Biologie cellulaire eucaryote – cours 1

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Moodle : Notre œil peut voir a l’échelle du mm, on zoom jusqu’au grain de sable, puis les amibes,
paramécie on doit prendre le MO. Toutes les cels n’ont pas la meme taille mais on est dans une
échelle cellulaire, on zoom encore pour arriver a des macromolécules. Mais cela nécessite d’utiliser
des machines.

DIAPO 2Vidéo.

DIAPO 3Éléments considérés comme acquis.

DIAPO 4 et 5Chapitres du cours.

DIAPO 6L’information arrive de l’extérieur de la cel par des récepteurs.

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Tp viennent a l’appui des cours. Généralement sont bien synchronisés.

La microbiologie est définie par l’échelle du micron (bactérie), défini par leur utilisation du
microscope. La biologie cellulaire est liée étroitement a un autre outil : le MET qui permet de
regarder a l’int de la cel. Cette discipline est liée a l’échelle cellulaire.

On va interpréter des images de MET. Il y a des MET a l’UPVD (et à Montpellier) mais sont manipulés
par des techniciens formés. Les étudiants ne peuvent pas les toucher. Ici ce sont des matériaux qui
sont utilisés par les physiciens. On peut demander a des entreprises de nous faire des images, mais
c’est à nous de les interpreter correctement.

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Pour cela il faut comprendre comment fonctionne ce MET.

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A partir d’en dessous d’1 µm on a besoin du MET (dont la résolution échelle du nm)

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Ca fonctionne comme un MO mais a la place des lentilles en verre on a des aimants qui vont
concentrer des faisceaux a particules et notamment des électrons. Depuis les années 30, on peut
utiliser ces microscope. Le grand essor des ME arrivent de ces années-là.

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Au microscope électronique on doit d’abord préparer les échantillons. Il y a

une préparation qui nécessite une coloration virtuelle, ce n’est pas avec des
couleurs. On a notre plateau sur lequel on dépose notre échantillon, on dépose
le colorant, on le colore par des métaux lourds(ex osmium). L’eau s’évapore
(ou le solvant). On peut aussi entourer l’échantillon d’un composé, ou on
utilise une lamelle en cuivre, et on peut l’entourer dans une glace ou des
polymères contenant ces colorants. On a des plasmides sur lesquels se fixent
l’uranium, donc on peut obs l’ADN ainsi on est presque a une échelle
moléculaire.
Ce traitement est très dur, aucune cel ne survit a ce traitement en étant déposée sur une matrice,
fixée et colorée par des métaux lourds. On obs donc des cadavres de cels en réalité. C’est un
désavantage : on peut regarder à l’int mais les cels ne restent pas vivantes.

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Comment est générée l’image ? les électrons qui arrivent vont etre déviés par les noyaux des atomes,
car ils passent a proximité. Plus ils sont proches, plus ils sont déviés : on parle de diffusion élastique.
Plus ils sont près, plus le noyau est lourd : c’est comme la gravité, la diffusion élastique est plus
grande si ces électrons passent près et si ces noyaux sont lourds. Cette diffusion est utilisée pour
former une image

Les électrons qui passent a travers vont dans un écran ou une plaque photographique pour laisser
une trace, alors que les électrons déviés ne laissent pas de trace car ne touche pas la plaque
photographique.

Pour les échantillon biologie on a des atomes léger (carbone, hydrogène, oxygène, azote…) : si on ne
prépare pas les échantillons, les électrons passent a travers comme un couteau dans le beurre, donc
tt les électrons passent a travers la plaque alors tout est noir ou tout est blanc, on n’a pas de
contraste. Donc besoin d’ajouter des noyaux lourds, les atomes lourds on n’a pas l’habitude de les
trouver dans les échantillon biologiques donc on doit les ajouter !

Le colorant le plus utilisé aujourdhui est l’osmium tétroxyde.

