PM_TP_Parasisologie

DIAGNOSTIC MEDICAL
Travaux pratiques de LA REFLEXION DU
LES PROBLEMES DU PATIENT
Parasitologie MEDECIN

IMAGERIE
LE DIAGNOSTIC
DIFFERENTIEL
LABORATOIRE
DE BIOLOGIE
Service de Parasitologie MEDICALE

Université de Kinshasa EPREUVES

FONCTIONNELLES

1 2

DIAGNOSTIC DIFFERENTIEL TYPES DE DIAGNOSTIC

Compte tenu du contexte
Diagnostic de certitude

épidémiologique La démarche

Diagnostic de quasi-certitude
diagnostique évalue toutes les
éventualités nosologiques concurrentes,
Diagnostic de présomption
y compris les parasitoses. C’est le
diagnostic différentiel.

On ne peut procéder que par élimination.

3 4

DIAGNOSTIC DE CERTITUDE DIAGNOSTIC DE CERTITUDE

Le diagnostic de certitude est obtenu par
Ce diagnostic consiste à rechercher les

la preuve de l’infection. protozoaires partout où ils sont

Celle-ci est apportée par l’identification susceptibles de se trouver :
formelle du parasite, soit :
peau, sang, lymphe, LCR, intestin

macroscopiquement (Helminthes) (épithélium, matières fécales), espace
interstitiel (moelle osseuse, rate, foie,

microscopiquement poumon, etc), et cavités organiques (urètre,

par les techniques de Biologie moléculaire vagin, fosses nasales, bouche, duodénum,
(antigènes, ADN ou ARN). rectum, tractus bronchique. etc).

5 6
PM_TP_Parasisologie

RELATION DE CAUSALITE RELATION DE CAUSALITE

Existe-t-il une relation de cause à
Pour maintenir ou imposer le

effet ? diagnostic causal retenu, d’autres
critères sont requis, notamment :

L’espèce parasitaire
Diagnostic Diagnostic
l’intensité de l’infection (effet de
parasitologique clinique masse),

La disparition des signes
pathologiques après une épreuve
thérapeutique spécifique
7 8

SYNDROMES CLINIQUES Syndromes cliniques

Il existe de nombreux syndromes cliniques
qui impliquent la recherche d’une parasitose
9 10

Adénopathie, fièvre, anémie, cardiopathie,
pneumopathie, gastrite, entérite, cirrhose
hépatique, dermatose, douleur abdominale
(hypochondre droit, épigastre, fosse iliaque
droite, etc), malnutrition, atteinte oculaire,
dysenterie, IST, hépatomégalie,
splénomégalie, masse abdominale, méga-
organe, encéphalopathie, tumeur cérébrale,
médullaire, méningite à éosinophile,
méningite lymphocytaire, neuro-psychique,
etc

ADENOPATHIE ANEMIE

Plasmodium falciparum

Toxoplasma gondii

T.b.gambiense

T.b. gambiense

T.b.rhodesiense

T.b.rhodesiense

Ankylostoma

Schistosoma sp

11 12
PM_TP_Parasisologie

FIEVRE SYNDROME D’ENCEPHALOPATHIE

Plasmodium sp
Plasmodium falciparum

Entamoeba histolytica
Trypanosoma gambiense

Trypanosoma
Trypanosoma rhodesiense

Leishmania
Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii
Toxocara sp

Babesia
Schistosoma sp

Pneumocystis carinii
Loa loa

Schistosoma sp
Trichinella spiralis

Fasciola
13 14

TUMEUR CEREBRALE ATTEINTE MEDULLAIRE

Echinococcus granulosus
Echinococcus

Taenia solium granulosus

Multiceps multiceps

Schistosoma sp

Naegleria fowleri

Acanthamoeba
Taenia solium
culberstoni
Dracunculus

Entamoeba histolytica medinensis

Armillifer sp

15 16

MENINGITE LYMPHOCYTAIRE
MENINGITE A EOSINOPHILE

Heterophies
T.b. gambiense

heterophies
T.b. rhodesiense

Toxocara sp

Plasmodium

Hypoderma bavis falciparum

Angyostrongyloide
s cantonensis
Naegleria fowleri

Strongyloides
stercoralis
17 18
PM_TP_Parasisologie

DIAGNOSTIC DE CERTITUDE MICROSCOPIE

Microscopie
Selles

Biologie moléculaire
Urines

Sang

LCR

Transsudat

Exsudat

Tissus
19 20

TP DE PARASITOLOGIE Introduction

Permet de mettre en évidence le (ou les) parasite(s)

ds 1 ou +++ stades de dé
développement

Examen des selles
3 aspects à considé

considérer :
 Temps de pré
prélèvement et conservation des selles
 Examen macroscopique (aspect ou consistance, l’l’odeur, le
contenu…
contenu…)
 Examen microscopique : selles fraî
fraîches, ex. aprè
après
concentration (flottation, mé
méthode de Baermann,
Baermann,
sédimentation), ex. aprè
après coloration (Kinyoun
(Kinyoun,, Kato Katz…
Katz…)

21 21 22 22

1. Pré
Prélèvement & Conservation des selles 1. Pré
Prélèvement & Conservation des selles

 A ne pas faire:

Conditions de pré
prélèvement :  recueillir ou conserver les selles ds un

La qualité
qualité du ré
résultat maté
matériel absorbant :boite d’d’allumettes,
carton, papier, linges

