Phosphoranylation de polyols :Voie d'acces aux phosphates

d'interet biologique. I. Cas du myo-inositol

BRIGITTE
DUTHU,DOURAID
HOUALLA'
ET ROBERT
WOLF
Universite' Paul Sabatier de Toulouse, Unite' associe'e au Centre national de la recherche scientifique no 454,
118 route de Narbonne, 31062 Toulouse CEDEX, France
Requ le 26 janvier 1988

BRIGITTE DUTHU, DOURAID HOUALLA et ROBERT WOLF.Can. J. Chem. 66, 2965 (1988).
Nous dicrivons une rnCthode originale de phosphorylation du rnyo-inositol non protCgC, qui fournit plusieurs myo-inositol
phosphates A la fois. Le schema reactionnel cornporte une phosphoranylation totale ou partielle du cyclitol, I'aide de
l'arninobicyclophosphane 8, suivie d'une oxydation des bicyclophosphoranes liaison P-H obtenus et d'une hydrolyse acide
des phosphates neutres qui en rCsultent. Dans le cas de la tris-phosphoranylationnous avons identifie, parmi les fractions sCparCes
par HPLC, le myo-inositol-l,2(cycl) phosphate 22, le myo-inositol-1 phosphate 23 et le myo-inositol-2 phosphate 24.

BRIGITTE DUTHU, DOURAID HOUALLA, and ROBERT WOLF.Can. J. Chem. 66, 2965 (1988).
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23

An original method for the phosphorylation of an unprotected myo-inositol is described, which yields several rnyo-inositol
phosphates at the same time. The reaction proceeds via a partial or complete phosphoranylation of the cyclitol by means of the
aminobicyclophosphane8, followed by oxidation of the resulting bicyclophosphoranesbearing a P-H bond and acid hydrolysis
of the neutral phosphates thus formed. In the case of the tris-phosphoranylation we identified, among the HPLC fractions, the
myo-inositol-l,2-(cyc1)phosphate22, the myo-inositol- 1-phosphate23, and the myo-inositol-2-phosphate 24.

Introduction
Des polynucltotides aux phospholipides, les constituants et
mttabolites du systeme biologique que l'on peut considtrer OH
I
comme des phosphates de polyols se comptent par centaines, ce
qui explique l'inttrgt que les chimistes et biochimistes portent 1 2
au problkme de la phosphorylation des polyols.
Schtmatiquement la phosphorylation d'un alcool a t t t
rtaliste jusqu'h prtsent essentiellement par deux voies :
1. Voie de Khorana et coll. (1) : Action d'un dtrivt du
phosphore tttracoordonnt posstdant dtjh le groupement phos-
phoryle P----O :

X Ctant un groupement nucliofuge: C1, OR, -OH, (R0)2P(0)