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A plus grande échelle, les électrons arrivent, ils sont focalisés avec ce système de lentilles
magnétiques sur l’échantillon, ce dernier contient cet osmium tétroxyde, les électrons sont déviés
lorsqu’ils sont près des noyaux d’osmium tétroxyde, ceux qui sont déviées sont empêchés d’arriver
sur la plaque photographique grâce au diaphragme de contraste. Si on l’ouvre complètement tous les
électrons passent, mais quand il est + fermé peu d’électrons arrivent car ne sont pas déviés et étaient
loin des noyaux d’osmium tétroxyde. Ca produit une image. On ne voit pas la présence de
biomolécules mais la présence d’osmium tétroxyde, quand c noir y a bcp d’osmium quand c blanc il y
a peu d’osmium tétroxyde. Ca devrait etre le contraire car les électrons c comme les rayons du soleil,
si bcp d’entre eux arrivent d’un coup on aurait qq chose de blanc, mais on utilisait un tirage,
permettant d’inverser les couleurs.

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On utilise une capacité de l’osmium tétroxyde de se fixer sur certaines biomolécules. 1 er constat : sur
les épaisseurs sur lesquels on travaille, 100µm a peu près pour l’échelle moléculaire, tt les électrons
passent a travers ils ne sont pas déviés car les noyaux sont trop légers, donc ça ne nous donne pas de
contraste. Ce contraste est aussi appelé absorption, c’est en ft une déviation des rayons plutôt. C’est
une image créée grâce à ce diaphragme de contraste. Certains électrons transmis n’arrivent pas
jusqu’aux détecteurs car ils sont stoppés par ce diaphragme de contraste.

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Pour palier a ce pb de non-déviation par des noyaux des biomolécules, on introduit cette coloration
avec osmium tétroxyde. L’osmium est lipophile, il a tendance a se fixer sur les mb. Meme si on ne
comprend pas complétement comment il interagit, on sait qu’il agit avec des lipides insaturées et
deux aa : le trp et l’his. aa = on les retrouve dans les protéines. Donc si une protéine ne contient ni his
ni trp elle ne sera pas colorée ou très peu.
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Tt ce qui est hydrocarbure ca ne se fixe pas, par ex-polymère de sucre, glycogène, amidon, c invisible
(donc blanc).

En s’attachant sur les protéine l’osmium va les fixer, il les rend insoluble, y a bcp d’étapes de lavage
pour enlever tt l’osmium tétroxyde donc les protéines restent stables. Ca préserve aussi les
phospholipides qui restent fixées sur place, donc ne bougent pas. Mais préserve mal les acide
nucléique et polymère de carbone. Les acides nucléiques on les retrouve rarement sans protéines
associées dans les cels. Les acides nucléiques ne sont pas colorés (donc apparaissent blanc, l’osmium
tétroxyde ne se fixe ni sur l’ADN ni sur l’ARN SEULES).

On ne voit que les traces de métaux lourds sur le MET, donc il convient de savoir dans quel mol on
aura cette coloration. L’osmium tétroxyde se fixe sur les mb et les protéines, mais pas sur l’ADN et
l’ARN, ni sur le sucre et polymère de sucre.

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Donne ce tableau-là. Phospholipide = noire, protéine (dépend de la compo° en aa) = noir/gris foncé,
sucre et polymère de sucre = blanc, ADN/ARN = blanc (meme s’il n’est jamais seul dans une cel, donc
apparaissent noir, mais dans la cel ! par ex quand sont purifié dans tube d’Eppendorf). ADN associés
a protéine et ARN associées a des protéines (ribosomes) = gris (blanc + noir). Choses à retenir !

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Avec la coloration de l’osmium tétroxyde on peut colorer certaines structures de la cel, les localiser,
et ca renseigne aussi sur sa composition. Si y a bcp de l’osmium tétroxyde c soit des lipides soit des
protéines, et si y a peu, ce sont des sucres ou acides nucléiques, ou rien du coup.

Bacillus. On a les phospholipides filiformes, avec 10 nm d’épaisseur. En 2, polyhydroxybutyrate,

polymère d’acide butyrique, c’est blanc car mol contenant bcp de carbone.

Les petits gris sont les ribosomes en 3.

4 : le nucléoïde, chromosome bactérien.