Conditions dé
dépendent:

malade

parasite recherché
recherché  Si l’l’examen est diffé
différé:

Maté
Matériel utilisé
utilisé  garder les selles au ré
réfrigé
frigérateur à 4°c ou
 ajouter un conservateur( produit qui
Ex: - le pré
prélèvement doit se faire avant la mise en route bloque la fermentation sans toutes fois
du traitement
alté
altérer la pré
préparation) ex: formol, SAF,
MIF…
MIF…
- pas de contact (e) urine et selles ( alté
altération des
formes vé
végétatives des protozoaires) 
23 23 24 24
PM_TP_Parasisologie

2. EXAMEN MACROSCOPIQUE 2. EXAMEN MACROSCOPIQUE

Observation visuelle & olfactive:

Consistance:

selles moulé
moulées,

molles,

diarrhé
diarrhéiques,

aqueuses,

dysenté
dysentérique

Odeur : nausé
nauséabonde, sans odeur…
odeur…

Contenu: dé
débris vé
végétaux, glaire, crachat,
sang, segments de vers ou vers adultes…
adultes…

25 25 26 26

3. EXAMEN MICROSCOPIQUE 3. EXAMEN MICROSCOPIQUE

Ex direct des selles

Principe: examen microscopique des
Examen direct des selles
selles entre lames & lamelles sans
manipulations au pré
préalable Nbre d’œufs/pr
’œufs/pré
éparation Notation semi-
semi-qttive des ré
résultats

NB : 1à2 Rares

si selles liquides: examiner directement 3à9 +

Si selles muqueuses et/ou sanglantes: 10 à 19 ++
pré
prélever la partie muqueuse pour l’l’examen

Examiner à l’obj 10x,40x 20 à 29 +++
30 et plus ++++

Examen systé
systématique d’
d’une lamelle de
20x20 mm repré
représente ± 2 mg de selles
27 28
27 28

3. EXAMEN MICROSCOPIQUE 3. EXAMEN MICROSCOPIQUE

29 29 30 30
PM_TP_Parasisologie

3. EXAMEN MICROSCOPIQUE 3. EXAMEN MICROSCOPIQUE

31 31 32 32

3. EXAMEN MICROSCOPIQUE

33 33 34

3. EXAMEN MICROSCOPIQUE 4. Mé
Méthodes de concentration
(MC)

Technique de flottation (mé

(méthode
modifiée) :
de Willis modifié

Principe:

les selles sont dilué
diluées dans un liquide à forte
densité
densité. Les parasites les plus lé
légers remontent à
la surface.

Parasites visibles:

Kystes & oocystes de protozoaires

œufs d’
d’helminthes( cestodes & né
nématodes )

NB: pas des tré
trématodes en raison de leur poids
élevé
levé.

35 35 36 36
PM_TP_Parasisologie
MEHODE DE FL0TTATION DE WILLIS
Technique

Délayer et
homogénéiser 2g
de celles dans 10ml
d’une solution
saturée de NaCl ;
(2) Mélange
avec selles
MEHODE DE FL0TTATION DE WILLIS
 Technique:

Remplir complètement le tube ou
flacon jusqu’à obtenir un ménisque
liquidien à la surface duquel on
dépose une lame(ou lamelle) porte-
objet.

Laisser reposer durant au moins 15
minutes
4. MC: TF
 Mode opératoire:
 Suspendre 5 g de selles ds 100 ml d’une sln saturée de NaCl
(ou ZnSO4)
 Homogénéiser la suspension (tamiser la suspension si
nécessaire à travers un tamis de thé)
 Verser la suspension dans un tube à essai à ras bord
 Appliquer une lamelle sur l’ouverture du tube
 Après 30 min, transférer la lamelle (tjrs en position
horizontale) sur la lame
 Observer systématiquement au microscope
37 38
38
Technique

Tamiser la dilution
fécale s’il existe des
(1)
Willis
débris trop grossiers à
travers la couche de
gaze
39 40
METHODE DE FL0TTATION DE WILLIS
 Technique:
Ménisque

Retirer la lame porte-objet et
recouvrir le liquide (film) entraîné
avec une lamelle couvre-objet ;

Examiner au microscope à l’objectif
10X puis 40X ;
N.B. : Cette méthode est sélective pour les œufs
d’Ankylostomes et d’hymenolepis
41 42
PM_TP_Parasisologie

METHODE DE FL0TTATION DE WILLIS 4.MC: TF

Limites de la technique de Willis modifié
modifiée:

elle ne permet pas parfois de distinguer

Avantage :
espèces (E. histolytica/
certaines espè histolytica/ dispar versus

Simplicité E. coli ; petits protozoaires); d’
d’où le recours à
des colorations spé
spéciales

Matériel rudimentaire ;

Possibilité d’examen en série (enquête
distorsion des kystes et des œufs si le contact
avec le zinc est prolongé
prolongé
épidémiologique)

Contre-indication :

Selles riches en lipides ou huile minérale ;

43 44

5. MC: Méthode de Baermann Technique de Baermann

Principe :

Elle est basé
basée sur l’l’hygrotropisme et le
thermotropisme positifs des larves
d’anguillules

Elle n’
n’est applicable ni sur les selles
liquides ou diarrhé
diarrhéiques, ni sur les selles
fixé
fixées, ni sur les selles vieilles de plus de
5h

45 46 46
45

5. MC: Méthode de Baermann

5. MC: Méthode de Baermann

 Mode opératoire:  Mode Opératoire:

 Mettre ± 20 g ds une passoire pointue(chinois) &  Recueillir ±10 ml du fond de l’entonnoir ds

tapisser par 2 couches de gaze un tube à centri

 Déposer la passoire ds un entonnoir en verre relié à  Centrifuger pdt 10 min à 2000 T/min
un tuyau en plastic fermé par une pince à clamper

 Décanter le surnageant et déposez le culot

 Remplir l’entonnoir d’eau tiède (30 à 35°c), jusqu’à sur une lame PO et recouvrir d’une lamelle
immerger complètement les selles CO
 Attendre 6h ou 1 nuit pour que les larves remontent ds
l’eau  Lecture au microscope à obj.
obj. 10x et 40x

47 47 48
PM_TP_Parasisologie

5. MC : Méthode de Baermann modifié

modifiée MC: Technique de sé
sédimentation: Technique de Ritchie

Remplacement du passoire par:
Principe:

tube à essai avec bouchon en caoutchouc perforé pour
permettre l’insertion d’une pipette

Qtté des selles +petite

Limites de la technique de Baermann:

Possibilité de contamination par les formes libres

Mode opératoire :
contenues dans l’eau:

Ces derniers sont moins résistant à une faible

Dilution des selles dans un liquide à faible densité (eau
physiologique).

Ceci entraine une concentration de tous les types d’œufs
et larves d’helminthes & kystes de protozoaires

Suspension ~ 3 g de selles ds 42 ml de NaCl 0,9%
formolée

acidité (distinguer les formes libres des formes

parasitaires)
Après homogénéisation(~ 30min ), verser ~ 1,5ml de
cette suspension ds un tube à centri à fond conique

Pas d’application sur des échantillons fixés ou gardés
Ajouter ~ 3,5 ml du NaCl 0,9% puis 5ml d’éther ou
+++ d’essence de voiture
49 50
50

DIPHASIQUE DE SEDIMENTATION AU
DIPHASIQUE DE SEDIMENTATION AU FORMOL– ETHER DE RITCHIE
FORMOL– ETHER DE RITCHIE

Technique :
 Mode opératoire: 

Filtrer à travers une couche de gaze

Délayer ~2g des selles hydrophile et laisser sédimenter 1
minute ;
dans 10ml de Filtrat de selles

centrifuger à 1500 tpm par min pdt 5 min
formaline (ou sln + formaline

physiol)

51 52

Technique Technique

Eliminer le surnageant, resuspendre
Mettre le dernier culot en Formol 10%

le culot dans 10ml de Formaline (sln Culot

physio) ; Formaline
suspension dans 5 ml de

Centrifuger à nouveau ; Culot formol à 10%
recommencer cette opération 3 ou 4 Ether
fois jusqu’à ce que le liquide soit
Ajouter 3ml d’éther, bien Formol
clair boucher le tube et agiter Culot

vigoureusement

Centrifuger à 1500 tpm pdt 2

min
53 54
PM_TP_Parasisologie

Technique Technique

Ether
Décoller l’anneau gras à l’aide d’une

On obtient 4 couches
l’interface baguette et décanter les 3
(couche supérieure
premières couches ;
d’éther, anneau gras à Formol

Examiner une couche du culot entre
l’interface entre l’éther et
Culot parasite lame et lamelle au grossissement
le formol, une couche de
100X puis 400X.
formol, et le culot) ;

55 56

MC: Technique de Ritchie

DIPHASIQUE DE SEDIMENTATION AU FORMOL–
ETHER DE RITCHIE
Limites:

Nécessité de la coloration spécifique pour

l’identification de certains parasites
 Avantage :

Partir d’une masse volumineuse de selles,
Si on recherche les oocystes de

simplicité Cryptosporidium:

il faut centrifuger à 500 tours/min pdt au moins

Matériel rudimentaire 10 min

Certains parasites (G. lamblia, œufs

d’ankylostome et Trichocéphale) se
concentrent mal lorqu’on utilise d’autres
conservateurs que le formol

57 58

5. Coproculture: Technique d’
d’Harada-
Harada-Mori

 Principe:
 Technique moins sensible qui permet de cultiver les larves
d’anguilllules et d’Ankylostomes

 Mode opératoire

 Etaler ~ 0,5 g à 1 g des selles fraiches au centre d’un whatman (30

sur 150 mm), en laissant intact les 5 cm à chaque extrémité

 Remplir le tube de 3-4ml d’eau distillée ds 1 tube conique de 15 ml

 Insérer le whatman ds le tube et fermer avec cellophane ou gaze

 Maintenir le tube dans un rack entre 25° et 30°c pdt 10 jours

 Formation du culot au bout du tube

 Examiner le culot entre lames et lamelles au microscope obj.