I Le D-myo-inositol- l,4,5 tris-phosphate, ainsi qu'un certain
2. Voie de Caruthers (2) : Action d'un dtrivt du phosphore
tricoordonnt, suivie d'une oxydation :
0 tant l'accks h des dtrivts marquts ou modifits, revet par const-
\ /
R-OH + -P --+ HX + RO-P
/ \
Les phosphates biologiquement inttressants sont des mono-
esters ou diesters auxquels on acckde par hydrolyse des phos-
phates neutres obtenus par ces deux proctdts.
Appliqutes aux polyols, chacune de ces deux mtthodes a ses
avantages et inconvtnients.
Le myo-inositol 1 voit son inttrgt renouvelt depuis la mise en
Cvidence du r61e du D-myo-inositol-1 ,4,5 tris-phosphate 2 et
d'autres myo-inositol phosphates, comme les dtrivts 3 et 4,
dans le mCcanisme de rtgulation du calcium intracellulaire
(3-5).
1. Auteur A qui adresser toute correspondance.
Pnnled In Canada 1 lmpnrni au Canada
nombre de myo-inositol phosphates, sont extraits du cerveau de
bovins par voie enzymatique (6). Quelques-uns sont disponi-
bles, depuis peu, dans le commerce h des prix forts tlevts (7).
La synthkse chimique de tels composts en fournissant des quan-
titts relativement importantes de produits et surtout en permet-
quent une importance considtrable. Une dizaine de syntheses
ont t t t dCcrites rtcemment. Elles ntcessitent toutes l'obtention
prkalable du myo-inositol prottgC, optiquement actif ou non, la
phosphorylation ttant faite soit par la mtthode de Khorana
(8- 12) soit par celle de Caruthers ( 13- 17).
Nous dtcrivons une mtthode originale et gtntrale de phos-
phorylation des polyols, appliqute h l'obtention d e difftrents
phosphates de myo-inositol. Elle s'appuie sur l'aptitude excep-
tionnelle des bicyclophosphanes 52 h additionner les alcools
pour donner des alcoxybicyclophosphoranes h liaison P-H
stables 6 (18) :
2. La nomenclature de ces composCs est la suivante : 5, 2,8-dioxa
5-aza l-phospha"l bicyclo[3,3,0]octane; 6 , 1-alcoxy 2,8-dioxa 5-aza
1-phosphaV bicyclo[3,3,O]octane. Pour des raisons de commoditi,
nous les appellerons bicyclophosphanes pour 5 et bicyclophosphoranes
pour 6.
 CAN. I . CHEM. VOL. 66, 1988
r r3 + ROH
0-p-0
- RO,,
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23
Nous avons montrC avec une sCrie d'alditols ( H M H 2 -
(CHOH),--CH20H (n = 0, 1, 2, 3, 4)) qu'on peut facilement
introduire autant de groupes bicyclophosphoranes qu'il y a de
fonctions alcool dans le polyol et que les per-
bicyclophosphoranes 6' obtenus sont en Cquilibre avec des en-
titCs dans lesquelles le groupe phosphorane est passe sous sa
forme tautomkre phosphite 6"(19).
Nous nous sommes alors attach& a rCaliser la phosphoryla-
tion du myo-inositol sans protection prkalable, en effectuant une
phosphoranylation totale ou partielle de ce dernier, suivie d'une
oxydation des bicyclophosphoranes obtenus et d'une hydrolyse
acide des esters neutres qui en rCsultent. Les produits de la
rkaction sont sCparCs par HPLC.
Resultats et discussion
Ces expCriences ont CtC conduites avec, comme agent de
phosphoranylation, le bicyclophosphane 8 qui se distingue de
son analogue 7 par la prCsence de deux substituants CH3 sur
chacun des carbones 3 et 7 au lieu de deux groupes CH3 sur le
seul carbone 6. L'intCrZt de cette substitution apparaitra par la
suite.
1 . Per-phosphoranylation
La per-phosphoranylation du myo-inositol a CtC effectuCe soit
dans le tolukne (phase hCtCrogkne), soit dans le dimCthyl sul-
foxyde (DMSO) (phase homogkne).
HI'=
HO
HO
5
+6 0-p-0
+ ' ~ 1
Elle nCcessite 6-14 h de chauffage 80°C dans le premier
cas, 1/2 h d'agitation a la tempCrature ambiante dans le second.
I /
En outre, nous avons vCrifiC a l'aide de la RMN 3 1que
~ dans ces
conditions le DMSO n'oxyde pas les derives phosphorCs obte-
nus (20).
La formation du per-phosphorane 9 est attestCe par (i) la
disparition, dans le spectre de RMN 31Pdu mClange rkactionnel,
du singulet correspondant au bicyclophosphane 8 (6 = 163
ppm) et son remplacement par un ensemble de doublets entre
-38 et -46 ppm avec un couplage IJppH de l'ordre de 800 Hz
(figure 1); (ii) l'absence dans le spectre infrarouge de toute
absorption de vibration OH; (iii) la prCsence dans le spectre de
masse (dCsorption de champ) d'un pic a M + = 1314, correspon-
dant l'addition de 6 molCcules de bicyclophosphane 8 (masse
molCculaire = 189) sur le myo-inositol.
Du point de vue stCrCochimique, la prCsence dans le myo-
inositol d'un plan de symCtrie passant par les carbones C2 et C5
se traduit par l'existence dans le per-phosphorane 9 de quatre
sites de phosphoranylation diffkrents (PI P3), P2, (P4 P6) et P5.
En fait, le spectre de RMN 3 1 comporte
~ au moins cinq pics
identifiables au lieu des quatre attendus (figure 1). Cela traduit
l'existence d6Cquilibres tautomkres phosphorane-phosphite,
comparable a ce qui a CtC observC avec les polyols 1inCaires (19)
et qui donne ipso-facto des phosphoranes originaux. On dCtecte
dans le spectre du produit 9 (figure 1) un signal peu intense
(infkrieur 2 lo%), situC 2 134 ppm, qui correspond a la rCso-
nance du noyau de phosphore des phosphites (21). La formation
de ces phosphites est Cgalement attestCe par la prksence dans le
spectre infrarouge de deux absorptions a 3235 cm-' et 3450
cm-I, attributables a VN-H associC et VN-H libre.
2. Phosphoranylation partielle
Comme exemple de phosphoranylation partielle du myo-
inositol, nous avons choisi la tris-phosphoranylation. Celle-ci a
CtC rCalisCe de deux manikres :
1. Action du bicyclophosphane 8 sur le myo-inositol en
solution dans le DMSO. A la fin de la rCaction le spectre de
OH
10
 DUTHU ET AL

RMN 3 1 ~ RMN 3 1 ~
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23

FIG. 1. Spectre de RMN 3 ' ~ (a)

, proton non dCcouple; (b) proton FIG. 2. Spectre de RMN 3 1 ~ (a), proton non dCcouplC; (b) proton
dCcouplC du per-phosphorane de myo-inositol9. dCcouplC du myo-inositol tris-phosphorane 10.

RMN 3'~comporte B -40ppm un ensemble de doublets
= 8 15 Hz) qui, par irradiation du proton, donnent naissance a 16
pics identifiables. Notons 18 Cgalement, la prCsence d'un signal
peu intense (-10%) a 134 ppm, attribuable aux phosphites
tautomkres (figure 2).
La complexitt de ce spectre s'explique par des considCrations
sttr6ochimiques. La fixation de trois atornes de phosphore sur le
myo-inositol donne naissance a 12 sttrtoisom~residentifiables
par RMN qui comportent 32 noyaux de phosphore difftrents. Ce
nombre peut encore Ctre augment6 par la presence de phosphites
tautomhes. Bien plus, on ne peut exclure dans cette reaction la
formation d'entites correspondant a la fixation d'un nombre
d'atornes de phosphore diffkrent de 3 ( I , 2 , 4 , 5 , 6 ) ce qui ajoute
B la complexitt du spectre.
2. Mtthanolyse du per-phosphorane 9. En effet, nous avons
prtalablement montre que l'action du mCthanol sur l'isopropyl-

11 12
S31P = -37,3 ppm S3'P = -36,9 ppm
' J p _ , = 7 9 1 3 HZ ' J ~ =. ~798 Hz
 CAN. J. CHEM. VOL. 66, 1988

RMN 3 1 ~
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23

1
1 + MeOH

-36,9ppm

FIG. 3. La rnithanolyse de 11 conduit exclusivement au mithoxy bicyclophosphorane 12. Spectre de RMN 3 1 de~ 11 et 12. (a) proton non
decouplC; (b) proton d&couplC.

oxybicyclophosphorane 11, sptcialement prtpark pour cette
experience, conduit exclusivement au rnCthoxybicyclophos-
phorane 12 (figure 3). La mtthanolyse du per-phosphorane 9 est
attestte par l'apparition dans le spectre de RMN 3 1 {'H)
~ d'un
signal 21 6 = -35,2 dQ au rntthoxybicyclophosphorane 12 (la
variation de la valeur de z3'p est due au changement de milieu)
et la multiplication attendue des signaux des phosphoranes de
myo-inositol (figure 4). On notera que l'aptitude du bicyc-
 DUTHU ET AL.

