Rôle des hormones thyroïdiennes sur le développement

neurologique des circuits cardio-respiratoires chez le

rongeur

Thèse

Jean-Philippe Rousseau

Doctorat en neurobiologie
Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

© Jean-Philippe Rousseau, 2020

 Rôle des hormones thyroïdiennes sur le
développement neurologique des circuits cardio-
respiratoires chez le rongeur.

Thèse

Jean-Philippe Rousseau

Sous la direction de :

Richard Kinkead, directeur de recherche

Résumé

Les hormones thyroïdiennes sont essentielles au bon développement du système

nerveux central. Ce dernier est très vulnérable à toute déficience en hormones thyroïdiennes,
spécialement à la période périnatale précoce où il dépend entièrement du transfert de la part
de la mère. Toute réduction du taux d’hormones thyroïdiennes chez la mère ou le retrait
précoces du fœtus par la naissance prématurée peut avoir d’importants effets néfastes sur la
formation du cerveau de la progéniture à court et long terme. Malgré l’état actuel des
connaissances concernant l’effet de la carence en hormones thyroïdiennes sur le
développement et la fonction du système nerveux central, leur influence sur les circuits
nerveux qui régulent le système cardio-respiratoire reste méconnue. Nous proposons que les
hormones thyroïdiennes au cours de la période périnatale du rat soient nécessaires au bon
développement du réseau neuronal responsable du contrôle cardio-respiratoire. Afin de tester
cette hypothèse, nous avons reproduit un modèle d’hypothyroïdisme expérimental par
l’exposition de la femelle sur l’entièreté de la gestation à l’agent anti-thyroïdien méthimazole
(MMI). L’évaluation des effets sur la commande respiratoire centrale, la ventilation, la
réponse à l’hypoxie et l’inhibition cardio-respiratoire par stimulation du chémoréflexe
laryngé a été divisée sur différentes tranches d’âge (jours postnataux : P1-P4-P15). Le
traitement de MMI réduit le rythme respiratoire produit centralement dans les premiers jours
de vie. Un effet âge dépendant du traitement est présent sur la ventilation de l’animal entier
et sa réponse à l’hypoxie. L’inhibition cardio-respiratoire est augmentée chez les animaux
déficients en hormones thyroïdiennes lors de la stimulation du chémoréflexe laryngé.
L’activation importante du système GABAergique est au cœur des conséquences observées.
Enfin, nous proposons que les cellules de type «microglie» pourraient moduler le
développement du réseau neuronal de contrôle respiratoire en réponse aux hormones
thyroïdiennes. En culture cellulaire, ses fonctions sont augmentées par l’exposition à
l’hormone T3 et l’effet dépend du micro-environnement. Nous concluons que les hormones
thyroïdiennes sont nécessaires pour la mise en place du système nerveux de contrôle
respiratoire et autonome.

iii
Abstract

Thyroid hormones are essential for the normal development of the central nervous
system. The latter presents a high vulnerability to any thyroid hormones deficiency,
especially in the early stages of perinatal development, when the mother is the only source
for the foetus. At that time, any maternal hypothyroidism or premature birth can alter thyroid
hormones supply and compromise brain functions on short and long term. Despite the current
state of knowledge concerning the effect of thyroid hormone deficiency on the development
and function of the central nervous system, their influence on the nervous circuits that
regulate the cardiorespiratory system remains unknown. We propose that thyroid hormones
during the perinatal period are necessary for the proper development of the neural network
responsible for cardiorespiratory control. To test this hypothesis, we reproduced a model of
experimental hypothyroidism by exposing the pregnant dams over the entire gestation to the
anti-thyroid agent, methimazole (MMI). Effects of the treatment were evaluated on central
respiratory command, ventilation, hypoxic response and cardiorespiratory inhibition by
laryngeal chemoreflex stimulation, across multiple age groups (P1-P4-P15). MMI treatment
reduces the central respiratory rhythm in the first days of life. An age-dependent effect was
noted on whole animal ventilation and hypoxic response. Cardiorespiratory inhibition
following laryngeal chemoreflex stimulation is increased in thyroid hormones deficient pups.
The enhanced GABAergic system activation is a major player in the consequences observed
here. Finally, we proposed that microglia could modulate development of the neuronal
respiratory control network in response to thyroid hormones. Using cell culture, we
demonstrated that their functions are increased by the exposure to T3 and the effect is
mediated by the surrounding microenvironment. We conclude that thyroid hormones are
necessary for the proper establishment of the respiratory and autonomic nervous control
systems.

iv
Table des matières
Résumé .................................................................................................................................. iii
Abstract .................................................................................................................................. iv
Table des matières .................................................................................................................. v
Liste des figures ..................................................................................................................... xi
Liste des tableaux ................................................................................................................ xiii
Liste des abréviations et des sigles ...................................................................................... xiv
Remerciements .................................................................................................................... xvi
Avant-Propos ..................................................................................................................... xviii
Partie 1 .................................................................................................................................... 1
Introduction ............................................................................................................................ 1
1. Hormones thyroïdiennes et développement ....................................................................... 1
1.1 Hormones thyroïdiennes chez les vertébrés .................................................................. 1
1.2. Axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien .................................................................... 2
1.2.1 Métabolisme des hormones thyroïdiennes ............................................................. 3
1.2.2 Transport et contrôle local des niveaux d’hormones thyroïdiennes ....................... 5
1.2.3 Action génomique et non-génomique des hormones thyroïdiennes ...................... 7
1.3 Ontogénèse des hormones thyroïdiennes et développement neurologique ................ 10
1.3.1 Apport d’hormones thyroïdiennes maternelles pendant la gestation ................... 12
1.3.2 Hormones thyroïdiennes en fin de gestation et période postnatale ...................... 14
1.3.3 Fenêtre temporelle des procédés neuro-développementaux influencés par les
hormones thyroïdiennes ................................................................................................ 15
1.4 Causes de la déficience en hormones thyroïdiennes ................................................... 18
1.4.1 L’hypothyroïdisme et l’hypothyroxinémie maternelle ........................................ 18
1.4.2 Prématurité et production d’hormones thyroïdiennes .......................................... 20
2. Système de contrôle respiratoire ...................................................................................... 21
2.1 Principes de base de la ventilation pulmonaire ........................................................... 21
2.2 Composantes centrales de la commande respiratoire ................................................. 24
2.2.1 Le complexe pré-Bötzinger .................................................................................. 27
2.2.2 Le complexe Bötzinger ........................................................................................ 29
2.2.3 Le noyau rétrotrapézoïde/groupe respiratoire parafacial ..................................... 29
2.2.4 Le complexe post-inspiratoire .............................................................................. 31

v
 2.2.5 Les groupes respiratoires ventraux ....................................................................... 31
2.2.6 Le noyau du tractus solitaire ................................................................................ 32
2.2.7 Les noyaux du Raphé ........................................................................................... 33
2.2.8 Les groupes neuronaux respiratoires du pont ....................................................... 34
2.3 La genèse du rythme respiratoire ................................................................................ 35
2.3.1 Les neurones rythmiques ...................................................................................... 36
2.3.2 Débats sur la génération du rythme ...................................................................... 38
2.3.3 Le triangle rythmogénique ................................................................................... 39
2.3.4 L’hypothèse du triple oscillateur .......................................................................... 43
2.4 Développement du réseau de contrôle respiratoire ..................................................... 46
2.4.1 Modification cellulaire du réseau de contrôle respiratoire au cours du
développement .............................................................................................................. 46
2.4.2 Maturation physiologique du réseau de contrôle respiratoire en période périnatale
....................................................................................................................................... 48
2.5 Physiologie de la réponse à l’hypoxie ........................................................................ 50
2.5.1 Les corps carotidiens ............................................................................................ 51
2.5.2 Les corps aortiques ............................................................................................... 53
2.5.4 Réponse centrale à l’hypoxie ............................................................................... 54
2.5.5 Réponse ventilatoire à l’hypoxie .......................................................................... 58
2.6 Le chémoréflexe laryngé............................................................................................. 59
2.6.1 Définition et développement du chémoréflexe laryngé ....................................... 59
2.6.2 Physiologie du chémoréflexe laryngé .................................................................. 61
2.7 Neuromodulation de la respiration par les hormones thyroïdiennes .......................... 63
3. Neurotransmission GABAergique .................................................................................... 65
3.1 Action générale du GABA dans le développement .................................................... 65
3.2 Métabolisme du GABA .............................................................................................. 67
3.3 Récepteur GABAA ...................................................................................................... 69
3.3.1 Structure du récepteur GABAA ............................................................................ 70
3.3.2 Modulation du récepteur GABAA ........................................................................ 73
3.3.3 Changement développementaux de l’homéostasie du chlore .............................. 75
3.4 Récepteur GABAB ...................................................................................................... 78
3.5 Modulation de la respiration par le GABA au cours du développement .................... 80
3.6 Régulation du système GABAergique par les hormones thyroïdiennes ..................... 83

