Microorganismes producteurs de molécules d’intérêt

TP N°1
DETERMINATION DE LA SENSIBILITE DE LA BACTERIE AUX
ANTIBIOTIQUES

Objectifs
1- Connaitre la notion de l’antibiogramme et son intérêt
2- Réaliser un antibiogramme standard (méthode de diffusion) in vitro
3- Connaitre les notions des CMI, CMB ;

I. Antibiogramme

I.1.Définition
L’Antibiogramme standard est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un ou plusieurs
antibiotiques par la technique de diffusion sur milieux gélosé. Il a pour but de prédire la
sensibilité d’un germe à un ou plusieurs antibiotiques dans une optique essentiellement
thérapeutique. Il sert également :
- À la surveillance épidémiologique de la résistance bactérienne ;
- À l’identification bactérienne par la mise en évidence de résistances naturelles.

I.2. Principe

La culture bactérienne est ensemencée à la surface d’une gélose Mueller-Hinton. Des

disques pré-imprégnés d’une dose connue d’antibiotique sont déposés à la surface de la
gélose. L’antibiotique diffusehorizontalement et verticalement à partir du disque en créant un
gradient de concentration minima inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de
la souche bactérienne en seront déduits.

I.3. Mode opératoire

1. Préparation de
2. l’inoculum
· A partir d’une culture bactérienne jeune de 18 à 24 h, préparer une suspension de 1 à 2
colonies dans un tube contenant 05 mL d'eau physiologique stérile. Homogénéiser
soigneusement la suspension.
·Ajuster l’opacité de la suspension de manière à obtenir une densité optique comprise entre
0,08 à 0,1 pour une longueur d’onde de 625 nm (environ 10 8 UFC/mL) (0,5 McFarland).
3. Ensemencement de la gélose Mueller-Hinton
· Dans les 15 minutes suivant l’ajustement de la turbidité de l’inoculum, tremper unécouvillon
dans cette suspension.
· Presser fermement contre la paroi intérieure du tube juste au-dessus du niveau duliquide,
tourner l’écouvillon pour enlever le liquide excédentaire.
· Etaler à trois reprises sur la surface entière de la gélose, en tournant la boite à environ60°
après chaque application afin d’obtenir une distribution égale de l’inoculum.
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· Appliquer les disques d’antibiotiques sur les boites de Pétri à une distance de 30 mm dès que
possible à moinsde 15 minutes après l’ensemencement à l’aide d’une pince stérile.
· Incuber les boites à 37°C pendant 18 heures

NOTE : Parce qu'une partie du médicament se diffuse presque instantanément, un disque ne

doit pas être déplacé une fois qu'il a été en contact avec la surface de la gélose.
Au lieu de cela, placez un nouveau disque dans un autre emplacement sur la gélose.

1.4. Lecture et interprétation

- Mesurer avec précision les diamètres de chaque zone d’inhibition en mm, et classer la
bactériedans l’une des catégories : sensible, intermédiaire ou résistante (Tableau 1).

Tableau 1 Concentrations, diamètres critiques et règles de lecture interprétative pour les

Enterobacteriaceae

Diamètres critiques
Antibiotique (symbole) (mm)
S I R
Ampicilline AMP ≥ 17 14-16 ≤13
Amikacine AK ≥ 17 15-16 ≤14
Céfazoline KZ ≥ 23 20-22 ≤19
Acide nalidixique AN ≥ 19 14-18 ≤13
Céftazidime CAZ ≥ 21 18-20 ≤17