17 18
-
6 " ~ 84,O ppm 6 3 1=~83,7 ppm

19 20
fj3'P - 52,O ppm 6 3 '=
~ 51.0 ppm

lophosphane a se fixer sur le myo-inositol et a en &treretire lui Ce melange reactionnel a CtC soumis a une stparation par
confere des caracteristiques d'un bon groupement protecteur. chromatographie liquide a haute performance (HPLC) sur une
3 . Oxydation - sulfuration rtsine Cchangeuse d'anions dans les conditions experimentales
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23

L'oxydation par le tertiobutylhydroperoxyde (22) des phos-
phoranes 9 et 10 en solution dans le DMSO a CtC effectute a la
temptrature ambiante. Dans les deux cas, les spectres de RMN
3 1{'H) ~ des melanges rtactionnels montrent la disparition totale
des signaux des phosphoranes et phosphites tautomeres et leur
remplacement par un groupe majeur situt entre 10 et 20 ppm,
attribuable aux composts 13 et 14 (23), et un groupe mineur,
situe entre - 16 et 0 ppm, attribuable aux dtrives 15 et 16 (23).
Bien entendu, le nombre de pics reprtsentant les produits d'ox-
ydation est bien plus grand dans le cas du produit 10 que dans
d'Irvine et al. (26). Celles-ci permettent, par la modification de
la force ionique a l'aide d'un gradient de formiate d'ammonium,
de separer les phosphates du myo-inositol en fonction du nom-
bre de leurs atomes de phosphore qui est en relation directe avec
la concentration du formiate d'ammonium. On conclut que les
fractions 1- 16 correspondent surtout aux molCcules a un atome
de phosphore, les fractions 17-22 aux moltcules a deux atomes
de phosphore et les fractions suivantes aux moltcules a trois
atomes de phosphore. Nous avons collect6 au total 48 fractions
et enregistre leurs spectres de RMN 3 1 (pH ~ = 33).

celui du dtrive 9, ce qui traduit le fait que le compost 9 est un L'etude de ces spectres montre que seules les 22 premikres
isomkre unique possedant quatre noyaux de phosphore diffe- fractions contiennent des molCcules phosphorees, ce qui veut
i rents alors que le derive 10 peut representer un mtlange de 12 dire que les entites separtes contiennent seulement un ou deux
isomkres comportant au total 32 noyaux de phosphore diffe- atomes de phosphore. L'hydrolyse ne s'est donc pas limitte aux
I rents. liaisons P - - 0 4 et P-N-C, liant le phosphore au reste
1 Nous avons montrt ensuite que l'action du soufre elementaire
1 transforme quantitativement les phosphoranes 9 et 10 en deux
, types de derivts thiophosphoryles : les produits majeurs 17 et 18
d'une part et les produits mineurs 19 et 20 d'autre part, dont les
parametres de RMN 3 1 sont ~ tout a fait comparables a ceux de
composes analogues releves dans la litttrature (23, 24).
4 . Hydrolyse
L'hydrolyse des phosphates neutres a pour but d'acceder aux
monoesters selon la reaction :

