UE 2

La cellule –Les tissus

Cours de l’année 2019-2020

NANCY-METZ

ED n°3

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SOMMAIRE.

I. ORGANISATION FONCTIONELLE DU FOIE ..................................................................................................... 3

A. GENERALITES ......................................................................................................................................................................... 3
B. COUPE HISTOLOGIQUE ............................................................................................................................................................. 4
C. EMBRYOGENESE ..................................................................................................................................................................... 5

II. ETUDE D’ARTICLE DE RECHERCHE ............................................................................................................... 5

A. DIFFERENCIATION CELLULAIRE ................................................................................................................................................... 5
B. DIFFERENCIATION HEPATIQUE ................................................................................................................................................... 6
C. OBSERVATIONS MICROSCOPIQUES.............................................................................................................................................. 9

III. LA CYTOMETRIE EN FLUX ............................................................................................................................ 9

IV. DIFFERENCIATION ENDOTHELIALE DES CELLULES SOUCHES MSENCHYMATEUSES ................... 10
A. LE CORDON OMBILICAL .......................................................................................................................................................... 10
B. DIFFERENCIATION DES CSM ................................................................................................................................................... 11
C. INDUCTION DE LA DIFFERENCIATION ENDOTHELIALE ..................................................................................................................... 13
D. TEST DE FONCTIONNALITE : INCORPORATION DE LDL ................................................................................................................... 14
E. TEST DE FONCTIONNALITE : FORMATION DE RESEAUX VASCULAIRES ................................................................................................ 15

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I. ORGANISATION FONCTIONELLE DU FOIE

A. Généralités

Le foie
Rôle énergétique
Stockage de glycogène

Rôle métabolisme
Rôles
Élimination des métabolites toxiques de l’organisme

Synthèse protéique
Beaucoup de protéines sont fabriquées par le foie (ex : albumine)

En lobuless hépatique
En forme de polyèdres centrés autour d’une veine centrolobulaire
Limité à ses angles par les espaces portes
s
Organisation
Le lobule hépatique correspond à l’unité veineuse du foie

Tissu hépatique apparait très organisé et est richement vascularisé

Permet la détoxification de l’organisme

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 B. Coupe histologique

Observation microscopique
Microscopie optique
Coloration au trichrome
Techniques • Hématoxyline
• Éosine
• Vert lumière

Structures polyédriques du lobule hépatique

Veine centrolobulaire au centre
Observations
Tissu conjonctif entre les lobules hépatiques
Hépatocyte

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 C. Embryogénèse

Embryogénèse

J 4 : morula
o Blastomères se compactent
J 5-6 : blastocyste
o Phénomène de Cavitation
o Trophectoderme
o Bouton embryonnaire interne

Les cellules hépatiques dérivent du bouton embryonnaire interne, possèdent la

Totipotence, elles peuvent former tous types de cellules
Développement
1ère étape de différentiation, développement de lignée pluripotentes :
o Endodermique
o Mésodermique
o Ectodermique

2ème étape de différenciation, développement de lignées multipotente

3ème étape de différentiation, développement de cellules différenciés

II. ETUDE D’ARTICLE DE RECHERCHE

A. Différenciation cellulaire

Reprogrammation cellulaire

Éclatement du foie.
Exemple :
Traitement envisageable aujourd’hui.
accident de la
o Traitement de substitution
voie publique
o Greffe

Recréer des cellules hépatiques

o Biopsie d’une partie saine du foie
o Mise en culture des cellules
Médecine o Reprogrammation génétique
régénérative  Redeviennent totipotente
 IPS : cellules souches pluripotentes induites.
o Mise en culture
o Différenciation en hépatocyte pour greffer au patient

o Reprogrammation génétique nécessaire

IPS o Cellules isolées du patient
Conclusion o Nombreux essais cliniques
o Rejet possible
ES
o Nombreux essais cliniques

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 Différentiation hépatique

Utilisation de cocktail pour permettre la différentiation.