10x,40x

59 59 60
PM_TP_Parasisologie

5. MC: Technique H-
H-M

Diagnostic diffé
différentiel des larves
5. Techn de Harada-
Harada-Mori
Strongyloï
Strongyloïdes Ankylostomes ssp

Cavité
Cavité buccale courte C. buccale profonde
rhabditoides Bulbe Bulbe
Queue peu pointue Q. trè
très pointue
Cavité
Cavité buccale courte C. buccale profonde
filariformes Sans bulbe Sans bulbe
Queue bifide Queue pointue

61 62 62
61

5.Techn de Harada-Mori
5. copro:
copro: Méthode des plaques d’
d’Agar

Limites de la technique de Harada-Mori:
C’est la méthode la plus sensible pour la mise en

évidence des larves de S. stercoralis et d’ankylostomes

Possibilité de contamination par les formes libres
contenues dans le sol ou dans l’eau
Mode opératoire:

Placer 2g des selles fraiches au centre d’une plaque

Ces derniers sont moins résistant à une faible d’agar scellée dans une boîte de pétri
acidité (distinguer les formes libres des formes
parasitaires)
Garder la boîte à T° ambiante pdt 2 jrs

Pas d’application aux échantillons fixés ou gardés
Mobilité des larves entraine une poussée des
bactéries sur leur trajectoire
longtemps
63 64

5. copro: Méthodes sur plaques d’Agar 5. copro: Méthodes sur plaques d’Agar

observation des larves au microscope:

A travers la boîte aux extrémités distales
des lignes formées par les colonies

Fénestrer la boîte de pétri

Déverser sur la surface de la préparation
une solution de formol 10%

Rincer et laisser reposer pdt 30 min

Recueillir le liquide dans un tube puis
centrifuger à 500 tours pdt 5 min

Examiner le culot à l’obj 10x, puis 40x pour
l’identification de l’espèce
65 66
PM_TP_Parasisologie
6. Techniques spé
spéciales

6.1. Scotch test (tape test ou test de
GRAHAM)

Principe:

on trouve les œufs à la marge anale.

oeufs adhèrent au morceau de scotch qui
ensuite est collé sur une lame PO puis
examiné directement au microscope.

recherche: œufs d’Enterobius vermicularis
(ou Taenia spp)

Tôt le matin avant défécation ou toilette
67 67
6.1.Scotch test: mode opératoire
6.2 : Kinyoun modifiée

Mode opératoire:

Confectionner un frottis fécal sur 2 lames
Sécher à 70°C à l’aide d’une source de chaleur



Fixer la préparation au méthanol pdt 3 min

Recouvrir avec carbol fuchsine (temps de contact =
5 min)

Chauffer sur la flamme d’1 lampe alcool (éviter
l’ébullition)

Rincer à l’eau et décolorer avec H2SO4 5% pdt 30
sec
6.1. Scotch test

Mode opératoire :
 Repliez un ruban autocollant transparent sur
un tube à essai, face adhésive vers
l’extérieur
 Ecartez les fesses et appliquez l’extrémité du
tube sur la marge anale
 Retirez le tube et collez le ruban sur une
lame PO
 Examinez au microscope à l’obj. 10x, 40x
68
68
6.2. Coloration de Zielhl-
Zielhl-Neelsen modifié
modifiée
(coloration de Kinyoun modifié
modifiée)

Principe :

Permet la détection des structures alcoolo-
acido résistantes dans les selles notamment
les oocystes de Cryptosporidium spp,
Cyclospora cayetanensis, (microsporidies)
69 70 70
6.2. Ziehl-Neelsen/Kinyoun modifié

Rincer à l’eau et colorer avec bleu de méthylène pdt 1 min

Rincer à l’eau, sécher puis examiner au microscope sous
immersion (obj. 100x)
Limites de ziehl-Neelsen & Kinyoun modifié:



Méthode non sensible pour les infections légères

Recommander de faire 3 prélèvements successifs:

( pcq: le nombre d’oocystes dans les selles varient du jr au jr)

Identification de cyclospora et microsporidies peut être laborieuse

Artefacts sont fréquents par cette méthode (d’où l’intérêt des
mensurations des parasites observés)
71 72
PM_TP_Parasisologie

6.3.Technique de Kato-
Kato-Katz

Coloration de Kinyoun
 Principe:
NB : ne pas confondre avec les levures  Utilise une couche épaisse et quantifiée des selles
 Recherche:
 œufs d’helminthes, spécialement œufs Schistosoma spp

 Préalables:
 Cellophane est découpé en +++ morceaux (25 à 35 mm)
 immergé ds le mélange de glycérol-vert de malachite 24h

 Temps d’éclaircissement dépend du type d’œuf recherché et de

la cc de glycérol

 Plus la coque de l’œuf est épaisse plus long sera le temps

d’éclaircissement
73 73 74
74

6.3.Technique de Kato-
Kato-Katz 6.3.Technique de Kato-
Kato-Katz

Procédure:

Déposez une petite qtté de selles sur un plan dur

Appuyer le tamis sur les selles préparation de façon à faire
passer les matières fécales à travers le tamis

Recueillir les selles tamisées avec un spatule

Retirer la plaque de façon que le cylindre de selles reste sur la lame

Couvrir la matière fécale avec un morceau de cellophane
préalablement imbibée de glycérol

Retourner la lame et presser fortement l’échantillon de selles contre
la cellophane sur une surface dure lisse

Déposer une plaque perforée au centre d’une lame PO

Remplir le trou de la plaque avec des selles tamisées

Eliminer l’excès de selles à l’aide du bord de la spatule

Retourner la lame en la soulevant de coté afin d’éviter que la
cellophane ne se détache

Déposer la lame sur la paillasse, la cellophane au dessus

Lire au microscope à l’obj 10x, 40x après 30 min à 24h

75 75 76 76

Quelques réactifs

Eau physiologique (NaCl 0,85%)

 Chlorure de sodium (NaCl)……………..8,5 g
 Eau distillée………………………………1000 ml

 Eau physiologique formolée à 10%

 Formaldéhyde………………………………10 ml
 Eau physiologique………………………….90 ml

 Fuchsine de Ziehl
 Fuchsine basique……………………………25 g
 Ethanol à 96%.............................................250 ml