L'hydrolyse acide conduisant a un alcool tertiaire ttant plus

rapide que celle conduisant a un alcool secondaire (25), l'utilisa-
tion du bicyclophosphane 8 permet de reduire le taux de dephos-
phorylation du myo-inositol. Gaminodiol9, mais elle a egalement touche les liaisons
Nous avons effectut cette reaction sur les produits d'oxyda-
P a inositol. Dans ces conditions, l'hydrolyse partielle
tion 14 et 16 des tris-phosphoranes 10. A la temperature
des phosphates 14 et 16 peut conduire a 7 types de molCcules
ambiante, la rtaction est quasi-instantanee. Le spectre de RMN
(a-g) qui se distinguent par l'allure du signal de resonance du
"P du melange rtactionnel continue a presenter deux groupes
phosphore : singulet pour b et g, doublet pour c et e et multiplet
de signaux, entre - 16 et 0 ppm d'une part et entre 10 et 16 ppm
pour a , d et f. Les fractions recherchees sont celles qui corres-
d'autre part, mais ce dernier groupe n'est plus aussi prtdomi-
pondent aux entitts c. Nous en avons releve trois :
nant comme dans le spectre des produits de dtpart. En outre les
deplacements chimiques sont sensiblement differents de ceux Fraction 5
pointts dans le spectre du melange des produits 14 + 16. Le spectre de RMN 3 1 (figure
~ 5) comporte un doublet qui se
 CAN. 1. CHEM. VOL. 66. 1988
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23
FIG.4. La mkthanolyse du per-phosphorane de myo-inositol9 con-
duit a une augmentation du nombre de phosphoranes de myo-inositol
(voir fig. 1) et i la formation du mCthoxybicyclophosphorane 12 : 6 =
-35,2 ppm valeur lkgkrement differente de celle lue sur la figure 3 en
raison de la modification du milieu.
transforme en singulet par dtcouplage des protons : S3'P, 15,8
ppm; 3~pn-H, 20,l HZ. Ces paramktres sont quasi identi-
ques iI ceux du myo-inositol- 1,2(cycl)phosphate 22 : S31P, 16,5
ppm; 3~p-c-,, 20 HZ (27). L'identification est parachevte
en comparant le spectre de RMN 'H de cette fraction (figure 6) 2
celui d'un tchantillon authentique du produit 22, rtcemment
publit dans la litttrature (28).
Fraction 7
Le spectre de RMN 3 ' (figure
~ 7) comporte un signal unique:
S3'p, 0,20 ppm; 3Jp-C-H, 7,6 Hz; cette fraction a t t t
RMN 3 1 ~
Solvant
pH 3,5
1 I
J ~ pPpm
20 15
FIG. 5. Spectre de RMN 3 ' ~ (a)
, proton non dkcouple; (b) proton
dkcouple de la fraction 5 obtenue lors de la skparation par HPLC des
produits d'hydrolyse de phosphates 14 et 16. Nombre d'accumula-
tions : 104.
identifite comme ttant le myo-inositol-1 phosphate 23 en com-
parant son spectre de RMN 'H a celui d'un tchantillon authenti-
que (28) (figure 8).
La valeur de S3'P : 0,20 ppm iI pH 3,5 diffkre de celle relevte
dans la litttrature : 4,75 ppm iI pH 8. Toutefois la difftrence
est conforme a ce qui a t t t gtntralement observt dans les
phosphates de myo-inositol : un blindage quand la valeur du
pH diminue (29). En revanche, les constantes de couplage
3~p-o-C-H 7,6 HZ et 7,3 Hz (litttrature) sont quasiment
identiques.
Le spectre de rtsonance 13C de cette fraction 7 est reproduit
en figure 9. I1 montre que les six noyaux de carbone sont
devenus tous difftrents par suite de la fixation du groupe phos-
phate sur le carbone 1 (ou sur le carbone 3 suivant I'enantiomkre
considtrt). Par comparaison avec les dtplacements chimiques
des noyaux de carbone du myo-inosito13 d'une part et compte
tenu de l'effet bien connu de dtblindage du noyau de carbone
touch6 par la phosphorylation (29, 30), le spectre peut &tre
3. Dans le myo-inositol, les noyaux de I3cont les deplacements
chimiques suivants : C,C3 = 72,44 ppm, C? = 72,18 ppm, C4C6 =
71 ,I, ppm, C5 = 74,35 ppm (solvant D20) (ce travail).
 ET AL.

RMN 'H I
RMN 3 1 ~
Solvant D20
pH 3,5

(a)
31
S P = 0,2ppm
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23

FIG. 6. Spectres de RMN 'H, (a) d'un Cchantillon authentique de

rnyo-inositol-l,2(cycl)phosphatepubliC par Cerdan et al. (28); (b) de la
fraction 5 obtenue lors de la skparation par HPLC des produits d'hyd- FIG. 7. Spectre de RMN 3 ' ~ (a)
, proton non dkcouplk; (b) proton
rolyse des phosphates 14 et 16. Nombre d'accumulations : 16. Le dCcouplk de la fraction 7 obtenue lors de la skparation par HPLC des
signal du proton Hz est rnasquC par le signal OH de H 2 0 , 6 > 4,5 ppm. produits d'hydrolyse des phosphates 14 et 16. Nombre d'accumula-
X = irnpuretk. tions : 64.

