/2

5’ 3’

2B4 2 3 4 5 6

ØThe human UGT2 gene on chromosome 4q13 or 4q28

ØSpans approximately 200 kb
ØComprise six exons that are not shared between the UGT2 family members
ØUGT 2B : steroïdes, carboxylic acids, bile acids, morphine and NSAID
ØPolymorphism of UGT2B : 2B4, 2B7 and 2B15
 ORGANISATION DES UGT : DOMAINES FONCTIONNELS

Modèle linéaire de l’organisation des UGTs et des éléments topogéniques

Domaine N-terminal Domaine C-terminal

(variable) (conservé)

Site de fixation de 246 Site de fixation de l'acide

l'aglycone UDP-glucuronique
26 489 505 531
NH2 COOH
293 345
Peptide-
signal Domaine
Domaine d’interaction Queue cytosolique
Sites de transmembranaire
membranaire glycosylation contenant le signal
de rétention KXXKX
 TARGETING AND RETENTION OF UGT IN THE MEMBRANE OF THE ER

Signal peptide

SRP (signal recognition particle)

Cytosol SRPR + + COOH

ER mb Sec 61p Transmembrane domain

Lumen NH
2
oligosaccharyl
transferases
Glycosylation sites NH
2

Human UGT1A6, a type I protein of the ER membrane, is composed of, at least, two topogenic domains : an

amino-terminal cleavable signal peptide and a carboxy-terminal membrane-anchoring domain

 Membrane Organization of UGT

CYTOPLASM

UDP-GlcA R-XH COO- Lys glucuronide

NH3+
+ + + Lys
+

Peptide-signal
ER

Domain
C-terminal glucuronide
Domain NH3
+
conserved
N-terminal
UDP-GlcA
variable Glycosylation
Sites
LUMEN
 IDENTIFICATION OF AN INTERNAL SIGNAL PEPTIDE-LIKE SEQUENCE
IN HUMAN UGT1A6 Proposed model for the membrane
SP TMD
topology of human UGT1A6 protein
UGT1A6
Membrane
CT

!
R
+
141 ++ COOH
UGT1A6D140/TMD/CT Membrane

!
240
UGT1A6D240/TMD/CT Cytosol

O H
! NH
2
141 240
UGT1A6D140-240/GFP

Membrane interaction conferred by the 140-240

region may provide a hydrophobic path from
Calnexin (ER marker) UGT140-240-GFP GFP
the membrane interior to the catalytic site
The 140-240 domain of UGT1A6 protein is able to target
and retain the cytosolic EGFP protein in the ER Ouzzine et al. J. Biol. Chem. 1999, 274 31401-31409
Hypothetical topology model
for human UGT, with the active
site localised on the luminal of
the ER
UDPGlcUA transporter
facilitates the transfer of
cofactor across the membrane.
 Selected endobiotic and drug substrates of human hepatic UDP-
glucuronosyltransferases (UGT1A)

Enzyme Endobiotic-substrates Drug-substrates Tissue distribution

1A1 Bilirubin*, estradiol (3-OH) Irinotecan/SN38 Liver
Eicosanoids Paracetamol, AINS Intestine
Thyroxin (hormone thyroïdiènne)

1A3 Estrogens, Bile acids (24-OH) Cyproheptadine Liver

Eicosanoids

1A4 Estrogens Nicotine, trifluoperazine* Liver

Eicosanoids Imipramine, lamotrigine Intestine
Anti-psychotiques

1A5 Unknown

1A6 Serotonin* Paracetamol Liver

Planar Phenols Gastrointestinal tract
Brain
Lung

1A7 ? Hydroxy-benzo(a)pyrene Gastrointestinal tract

1A8 Estrone Flavonoid Gastrointestinal tract

2-estrone composés phénoliques
2-hydroxyestradiol
diydrotestosterone

1A9 Estrogens Propofol*, mycophenolate,

Eicosanoids paracetamol, Flavonoids
Selected endobiotic and drug substrates of human hepatic UDP-
glucuronosyltransferases (UGT2B)

Enzyme Endobiotic-substrates Drug-substrates Tissue distribution

2B4 Bile acids (6-OH) Codeine Liver

Androstane-3,17-diol Fibrates
Arachidonic acid

2B7 Bile acids (3-OH), estradiol (17-OH) Morphin (6-OH)* Liver,

Progesterone Mycophenolate Intestine
Mineralocorticoids, glucocorticoids zidovudine* (AZT) Kidney
Eicosanoids
Retinoids

2B10 Eicosanoids Nicotine

2B11 ?? Liver, Kidney, prostate

2B15 Testosterone (17-OH) S-Oxazepam* (anxiolytique) Liver, Kidney, Prostate,

Breast, Skin
Paracetamol
2B17 Dihydrotestosterone (17-OH) eugénol prostate
Testosterone
EXPRESSION OF UGTs IN GASTROINTESTINAL TRACT
GLUCURONIDATION GRADIENT DURING THE INTESTINAL PASSAGE

