Introduction :

La coloration diffrentielle ou coloration de gram est ltape essentielle de lidentification bactrienne, surtout dans le domaine mdical, partir dune culture pure (culture pure contenant une seule espce), elle est aussi appele coloration V.L.A.F (Violet, Lugol, Alcool, Fuschine) La coloration de gram est un caractre Tinctorial cset dire laffinit de la cellule bactrienne se colorer.

La coloration de Gram doit son nom au bactriologiste danois Hans Christian Gram qui a mis au point le protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en vidence les proprits de la paroi bactrienne, et d'utiliser ces proprits pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donner une information rapide sur les bactries prsentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.

But :
La coloration de Gram est la mthode de coloration la plus utilise en bactriologie mdicale; elle permet de colorer les bactries et de les distinguer l'examen direct par leur aptitude fixer le violet de gentiane (Gram +) ou la fuschine (Gram -). L'intrt de cette coloration est de donner une information rapide et mdicalement importante.

Principe :
La coloration de Gram est fonde sur l'action successive d'un colorant d'aniline, le cristal violet, d'iode puis d'un mlange d'alcool et d'actone. Dans un premier temps, le colorant pntre dans la paroi et le cytoplasme. Dans un second temps, l'iode ragit avec le colorant et le rend insoluble. La permabilit plus grande des bactries Gram ngatif l'alcool permet la dcoloration. Les bactries Gram positif restent colores en violet ou mauve. Une contre-coloration (par exemple en rose) permet de visualiser nouveau, les corps cellulaires des bactries Gram ngatif.

Mode opratoire :
Ractif :

- le violet phnique : violet de gentiane (Crystal de violet) + alcool absolu + eau phnique - liquide de Lugol : iode + iodure de potassium + eau distille - alcool 96 (agent de dcoloration) - solution de fuschine ou de safranine (colorant de contraste) : solution de fuschine sature a lalcool+eau distille Matriels :

-Microscope optique, lame, bec de bunsen, pipette pasteur, anse de platine, huile de cdre, ainsi que le matriel habituel du laboratoire de Microbiologie.

Prparation du Frottis :

En effectuant une fixation simple l'eau et la flamme selon les indications suivantes : sur une lame, dposer une goutte d'eau strile. Ajouter l'anse de platine strilise une goutte de la colonie isole. taler et fixer la chaleur environ 40C pendant 10 15 minutes. Poser la lame sche sur le portoir reposant sur un bac de coloration.

Ralisation de la coloration :

1- Coloration primaire : Coloration par le violet de gentiane ou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes 1 minute. Rincer l'eau dminralise. 2- Mordanage au lugol (solution d'iode iodo-iodure): taler le lugol et laisser agir 60 secondes ; Rincer l'eau dminralise. On peut raliser une deuxime fois l'opration identiquement pour plus de scurit. 3- Dcoloration (rapide) l'alcool (+actone): verser goutte goutte l'alcool ou un mlange alcoolactone sur la lame incline obliquement, et surveiller la dcoloration (5 10 secondes). Le filet doit tre clair la fin de la dcoloration. Rincer sous un filet d'eau dminralise. 4- Contre-coloration la safranine ou la fuchsine. Laisser agir de 30 secondes 1 minute. Laver doucement l'eau dminralise. Scher la lame sur une platine chauffante 40C, 10 15 minutes.

Lugol

Dcolorisation

Contre-coloration par la Safranine ou la Fuschine Les tapes 1 et 2 colorent en violet le contenu de la bactrie. Le violet de gentiane se fixe sur les composants cytoplasmiques de toutes les bactries. Le lugol permet de fixer cette coloration interne. L'tape 3 (alcool) sert dcolorer le cytoplasme des bactries qui seront dites Gram ngatives . En effet, celles-ci ont une paroi pauvre en peptidoglycanes - donc plus fine - qui va laisser passer l'alcool (molcule lipophile) ou le mlange alcool-actone, et qui dcolorera le cytoplasme en liminant le violet de gentiane. Au contraire, pour les bactries dites Gram positif la paroi constitue une barrire impermable l'alcool car elle est compose d'une couche de peptidoglycanes plus importante donc de ce fait ; plus paisse. Elles resteront alors violettes. L'tape 4 est une contre-coloration ayant pour but de donner aux bactries Gram ngatives prcdemment dcolores une teinte rose permettant de les visualiser au microscope. Les bactries Gram positif restes violettes seront videmment insensibles cette contre-coloration plus ple que le violet imprgnant leur cytoplasme. la coloration de Gram permet de diffrencier la paroi bactrienne et de scinder les bactries en deux grand groupes: - Gram+ qui ont une paroi de peptidoglycanes paisse (ex : Bacillus cereus) - Gram- qui ont une paroi de peptidoglycanes fine, mais ont en plus une membrane externe lipidique (ex : Escherichia coli). Ces diffrences de coloration et les diffrences de formes (bacille ou cocci) sont l'origine de la classification des bactries.

- Observer

avec une goutte d'huile immersion objectif 100 (grossissement 1000).

Staphylococcus (cocci) en couleur violet (Gram+) X100 a immersion

E.coli (cocco bacille) en couleur rose (Gram-) X100 a immersion

Conclusion :

Compaaison entre les bacteries Gram+ et Gram-

La paroi des bactries Gram positives montre un peptidoglycane pais, jusqu' 80nm d'paisseur, constitu par un empilement de la structure dcrite prcdemment. On note aussi la prsence d'acides tchoques (polymre base de ribitol et glycrol phosphate) qui traversent le peptidoglycane. Certains sont ancrs directement dans la membrane plasmique par l'intermdiaire d'une partie lipidique et portent le nom d'acides lipotchoques. Ces molcules, dont la fonction reste assez floue, montrent une grande variabilit au sein du monde microbien. Ils sont utiliss, comme marqueurs antigniques, pour la classification des streptococcus travers la classification de Lancefield. Remarque : Une bactrie gram + qui perd son peptidoglycane (par action d'antibiotique ou du lysosyme) devient un protoplaste. La paroi des bactries Gram- montre une structure diffrente de la paroi des Gram+. Elles possdent une membrane externe en plus du peptidoglycane (structure commune aux Gram+ et Gram-) qui est ici trs fin puisque sa taille moyenne n'est que de quelques nanomtres avec souvent seulement une ou deux couches de la structure montre plus haut. La membrane externe, qui entoure la cellule (peptidoglycane compris) ressemble une membrane biologique classique : double couche de phospholipides incluant des protines (des porines pour le passage des nutriments par exemple); mais la couche externe de cette membrane externe contient une molcule particulire : le LPS ou LipoPolySaccharides ou encore endotoxine. Le LPS est spcifique des bactries Gram ngatives. Comme son nom le laisse penser, le LPS possde une partie lipidique : le lipide A. Cette partie hydrophobe possde aussi l'activit toxique que montre la molcule (provoque la fivre par exemple). Le reste de la molcule est uniquement glucidique avec la partie centrale ou core (nombreux glucides rares avec 7 carbones par exemple) et la partie la plus externe ou Antigne O. L'antigne O est trs variable chez les Gram-, cette diversit est par exemple utilise pour le srotypage des Salmonella. La membrane externe cre une barrire impermable, comme la membrane plasmique, qui dlimite, enferm par ces 2 membranes, l'espace priplasmique. Il contient de nombreuses enzymes.