vi
 3.6.1 Effet sur le métabolisme du GABA ..................................................................... 85
3.6.2 Effet sur la fonction des récepteurs GABAergiques ............................................ 86
4. Les microglies : effecteurs de plasticité au cours du développement............................... 87
4.1 Description des microglies.......................................................................................... 87
4.1.1 Physiologie des microglies ................................................................................... 87
4.1.2 Origine développementale des microglies ........................................................... 88
4.2 Rôles des microglies dans le développement.............................................................. 91
4.2.1 Les nettoyeurs du système nerveux central en développement............................ 91
4.2.2 Support de la survie et prolifération des neurones en développement ................. 93
4.3 Influence des hormones thyroïdiennes sur les microglies .......................................... 93
4.4 Microglie et contrôle respiratoire................................................................................ 94
5. Problématique, objectifs et hypothèses de la recherche ................................................... 95
5.1 Problématique ............................................................................................................. 95
5.2 Objectif général ........................................................................................................... 96
5.3 Hypothèse générale ..................................................................................................... 96
5.4 Objectifs et hypothèses spécifiques ............................................................................ 97
Partie 2 ................................................................................................................................ 101
Chapitre 1 ........................................................................................................................... 101
Thyroid hormones during the perinatal period are necessary to respiratory network
development of newborn rats. ............................................................................................ 101
1.1 Résumé...................................................................................................................... 102
1.2 Abstract ..................................................................................................................... 103
1.3 Introduction ............................................................................................................... 104
1.4 Methods .................................................................................................................... 106
1.4.1 Ethical approval.................................................................................................. 106
1.4.2 Maternal methimazole (MMI) treatment to induce thyroid hormone deficiency in
rat pups. ....................................................................................................................... 106
1.4.3 Thyroid hormone supplementation .................................................................... 107
1.4.4 Assessment of THs inhibition and supplementation efficacy by blood T4
measurements .............................................................................................................. 108
1.4.5 In-vivo plethysmographic recordings ................................................................. 109
1.4.6 In-vitro measurements of neural respiratory-related activity ............................. 110
1.4.7 Western blot analysis ......................................................................................... 111
1.4.8 Data analyses ...................................................................................................... 112

vii
 1.4.9 Statistics ............................................................................................................. 113
1.5. Results ...................................................................................................................... 115
1.5.1 Efficacy of anti-thyroid hormone treatment (MMI) on pup’s thyroxine (T4) blood
levels, weight and body temperature. .......................................................................... 115
1.5.2 Thyroid hormones deficiency augments apnea frequency and duration. ........... 117
1.5.3 Thyroid hormones deficiency depresses ventilation at rest. .............................. 119
1.5.4 Thyroid hormones deficiency delays development of phrenic motor output. ... 121
1.5.5 Enhancement of GABAergic inhibition by thyroid hormones deficiency is
significant at 4 days old. .............................................................................................. 123
1.5.6 Thyroid hormones deficiency increases protein levels of GABAA receptor
subunit α1. ................................................................................................................... 127
1.6 Discussion ................................................................................................................. 129
1.6.1 Effectiveness of thyroid hormones deficiency and L-T4 supplementation protocol
..................................................................................................................................... 129
1.6.2 Thyroid hormones deficiency increases respiratory instability and alters
ventilation in newborn pups. ....................................................................................... 130
1.6.3 Putative mechanisms underlying thyroid hormone modulation of respiratory
development. ............................................................................................................... 131
1.7 Conclusion ................................................................................................................ 134
Chapitre 2 ........................................................................................................................... 135
Maternal thyroid hormone deficiency and cardiorespiratory disorder in rat pups. ............ 135
2.1 Résumé...................................................................................................................... 136
2.2 Abstract ..................................................................................................................... 137
2.3 Introduction ............................................................................................................... 138
2.4 Methods .................................................................................................................... 140
2.4.1 Ethical approval.................................................................................................. 140
2.4.2 Maternal treatment and thyroid hormone deficiency in rat pups ....................... 140
2.4.3 Thyroid hormone measurements ........................................................................ 141
2.4.4 In-vivo respiratory recordings in intact (non-sedated) pups ............................... 141
2.4.5 Laryngeal chemoreflex stimulation protocol in anesthetised pups .................... 142
2.4.6 Data analysis and statistics ................................................................................. 143
2.5 Results ....................................................................................................................... 146
2.5.1 Efficacy of maternal methimazole treatment (MMI) on thyroxin levels (T4) and
pups ............................................................................................................................. 146

viii
 2.5.2 Thyroid hormone deficiency attenuates the breathing frequency response to
hypoxia in intact pups ................................................................................................. 148
2.5.3 Effect of anesthesia and thyroid hormone deficiency on cardiorespiratory activity
at rest and in responses to laryngeal chemoreflex stimulation .................................... 151
2.6 Discussion ................................................................................................................. 154
2.6.1 Critique of the model.......................................................................................... 154
2.6.2 Hypoxic ventilatory response is attenuated thyroid hormone deficient pups. ... 156
2.6.3 Thyroid hormone deficiency augments anesthesia-induced respiratory depression.
..................................................................................................................................... 157
2.6.4 The GABAergic regulation of the laryngeal chemoreflex following thyroid
hormone deficiency ..................................................................................................... 158
2.7 Conclusion ................................................................................................................ 159
Chapitre 3 ........................................................................................................................... 160
Is regulation of microglial functions by thyroid hormone dependent on the micro-
environment?: insights from the cortex and brainstem of newborn mice .......................... 160
3.1 Résumé...................................................................................................................... 161
3.2 Abstract ..................................................................................................................... 162
3.3 Introduction ............................................................................................................... 163
3.4 Material and methods ................................................................................................ 165
3.4.1 Ethical approval of animal experiments ............................................................. 165
3.4.2 Cell culture ......................................................................................................... 165
3.4.3 Motility assay ..................................................................................................... 167
3.4.4 Phagocytosis assay ............................................................................................. 167
3.4.5 Statistical analysis .............................................................................................. 168
3.5 Results ....................................................................................................................... 168
3.5.1 Influence of T3 on microglial motility is dependent on the micro-environment.
..................................................................................................................................... 168
3.5.2 T3 increases phagocytosis in the single-cultured microglia from brainstem. .... 171
3.6 Discussion ................................................................................................................. 173
3.6.1 Microglial motility in the brain is region dependent. ......................................... 173
3.6.2 Direct microglial response to T3: assessment of motility according to the micro-
environment. ................................................................................................................ 174
3.6.3 The effect of T3 on microglial phagocytosis involves specific mechanisms ..... 174
3.7 Conclusion ................................................................................................................ 175
Partie 3 ................................................................................................................................ 177