The lowest glucuronidation

activities are found in the
esophagus and stomach as well
as in distal colon

Extrahepatic glucuronidation in
small intestine can function to
complement hepatic
glucuronidation

Tukey RH and Strassburg CP ( 2001) Mol Pharmacol 59:405-414

 Selected xeno- and endobiotic inducers of transcription
factors/xenosensors and UGTs as target genes

Transcription factor Xeno- and endobiotic ligands UGTs as target

genes /xenosensor /inducers

AhR (bHLH-PAS) Benzo[a]pyrene UGT1 members

TCDD
Nrf2 (LZ) β-Naphthoflavone UGT1 and 2 members
Quercetin
Eicosanoids*
Bilirubin*
Sulforaphane
β-Naphthoflavone

PXR/CAR Phenobarbital UGT1A1

Phenytoin
Carbamazepin
Rifampicin
Bile acids*
FXR, Bile acids* UGT1A3

LXR Bile acids* UGT1A3

PPARα Fibrates UGT1A1, UGT1A9
Eicosanoids* UGT2B4

Ah = Arylhydrocarbon; CAR = Constitutive androstane recepteur; hPXR human pregnane X receptor; bHLH-PAS
(basic Helix-Loop-helix/Per-ARnt-Sim)
From Bock et al 2010
 Déficiences et polymorphismes génètiques
Déficience génétique de la glucuronoconjugaison de la bilirubine
Métabolisme de la bilirubine (UGT1A1)

Hémoglobine
Globules rouges

Production de globules rouges

Cellules souches de la moelle

UGT1A1

X Déficience de
glucuronoconjugaison
 Déficience génétique de la glucuronoconjugaison de la bilirubine

Syndrome de Gilbert : Hyperbilirubinémie familiale modérée, > 5 % de la population, prévalence > sexe masculin.
Asymptomatique ≠ polymorphisme

Bilirubine non conjuguée : 20 à 50 µMol/l

Anomalie moléculaire insertion TA au niveau de la tatabox

• Extension de la TATA box au niveau du

promoteur de l’UGT1A1
• Diminution de l’activité transcriptionnelle
• Diminution de l’expression de l’enzyme UGT1A1
Mécanismes moléculaires des déficiences génétiques de la glucuronoconjugaison de la bilirubine (UGT1A1)

• Maladie de Crigler-Najjar de type I

Forme familiale d’hyperbilirubinémie non conjuguée sévère : Retard mental et décès des enfants atteints

- Mutations ponctuelles au niveau du locus 1 (+ de 20 lésions génétiques répertoriées)

Mutation au niveau de l’ exon 2 3 4 5: affecte toutes les formes du locus

Exon 1 : n’affecte q’une seule isoforme l’UGT1A1

Délétion de l’exon 2, protéine tronquée (rat Gunn)

• Maladie de Crigler-Najjar de type II

Forme familiale d’hyperbilirubinémie non conjuguée moins sévère

- Mutations identiques mais forme hétérozygote

- Mutations touchant des acides aminés moins essentiels pour la fonction

 Influence du polymorphisme sur la toxicité des
médicaments à index thérapeutique étroit

Carbone esterase
decarboxylation

SN-38 is 1000 x more active than Irinotecan

Inhibition de la topoisomérase I
carboxylesterases
La clairance rénale d'élimination est
diminuée de 40 % chez les patients avec une
bilirubinémie comprise entre 1,5 et 3 fois la
limite supérieure de la normale.

Mutation UGT1A1 Sensibilité plus importante aux effets toxiques du SN-38

 POLYMORPHISME DES UGT ET SUSCEPTIBILITE AU CANCER COLORECTAL

UGT1A7*1/*2/*3 N129K/R131K W208R

UGT2B7*1/*2 H268Y
Risque Cancer colorectal accru ?