77 78 78
PM_TP_Parasisologie

Réactifs Réactifs

 Solution de Bleu de Méthylène ( ou Vert de Malachite)

 Bleu de méthylène (ou vert de malachite)..3 g

Bleu de méthylène (solution mère ou saturée)  Eau distillée……………………………………100ml

 Bleu de méthylène……………………….25 g
 Ethanol à 96%...................................250 ml  Solution de travail Glycérol-Vert de malachite (ou Bleu
de méthylène)
 Vert de malachite (ou Bleu de méthylène) à 3% en

 Bleu de méthylène (solution de travail) solution aqueuse………………………………….1 ml

 Glycérol…………………………………………100 ml
 Solution saturée filtrée…………………100 ml  Eau distillée…………………………………….100 ml

 Eau distillée………………………………1000 ml

79 79 80 80

Réactifs Réactifs

Solution saturée en Chlorure de Sodium
SAF (Sodium-acétate/Acetic acid /Formalin)

 NaCl……………………………………………
NaCl……………………………………………250 250 g  Sodium acétate anhydre……………………15 g

 Eau distillé
distillée…………………………………1000
…………………………………1000 ml  Acide acétique glacial………………………20 ml

 Formol à 37% (Formaldéhyde)…………40 ml

 Eau distillée………………………………….920 ml
 Solution saturée en Sulfate de Zinc
 ZnSO4………………………………………
ZnSO4………………………………………..330..330 g
 Eau distillé
distillée…………………………………1000
…………………………………1000 ml

81 81 82 82

Examen d’
d’urine

Recherche:
œufs de Schistosoma haematobium
Examen des urines 

 œufs d’ Enterobius vermicularis

 œufs de Taenia ssp
 Trophozoïtes de Trichomonas vaginalis
 Microfilaires des espèces suivantes :
 Wuchereria bancrofti (en cas de chylurie)
 Loa loa (en cas d’hématurie aussi)
 Onchocerca volvulus (en cours du TTT)
 Techniques: filtration et sédimentation

83 83 84 84
PM_TP_Parasisologie

Examen d’urine Technique de sédimentation

Procédure:
 Prélèvement:
Agiter & verser l’échantillon d’urine ds un verre à pied conique

 Dans un récipient en plastique à large
ouverture
 Volume récolté: 10 ml au minimum
 Récolter le premier jet urinaire matinal

Laisser sédimenter pdt 1H au moins et éliminer le surnageant

Conserver 10 ml au fond du verre
Mélanger et transvaser ds 1 tube à centrifuger à fond conique

Centrifuger à 2500 T pendant 5 minutes

Transvaser le culot sur une lame PO recouverte d’une lamelle

Examiner au microscope au grossissement 200x, 400x

85 85 86 86

87 87 88 88

Technique de filtration Technique de filtration

Dévisser le porte-filtre

Procédure:

Homogénéiser et prélever ~ 10 ml ds 1 seringue
Retirez le filtre avec une pince et

Adapter un filtre (porosité de 10 à 20µm)
Déposer-le sur une lame en maintenant la

Adapter la seringue ds le porte-filtre face filtrante au dessus

Maintenir le dispositif verticalement

Recouvrir d’une lamelle et

Faire passer les urines à travers le filtre

Dévisser soigneusement le porte-filtre
Observer systématiquement au microscope

Remplir la seringue d’air,

Fixer-la au porte filtre et

Expulser l’air pour éliminer l’excès d’urine dans le
porte-filtre et plaquer les œufs sur le filtre
89 90 90
89
PM_TP_Parasisologie

Examen du crachat

Examen d’Exsudat  Précaution:

 Prélevez à l’extérieur ou dans une pièce
très bien ventilée, le plus loin possible
d’autres personnes
 Le crachat doit provenir du plus profond
des poumons après plusieurs inspirations
suivies d’une expiration forcée

91 91 92 92

Examen des crachats: sédimentation

Procédure:

5 ml dans un tube à centrifuger

Ajouter 5 ml sol. de NaOH ou KOH 1%

Fermer hermétiquement le tube avec un bouchon

Mélanger pendant 1 min

Laisser reposer pdt 1H

Mélanger encore pendant 1 min

Centrifuger à 2500 T pdt 5 min

Eliminer le surnageant

Recueillir le culot sur une lame recouverte d’une
lamelle

Lire au microscope

Recherche: œufs de paragonimus spp

93 93 94 94

TP DE PARASITOLOGIE
Etalement sanguin à frais
Principe: examen microscopique entre
Examen de Sang

lames et lamelles qui permet de

visualiser les parasites extracellulaires

95 95 96
PM_TP_Parasisologie

97 98

Goutte épaisse colorée Goutte épaisse colorée

Principe: microméthode de concentration qui
Expression des résultats (Plasmodium):

permet de visualiser le parasite intracellulaire et
extracellulaire sanguicoles

Semi-quantitative: OMS

+=1-10 tropho/100 ch

Mode opératoire

Désinfecter le doigt
++=11-100 tropho/100ch

Prélever la goutte, défibriner, sécher

Colorer pdt 30-10’ dans sol. Giemsa 5% -10%
+++=1-10 tropho/ch

Laver à l’eau de robinet, sécher

++++=plus de 10 troph/ch

Lire au microscope à l’obj. à immersion

Quantitative:

Recherche: Trypanosomes, Plasmodium, Microfilaires
nbre de tropho(µl) x nbre GB/200

99 100

CHARGE PARASITAIRE (SANG) Frottis de sang mince

Etalement monocellulaire

Estimation de la charge parasitaire de Plasmodium
par rapport à la leucocytémie présentée par le
Fixation au méthanol ou au May-Grünwald
patient.