Processus de o Changement d’aspect des cellules

différentiation o Sécrétion de facteurs différents selon la différenciation

QCM : la détection de protéine peut se faire par

A. Immunocytochimie
B. Hybridation in situ
C. ELISA
D. Cytométrie en flux
E. Immunohistochimie

Réponses justes : A, C, D et E
B. Faux. Acides nucléiques

B. Différenciation hépatique

Cellule souche embryonnaire (IPS)

Stade le plus immature

Expression de principaux facteurs :
Généralités
o Oct4 : développement de la masse cellulaire interne
o Nanog : impliqué dans la pluripotence des cellules

Observations
microscopiques

QCM :
A. L’immunocytochimie est l’utilisation d’anticorps reconnaissant spécifiquement un antigène d’une
protéine à étudier
B. L’immunocytochimie nécessite toujours l’utilisation de 2 anticorps
C. L’immunocytochimie est toujours visualisée en microscopie optique a fluorescence
D. Le signal peut être amplifié par l’utilisation d’un 2 ème anticorps
E. La coloration des noyaux au DAPI est réalisée par immunohistochimie

Réponses justes : A et D
B. Faux. Méthode directe
C. Faux. MET aussi
E. Faux. Le DAPI est une technique de fluorescence

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 Endoderme définitif
Stade suivant de différenciation
Expression de facteurs spécifiques :
o Sox17 : facteur de transcription spécifique de l’endoderme
Généralités o CXCR4 : récepteur membranaire aux chimiokines, uniquement présent sur
l’endoderme

Morphologie particulière, différente des IPS

Observations

Progéniteurs hépatiques (hépatoblastes)

Morphologie différente
Expression de facteur spécifique :
o HNF4 : facteur de transcription spécifique
Généralités o AFP (Alpha Fœto Protéine) :

Hoechst : traceur
Merge : superposition des traceur

Observations

Hoechst : traceur
Merge : superposition des traceurs

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 Hépatocyte différencié
2 protéines spécifiques
Généralités o MRP1 : transporteur des ABC transporteurs
o CYP3A4 : enzyme des xénobiotiques

Observations

QCM :
A. Les 2 séries d’images (haut & bas) sont à la même échelle
B. MRP1 est une protéine nucléaire
C. CYP3A4 est une protéine cytoplasmique
D. Le protocole de différenciation hépatique utilisé est optimal
E. La caractérisation des hépatocytes est validée avec ce test

Réponses justes : C et D
A. Faux.
B. Faux. Protéine cytoplasmique
E. Faux. Nécessite des tests de fonctionnalité

Test fonctionnel
o Utilisation d’un colorant : vert indocyanine
o Permet la mise en évidence des fonctionnalités des transporteurs
Généralités
L’hépatocyte mature internalise le colorant (apparaissent vert)
Surveillance de la clairance des hépatocytes, les hépatocytes matures rejettent le
colorant grâce aux transporteurs MRP1

Observations

4h après lavage, les hépatocytes ont rejeté le

colorant ICG
QCM :
A. La photo A montre une internalisation de l’indocyanine green
B. Les photos B et C sont réalisées en modifiant le bruit de fond
C. Les hépatocytes sont capables d’expulser l’ICG
D. La photo D montre l’immunomarquage d’une protéine hépatique
E. La figure E est une quantification d’un ELISA

Réponses justes : A, C, E
B. Faux.
D. Faux. Coloration PAS (spécifique des sucres via glycogène)

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 C. Observations microscopiques

MET

Observations

Visualisation :
o Hépatocyte
o REG et Golgi
Éléments
o Noyau
o Mitochondrie
o Particule de glycogène

QCM : quelles sont les propositions exactes ?

A. MO
B. Immunocytochimie
C. Mise en évidence des grains de sécrétion
D. Coloration PAS
E. Coloration PAS + diastase

Réponses justes : A, D

III. LA CYTOMETRIE EN FLUX

Cytométrie en Flux
1. Cellule mise en suspension
2. Passant devant un faisceau laser
3. La lumière réémise permet de classer la population cellulaire selon plusieurs
critères.
Généralités
Plusieurs critères :
o Taille relative
o Granularité
o Intensité fluorescence relative

Mise en culture des cellules avec des anticorps spécifiques marqués par un
Principe
fluorochrome, la fluorescence est récupérée et analysée

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IV. DIFFERENCIATION ENDOTHELIALE DES CELLULES SOUCHES MSENCHYMATEUSES
A. Le cordon ombilical

Le cordon ombilical
Apporte à l’embryon l’oxygène, les nutriments…

Composé de :
o Deux artères ombilicales
Généralités o Une veine ombilicale
 Entouré d’un tissu conjonctif : la gelée de Wharton

La gelée de Wharton est riche en cellules souches mésenchymateuses (CSM)

 Permet un prélèvement non invasif de CSM

o Sont abondantes dans le cordon ombilical

o Important potentiel d’auto-renouvèlement
CSM
o Se différencient en différents types cellulaires
o Immunoprivilégiée, permet d’échapper au système immunitaire de l’hôte receveur

Observations

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 B. Différenciation des CSM

Différenciation
Constituent les parois vasculaires, peuvent être utilisées pour soigner les maladies
vasculaires.