ix
Discussion / conclusion générale ........................................................................................ 177
1. Principaux résultats ..................................................................................................... 177
2. Précisions méthodologiques et limites des études ...................................................... 178
2.1 L’hypothyroïdisme expérimental par exposition à l’agent anti-thyroïdien
méthimazole ................................................................................................................ 178
2.2 L’utilisation de la pléthysmographie sur l’animal entier ...................................... 180
2.3 Le modèle expérimental d’enregistrements électrophysiologiques sur préparations
de tronc cérébral-moelle épinière isolés ...................................................................... 181
2.4 Évaluation des niveaux de protéines du système GABAergique sur moelle allongée
entière .......................................................................................................................... 183
3. Les hormones thyroïdiennes et le réseau neuronal de contrôle respiratoire ............... 184
3.1 Les hormones thyroïdiennes ont-elles un effet sur le développement des noyaux
respiratoires du tronc cérébral? ................................................................................... 184
3.2 Effets dépressifs du rythme respiratoire par la déficience en hormones
thyroïdiennes : la balance excitation/inhibition en cause ? ......................................... 186
3.3 La chémoréception centrale est affectée par la déficience en hormones
thyroïdiennes ............................................................................................................... 188
4. L’effet d’une déficience en hormones thyroïdiennes varie selon l’âge ...................... 189
5. Retour sur la technique de culture primaire de microglie du tronc cérébral ............... 192
5.1 Utiliser la culture cellulaire sur tronc cérébral entier pour répondre aux questions
..................................................................................................................................... 192
5.3 Critique du modèle ................................................................................................ 193
6. Retombées dans la recherche clinique ........................................................................ 194
7. Conclusion générale .................................................................................................... 196
Partie 4 ................................................................................................................................ 198
Bibliographie ...................................................................................................................... 198
Partie 5 ................................................................................................................................ 246
Annexe A : Liste des conférences nationales et internationales ......................................... 246

x
Liste des figures

Figure 1. Axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien. .............................................................. 3

Figure 2. Schéma de la synthèse des hormones thyroïdiennes. ............................................. 5
Figure 3. Représentation schématique du transport et déodination des hormones
thyroïdiennes. ........................................................................................................................ 7
Figure 4. Effet non-génomique de T3 et T4. ......................................................................... 9
Figure 5. Résumé du développement fœtal et postnatal du cerveau humain en relation avec
les hormones thyroïdiennes. ................................................................................................ 11
Figure 6. Les hormones thyroïdiennes au cours du développement postnatal. ................... 15
Figure 7. Les hormones thyroïdiennes et le développement du cerveau. ............................ 18
Figure 8. Le système respiratoire. ....................................................................................... 23
Figure 9. Générateur de patron central (CPG). .................................................................... 25
Figure 10. Noyaux et groupes respiratoires du tronc cérébral impliqués dans la génération et
régulation du rythme respiratoire. ....................................................................................... 26
Figure 11. Les types de neurones rythmiques selon les phases de ventilation. ................... 37
Figure 12. Interactions entre la synchronisation, la décharge et la période réfractaire des
cellules du préBötC. ............................................................................................................ 41
Figure 13. Vision contemporaine de l’origine du rythme respiratoire. ............................... 45
Figure 14. Ontogenèse du réseau neuronal responsable de la rythmogenèse respiratoire. . 47
Figure 15. Enregistrements in-vitro et in-utero de l’activité respiratoire fœtal du rat. ........ 49
Figure 16. Illustration schématique de l’activité sensorielle du corps carotidien en réponse à
l’hypoxie. ............................................................................................................................. 53
Figure 17. Réponse ventilatoire à l’hypoxie. ....................................................................... 59
Figure 18. Circuits neuronaux impliqués dans le chémoréflexe laryngé fœtal. .................. 62
Figure 19. Métabolisation du GABA. ................................................................................. 67
Figure 20. Diagramme schématique de la synthèse et le transport du GABA dans la
synapse. ............................................................................................................................... 69
Figure 21. Le récepteur GABAA. ........................................................................................ 71
Figure 22. Expression des sous-unités α du récepteur GABAA à travers le développement.
.............................................................................................................................................. 72
Figure 23. Changements de l’homéostasie du chlore au cours du développement. ............ 76
Figure 24. Expression des co-transporteurs NKCC1 et KCC2 à travers le développement.
.............................................................................................................................................. 78

xi
Figure 25. Changement âge-dépendant de l’effet conducteur du chlore suite à l’exposition
au muscimol. ........................................................................................................................ 83
Figure 26. Représentation des possibles interactions entre l’axe HPT et le système
GABAergique ...................................................................................................................... 84
Figure 27. Migration et différentiation des microglies à travers le développement. ........... 90
Figure 28. Fonctions des microglies au cours du développement du SNC. ........................ 92
Figure 29. Schematic representation of the time course of the experimental protocol used to
create all groups of pups ..................................................................................................... 108
Figure 30. Time related changes of blood T4 levels between 2 and 4 days old pups. ....... 116
Figure 31. Whole body plethysmography in unrestrained rats. .......................................... 118
Figure 32. Ventilatory response to a 12% hypoxic event. .................................................. 120
Figure 33. Measurements of phrenic burst activity in isolated brainstem-spinal cord
preparations. ....................................................................................................................... 122
Figure 34. Dose dependent phrenic burst response to muscimol exposure ........................ 124
Figure 35. Phrenic burst response to muscimol exposure in 4 days old pups. ................... 126
Figure 36. Western blot analysis of proteins expression from medulla oblongata
homogenates ....................................................................................................................... 128
Figure 37. Maternal methimazole treatment (MMI) reduces thyroid hormone levels and
body weight. ....................................................................................................................... 147
Figure 38. Whole body plethysmography in unrestrained rats........................................... 149
Figure 39. Ventilatory response to a 12% hypoxic event between control and MMI-treated
pups..................................................................................................................................... 150
Figure 40. Original recording comparing cardiorespiratory responses to stimulation of the
laryngeal chemoreflex by water injection (10 µl) near the larynx ..................................... 152
Figure 41. Thyroid hormone deficiency augments cardiorespiratory inhibition induced by
laryngeal chemoreflex stimulation. .................................................................................... 153
Figure 42. T3-induced motility in primary cultured microglia from cortex and brainstem.
............................................................................................................................................ 170
Figure 43. T3 increases phagocytosis of single-cultured microglia in the brainstem. ....... 172
Figure 44. Représentation schématique du système d’enregistrement in-vitro sur
préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés. ........................................................ 182

xii
Liste des tableaux

Table 1. Comparison of body weight and temperature, T4 hormone levels and selected
respiratory variables between 1 and 4 days old pups born under standard conditions (control)
or born from mothers subjected to methimazole treatment (MMI; thyroid hormone deficient
pups)………………………………………………………………………….…114

Table 2. Comparison of body temperature and selected cardiorespiratory variables between

14 and 15 days old pups born and raised under standard conditions (Control) or born to
mothers subjected to methimazole treatment (MMI; thyroid hormone deficient
pups)……………………………………………………………………………………....145

xiii
Liste des abréviations et des sigles
𝑽̇E : Minute ventilation
𝑽̇O2 : Volume d’O2 consommé
5-HT : Sérotonine
AoP : Apnea of prematurity
ATP : Adénosine triphosphate
BDNF : Facteur neurotrophique issu du cerveau
CO2 : Dioxyde de carbone
CPG : Générateur de patron central
CRL : Chémoréflexe laryngé
CX3CL1 : Fractalkine
DbX1 : Facteur de transcription du développement cérébral Homeobox 1
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium
ƒR : Fréquence respiratoire
FT4: Free T4
GABA : Acide y-aminobutyrique
GAD : Glutamate décarboxylase
GDx : Nombre (x) de jours de gestation
IGF-1 : Facteur de croissance de l’Insuline-1
KF : Noyau Kölliker-Fuse
L-T4 : Levothyroxine
MMI : Méthimazole
NK1 : neurokinine-1
NTS : Noyau du tractus solitaire
O2 : Oxygène
PaCO2 : Pression partielle artérielle en CO2
PFA : Paraforlmaldéhyde
pFL : Noyau parafacial latéral
pFv : Noyau parafacial ventral
PiCo : Complexe post-inspiratoire
préBötC : Complexe pré-Bötzinger
PTU : Propylthiouracile

xiv
Px : Nombre (x) de jours de vie postnataux
RTN/pFRG : Noyau rétrotrapézoïde/groupe respiratoire parafacial
SIDS : Syndrome de la mort subite du nourrisson
SNC / CNS : Système nerveux central (central nervous system)
SpO2: O2 saturation
SST : Peptide somatostatine
T3 : Triiodothyronine
T4 : Thyroxine
TG: Thyroglobuline
THs: Thyroid hormones
TRH : Hormone thyérotrope
TRs : Récepteurs nucléaires de l’hormone thyroïdienne
TSH : Thyréostimuline
TT4 : Total T4
VRG : Groupes respiratoires rostral-ventral
VT : Volume courant

xv
Remerciements

Cette thèse est le produit d’un travail soutenu dans les dernières années, mais aussi
de précieuses collaborations et de l’entraide afin de progresser dans mon cheminement
universitaire et parcours scientifique.

