ELECTROPHORESE

PRINCIPE GENERAL

• Séparation d’espèces
chargées contenues dans ANODE CATHODE
POLE POLE (-)
un électrolyte. (+)

• Les espèces migrent

E
grâce à un champ
électrique. GENERATEUR

Le champ électrique est créé

par deux électrodes reliées à un
générateur de tension continue.
Les ions sont attirés par
l’électrode de potentiel opposé à
leur charge.

Les cations → la cathode (pôle -).

ANODE CATHODE
POLE POLE (-)
Les anions → l’anode (pôle +). (+)

Les substances neutres ne

subissent pas l’action du champ E
électrique.
GENERATEUR

Les espèces ne se déplaçant pas

à la même vitesse → séparation.
Espèces analysées en électrophorèse :

• Minérales ou organiques.

• De la taille d’un ion simple comme F- (on parle

d’ionophorèse) ou de celle d’une macromolécule
(comme les protéines).

• Chargées dans les conditions de l’expérience.

 1. MOBILITE ELECTROPHORETIQUE DES
ESPECES CHARGEES

• Mobilité électrophorétique = déplacement de l’espèce sous

l’action du champ électrique.

• Mobilité = distance parcourue par l’espèce pendant 1 s sous

l’action d’un champ électrique de 1 V.m-1 .

• La mobilité dépend :
- de la charge,
- de la taille (si le milieu dans lequel s’effectue cette
migration est poreux),
- de la viscosité du milieu.
Ions minéraux simples : leur charge dépend de leur degré
d’oxydation.

Exemple : Fe2+ , Cr3+ , F- …

→ mobilité électrophorétique =

μ = q/6πηr

Avec q = charge de l’ion

η = viscosité du milieu
r = rayon
• Une macromolécule organique possède
de nombreux groupements ionisables.

• Certains seront chargés positivement et

d’autres négativement au pH de
l’expérience.
La molécule porte une charge
propre globale Q
+
- - Elle attire en
+
- + + - surface les ions de
- -
+ charges opposés
+ - - qui forment la
-
- - couche liée (avec le
- + +
+ - - solvant).
-
- - -
+ -
- +
+ - - Cette couche liée
+
perturbe aussi la
répartition des
autres ions en
L’ensemble surface. Ils
forme la couche forment la couche
double diffuse.
Conséquences :
• C’est l’ensemble molécule + couche double qui
se déplace.
• On parle de potentiel électrocinétique ζ’ qui
apparaît à la surface de la macromolécule
solvatée.
• Il dépend :
- De la structure de la molécule.
- De l’électrolyte qui la contient par sa
composition.
• La mobilité électrophorétique vaut
alors :

μ = ζ’ε/6πη

Avec ε = constante diélectrique du

milieu
η = viscosité du milieu
POINT ISOIONIQUE ET ISOELECTRIQUE

• C’est dans les deux cas le pH pour lequel la mobilité

électrophorétique est nulle.

• Dans l’eau pure → point isoionique.

5,37 pour l’albumine

• Dans un milieu complexe → point isoélectrique.

4,4 pour l’albumine dans du NaCl 0,15 M
2. ELECTROPHORESE DE ZONE
La migration s’effectue sur un support horizontal ou vertical,
imprégné d’un électrolyte tampon.

Le système est fermé pour éviter l’évaporation.

Les deux bornes sont reliées à un générateur de tension continue.
La tension imposée est supérieure à 100 V.
→ L’intensité du courant électrique est de quelques mA.
 2.1 LE SUPPORT
• Milieu poreux.
• Bande de papier filtre ou d’acétate de
cellulose.
• Gel minéral ou organique comme le
polyacrylamide (permet en plus une
filtration suivant la taille).
 2.2 MODE OPERATOIRE

Dépôt de l’échantillon :
- Sous forme d’un trait transversal sur la
bandelette.
A l’intérieur de puits aménagés lors de la fabrication du gel.
→ analyse de différentes fractions en même temps.
Migration :
- Suivant le pH et la composition du milieu, les
molécules vont acquérir un potentiel
électrocinétique.
- Elles migrent en direction de l’électrode de signe
opposé.