Coloration au Giemsa dilué PBS (pH:7.2):

Exemple : 45 tropho pour 223 GB dénombrés sur
GE chez un patient dont la leucocytémie est de
Permet d’établir la F.L
5700 GB/µl correspond à une parasitémie de 1150
tropho/µl :

Permet de faire le Diagnostic différentiel des
plasmodiums

Permet de déterminer le % des GR parasités

101 102
PM_TP_Parasisologie

Double étalement :
Double étalement: prélèvement
prélèvement

Déposer une goutte de

•Laisser sourdre une petite
sang (10µl) à 2 cm
goutte de sang (5µl), à
environ d’une des
environ 4 cm de la même
extrémités d’une lame
extrémité de la lame

103 104

Double étalement
Double étalement:

•Amener au contact de la Faire alors glisser la lame

petite goutte du sang, la rodée, sans modifier son

angle d’inclinaison, d’un
lame rodée ténue selon
mouvement régulier jusqu’à
l’angle de 30 à 40°,
l’autre extrémité de la lame
40°
porte objet
(1) Frottis
(2) Goutte épaisse mince

(2) Goutte
(1) Frottis
épaisse 105 106
mince

Double étalement Double étalement

2è Goutte épaisse

•Etaler régulièrement la grosse •Laisser sécher.

goutte en un mouvement de
spirale avec le coin d’une autre
lame porte objet, sur un (1) Frottis
(2) Goutte
épaisse mince
diamètre de 1 cm d’environ ;

(2) Goutte épaisse (1) Frottis

mince

107 108
PM_TP_Parasisologie

GOUTTE EPAISSE FROTTIS MINCE

109 110

Fixation de frottis au méthanol

Préparation de GIEMSA
•Tenir la lame inclinée, en glisser

Giemsa Billes de verre 30,0 ml
le long du frottis sanguin mince 2 3,0 mm
stock
ou 3 gouttes de méthanol en tête
Méthanol absolu 270,0 ml
du frottis ;
Giemsa poudre 3,0 g
•Laisser agir 1mn;
Glycérol 140,0 ml
Méthanol

111 112

GIEMSA: solution
GIEMSA: tampon phosphate
extemporanée

Giemsa solution Tampon PBS 0,0064 M; 39 ml
Tampon stock 0,67 M Na2HPO4 59,24 g
pH 7,2
de travail à 2,5 KH2PO4 36,38 g
% (on peut utiliser la E.D. 1000,00 ml
solution à 10%) Giemsa stock 1 ml

Triton X-100 (5 %) 2 gouttes
Tampon de travail Stock 10,0 ml

0,0067 M E.D. 990,0 ml

113 114
PM_TP_Parasisologie

Coloration par baignade dans un bac

Coloration de coloration
lames

•Couvrir les 2
étalements de la Immerger la lame
Solution
solution de Giemsa à dans la solution de de

10%; Giemsa à 10%; Giemsa

Bac de
coloration

115 116

Fixation du frottis mince et

coloration du double étalement
Plasmodium sp

laisser agir 10 mn;
Goutte épaisse

Rincer l’eau

Laisser sécher soigneusement

Frottis mince

117 118

CHARGE PARASITAIRE
CHARGE PARASITAIRE (SANG)
(SANG)

Méthode des croix de l’OMS. No No No
Estimation de la charge parasitaire de Plasmodium par
champs tropho croix

Pour une préparation indexation à la leucocytémie normale dans la population
standard de 10 µl de sang,
100 <1 0
(8000 GB/µl )
ayant un diamètre de 1 cm, 100 1<10 1
100 champs microscopiques 100 10<100 2
Exemple : 45 tropho pour 223 GB dénombrés chez un
correspondent à 0,4 µl de 1 1<10 3 enfant correspond à une parasitémie de 1614 tropho/µl.
sang. 1 10<100 4

119 120
PM_TP_Parasisologie

CHARGE PARASITAIRE (SANG) DIAGNOSTIC DIFFERIENTIEL

Estimation de la charge parasitaire de Plasmodium
Pourcentage de GR infectés

par rapport à l’érythrocytémie présentée par le
Trophozoïtes : jeune (petit), âgé (grand)
patient.

Schizontes : nombre de merozoïtes

Gamétocyte : forme, nombre

Exemple : 59 GR infectés pour 2000 GR dénombrés

Granulation (tache) : Schüffner, Maurer ,
sur un frottis mince correspond à une charge de pigment
2,95 %
Eléments atypiques

121 122

DIAGNOSTIC DIFFERIENTIEL Trophozoïte P. falciparum(FM)

Caractères P. falciparum P. vivax P. ovale P.
malariae
GR infecté >40% 2% 2% 2%

Taille GR Normale Augmentée Augmentée Petite

,ovale
Gamétocyte P. falciparum
Granulations Maurer Schüffner - -

Trophozoïtes 1, 2/GR + 2 1/ GR 1(2)/GR Forme en

noyaux bande,
pigment
Schizontes Absent en 16 – 24 8-10
périphérie merozoïtes merozoïtes
Gamétocytes Croissant arrondie arrondie arrondie
Schizonte P. falciparum

123 124

Trophozoïte P. Trophozoïte P. malariae

falciparum (GE) en bande

Trophozoïte P. malariae
pigment
Trophozoïte P. falciparum
avec tache de Maurer

Schizonte P. malariae

125 126
PM_TP_Parasisologie

P. ovale forme amoeboïde

Trphozoïte P. ovale trophozoïte

Trophozoïte P. ovale dans

P. ovale gamétocyte
un geant GR ovale

Trophozoïte P. ovale avec

2 tropho/ cellules P. ovale schizonte

127 128

ITM-Kinshasa / CEFA-MONKOLE / ACTEC 2009

Trophozoïte P.vivax Trypanosoma brucei.