Je me dois de débuter en remerciant mon directeur de recherche, le Dr Richard

Kinkead. Tu as cru en moi dès mon premier passage dans ton laboratoire en tant qu’étudiant
de premier cycle. Cette confiance envers mes capacités d’apprentissage a permis de
développer mon sens de l’autonomie, d’aiguiser mon esprit critique et ma rigueur
scientifique, mais tu as surtout su cultiver cette passion de la recherche que je ne pensais pas
posséder dans les premières années. Ta porte était toujours ouverte. Tu m’as fait découvrir
toutes les facettes de la recherche ici, comme à l’international à travers divers congrès. J’ose
croire que je suis maintenant un meilleur scientifique et c’est en grande partie grâce à toi. Tu
es un mentor et es aussi devenu un ami.

Un merci au Dr Vincent Joseph, Dre Aida Bairam, Dre Marie-Ève Tremblay et Dr

Jorge Soliz pour vos précieux conseils, votre générosité et les multiples discussions
scientifiques que j’ai pu avoir avec chacun. Votre collaboration a été plus que bénéfique pour
mon cheminement au doctorat. Je dois remercier les professionnels de recherche sans qui
mon travail aurait été une montagne. Dre Roumiana Gulemetova qui m’a accueilli à bras
ouverts dans les premières années et n’a jamais hésité à prendre du temps pour m’aider.
Stéphanie Fournier pour tes conseils dans l’élaboration et application des protocoles ainsi
que ton aide pour tous les papiers administratifs. François Marcouiller, un collègue et un ami,
pour ton assistance dans le laboratoire et nos nombreuses discussions dans les dernières
années.

Un doctorat ne peut être fait sans croiser une importante quantité de personnes qui
marque votre parcours ; plusieurs d’entre elles avec qui on se lie d’amitié. Merci au Dre
Céline Caravagna pour les fous rires et l’entraide dans les premières années. Dr Sofien
Laouafa pour nos discussions, notre collaboration et tous les agréables moments passés

xvi
ensembles au laboratoire ou à l’extérieur. Dre Alexandra Demars pour la camaraderie créée
en se supportant à chaque jour, le tout dans une bonne humeur qui fait toujours un grand bien.
Une mention spéciale pour tous les autres collègues : Dr Tommy Seaborn, Dre Luana
Tenorio-Lopes, Dre Cécile Baldy, Dre Tara Adel-Janes, Anabel Buteau-Poulin, Dre Orlane
Rossignol, Mélanie Pelletier, Dre Hayet Kouchi, Orlane Ballot, Rose Tam, Christian Arias,
Elizabeth Elliot Portal, Jaime Pablo Iturri Soliz, Dr Flavien Delhaes et Dr Morgan Gazzola.

Merci à mes parents pour votre soutien inébranlable sur l’entièreté de mon parcours
académique (Oui Luc, je ne serai bientôt plus un étudiant !). Vous êtes des piliers et des
modèles que je peux suivre sans hésitation. Votre confiance a fait de moi l’homme que je
suis aujourd’hui et je vous en serai toujours reconnaissant. Je remercie ma sœur qui m’a
écouté attentivement à chaque discussion. Tu apportes constamment du bonheur dans une
journée avec ton rire communicatif. Finalement, ce texte ne peut se terminer sans remercier
ma femme et amour : Audrey Cardinal. Tu me soutiens dans tous les moments, heureux ou
difficiles, que je traverse depuis notre rencontre. Tu es ma confidente et ma meilleure amie,
avec qui mon cheminement académique aura été bien plus plaisant. La mère exceptionnelle
que tu es me rassure à chaque jour sur les choix que je fais dans la vie.

Ma fille, ma joie, mon rayon de soleil : Livia

xvii
Avant-Propos

Les études intégrées à cette thèse ont été effectuées au cours de mes études supérieures de 3e
cycle de 2015 à 2019 sous la direction du Dr. Richard Kinkead. Le travail a été effectué au
centre de recherche du CHUQ à l’hôpital Saint-François d’assise (Université Laval) ainsi
qu’au centre de recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et Pneumologie de
Québec (Université Laval). Les études du chapitre 3 ont été effectuées en partie dans le
laboratoire du Dr. Mami Noda situé à l’Université de Kyushu lors d’un stage à l’étranger
financé par une bourse de déplacement du Réseau en Santé Respiratoire du Québec.

L’article du chapitre 1 est considéré comme complet par le directeur de recherche pour
insertion dans cette thèse. Il sera soumis prochainement au journal «Acta Physiologica» ou
«Journal of Physiology». Les résultats contenus dans l’article ont été considérés par la
communauté scientifique comme assez importants pour être présentés à de multiples
conférences internationales lors de session orales dans les dernières années. Une liste des
conférences nationales et internationales où j’ai présenté les résultats des trois chapitres de
cette thèse est insérée en annexe.

L’article du chapitre 2 a été publié dans le journal «Experimental Neurology» le 18 Mai

2019 ; 320:112960. doi: 10.1016/j.expneurol.2019.112960.

L’article du chapitre 3 a été accepté pour publication dans le journal Brain Research Bulletin
le 13 janvier 2020.

Chaque chapitre contient son propre avant-propos décrivant mon rôle exact ainsi que celui
des autres auteurs dans la création de chaque article.

xviii
Je suis aussi co-premier auteur d’une revue de littérature et premier auteur d’un manuscrit de
méthode expérimentale en format vidéo, tous deux effectués pendant le doctorat dans le
laboratoire du Dr. Richard Kinkead :

Rousseau JP.*, Tenorio-Lopes L.*, Baldy C., Janes T.A., Fournier S., Kinkead R. (2017) On
the origins of sex-based differences in respiratory disorders: lessons and hypotheses
from stress neuroendocrinology in developing rats. Physiol. Respir. Physiol. Neurobiol.
245: 105-121. doi: 10.1016/j.resp.2017.03.013

Rousseau JP., Caravagna C., (2015) Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord

preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output
recording. J. Vis. Exp. ; 105. doi: 10.3791/53071.

Enfin, j’ai eu l’opportunité de participer à la réalisation des expériences et la rédaction de

deux manuscrits pendant mon doctorat :

Landry‐Truchon K., Fournier S., Houde N., Rousseau JP., Jeannotte L., Kinkead R. (2017)
Respiratory consequences of targeted losses of Hoxa5 gene function in mice. J. Exp. Biol.
220 (24): 4571-4577. doi: 10.1242/jeb.165084