UGT2B transcripts (UGT2B7, 10, 11, 15, 17) are abundantly expressed in steroid-sensitive target tissues such as prostate
and mammary gland
Tukey RH and Strassburg CP ( 2001) Mol Pharmacol 59:405-414
Rôle des UGTs dans la régulation de l’activité biologique des hormones stéroïdiennes et polymorphisme

Glucuronoconjugaison de la DHT / 2B15 = régulation

activation du récepteur Androstérone AR

Androgen metabolism and inactivation by UDP-glucuronosyltransferases in the human prostate. Testosterone is secreted by the testes,
whereas the adrenals produce DHEAS, DHEA, 5-DIOLS, 5-DIOL and 4-DIONE..
Accumulation de DHT au niveau des organes périphériques cibles (prostate) pourrait être un facteur prédisposant au cancer de la prostate
hormonodépendant
 BIOACTIVATION MECHANISM AND CONSEQUENCES

P450s, UGTs

ELECTROPHILES
XENOBIOTICS METABOLITES Dieldrin is a highly persistent
Tienilic acid organochlorine insecticide that
Diclofenac was widely used on a variety of
crops for several decades until
Ketoprofen 1970, and for termite control until
1987
ADDUCT FORMATION

PLASMA PROTEINS CELLULAR PROTEINS

Albumin
IMMUNOTOXICITY
Defined as adverse effects on the functioning of both local and
systemic immune systems that result from exposure to toxic
substances. Either Immunosuppression or Immunostimulation
P450, COX, UGT
CRABP
RAR, RXR,...
Immunostimulation can cause autoimmune
diseases, in which healthy tissue is attacked by an
immune system. The pesticide dieldrin induces an
AUTOIMMUNE DISEASES autoimmune response against red blood cells,
resulting in hemolytic anemia.
HEPATOTOXICITY
Antibody for dieldrin-coated red blood cells .
STRUCTURE CHIMIQUE DES XENOBIOTIQUES A L’ORIGINE DE LA FORMATION
D’ACYLGLUCURONIDES

CH3
O
R-CH-C
* OGlcUA
acylglucuronide
 MECANISMES DE REACTIVITE DES ACYLGLUCURONIDES

Acylglucuronides = esters réactifs ( caractère électrophile du groupement carbonyle)

FORMATION DE LIAISONS COVALENTES AUX PROTEINES OU D’ADDUITS

Attaque Nucléophile Acylmigration et formation d’une Base de Schiff

COOH COOH
COOH
HO O HO O
O
HO O
O
HO O-C - R HO OH
HO O-C - R Lys, Tyr, Cys HO
XH X = NH, O, S O
HO
C O

R
P isomérisation (a /b )
COOH COOH
R HO OH
HO OH
C O O
HO HO
X CH
CH
+ acide glucuronique O O
NH 2
P C O
N C O
Lys
R R
P P

R = aglycone
 Formation of d’autoantibodies

LKM : anti–liver-kidney microsomal antibody Rein

Detection of autoantibodies (LKM-3 aABs) by immunohistofluorescence on
liver and kidney cryostat sections (distal renal tubules / hepatocytes)

Foie
Hépatites médicamenteuses
d’origine auto-immune
STRATEGIES D’ETUDES DES UDP-GLUCURONOSYLTRANSERASES

Etudes Structure-Fonction

Que font les UGTs et comment ?

- Enzymes membranaires localisées dans le RE phospholopidodependentes

- Plusieurs isoformes avec des spécificités de substrats larges et chevauchantes
- Difficile à purifier
 Structure/fonction des UGTs

Stratégies en absence de la structure 3D

- Techniques de génie génétique et protéique (clonage, expression hétérologue, production, purification,

mutagénèse dirigée)

- Analyse cinétique des enzymes sauvages et des mutants

- Modification chimique des acides aminés

- Synthèse chimique de substrats, de sondes photoactivables et d’inhibiteurs

- Utilisation de l’outil bioinformatique (alignements de séquences, phylogénie)

- Chimie théorique (relations structure-activité)

- Modélisation moléculaire (modélisation par homologie)

 STRATEGIES D’ETUDES DES UDP-GLUCURONOSYLTRANSERASES

Systèmes d’expression hétérologue

Ø Organismes unicellulaires
• cellules bactériennes (GST-GlcAT-I / GST-ß4GalT7)

• cellules eucaryotes (levures Pichia pastoris)

Ø Organismes pluricellulaires
• cellules animales ou humaines
• cellules de plantes
• cellules d’insectes
• animaux transgéniques
CLONAGE ET EXPRESSION FONCTIONNELLE DANS LES CELLULES DE MAMMIFERES (V79, CHO, HEK)
Analyse immunohistochimique de l'UGT1A6

ADNc UGT
Transfection
Analyse in vitro de la spécificité de
contrôles recombinantes
substrat de l'UGT2B1

pCDNA/néo Cellules
en culture
Ibuprofène
Kétoprofène
Production de glucuronides in situ
Naproxène
Pirprofène
80 Acide clofibrique
Cellules transfectées Diflunisal
60
Aspirine
40 Acide salicylique
Blanc
20 Cellules contrôles
Les homogénats cellulaires sont incubés en présence
0 de substrat et d'acide UDP-glucuronique radiomarqué.
0 20 40 60 80 100 Séparation par CCM et autoradiographie.
Temps d'incubation (min)
DETERMINATION DE LA SPECIFICITE DE SUBSTRAT DES UGT RECOMBINANTES