analysk de la f a ~ o nsuivante : le doublet 2 6 753, ppm, 'Jc-, 5,8

C6mc2
I

Hz, correspond au carbone C l ;le doublet a 6 74,05 ppm, avec un

kcart de 0,8 Hz entre ses branches, est attribuk au carbone C5
prksentant un couplage a travers quatre liaisons avec le phos-
phore : 4~C4-Cnp 0,8 HZ ; les singulets a 6 72,3 pprn et 6
70,8 pprn sont attribuables respectivement aux carbones C3 et
C4; le doublet B 6 71,6 ppm, 3 ~ C - p 5,8 Hz, peut &treattribuk
aussi bien au carbone C2 qu'au carbone C6. 11en est de m&medu
doublet B 6 7 1,25, 3 ~ C - p 1,65 HZ.
Cette ambigu'itk peut &trelevke en tenant compte d'une part
du fait que les variations des constantes de couplage 3J~4-+p
en fonction des angles dikdres C X U P suivent une loi
(3 1) comparable B celle qui existe pour les constantes de cou-
plage 3 ~ H 4 n p (32) et, d'autre part, en considkrant la valeur
non nulle du couplage 4JC-p. Cette dernikre donnke implique en
effet que les quatre liaisons C 5 X 6 , C 6 X 1 ,C I - O et 0 - P
sont dans le m&me plan (rkgle du M), ce qui entraine un
emfichement B la rotation autour de la liaison C 1 4 .Ceci peut
rksulter d'une liaison hydrogkne intramolkculaire entre le
groupement phosphoryle P=O et l'hydroxyle port6 par le car-
bone C6 ou C2. La liaison 0-P peut donc &tresoit du c6tk du
carbone C6 soit du cat6 du carbone C2 par rapport au plan
perpendiculaire au plan moyen du cycle et passant par C, et C4.
L'examen d'un modkle molkculaire montre que dans le premier
cas ((A): projection de Newman suivant O--C1), l'angle dikdre
CA1--O-P serait presque nu1 et l'angle dikdre C 2 - C 1 -
0-P voisin de 120°, alors que dans le second (B) les valeurs des
mCmes angles dikdres seraient voisines de 180" et 60' respec-
tivement. Seule cette dernikre situation rend bien compte des
PO3
A B
valeurs expkrimentales des constantes de couplage. L'attribu-
tion dkfinitive est donc : SI3C27 1,25 ppm, 3 ~ C 2 - p1,65 HZ;SI3C6
71,6 ppm, 3 ~ C G p5,8 Hz.
Fraction 8
Le spectre de cette fraction (figure 10) comporte deux doub-
lets d'inkgale intensitk : 6 3 ' 1,9
~ ppm, 3~p--H 7,5 HZ ; s
3 10,38
~ ppm, 3 ~ pn p-H 7,2 HZ.L'analyse de son spectre de
RMN 'H montre qu'elle est constituke d'un mklange de myo-
inositol- 1 phosphate 23 et de myo-inositol-2 phosphate 24. On y
H OH&oH
24
relkve, en effet, les deux signaux caractkristiques du proton Hz
de ces deux entitks (cf. rkf. 28) : un triplet B 6 4,08 pprn
correspondant au proton H2 de 23, un doublet de triplet B 6 4,35
pprn correspondant au proton H2 de 24.
Le spectre de RMN I3cde cette fraction (figure 11) confime
la prksence de ces deux entitks. I1 est facile d'y reconnaitre les
six signaux (ombrks) correspondant aux noyaux de carbone de
23. Le reste du spectre comporte quatre signaux dont les inten-
sitks relatives sont comme 1.1.2.2. Cette allure est celle prkvue
 2972 CAN. I. CHEM. \
I RMN 'H I RMN 3 1 ~
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23
FIG. 8. Spectres de RMN 'H, (a) d'un Cchantillon authentique de
rnyo-inositol-1 phosphate 23 publiC par Cerdan et al. (28); (b) de la
fraction 7 obtenue lors de la separation par HPLC des produits d'hyd-
rolyse des phosphates 14et 16. Nornbre d'accurnulations : 16.
RMN I3c
FIG. 9. Spectre de RMN 'k (20,15 MHz) de la fraction 7 obtenue
lors de la separation par HPLC des produits d'hydrolyse des phosphates
14 et 16. Nombre d'accumulations : 4480.
Sol vant D20
pH 3,5
FIG. 10. Spectre de RMN 3 1 ~(a), proton non dCcouplC; (b) proton
decouple de la fraction 8 obtenue lors de la separation par HPLC des
produits d'hydrolyse des phosphates 14 et 16. Nombre d'accumula-
tions : 240.
RMN I3c
FIG. 11. Spectre de RMN I3C (62,97 MHz) de la fraction 8 obtenue
lors de la sCparation par HPLC des produits d'hydrolyse des phosphates
14 et 16. Nombre d'accumulations : 4970. Les signaux ombrCs appar-
tiennent au myo-inositol-1 phosphate 23, les autres au myo-inositol-2
phosphate 24.
 DUTHU ET AL.
pour les signaux I3C du myo-inosotol-2 phosphate 24. Tout
comme le myo-inositol, ce dernier admet comme plan d e symkt-
rie le plan perpendiculaire au plan moyen du cycle et passant par
CZ et C5. Ainsi les paramktres d e R M N I3C d e 24 sont les
suivants : C I C 3 , 6 72,g4; C 2 , 6 77,45, 2 ~ C 2 - p 5 , 8 Hz; C4C6, 6
71,11;Cg, 674,52.
La skparation d e ces monophosphates dans l'ordre que nous
venons d e dkcrire concorde avec les resultats rtcemment publits
par Binder et al. (33). Ainsi, parmi les produits a un atome d e
phosphore obtenus dans cette rtaction, nous avons caractkrise
trois myo-inositol monophosphates qui peuvent avoir un intb&t
biologique.L'analyse des fractions 2 deux atomes d e phosphore
dans le but d e dktecter des myo-inositol bis-phosphates se pour-
suit actuellement.
Conclusion
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23
Nous avons mis au point une mkthode d e phosphorylation du
myo-inositol qui diffkre d e toutes celles rapportkes dans la
littkrature (8-17,35) par le fait qu'elle n'exige pas la protection
prkalable du myo-inositol.
C e procedt a trois ttapes seulement : phosphoranylation du
myo-inositol, oxydation des phosphoranes et hydrolyse des
phosphates neutres ainsi obtenus, permet d'acckder en une seule
preparation a plusieurs phosphates d e myo-inositol, c e qui est
illustrk par l'obtention des myo-inositol phosphates 22,23 et 24
en partant des tris-phosphoranes 10. L'obtention, toujours en
une seule optration, d'autres phosphates d e myo-inositol biolo-
giquement inttressants, comme les tris ou les tetrakis-
phosphates, devient ainsi concevable moyennant une adkqua-
tion du degrk d e phosphoranylation du myo-inositol et une
recherche d e conditions d'hydrolyse qui protkgeraient la liaison
P--0 d e I'inositol. C'est c e que nous nous proposons d'ttudier
dans un proche a ~ e n i r . ~
Partie experimentale
MPthodes spectroscopiques