Noda M., Tomonaga D., Kitazono K., Yoshioka Y., Liu J., Rousseau JP., Kinkead R., Ruff
M., Pert C. (2018) Neuropathic pain inhibitor, RAP-103, is a potent inhibitor of
microglial CCL-1/CCR8. Neurochem. Int. 2018 Oct; 119: 184-189. doi:
10.1016/j.neuint.2017.12.005

xix
 Partie 1

Introduction

1. Hormones thyroïdiennes et développement

1.1 Hormones thyroïdiennes chez les vertébrés

Les hormones thyroïdiennes sont connues comme ayant des fonctions biologiques
très répandues et essentielles au cours du développement non seulement des vertébrés, mais
aussi des invertébrés (Ahmed et al., 2010a). Les procédés régulés par les hormones
thyroïdiennes sont effectivement largement conservés dans le règne animal. Certaines
espèces d’invertébrés utilisent les hormones thyroïdiennes en les ingérant depuis
l’environnement et qui servent alors de signal développemental exogène (Moog et al., 2017).
Pour les vertébrés, la majorité des animaux passent par une transition d’un stade «larvaire
vers juvénile» contrôlée en partie par les hormones thyroïdiennes, que ce soit intra ou extra
utérin. Un excellent exemple d’une transition extra-utérine est retrouvé dans la
métamorphose de l’amphibien avec sa sortie de l’eau (Buchholz, 2015). Cette dernière,
caractérisée par le passage de l’environnement aquatique vers l’environnement terrestre,
dépend grandement de l’action des hormones thyroïdiennes. Ces dernières régulent entre
autre la maturation des intestins pour adapter au changement de diète, l’élongation des
membres, une maturation des poumons pour combler le nouveau type d’échange gazeux ainsi
qu’une restructuration du système nerveux incluant le réseau de contrôle respiratoire tel que
démontré par notre équipe (Buchholz, 2015; Rousseau et al., 2016a). De façon parallèle à la
transition du têtard vers l’adulte chez l’amphibien, les mammifères sont exposés à un cocktail
d’hormones incluant les hormones thyroïdiennes qui influencent la maturation d’une
multitude de tissus et d’organes lors de la transition de la vie utérine vers l’air ambiant
(Buchholz, 2015). Ces changements assurent l’activation de procédés essentiels à
l’homéostasie de l’organisme suite à la naissance tels que les échanges gazeux au niveau des
poumons, la régulation cardiaque, la thermogénèse et le développement du système nerveux

1
central (SNC) qui maintient une coordination adéquate des fonctions cardio-respiratoires
(Buchholz, 2015). Alors que seule la physiologie des mammifères sera abordée dans les
paragraphes suivants, tous les vertébrés possèdent de façon similaire un système de contrôle
de production des hormones thyroïdiennes par l’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien.

1.2. Axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien

Les hormones thyroïdiennes, principalement la thyroxine (T4; 3,5,3’,5’-

tetraiodothyronine) et triiodothyronine (T3; 3,5,3′-triiodothyronine), sont produites via l’axe
hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HPT) (Figure 1). Cette production est initiée par la
libération de l’hormone thyérotrope (TRH) via la région périventriculaire parvicellulaire du
noyau paraventriculaire de l’hypothalamus en réponse aux signaux environnementaux
(Zoeller et al., 2007). La TRH circule jusqu’à l’hypophyse antérieure afin de déclencher la
production de thyréostimuline (TSH) qui contrôle la production et sécrétion d’hormones
thyroïdiennes (Degitz et al., 2005). Le taux de TRH et TSH dans la circulation est modulé en
partie par le contrôle rétroactif des hormones thyroïdiennes sur l’hypothalamus et par
conséquent, son action sur l’hypophyse. Les mécanismes moléculaires qui gèrent cette
rétroaction restent vaguement compris, mais il est démontré que la T3 peut se lier aux
récepteur thyrotrophes de l’hypophyse et la T4 agit sur l’expression des gènes TSH-β,
suggérant ainsi que les hormones thyroïdiennes ont la capacité de réguler leur propre
production (Ahmed et al., 2008; Bogazzi et al., 1997). La synthèse des hormones
thyroïdiennes par la glande thyroïde sera abordée dans la section suivante.

2
Figure 1. Axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien. Régulation de la production des
hormones thyroïdiennes, transport dans le sang et dans les cellules et effets sur cette dernière
à travers des mécanismes génomiques et non-génomiques (Moog et al., 2017).

1.2.1 Métabolisme des hormones thyroïdiennes

Les hormones thyroïdiennes sont d’abord synthétisées dans la glande thyroïde

composée d’un seul type de cellule, les cellules thyroïdiennes folliculaires (Hulbert, 2000).
Ces dernières se regroupent sous forme de follicule de type colloïde et assurent la production,
le stockage et la libération d’hormones thyroïdiennes dans la circulation sanguine (Hulbert,
2000). La production débute avec la synthèse de la thyroglobuline (TG) qui sert de réservoir
de résidus tyrosines sur lesquels pourront se lier des atomes d’iodes (figure 2) (Ahmed et al.,
2008). L’hormone est produite par la condensation de deux cycles aromatiques de résidus de
tyrosine couplés à des atomes d’iodes par la thyroperoxidase, le tout lié au précurseur TG
(Dunn and Dunn, 1999). Chaque cycle aromatique (un extérieur et un intérieur) peut se lier
à deux atomes d’iodes afin de déterminer le type d’hormones produit ; T4 contenant 4 atomes
d’iode et T3 lié à 3 atomes suite à la déiodination sur le cycle extérieur (Hulbert, 2000). Afin
de créer une déficience expérimentale en hormones thyroïdiennes, plusieurs composés

3
antithyroïdiens agissent sur l’iode et plus précisément son transport dans la glande thyroïde
(perchlorate de sodium) ou sa liaison avec le résidu de tyrosine (méthimazole; MMI et
propylthiouracile; PTU) (Opitz et al., 2006). La T4 et T3 restent liées à la thyroglobuline lors
de leur entreposage dans le colloïde jusqu’à ce qu’elles soient prisent en charge par les
cellules folliculaires et sécrétées (Wendl et al., 2002). La T4, majoritairement sécrétée par la
glande thyroïde (~93%), possède une faible activité biologique alors que la T3, très active
biologiquement, est sécrétée dans une moindre mesure (~7%) (Bernal, 2000; Holzer and
Laudet, 2013). Les hormones en circulation dans le système se déplacent soit sous la forme
libre (1% de la concentration d’hormones) ou en liaison avec des protéines de transport telles
que la globuline de liaison à la thyroxine (TBG), la transthyrétine (TTR) ainsi que l’albumine
(Moog et al., 2017). Une fois arrivées au tissu visé, les hormones passent par différents
procédés qui déterminent la concentration locale dans le tissu.

4
Figure 2. Schéma de la synthèse des hormones thyroïdiennes. L’action des enzymes D1-
D3 s’exerce sur le cycle aromatique extérieur (ORD) ou intérieur (IRD). Tiré de (Holzer and
Laudet, 2013)

1.2.2 Transport et contrôle local des niveaux d’hormones thyroïdiennes

Afin de contrôler localement la concentration d’hormones thyroïdiennes, trois

iodothyronines déiodinases (D1, D2, D3) agissent en retirant l’atome d’iode du cycle
extérieur ou intérieur de l’hormone (Figure 2) (Bianco and Kim, 2006). La D1 catalyse la
conversion de la T4 en T3 dans le foie et les reins et est responsable de la majeure fraction
de T3 en circulation dans le système. Au niveau du cerveau (e.g. cortex cérébral, cervelet,