Substrate specificity of recombinant enzymes expressed in V79 cells

UGT isoform (As nmol/min/mgP)
Substrate 1A6 1A1 1A9 1-Naphthol

1-Naphthol 3.2 0.3 0.2 HO

Vanilin 2.4 - 0.9
Eugenol 1.1 - 1.2
4-ethylphenol 1.3 - 1.9
4-tert-butylphenol 0.2 - 3.1 4-methylphenol
5-n-Octylgallate 0.1 - 5.3
Emodin 0.0 - 1.9 HO
Quercetin 0.0 - 1.8
Propofol ND ND 1.2
4-ethylphenol
Labetol - - 0.06
Propanolol - - 0.04
Diflunisal - - 0.05 HO
Ethinylestradiol ND 0.35 0.14
4-hydroxyestrone - - 0.45
Ibuprofen - - 0.08 4-tert-butylphenol
MethylethylhexylphtalateND ND 0.17
Retinoic acid - - 0.05 HO
Phenophtalein - - 0.47
Bilirubin ND 0.40 ND
Triphenylheptanoic acid ND 0.06 ND Abbreviations -, not assayed; ND, not detected
 SONDES DE PHOTOAFFINITE

HO O
N O O O
3
3N
O H
N
OH O
HO O P32
O N
O O
HO O P O
fluorescence O
O
λEx = 380nm
λEm= 442nm OH
7-azido-4- (b-32P)5N3UDP-glucuronic acid OH
methylcoumarin

UV
UGT UGT
photoaffinity label

purification, digestion , peptide

mapping, sequencing
labeled protein
UTILISATION D’AGENTS DE MODIFICATION CHIMIQUE
 Identification of AA critical for substrate specificity and catalysis of human UGT1A6

Importance in Toxicology and Pharmacology of UGT1A6

Role as a protective metabolic barrier against the intrusion of xenobiotics (liver, lungs, brain, stomach,
small intestine, colon, kidney, bladder…)

UGT1A6 induced by polycyclic aromatic hydrocarbons (Bap) and TCDD

 Strategy developed to investigate the active site of UGT1A6

UGT cDNA cloning Sequence Alignements

Photoaffinity labelling
([β-32P]5N3UDP-GlcUA)
O Transfection
O O
N3
Site-directed mutagenesis
O NH Ú Histidine
OH O O Ú Aspartic/glutamic acid
O P32 P O
N O Host cell
O O
OH
OH O
O
HO OH Expression Substrate specificity
R
N3 O O
Human UGT1A6
HO

(7-azido-4-methyl-coumarin)
Determination of kinetics
Competitive inhibitors constants: Km,Vmax
(7,7,7-triphenylheptyl-UDP)
Chemical modification
Diethylpyrocarbonate
O O Carbodiimides Enzyme titration :
(CH2)n Uracile
Maleimides To evaluate pKa of
O P O P O O
Butanedione catalytic amino acid
O O
HO OH
 Chemical Modification of UGT1A6

u Histidyl-directed reagent

Diethylpyrocarbonate (DEPC) Histidine

R R
(C2H5OCO)2O O
N NH N N-C-OC2H5 + CO2 + C2H5OH

Battaglia, et al (ABB, 1994)

u Carboxyl-directed reagent

Dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) Aspartic/glutamic acid

R

R N C N C
O O
C
HO O N C N
H

Battaglia, et al (FEBS Lett.1994)

POSTULATED ACID-BASE CATALYTIC MECHANISM FOR THE GLUCURONIDATION OF
PHENOLS BY UGT1A6

(His/Asp/Glu) B:

R
H O
Acceptor
O O
O P UMP
Donor:
UDP-GlcA O
Mg++ NH
H N

His370

ØA acid-base mechanism has been proposed for the glucuronidation reaction catalyzed by human UGT1A6

Ouzzine et al, (Mol Pharm, 2000)

Radominska-Pandya et al, (Methods Enzymol, 2005)
Strategy of production of UGTs and mutants in the methylotrophic yeast P.pastoris

Interest UGT cDNA Integration into the chromosome of yeast

UGT
recombinant
Linearization Yeast
P. Pastoris
pPICZB
Transformation
pPICZB
3,3 kb
Culture in the presence Production
of Glycerol 1% (V / V) of biomass
as Carbon source

Induction
Methanol 2% (V/V)
◆Determination of protein 36 h 30℃
concentration
◆Immunoblot Analysis
Yeast culture
◆Enzyme activity Production of recombinant protein
◆Determination of kinetic
parameters Centrifugation
à 4000 t/mn
UltraCentrifugation Centrifugation Breakdown
Microsomes Pellet
1h, 100000g 20 min, 10000g Glass beads