Gamétocyte + granulation de
schüffner

Gamétocyte géant P. vivax

Schizonte P. vivax

129 130130

ITM-Kinshasa / CEFA-MONKOLE / ACTEC 2009 ITM-Kinshasa / CEFA-MONKOLE / ACTEC 2009

Trypanosoma sp. Trypanosoma cruzi

131131 132132
PM_TP_Parasisologie

Microfilaires du sang Bruggia malayi

133 134

FILARIOSE LYMPHATIQUE W. Bancrofti (goutte épaisse)

Wuchereria bancrofti, Giemsa, faible grossissement

Coloré au Giemsa

Coloré au Giemsa
Coloré à l’hématoxyline
135 136

Bruggia malayi Bruggia malayi

Gaine

Giemsa stain.
Coloré à l’hématoxyline

137 138
PM_TP_Parasisologie

Loa loa Loa loa et Mansonella perstans

Gaine

Noyau terminal

139 140

W. bancrofti Loa-loa M. perstans

Onchocerca volvulus Pathogénicité Pathogène Pathogène Non pathogène

Région Afr.intertropicale Afr. centrale ,Golfe Afrique intertropicale

du Sénégal de Guinée ;grands
AuMozambique lacs ,Bassin du
Congo

prélèvement nuit (22 h et 4 h) jour (10 h et 16h) Apériodique

Vecteurs Culex Taon (Chrysops) Moucheron (culicoïdes)

Taille 200-300 µm 250-300 µm 150 µm

Epaisseur 8 µm = un GB 8 µm = un GB 4 µm = ½ GB

Mobilité à frais Souple et Souple et ondulant reste sur place dans le

ondulant, rapide traverse rapide le champ, s'immobilise en
dans le champ champ, aime les quelques minutes
bords de la lamelle

141 142

W. bancrofti Loa-loa M. perstans

Courbure du Régulière Irrégulière Régulière (en boule de CHARGE EN MICROFILAIRES
corps ficelle )
Gaine Rose incolore Pas de gaine
SANGUICOLES
Queue Rectiligne et Incurvée et effilée Rectiligne et bout arrondi
effilée pas de noyaux jusqu'au en doigt de gant
noyau au bout bout
On dénombre les microfilaires (MF) dans une GE
Noyaux du Noyaux moyens Gros noyaux se Petits noyaux serrés peu
corps bien séparés chevauchant distincts
est confectionnée à partir d’un prélèvement
Corps interne Unique-visible Non visible petits noyaux serrés peu sanguin réalisé dans un tube capillaire hépariné (75
distincts
non visible µl).
Courbure du Régulière et Irrégulière et tortillée Régulière, en boule de
corps souple ficelle
Gaine Rose incolore Pas de gaine
Exemple : 127 MF trouvées dans la GE calibrée
correspondent à une charge de 1693 MF/ml.
143 144
PM_TP_Parasisologie

Frottis mince

145145 146146

147147 148148

149149 150150
PM_TP_Parasisologie

151151 152152

153153 154154

155155 156156
PM_TP_Parasisologie

Examen du suc ggl Examen du suc ggl

Principe
Technique

consiste en une observation microscopique du suc
Créer un vide dans une seringue
ganglionnaire obtenu par PG hypertrophiés
Désinfecter le site de ponction

Matériels
choisir un ggl (e) le pouce et index

Aiguilles d’une seringue

Piquer avec une aiguille

Désinfectant

Microscope

Déposer le suc sur une lame

Lames et lamelles
Recouvrir puis observer à l’obj.40x

157 158

CTC ou BF ou mHCT
PG

Matériels

Tubes capillaires héparinés ou tubes à Ht

Centrifugeuse à Ht

Microlancettes

Plasticine

Exécution du test

Piquer puis remplir 4 tubes à Ht

Boucher une extrémité tube avec de la plasticine

Centrifuger les 4 tubes pdt 5-8 minutes à 12 000 tours par min

Recherche:

Microfilaires, trypanosomes

159 160

Buffy Coat
Quantitative Buffy Coat (QBC)

Principe:

centrifugation différentielle avec visualisation des
noyaux des plasmodiums colorés par l’AO

Matériels:

Tubes capillaires QBC

Microscope à fluorescence ou source à fluorescence

Centrifugeuse à QBC

flotteur

161 162
PM_TP_Parasisologie

Quantitative Buffy Coat (QBC)

Quantitative Buffy Coat (QBC)

MO:

Remplir le tube à QBC avec 60µl de sang

Introduire le flotteur à frottement doux

Centrifuger à 12 000tpm

Monter sur une chambre de lecture

Lire au microscope à la lumière ultraviolette

Recherche: plasmodiums, trypanosomes

163 164

Mini Anion Exchange

centrifugation Technique mAECT

Principe
Mode opératoire

basé sur la différence de charge (e) les
verser 300-350µl de
sang veineux
trypa et les elts figurés du sang

séparation par une résine échangeuse
d’anions DEAE (Diethylamino-Ethyl
cellulose).