5 : protéines dans la paroi, cel wall.

6 : ces différents niveaux de gris pourraient etre des phospholipides mais les phosopholipides étant
des mb ils seraient filiformes, les mb ont toujours des épaisseurs faibles, mais ici c’est plus, ce sont
les protéines avec un mélange d’autre chose, ca pourraient etre des plasmides etc. = le cytoplasme.

7 : le mésosome. Il est très noir donc soit phospholipides et/ou protéines. Il pourrait etre une
précipitation d’osmium tétroxyde (donc pb de fixation), on sait pas trop ce que c’est, ca pourrait
donc etre un artefact de cette fixation. Donc garder ça en tete !

Rappel : on voit que l’osmium tétroxyde pas les vrais choses.

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Image générée de la mitochondrie. On regarde la taille, a peu pres 2 µm de large. Double trait, donc
fortement colorée en osmium tétroxyde, il s’agit donc de phospholipides (donc mb), on obs les
mêmes structures a l’int. Double trait séparées de 10 nm, donc des doubles mb certainement car
sont très colorées (noir).
Dans les livres on retrouve ce genre de schéma, avec la mb interne et externe. C’est une
reconstitution intellectuel a partir de ces images, donc personne ne peut voir des mitochondries
comme ça. Dans les vidéos on voit ca mais personne ne peut voir ces images-là. En TP il faut
reconstruire des images, mais on ne le voit pas. Ici on ne voit pas une mitochondrie mais une
projection. J’observe + je décris / je constate + je déduis/reconstruit.

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Quelques colorations, spécifiques pour certaines structures on parle de contraste négatif. Les virus
sont très petit. Sont déposées sur une surface, on les colore juste assez pour que les trous entre les
glycoprotéines soient remplis. On peut avec un traitement de superposition de plusieurs images pour
reconstruire ces protéines de surface. Par ex pour le sars cov 2.

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Ensuite ce contraste négatif peur etre utilisé aussi pour des bactéries. Ici bactérie coupée en lamelle
pour colorer l’intérieur avec l’osmium, on peut le déposer sur le support directement et faire une
coloration extérieure. Permet de voir sur l’image ces structures faiblement colorés qui sont les pilis.

MEB, nécessite une coloration avec des métaux lourds aussi. Les faisceaux d’electrons vont balayer la
surface et reconstruire une image grâce a un ordinateur pour avoir une image en 3D.

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Pour mieux cibler certaines protéines on peut utiliser des petites particules d’or, avec un diamètre
défini (5 ou 10 nm). Ils sont couverts par une protéine A, qui a la capacité de se fixer sur n’importe
quel anticorps. On peut incuber nos coupes d’objets biologiques (par ex bactérie) avec un anticorps
primaire qui va se fixer sur certaines protéines qui nous interssent et pour le rendre visible sur le ME,
on le lave et ajoute ces billes d’or couvertes de ces protéines qui vont se fixer sur ces anticorps.

Ce diamètre nous permet d’utiliser un deuxieme anticorps qui se fixe sur une autre protéine, donc
utiliser une deuxieme taille apres avoir enlevé tout ce qui ne s’est pas fixé. On peut donc utiliser 2nm
ou 20 nm pour encore détecter d’autres protéines. Ensuite il faut colorer en + avec l’osmium
tétroxyde pour rendre visible les autres structures. L’or possède aussi un noyau lourd, donc apparait
noir. y a deux tailles différentes. La coloration en haut montre qu’il y a deux mb (on est chez E coli qui
est gram – donc possède deux mb), l’or s’accumule dans l’espace périplasmique, donc protéine
exportée du cytoplasme vers la mb extérieur. Permet donc de localiser les protéines.

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Pour terminer, ces images sont des reconstructions, il y a des travaux d’interprétations, dans les
livres on voit cette interprétation de la cel qui change, avec les années (20’s vs 2010 c diff, car notre
connaissance sur les cels a changer).

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Livres sur la MET. Images et techniques. Dans ces livres on trouve tt les reponses aux questions qu’il
va poser a l’exam !