5
tronc cérébral, hippocampe, thalamus, hypothalamus), la D2 catalyse la conversion de T4 en
T3 principalement dans les astrocytes et T3 est ensuite relâchée afin d’être utilisée
notamment par les neurones (Crantz et al., 1982; Guadaño-Ferraz et al., 1997). Il est estimé
que près de 80% de T3 dans le SNC provient de la conversion locale de T4 par la D2 (Figure
3) (Crantz et al., 1982; Mohácsik et al., 2011). Pour sa part, D3 est située dans le SNC et
convertit la T4 en T3 inverse (rT3) et la T3 en 3,3'-diiodothyronine (T2), toutes deux
considérées comme inactives, mais pouvant exercer un effet dans des conditions spécifiques
(Ball et al., 1997; Köhrle, 2000). En plus de la conversion locale des hormones, le niveau de
T3 et T4 dans les différents systèmes est contrôlé par le transport des hormones dans les
cellules grâce aux transporteurs d’hormones thyroïdiennes transmembranaires (THTs)
(Moog et al., 2017). Ce groupe inclus les membre de la famille des peptides de transport
d’anions organiques (OATPs), les transporteurs L-amino acide (LATs) et les transporteurs
monocarboxylates (MCTs) (Bernal, 2005). Les OATPs sont largement distribués à travers le
cerveau et sont principalement retrouvés dans les cellules endothéliales des capillaires du
cerveau et du plexus choroïdien (Figure 3) (Pizzagalli et al., 2002). Ils ont une grande affinité
pour le transport de T4 et rT3 avec une plus faible affinité pour T3 (Pizzagalli et al., 2002).
Leur rôle principal serait alors de transporter T4 à travers la barrière hémato-encéphalique
par les astrocytes où l’hormone sera par la suite convertie en T3 et permettent aussi le
relâchement de rT3 (Bernal, 2005). Parmi la famille des transporteurs monocarboxylates, les
deux transporteurs spécifiques pour les hormones thyroïdiennes sont MCT8 et MCT10
(Visser et al., 2008). MCT8 est exprimé dans les neurones et pourrait jouer un rôle dans
l’absorption neuronale de T3 produite par les astrocytes (Figure 3) (Heuer et al., 2005).
MCT8 assure aussi le passage de T4 et T3 à travers la barrière hémato-encéphalique afin
d’atteindre les cellules nerveuses et gliales situées proche des vaisseaux sanguins
(Dumitrescu et al., 2006; Trajkovic et al., 2007). Une fois l’hormone convertie et transportée
dans la cellule d’intérêt, son action sur l’organisme peut passer par la voie génomique
impliquant les récepteurs nucléaires ou par différentes voies non-génomiques abordées dans
la section suivante.

6
Figure 3. Représentation schématique du transport et déodination des hormones
thyroïdiennes. A) Circulation de T3 et T4 dans le système sanguin ou le liquide
cérébrospinal. Transport des hormones à travers la barrière hémato-encéphalique et insertion
dans les astrocytes par l’action de OATP1C1 ou MCT8. B) Conversion locale de T4 en T3
par D2. C) Transport de T3 des astrocytes vers les neurones par MCT8. Le transporteur
responsable de la sécrétion de T3 par les astrocytes est encore inconnu. Tiré de (Dezonne et
al., 2015)

1.2.3 Action génomique et non-génomique des hormones thyroïdiennes

La T3 produit la majorité de ses effets en interagissant avec des récepteurs nucléaires

(TRs) comme facteurs de transcription (Moog et al., 2017). Ces récepteurs nucléaires sont

7
regroupés sous quatre isoformes dont deux (TRα1 et TRβ2) ont la capacité de se lier à T3,
de former un complexe intra-nucléaire avec l’hormone et ainsi occuper les complexes
régulateurs situés sur les gènes de réponse à l’hormone thyroïdienne pour modifier leur
transcription (Cheng et al., 2010; Moog et al., 2017). Il est reconnu que la T3 possède une
affinité pour les récepteurs TRs dix fois plus élevée que la T4, expliquant en partie sa
catégorisation en tant que molécule biologiquement active (Hulbert, 2000). Malgré l’effet
nucléaire reconnu des hormones thyroïdiennes, ces dernières peuvent également exercer
certains de leurs effets via des mécanismes non-génomiques (Davis et al., 2016a). Ces
mécanismes n’impliquent pas la transcription de gènes ni la synthèse de protéines assurant
ainsi une réponse plus rapide (minutes ou quelques heures) comparativement à l’effet
génomique de T3 et sa liaison aux récepteurs nucléaires (Davis et al., 2016a). L’effet non-
génomique peut être engendré par la liaison de l’hormone thyroïdienne à un isoforme tronqué
du récepteur nucléaire retrouvé dans le cytoplasme, la membrane plasmatique ou la
mitochondrie tel que p30 TRα1 (Davis et al., 2016a; Kalyanaraman et al., 2014). Il a aussi
été démontré que T3 et T4 agissent via un récepteur transmembranaire αvβ3 (Davis et al.,
2011). Contrairement aux isoformes tronqués, cette intégrine n’est pas homologue au
récepteur nucléaire TR et possède deux domaines de liaison aux hormones thyroïdiennes
avec un affinité plus importante pour T4 que T3 (Davis et al., 2016a; Lin et al., 2011).
L’action non-génomique des hormones thyroïdiennes à travers les isoformes tronqués et
l’intégrine αvβ3 a été reliée à la formation des microfilaments du cytosquelette (migration
neuronale et ostéogénèse), l’angiogénèse et le contrôle de la prolifération de cellules
cancéreuses. Elle est aussi reliée à la respiration cellulaire de la mitochondrie par la liaison
aux récepteurs mitochondriaux p43 et p28 (Figure 4) (Bergh et al., 2005; Davis et al., 2011;
Kalyanaraman et al., 2014; Padron et al., 2014; Wrutniak-Cabello et al., 2001). L’action
locale des hormones thyroïdiennes à la membrane plasmatique ou autres membranes active
aussi plusieurs pompes ioniques telles que l’échangeur Na+/H+ qui maintient le pH cellulaire
en cas de stress et Na+/K+-ATPase, cruciale pour l’homéostasie cellulaire (Figure 4)
(D’Arezzo et al., 2004; Lei et al., 2004, 2009)

8
Figure 4. Effet non-génomique de T3 et T4. A) Liaison avec l’intégrine αvβ3 et action sur
la transcription du gène. B) Régulation du cytosquelette par T4 et rT3. C) Modification de la
prolifération cellulaire par la liaison de T3 à l’isoforme tronqué p30 TRα1. D) Activation de
l’échangeur Na+/H+ par T3 à travers la signalisation MAPK1 et MAPK2. E) Activation de la
pompe ionique Na+/K+-ATPase via PI3K/AKT. F) Mécanisme d’action directe de T3 et T2
sur la respiration mitochondriale par les récepteurs p43 et p28. Modifié de (Davis et al.,
2016a).

9
1.3 Ontogénèse des hormones thyroïdiennes et développement
neurologique

Le modèle expérimental du rongeur a été extrêmement utile pour la compréhension

de l’ontogénèse des hormones thyroïdiennes lors du développement, mais l’adaptation des
résultats obtenus vers le modèle humain doit se faire avec précaution considérant les
différences temporelles du développement de chacun. En effet, la glande thyroïde de
l’humain est fonctionnelle à 18-20 semaines de gestation comparativement à l’âge
gestationnel de 17.5-18 jours pour le rat (GD17.5-18) (Ausó et al., 2004; Morreale de Escobar
et al., 2004; Porterfield and Hendrich, 1993). De plus, le nouveau-né humain peut être
comparé à un raton de 10 jours, ce qui signifie que le rongeur naît avec un système nerveux
sous-développé (Morreale de Escobar et al., 2004). Plusieurs évènements développementaux
se produisent donc chez le rongeur en période postnatale où son système n’est plus protégé
par le transfert d’hormones maternelles comparativement à l’humain, puisque le lait maternel
du rongeur contient très peu d’hormones thyroïdiennes (Morreale de Escobar et al., 2004).
Alors qu’une comparaison efficace peut être effectuée entre les deux modèles avant le début
des fonctions de la glande thyroïde, les résultats provenant des périodes développementales
subséquentes doivent être comparés avec modération. Afin de clarifier l’ontogénèse des
hormones thyroïdiennes, la Figure 5 représente adéquatement les différentes phases de
développement du système nerveux influencées par les hormones thyroïdiennes chez
l’humain (peut être comparé au rongeur) ainsi que les procédés reliés à l’action et
l’homéostasie de T3 et T4 qui seront abordés dans les sections suivantes.