- On applique la tension pendant un temps assez

court pour éviter la diffusion dans le milieu
poreux.
• Après la migration et la révélation, on obtient
l’électrophorégramme.
• On y observe les différentes bandes
correspondantes aux molécules séparées.
Procédés de révélation :
- Réactif colorant.

- Observation sous UV
avec un densitométre
(après avoir rendu le
support transparent).
3. ELECTROPHORESE
CAPILLAIRE
 La migration électrophorétique
s’effectue dans un tube capillaire (15
à 150 micromètres de diamètre et
35 à 100 cm de longueur). La détection des molécules se fait
grâce à un système placé sur le
trajet : ce peut être un détecteur
UV ou des électrodes.

Les potentiels employés sont de

Le tube capillaire plonge à ces l’ordre de 10 à 30 kV.
deux extrémités dans la
solution d’électrolyte.
 3.1 LE FLUX
ELECTROOSMOTIQUE
 La paroi interne du capillaire se polarise négativement à
cause des groupements silanols qui s’ionisent quand le pH
est supérieur à 3.

Il y aura donc une

accumulation de charge
positive au contact de cette
paroi, créant une véritable
enveloppe autour de
Cathode
Anode Sous l’effet du champ
l’électrolyte.
électrique, on observe un
déplacement d’ensemble,
à vitesse constante, du
milieu vers la cathode (-)
→ flux électroosmotique

Toutes les espèces (chargées ou non)

subissent ce mouvement.
Molécule chargée positivement :

Flux
Anode
+ + électroosmotique - Cathode
Mobilité électrophorétique de
l’ion

Déplacement électrophorétique (en direction de la

cathode) et flux électroosmotique ont la même
direction,
→ les deux mouvements s’additionnent et l’espèce est
accélérée.
Molécule chargée négativement :

Flux
Anode
+ - électroosmotique - Cathode
Mobilité électrophorétique de
l’ion

Déplacement électrophorétique (en direction de l’anode)

opposé au flux électroosmotique,
→ l’espèce est ralentie.
Les molécules neutres ou à leur point isoélectrique
se dirigeront vers la cathode à la vitesse du flux.

Cette technique est intéressante pour l’analyse des

cations puisque leurs vitesses de déplacement
seront bien différenciées.
On peut inverser le flux en plaçant dans
l’électrolyte un tensioactif cationique qui
apportera une polarité positive en surface.
• Il faut cependant veiller au sens de polarisation du
capillaire pour que :

- L’introduction de l’échantillon s’effectue du même coté.

- Les anions migrent bien en direction du détecteur.

• Cela permet l’analyse performante et très rapide des

anions qui sont accélérés par l’action des deux
phénomènes.
3.2 INTRODUCTION DE L’ECHANTILLON
• Comme les espèces migrent en général dans le même
sens (vers le détecteur), on effectue le dépôt au niveau
opposé.
• On peut se contenter de quelques nano litres que l’on
fait pénétrer dans le capillaire par différentes
techniques :
- En trempant le capillaire dans l’échantillon et en
surélevant l’ensemble : l’échantillon est ainsi siphonné
(injection hydrostatique).
- Par aspiration par l’autre extrémité (injection
hydrodynamique).
- Par mobilité électrophorétique (injection par
électromigration) qui est discriminatoire.
 4. TECHNIQUE DERIVEE : LA FOCALISATION
ISOELECTRIQUE

• Applicable aux deux techniques.

• Cela consiste à créer un gradient de pH dans le

capillaire ou sur le support (EZ)
• Sous l’action du
champ électrique, les
molécules migrent
jusqu’à la zone où le pH
est égal à leur pI.
• Elles restent à ce
niveau puisqu’elles ne
subissent plus les effets
du champ électrique.
• Cela permet de lutter
contre la diffusion.
• Utiliser pour les
espèces amphotères.
5. APPLICATIONS
Analyse de protéines sériques (identification et
dosage des protéines du sérum)
 Détermination des propriétés des
molècules
- Leur point isoélectrique.

- Leur poids moléculaire (par comparaison

des mobilités avec celles de standards de
masses moléculaires connues).
Séparation et dosage d’espèces
organiques ou ioniques.