Trypanosomes passeront tandis que les
elts figurés du sang seront retenus

165 166

mAECT TP PARASITOLOGIE

centrifuger à 3000
Examen de LCR
tpm pdt 15 min

lecture en observant
le bout effilé du tube
à l’obj 10x dans une
chambre lecture

167 168
PM_TP_Parasisologie

DIAGNOSTIC DE PRESOMPTION
Examen du LCR

Examen à frais:

Précaution: utiliser le matériel
stérile et dans la stricte asepsie
Immunofluorescence indirecte (IFI)
Procédure:

Faire PL et le recueillir dans le

Enzyme Linked immunosorbent assay
tube aseptique

Étaler sur une lame PO recouverte
(ELISA)
d’une lame CO

Observer au microscope à

Autres techniques sérologiques
l’obj.10x ou 40x

Parasites recherchés:

Trypanosomes, amibes télluriques,
Loaloa, T.cruzi

Technique peu sensible et

dangereuse
169 170

CATT(Card agglutination test for
Technique CATT sang total

Trypanosomiasis)
Reconstitution Ag

Composition des Réactifs:

Antigène:

Suspension des trypomastigotes sanguicoles T.b. gambiense

exprimant LiTat 1.3 fixés, colorés au bleu de coomassie et

stabilisés.

Témoin positif:

Antisérum de chèvre dilué et lyophilisé.

Témoin négatif:

Solution lyophilisée d’albumine bovine -Reconstitution témoin

Tampon: positif et négatif

Solution saline tamponnée (phosphate pH 7,2)

Matériels ou KIT

Microlancettes, Ouate, Désinfectant, Tube à Ht, Seringues
Rotateurs, Carte plastifiée, Tiges, Compte-gouttes

171 172

•Déposer sur la zone de réaction une goutte réactif (

45µl) bien homogénéisé
Déroulement •Ajouter ensuite une goutte de sang
de la réaction
•A l’aide d’une tige d’agitation, mélanger le sang avec
le réactif
•Agiter la carte pendant 5 minutes à 60 tours à l’aide

Prélèvement d’un rotateur.

Désinfecter puis essuyer la

première goutte

Remplir le tube à Ht jusqu’au ¾

173 174
PM_TP_Parasisologie

Lecture se fait dans le rotateur Immunofluorescence indirecte

Réaction positive/négative underline:

Présence ou absence des grumeaux rougeâtres

1e Contact

+ ↔
Antigène Anticorps Ac-Ag

Lavage
175 176

Immunofluorescence indirecte
2e Contact Immunofluorescence indirecte

+ ↔
Ac-Ag Anti-Ac+if AntiAc(if)-Ac-Ag

2e Lavage Lecture au microscope à UV

177 178

ImmunoFluorescence ImmunoFluorescence Indirecte

Indirecte
Cas positif 1e Contact Cas positif
•2e Contact
Ac Cas négatif
Cas négatif Anti-Ac+if

+ ↔
+ ↔ ↔ + ↔
+
Antigène Anticorps Ag Ag Anti-Ac+if
Ac-Ag Antigène Anticorps Ac-Ag Anti-Ac+if AntiAc(if)-Ac-Ag Ag

Lavage Lavage

Ac-Ag
Ag

179 180
PM_TP_Parasisologie

ImmunoFluorescence
Indirecte
Lecture au microscope à UV

Cas positif Cas négatif Trypanosoma

181 182

ELISA ELISA (ENZYM LINKED IMMUNOSORBANT ASSAY)

2e Contact
1e Contact

+ ↔ + ↔

Antigène Ac-Ag Anti-Ac+Enz AntiAc(Enz)-Ac-Ag

Anticorps Ac-Ag

2e Lavage
Lavage
183 184

ELISA ELISA
Peroxyde

Eau oxygénée et chromogène

+
Arrêt de la réaction
Avec H2SO4 2N

Lecture à l’œil ou spectrophotomètre

185 186
PM_TP_Parasisologie

Dilution Dilution

l
1m

5m
l l
ml ml

0,

0,
0,1 1m 0,5 5 m
ml 0, ml 0,
0,1 0,5

0,9ml 1ml 1ml 0,9ml 1ml 0,9ml 1ml 0,5ml 1ml 1ml 0,5ml 1ml 0,5ml 1ml
0,9ml 0,5ml
1/10 1/100 1/1000 1/10000 1/2 1/4 1/8 1/16
Sérum Sérum

0,9ml 0,9ml 0,5ml 0,5ml

0,9ml 1ml 0,5ml 1ml

Sérum 1/10 1/100 1/10000 Sérum 1/2 1/4 1/16

1/1000 1/8

187 188

Dilution

l
m
Dilution

25
l l
5m 5m

0,
5m
l 0,2 0,
2
0,2

Tampon

0,75ml 1ml 1ml 0,75ml 1ml 0,75ml 1ml

0,75ml
1/4 1/16 1/64 1/256
Sérum

0,75ml 0,75ml
0,75ml 1ml

Sérum 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml Sérum 1/4 1/16 1/64 1/256

189 190

MERCI DE VOTRE
ATTENTION

191