10
Figure 5. Résumé du développement fœtal et postnatal du cerveau humain en relation
avec les hormones thyroïdiennes. Le moment approximativement équivalent de la
naissance du rat est représenté par la barre grise vers la mi-gestation de l’humain. A)
Ontogénèse des procédés régulant l’homéostasie des hormones thyroïdiennes. B) Altérations
des niveaux d’hormones au cours du développement. C) Schéma des procédés neuro-
développementaux influencés par les hormones thyroïdiennes. Tiré de (Bernal, 2007)

11
1.3.1 Apport d’hormones thyroïdiennes maternelles pendant la gestation

Pendant des années, le placenta était vu comme une barrière imperméable aux
hormones thyroïdiennes de source maternelle. Plusieurs études démontrent désormais que les
hormones thyroidiennes maternelles représentent la seule source d’hormone pour le fetus
jusqu’à ce que la glande thyroide fetale soit fonctionnelle. Les hormones thyroidiennes sont
donc présentent dans le système nerveux au cours de la majeur partie du développement
(Bárez-López et al., 2018; Bradley et al., 1992; Dong et al., 2015; de Escobar et al., 2004;
Fernández et al., 2015; Ferrara et al., 2013; Ferreiro et al., 1990; Morreale de Escobar et al.,
1990, 2000; Obregon et al., 1984; Perez-Castillo et al., 1985; Porterfield and Hendrich, 1991;
Ruiz de Oña et al., 1988, 1991). Avant que la glande soit en mesure de produire ses propres
réserves d’hormone thyroïdiennes utilisables, les tissus embryonnaires sont fournis avec des
faibles niveaux de T4 et T3 de source maternelle dès l’âge gestationnel GD11 (Calvo et al.,
1990, 2002; Obregon et al., 1984; Woods et al., 1984). Une expression des récepteurs TRs
est aussi retrouvée dans le tube neural à l’âge gestationnel GD11 ainsi que dans le
prosencéphalon, mésencéphalon et rhombencéphalon à GD12.5 (Bradley et al., 1992).
L’expression des TRs augmente avec l’âge et les récepteurs sont occupés (liés à leur
hormones) en concentration assez significative (~25%) pour engendrer une réponse
physiologique (Bradley et al., 1992; Ferreiro et al., 1990). Le transfert des hormones
maternelles vers l’embryon est aussi confirmé par l’importante augmentation des taux de T4
maternels accompagnée par une inhibition de TSH dans le premier trimestre de gestation afin
d’assurer un apport adéquat d’hormones thyroïdiennes à l’embryon lors des phases critiques
de développement neurologique (de Escobar et al., 2004; Morreale de Escobar et al., 2004).
La T4 transférée est retrouvée principalement sous forme libre dans le fœtus due aux
différences entre la mère et le fœtus concernant la liaison de l’hormone aux protéines de
transport (Calvo et al., 2002).

Au cours de la période fœtale, la réserve en T3 du SNC dépendrait principalement de

la conversion locale de T4 maternelle en T3 générée par la déiodinase D2 (Calvo et al., 1990).
Contrairement au raton et à l’adulte où une partie de la T3 est en circulation dans le système
sanguin et traverse la barrière hémato-encéphalique pour être disponible aux cellules
présentes, le cerveau fœtal semble être en partie imperméable à la T3 de source maternelle

12
(Calvo et al., 1990; Galton et al., 2007; Trajkovic et al., 2007). En effet, le tout a été démontré
sur des rates femelles gestantes qui ont subi un hypothyroïdisme pour ensuite être
supplémentées en hormones thyroïdiennes. Alors que l’administration de T4 chez la mère
cause une augmentation des niveaux de T3 dans le cerveau fœtal, la même procédure avec
T3 n’augmente que les niveaux périphériques de T3 et n’influence aucunement ceux du SNC
(Calvo et al., 1990). La raison de cette imperméabilité peut être expliquée par le transport de
l’hormone. Malgré le fait que le patron spatio-temporel d’expression des transporteurs
d’hormones thyroïdiennes lors de la gestation chez le rongeur n’est pas entièrement compris,
les protéines de MCT8 et OATP1c1 ont été retrouvées dans le cerveau prénatal (Grijota-
Martínez et al., 2011). Il est tout d’abord supposé que MCT8 ait un rôle d’extraction de la T3
hors du SNC tôt dans le développement. Des souris déficientes du transporteur MCT8
présentent un stade d’hyperthyroïdisme du système nerveux de l’âge gestationnel GD18
jusqu’à l’âge postnatal P5 (Ferrara et al., 2013; Núñez et al., 2014). Ensuite, il est possible
que la T3 qui passe la barrière hémato-encéphalique soit directement dégradée par la
déiodinase D3 qui est exprimée en forte quantité tôt dans le développement afin de prévenir
une surexposition du cerveau aux hormones thyroïdiennes et qui diminue avec le
développement (Hernandez, 2005).

Il est intéressant de questionner la présence de T3 dans le cerveau fœtal alors qu’il est
imperméable au passage de l’hormone provenant de la périphérie. L’activité de la déiodinase
D2 n’a pour le moment été observée qu’à l’âge gestationnel GD17 et coïncide avec le début
des fonctions de la glande thyroïde (Ruiz de Oña et al., 1991). Puisque l’enzyme D2 a déjà
été observée chez le fœtus humain aux stades précédents le début de l’activité de la glande
thyroïde, la présence de T3 dans le cerveau embryonnaire du rat peut être expliquée par
l’action hâtive de la déiodinase D2 dans le système nerveux ou la participation d’un
mécanisme complémentaire ici inconnu (Calvo et al., 2002; Karmarkar et al., 1993). Ces
résultats démontrent qu’en absence d’un mécanisme compensatoire de la déiodinase D2 afin
de maintenir les niveaux de T3 dans le cerveau, toute déficience en T4 de source maternelle
ne peut se terminer que par une faible concentration intracellulaire de T3 résultant en
désordre du développement nerveux.

13
1.3.2 Hormones thyroïdiennes en fin de gestation et période postnatale

Une fois fonctionnelle, la glande thyroïde assure la production d’hormones afin que
les hormones maternelles transférées au fœtus à terme ne représentent que 17.5% des réserves
pour la T4 et 47% pour la T3 (Grijota-Martínez et al., 2011; Morreale de Escobar et al.,
1990). En phase postnatale, le raton se prépare au sevrage où il devra être indépendant de la
mère. Pour se faire, plusieurs organes tels que les intestins et le cerveau subissent des
modifications physiologiques qui sont en partie régulées par les hormones thyroïdiennes
(Holzer and Laudet, 2013). Le nouveau-né doit être en mesure de produire ses propres
hormones thyroïdiennes avant le sevrage puisque comme mentionné précédemment, le lait
maternel ne contient qu’une infime quantité d’hormones thyroïdiennes (Morreale de Escobar
et al., 2004). Suite à la naissance, la production de l’hormone T4 par le nouveau-né augmente
afin d’atteindre son pic maximum vers 16 jours de vie (Figure 6) (Dussault and Labrie,
1975). Cette production coïncide avec les niveaux de TRH et TSH observés dans le sérum
qui augmentent drastiquement à partir du 12e jour de vie et atteignent le pic vers l’âge
postnatal P16 (Dussault and Labrie, 1975). Pour sa part, la T3 augmente aussi de façon
parallèle à T4, mais atteint son pic de production plus tard vers 28 jours (Dussault and Labrie,
1975). L’expression de la déiodinase D2 augmente juste avant la naissance (GD18-21) pour
ensuite atteindre son pic à l’âge postnatal P15, ce qui explique en partie la montée en T3 à
cette période (Obregón et al., 1991; Ruiz de Oña et al., 1988). Il est supposé que c’est aussi
à cette période que le cerveau est le plus sensible à la T3 en se fiant à la forte occupation des
récepteurs TRs ainsi que les importants effets développementaux des hormones
thyroïdiennes sur le cerveau qui se produisent dans les trois premières semaines de vie du
rongeur (Ferreiro et al., 1990).

L’apport d’hormones thyroïdiennes de la mère et la production par le fœtus en période

prénatale sont nécessaires au bon développement du SNC et l’effet se poursuit suite à la
naissance où le rongeur produit ses propres réserves d’hormones. L’objectif est de maintenir
un développement neural adéquat selon les phases critiques de sensibilité. Ces phases seront
introduites dans le paragraphe ci-dessous.