Les spectres de RMN 'H, I3C et 3 1 ont ~ CtC enregistrCs avec diffC-
rents appareils Bruker : W.P 60, A.C 80, W.H. 90, W.M. 250 et A.M.
300 WB.
Les dCplacements chimiques, exprimCs en parties par million du
champ inducteur (pprn) sont mesurCs avec une prCcision de +0,02 p m
'P
pour 'H, 20,03 ppm pour 31Pet I3C (rCfCrences : TMS pour 'H et C,
H3PO4a 85% pour 3 1 ~ Les ) . constantes de couplage, exprimCes en Hz,
sont mesurCes avec une prCcision de +0,2 Hz.
Les spectres IR ont ttC enregistrCs l'aide d'un spectrographe
Bruker I.F.S. 110 fonctionnant en transfornee de Fourier (cuves de
200-1000 Km, 50-1000 accumulations). RCsolution k0.5 cm-'.
1. Le bicyclophosphane 8
Le 3,3,7,7-tetramethyl 2,s-dioxa 5-aza ~ - ~ h o s ~ h abicyclo"'
[3,3,0]octane (bicyclophosphane 8) a CtC obtenu selon une procCdure
que nous avons dCcrite prCcCdemment (18, 34).
L'oligomCrisation bien connue de ce composC a CtC rCduite en
mClangeant les solutions des rCactifs goutte a goutte et non en une seule
fois, comme c'Ctait le cas prCcCdemment. La puretC du produit obtenu a
CtC vCrifiCe par RMN 3'P, 'H et I3C. Elle se situe en gCnCral entre 95 et
100%. Rdt, 45%. RMN 3 ' (32,44~ MHz, tolukne-d8) : s 163 ppm; 'H
(80 MHz, C6D6): 1,216 ppm (s, 6H, CH3), 1 ,308 pprn (s, 6H, CH3),
4. Pendant le temps qui s'est CcoulC entre I'envoi du manuscrit et la
rkception des avis des rapporteurs, nous avons identifie, parmi les
fractions a 2 atomes de phosphore, le myo-inositol-1,4 bis-phosphate.
Cette identification a CtC rCalisCe en comparant le spectre de RMN ' H de
la fraction sCparCe a celui d'un Cchantillon authentique publiC dans la
litterature (28).
2973
2.73 et 2,99 pprn (2 quadruplets AB, 4H, H3H4H5H6,2 ~ H 3 H 4= 2 ~ H 5 H 6
= - 11,s HZ; I 3 ~ H 3 Ip= / 3 ~ H 5 pI = 8 HZ; ( 3 ~ ~ / 43 p~ ~ I 6=p9,3 HZ); I3c
{'H) (20,15 MHz, tolukne-d8): 28.5 (s, C9), 30,52 (d, Clo, 3 ~ C p= 3,2
HZ)5; 64,20 (d, C4, C6, 'JC-N-~ = 3,8 HZ), 82,07 (d, C3, C7 'JC-L~
= 10,5 Hz) ppm.
2. Phosphoranes de myo-inositol
Les per-phosphoranes ainsi que les tris-phosphoranes de myo-
inositol ont CtC prCparCs selon le mCme protocole expkrimental dont
voici un exemple. Une solution de 14,4 mg (0.08 X mol) de
myo-inositol dans 5 mL de DMSO est ajoutCe en une fois a 90,7 mg
(0,48 x mol) de bicyclophosphane 8 (45,8 mg soit 0,24 x l V 3
mol dans le cas de la tris-phosphoranylation). Au bout d'une dizaine de
minutes d'agitation a la tempkrature ambiante, I'examen du spectre de
RMN 31Pdu mClange rCactionne1 montre que la rCaction est terminCe
(voir RCsultats et discussion).
3. Le 3,3,7,7-tPtramPthy1-1isopropyloxy-2,8 dioxa-5 aza-1 phosphaV
[3,3,0] bicyclooctane 11
Une solution de 30 mg (0,5 x mol) d'isopropanol, fraichement
distillC, dans 0,25 mL de tolukne a CtC ajoutCe en une fois a une solution
de 94,5 mg (0,5 x mol) du bicyclophosphane 8 dans 0,25 mL du
mCme solvant. Le spectre de RMN 31P enregistrC 10 min aprks le
mClange des rCactifs montre que la rtaction est terminCe. Le produit n'a
pas CtC isolC. I1 a CtC caractCrisC par RMN 'H, 3 1 et~ I3C. RMN 3 1 ~
(32,44 MHz, tolukne-d8) : -37,27 pprn (d, ' J ~ =_ 791.5 ~ Hz); "P
{'H) : -37,23 ppm (s); 'H (300 MHz, tolukne-d8) : 1,185 ppm (d, 6H,
CH3 (lo), 3 ~ ~ - ~ - ~ - H= 6,2 HZ), 1,21 pprn (s, 6H, CH3 (1 1 OU 12)),
1,285 ppm (s, 6H, C H (12 ou 1I)), 2,4g7 et 2,566 pprn (2 quadruplets
AB, 4H, H3, H4, H5, H6, 'JH3H4 = 2 ~ H 5 H 6= -8,2 Hz; 3 ~ ou ~H,P 3I =
15 H r 1 3 J ~ 4 , u ~ 3 p 1= 12.8 HZ). 4,594p~IIl(m, 1H H9, 'JH-C-LP =
10,7 HZ); I3C{'H) (20,15 MHz, tolukne-d8) : 24,17 (d, Clo,3~c-c-
P = 5,9Hz), 29,17 (s, C I I ) ,29,63 (d, C12, 3~~~ = 5 HZ),55,59 (d, C4,
C6, 2~c-N-P = 19 HZ), 6839 (d, C9, 'JC-LP = 6,4 HZ), 70,08 (d,
C3, C7, J'c-P = 5 , s Hz) ppm.
4. 0-rydation
Au mtlange riactionnel issu de la per-phosphoranylation (105,l mg
(0.08
. . x lo-' moll du composC 9 en solution dans 5 mL de DMSO) on
ajoute 43,20 mg' (0,48 x mol) de tertiobutylhydroperoxyde,
t-C4H900H,fraichement redistill6 (Eblo= 28°C). Une agitation pen-
dant 2 h a la tempkrature ambiante suffit pour conduire au melange des
phosphates neutres 13 et 15. Le mClange des phosphates 14 et 16 est
obtenu par le mCme procCdC. Seule la quantitk de tertiobutylhyd-
roperoxyde est divisCe par 2.
5. Sulfuration
Une solution de 131,4 mg (0,l x mol) du per-phosphorane de
myo-inositol9 dans 5 mL de DMSO est mClangCe a 19,2 mg (0,075 X
mol) de fleur de soufre S8. La dissolution de ce dernier dans le
mClange rCactionnel nCcessite un chauffage 40°C pendant 20-30 min.
Un contrble par RMN de 3 ' montre ~ que la sulfuration est terminCe.
Dans le cas des tris-phosphoranes 10 la quantitC de fleur de soufre est
rCduite de moitiC.
+
6. Hydrolyse desphosphates neutres 13 15 ou 14 16 +
L'addition a la temperature ambiante de la quantitC stoechiomCtrique
d'une solution d'acide chlorhydrique 1 N au mClange rCactionnel des
+ +
produits 13 15 ou 14 16 en solution dans le DMSO conduit a une
solution dont le pH est tgal i 5. A ce pH, la rCaction est lente; au bout de
6 h, les modifications du spectre de RMN 31Psont quasiment nulles.
Nous avons vCrifiC qu'en diminuant le pH par addition de quantitC
5. L'Ctude conformationnelle des bicyclophosphanes de ce type nous
montre que la molCcule se prCsente comme un toit deux pentes, les
doublets libres du phosphore et de I'azote Ctant sur le toit. Les cycles
pentagonaux adoptent une conformation enveloppe bloquCe, les
atomes de carbone C3 et C7 Ctant a la pointe des rabats, lesquels sont
orient& en trans par rapport aux doublets libres du phosphore et de
l'azote (gComCtrie endo-endo (34)). L'existence d'une relation de type
Karplus (31) pour le couplage 3~p.o.C.C explique l'existence ou non
d'un couplage dCtectable entre le phosphore et les carbones C9 et C l o
Pour le premier l'angle dikdre P--0--C9 est voisin de 90°, alors que
I'angle dikdre P S - - C l o est voisin de 150".
 2974 CAN. J. CHEM. VOL. 66. 1988