Caractérisation phénotypique :
Cellules
o VE-Cadherin+, vWF+
endothéliales

Tests fonctionnels :
o Incorporation de LDL
o Formation de réseaux vasculaires
Caractérisation phénotypique :
o CD73+, CD90+, CD105+
o CD34-, CD45-

CSM Tests fonctionnels :

Potentiel de différenciations :
o adipocytaire (Oile Red O),
o ostéogénique (Von Kossa),
o chondrogénique (Bleu alcian)

QCM : La cytométrie en flux :

A. Est une technique permettant de quantifier des gènes d’intérêts
B. Nécessite de préparer des coupes histologiques
C. Nécessite l’utilisation d’anticorps couplés a des billes
D. Nécessite l’utilisation de fluorochromes
E. S’applique sur des cellules en suspension

Réponses justes : D et E
A. Faux.
B. Faux. Cellules en suspension
C. Faux. Fluorochromes

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 Cytométrie en flux des CSM
CSM-GW : cytométrie en flux

Montrent les protéines exprimées par les cellules.

Expression des facteurs

o CD105
Interprétation o CD90
o CD73
Non expression des facteurs
o CD45
o CD34

Test de fonctionnalité des CSM

QCM :
A. La photo 4 montre la différenciation des CSM en cellules endothéliales
B. La photo 6 montre la différenciation des CSM en cellules osseuses
C. La photo 8 montre la différenciation des CSM en adipocytes
D. La condition contrôle correspond à des cellules non colorées
E. Les résultats confirment le potentiel de différenciation des CSM

Réponse juste : E
A. Faux. Ostéocytes
B. Faux. Adipocytes
C. Faux. Chondrocytes
D. Faux. CSM sans induction de différenciation

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 C. Induction de la différenciation endothéliale

Induction de la différenciation endothéliale

o Isolement des CSM de la gelée de Wharton
o Mise en culture dans un milieu basal
Méthode o Amplification jusqu’au 3 ème passage
o Ajout de facteurs spécifiques des cellules endothéliales
o Analyse des cellules obtenues

Observations

Caractérisation phénotypique des cellules différenciées

QCM :
A. La technique utilisée nécessite l’emploi d’anticorps couplés à une enzyme
B. Les structures colorées en bleu correspondent aux noyaux cellulaires marqués au DAPI
C. La protéine vWF est nucléaire
D. La protéine VE-Cadherin est exprimée dans les cellules non différenciées
E. Les résultats obtenus confirment la différenciation des CSM en cellules musculaires lisses

Réponses justes : B
A. Faux. Couplés à un fluorochrome
C. Faux. Cytoplasmique
D. Faux. Dans les cellules différenciées
E. Faux. Cellules endothéliales

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 D. Test de fonctionnalité : incorporation de LDL

Test de fonctionnalité : incorporation de LDL

o Internalisation du LDL par les cellules endothéliales de l’intima
o Oxydation du LDL
o Phagocytose des LDL oxydés par les macrophages
Généralités
o Possibilité des macrophages de devenir pathologiques : macrophages spumeux
(Mas)
o Formation de plaques d’athéromes par les Mas, LDL …

QCM :
A. Les éléments marqués en rouge correspondent aux noyaux
B. La photo A correspond aux cellules différenciées
C. La photo B correspond aux cellules différenciées
D. Les résultats sont analysés en utilisant un microscope électronique
E. Le LDL incorporé par les cellules est stocké dans le noyau

Réponses justes : C
A. Faux. Marquage au DAPI → Bleu
B. Faux. Contrôle négatif
D. Faux. Optique a la fluorescence
E. Faux. Cytoplasmique

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 E. Test de fonctionnalité : formation de réseaux vasculaires

Test de fonctionnalité : formation de réseaux vasculaires

o Culture de cellules dans du matrigel
o Dépôt de la solution dans des puits
o Incubation 30min a 37°C
o Aspiration de l’excès de solution non sédimenté
Méthode
o Détachement des cellules et mises en suspension
o Ensemencement dans les puits recouverts de matrigel
o Incubation 4h a 37°C
o Observation

Observations

A. Quel type de microscope est utilisé́ pour observer les réseaux vasculaires ?
 Microscopie optique à contraste de phase
B. A quel type de cellules correspond la photo a ?
 Cellules endothéliales différenciées
C. A quel type de cellules correspond la photo e ?
 CSM non induit

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