croissante de solution d'acide chlorhydrique, la rkaction est accCltrCe. 14. C. B. REESEet J. G. WARD.Tetrahedron Lett. 28, 2309 (1987).
A pH 2 elle est quasiment instantanke. Aussi les hydrolyses de ces 15. ( a )A. M. COOKE,B. V. L. POTTER et R. GIGG.Tetrahedron Lett.
phosphates ont CtC effectutes en portant directement a 2 la valeur du pH 28,2305 (1987). ( b ) M. COOKE,R. GIGGet B. V. L. POTTER.J .
de la solution par addition de la quantitC nCcessaire de solution d'acide Chem. Soc. Chem. Commun. 1525 (1987).
chlorhydrique I N. 16. ( a ) Y. WATANABE, T. OGASAWARA, N. S H I O T A et
N ~S. OZAKI.
7. SPparation par HPLC Tetrahedron Lett. 28, 2607 (1987);( b ) S. OZAKI,Y . KONDO,H.
Le mClange rkactionnel de I'hydrolyse des phosphates neutres est NAKAHIRA, S. YAMAUKA et Y . WATANABE. Tetrahedron Lett.
CvaporC a sec sous Ton ( l T o n = 133.3 Pa). Le rCsidu est repris 28,469 1 (1 987).
par un minimum d'eau puis filtrC sur 0,22 km millipore. 17. ( a )M. R. HAMBLIN, J. S. FLORAet B. V. L. POTTER.Biochem. J .
La separation HPLC est rCalisCe sur colonne Cchangeuse d'anion 246, 771 (1987);( b ) K. L. Yu et B. FRASER-REID. Tetrahedron
Whatman Partisil Sax 10. Le gradient employ6 est analogue a celui de Lett. 29, 979 (1988); ( c ) J. L. MEEK,F. DAVIDSON et F. W.
lrvine et al. (26). Le pH des solutions tampons est ajustC 3,5 avec HOBBS,JR. J. Am. Chem. Soc. 110, 2317 (1988).
I'acide chlorhydrique et non de l'acide orthophosphorique pour per- 18. D. HOUALLA, F. H. OSMAN,M. SANCHEZ et R. WOLF. Te-
~nettrele contrble par RMN. Tout au long de la stparation, le dCbit est trahedron Lett. 35, 3041 (1977).
,de 3 mLlmin et les fractions sont collectCes toutes les minutes. 19. ( a ) D. HOUALLA, A. MUNOZ,H. RAMDAME et R. WOLF. Te-
trahedronLett. 26,2003 (1985);( b )B. DUTHU,D. HOUALLA, M.
Remerciements C. DURIEZet R. WOLF.Phosphorus Sulfur, 3 0 , 319 (1987).
20. ( a ) E. H. AMONDO-NEIZER, S. K. RAY,R. A. SHAWet B. C.
Can. J. Chem. Downloaded from cdnsciencepub.com by 196.89.46.74 on 06/14/23

Les auteurs tiennent a remercier les responsables et person- SMITH.J. Chem. Soc. 4296 (1965);( b )M. DREUX,Y . LEROUX et
nels techniques des services sptcialists du Groupe rkgional d e P. SAVIGNAC. Synthesis, 506 (1974); ( c ) A. M u ~ o z ,M.
rnesures physiques d e Toulouse : M m e Bon, M M . Commenges, GALLAGHER, A. KLAEBEet R. WOLF. Tetrahedron Lett. 673
Dall'ava, Pelletier, Servin et Tran le Trang (RMN), M m e (1976); (4J. DABROWIEZ, T. NUMATA et S. OAE.Org. Prep.
Bouissou (IR) et M . Roussel (spectromttrie d e masse) pour Proced. Int. 9 , 6 3 (1977).
l'enregistrernent des spectres qui ont servi au cours d e c e travail. 21. J. M. S o c o ~ e t JG.
. VERKADE. Inorg. Chem. 23,3487 (1984).
11s tiennent tgalement ?I remercier M m e et Monsieur Cavadore 22. K. TAIRAet D. G. GORENSTEIN. Tetrahedron, 40,3215 (1984).
du Centre d e recherche d e biochirnie macromoltculaire du 23. V. MARK,C. H. DUNGAN, M. M. CRUTCHFIELD et J. R. VAN
WAZER.Topics in phosphorus chemistry. Interscience Pub-
C.N.R.S. a Montpellier qui ont apportt une contribution dtci-
lishers, New-York, NY. 1967. Chap. 4 .
sive a la mise au point des stparations chromatographiques. 24. J. DEVILLERS. Thkse de llUniversitC Paul Sabatier de Toulouse.
1972.
1. K. L. AGARWAL, A. YAMAZAKI, P. T. CASHIONet M. G. 25. J. P. Cox et M. G. NEWTON. J. Org. Chem. 34,2600 (1969).
KHORANA. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 11,457 (1972). 26. R. F. IRVINE,E. E. ANGGARD, A. LETCHER et C. P. DOWNES.
2. M. H. CARUTHERS. Science, 230,28 1 (1985). Biochem. J. 229,505 (1985).
3. ( a )H. STREB,R. F. IRVINE, M. J. MICHELL et I. SCHULE. Nature, 27. R. A. GRAHAM, R. A. MEYER,B. S. SZWERGOLD et T. R.
306,67 (1983);( b )M. J. BERRIDGE et R. F. IRVINE. Nature, 312, BROWN. J. Biol. Chem. 262,35 (1987).
315 (1984). 28. S. CERDAN, C. A. HANSEN, R. JOHANSON, T. INUBUSHI et J. R.
4 . R. J. MICHELL.Nature, 318, 176 (1986). WILLIAMSON. J. Biol. Chem. 261, 14676 (1986).
5. A. A. ABDEL-LATIF. Pharmacolol. Rev. 3 8 , 227 (1986). 29. L. R. ISBRANDT et R. P. OERTEL.J. Am. Chem. Soc. 102, 3144
6 . ( a )C. GRADO et C. E. BALLOU. J. Biol. Chem., 236, 54 (1961); (1980).
( b )R. V. TOMLINSON et C. E. BALLOU. J. Biol. Chem. 236, 1902 30. J. C. LINDON,D. J. BAKER, R. D. FARRANT et J. M. WILLIAMS.
(1961). Biochem. J. 233,275 (1986).
7 . Catalogue Boehringer, Mannheim, RCpublique fidtrale d'Alle- 31. D. G. GORENSTEIN. Phosphorus 31 NMR - Principles and ap-
magne. 1987. pp. 158-160. plications. Academic Press, New York, NY. 1984. pp. 43-5 I .
8. S. OZAKI,Y. WATANABE, T. OGASAWARA, Y. KONDO,N. 32. ( a ) M. KARPLUS. J. Am. Chem. Soc. 85, 2870 (1963);( b ) W. J.
SHIOTANI, H. NISHIet T. MATSUKI. Tetrahedron Lett. 27, 3157 JUNG,R. E. MARSHet M. KAINOSHO. J. Am. Chem. Soc. 99,
(1986). 5471 (1977); ( c ) Y . Y. SAMITOV,A . A . MUSINA,R. M.
9 . D. C. BILLINGTON, R. BAKER,J. J. KULAGOWSKI et I. M. AMINOVA,M. A. PUDOVIK,A. 1. KHAYAROV et M. D.
MAWER. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 314 (1987). MEDVEDEVA. Org. Magn. Reson. 13, 162 (1980); (4 P. P.
10. D. C. BILLINGTON et R. BAKER.J. Chem. Soc. Chem. Commun. LANKHORST, C. A. G. HAASNOOT, C. ERKELENS et C. ALTONA,
101 1 (1987). J. Biomol. Struct. Dyn. 1 , 1387 (1984).
11. ( a )J. P. VACCA,S. JANEDE SOLMES et J. R. HUFF..I.Am. Chem. 33. H. BINDER, P. C. WEBERet W. SIESS.Anal. Biochem. 148, 220
Soc. 109,3478 ( 1987);( b ) Tetrahedron Lett. 28,4503 (1987). (1985).
12. Y. WATANABE, H. NAKAHIRA, M. BUNYAet S. OZAKI.Tet- 34. C. BONNINGUE, D. HOUALLA, M. SANCHEZ, R. WOLFet F. H.
rahedron Lett. 28,4179 (1987). OSMAN. J. Chem. Soc. PerkinTrans. 2, 19 (1981).
13. M. R. HAMBLIN, B. V. L. POTTERet R. GIGG.J. Chem. Soc. 35. ( a ) F. L. PIZERet C. E. BALLOU.J. Am. Chem. Soc. 81, 915
Chem. Commun. 626 (1987). (1959);( b )T. POSTERNAK. Helv. Chim. Acta, 42, 390 (1959).