14
Figure 6. Les hormones thyroïdiennes au cours du développement postnatal. Mesure des
niveaux d’hormones thyroïdiennes (T4 et T3) dans le sérum de ratons suite à la naissance.
Tiré de (Dussault and Labrie, 1975)

1.3.3 Fenêtre temporelle des procédés neuro-développementaux influencés

par les hormones thyroïdiennes

Au cours de la gestation et suite à la naissance, le système nerveux est

particulièrement sensible aux hormones thyroïdiennes, mais les périodes de dépendance
restent encore à être caractérisées (Ahmed et al., 2008; Bárez-López and Guadaño-Ferraz,
2017). Tout d’abord, il est généralement accepté qu’il n’existe pas une simple période
critique de dépendance aux hormones thyroïdiennes au cours du développement (Dowling et
al., 2000). L’action des hormones thyroïdiennes dépendrait plutôt de la région ciblée et de sa
sensibilité à l’hormone lors d’une période spécifique du développement, sensibilité qui est
engendrée en partie par le contrôle local des hormones thyroïdiennes (Zoeller and Rovet,
2004). Malgré la large distribution régionale et temporelle de l’effet des hormones

15
thyroïdiennes sur le développement neurologique, il est possible de regrouper le tout en trois
grandes périodes de dépendance (Figure 7) :

La première phase se produit avant le début des fonctions de la glande thyroïde où la

mère est la seule source d’hormones thyroïdiennes pour le fœtus. Bien que les hormones
thyroïdiennes n’ont pas d’influence sur les évènements développementaux très hâtifs tels que
l’induction neural et l’établissement de la polarité, leur présence influence les procédés
ultérieurs incluant la prolifération et la migration des neurones dans le cortex cérébral et
l’hippocampe (Ausó et al., 2004; Lucio et al., 1997; Narayanan and Narayanan, 1985). Il a
été démontré qu’un hypothyroïdisme maternel chez le rat mène à un défaut dans la
prolifération de précurseurs neuronaux, des procédés qui sont habituellement complétés entre
l’âge gestationnel GD12 et GD16-17, donc avant le fonctionnement de la glande thyroïde
(Lucio et al., 1997; Narayanan and Narayanan, 1985). La T4, par sa liaison avec l’intégrine
αvβ3, est nécessaire pour la prolifération de précurseurs neuronaux intermédiaires et une
déficience en T4 mène à une réduction de l’épaisseur corticale avec la perte de couches
supérieures (Mohan et al., 2012). De plus, une déficience en hormones thyroïdiennes chez la
mère, causée par une alimentation pauvre en iode s’ensuit d’une migration anormale des
neurones qui est achevée aussi avant GD17.5-18 (Lavado-Autric et al., 2003).

La deuxième phase a lieu entre le début de l’activité de la glande thyroïde et la

naissance. Au cours de cette période, le fœtus et la mère fournissent de façon combinée un
stock d’hormones thyroïdiennes utilisables pour le développement (Ahmed et al., 2008).
Cette phase est très courte chez le rat et inclue principalement la continuation de la migration
et neurogénèse cérébrale (Porterfield and Hendrich, 1993). À ce stade, les procédés
neurologiques dépendants aux hormones thyroïdiennes incluent la différentiation neuronale,
la croissance axonale, la ramification dendritique, la synaptogénèse et la migration et
différentiation des cellules gliales (Bernal et al., 2003; Morreale de Escobar et al., 2000;
Porterfield and Hendrich, 1993). Il est d’ailleurs démontré que l’hypothyroïdisme
développemental cause une réduction dans l’expression de régulateurs de la différentiation
neuronale, la croissance des neurites et la synaptogénèse. Ces régulateurs incluent le facteur
neurotrophique issu du cerveau (Brain derived neurotrophic factor; BDNF), le facteur
neurotrophique-3 (NT-3), le facteur de croissance 1 analogue à l’insuline (IGF-1), la sous-

16
unité 5 du complexe ARP 2/3 (ARPC5) et la protéine 2B médiatrice de la réponse de la
collapsine (CRMP2B) (Elder et al., 2000; Koibuchi et al., 1999; Lindholm et al., 1993; Liu
et al., 2013)

Finalement la troisième phase se déroule suite à la naissance. Puisque le système

nerveux du rat n’est pas entièrement développé à la naissance, la phase trois englobe encore
la majorité des procédés de la phase deux ainsi que la myélinisation (Bernal et al., 2003;
Morreale de Escobar et al., 2000; Porterfield and Hendrich, 1993). Un hypothyroïdisme
néonatale retarde le dépôt de myéline par la suppression de la biosynthèse de ses composantes
telles que la cérébroside, la sulfatide et la sphingomyéline (Tsujimura et al., 1973). En
conséquence, une réduction du volume de la matière blanche et du pourcentage de matière
blanche a été observé chez des rats déficients en hormones thyroïdiennes durant le
développement (traitement PTU) et ces changements persistent longtemps après que les
niveaux d’hormones normaux soient rétablis chez l’animal (Powell et al., 2012).

Chaque procédé développemental est altéré par une déficience en hormones

thyroïdiennes et il est accepté que le moment où le fœtus est coupé de la source maternelle
représente un facteur critique dans le dénouement du développement. Cependant, plus la
carence en hormones thyroïdiennes est présente tôt dans le développement, plus grave seront
les conséquences sur les fonctions neurologiques (Williams, 2008).

17
Figure 7. Les hormones thyroïdiennes et le développement du cerveau. Phases de
développement neurologique dépendantes aux hormones thyroïdiennes chez le rat. DPC :
jours post-conception. DPN : jours postnataux. Tiré de (Porterfield and Hendrich, 1993)

1.4 Causes de la déficience en hormones thyroïdiennes

1.4.1 L’hypothyroïdisme et l’hypothyroxinémie maternelle

En lien avec l’hypothèse que le placenta agit comme barrière imperméable aux
hormones thyroïdiennes, il a longtemps été proposé que les effets des hormones sur le
cerveau aient seulement lieu suite à la naissance (Fisher, 1999). Cette hypothèse est en partie
due aux études sur des modèles d’hypothyroïdisme congénital, un désordre du
développement de la glande thyroïde du fœtus qui engendre une production réduite de T4 à
la naissance (Macchia, 2000). Si l’hypothyroïdisme est détecté rapidement et traité dès la
naissance, il est possible de contrer les défauts neurologiques habituellement rencontrés
(Bernal, 2007). Dans cette situation, les cliniciens ont cependant omis de considérer le rôle
des hormones maternelles qui ne sont pas affectées par l’hypothyroïdisme congénital et
protègent le cerveau au cours de la gestation (Bernal, 2007). Un apport adéquat de T4 de la
mère assure un niveau normal de T3 au cerveau du fœtus et évite des dommages sévères
pendant la gestation. Puisque le cerveau a été épargné, il est possible de rétablir son

18
développement normal suite à la naissance avec une supplémentation en T4 (Morreale de
Escobar et al., 2004).

Les désordres neurologiques plus importants se produisent plutôt lorsque les niveaux
maternels de T4 sont sous les valeurs normales au cours de la gestation, situation engendrée
par diverses affections du statut thyroïdien incluant l’hypothyroïdisme maternel avec des
niveaux relativement faibles de T4 et T3 ou une hypothyroxinémie maternelle où seule la
concentration de T4 est réduite alors que la T3 n’est pas affectée (Morreale de Escobar et al.,
2004).

- L’hypothyroïdisme chez la mère peut être causé entre autre par une déficience de
Pit-1, un facteur de transcription pour le développement de l’hypophyse ou par la
présence en forte dose d’anticorps bloquant la stimulation de la glande thyroïde
(Blizzard et al., 1960; Yasuda et al., 1999; de Zegher et al., 1995). Plusieurs études
ont caractérisé les conséquences neuro-anatomiques et fonctionnelles d’une
carence en hormones thyroïdiennes chez le rongeur par la provocation d’un
hypothyroïdisme expérimental avec l’utilisation de drogues anti-thyroïdiennes
(MMI et PTU) ou la thyroïdectomie de la mère lors de la gestation (Moog et al.,
2017). Des modèles génétiques d’insuffisance en hormones thyroïdiennes par la
délétion ou mutation des récepteurs TRs permettent d’engendrer des réductions
drastiques des niveaux de T4 et T3 comparable à l’hypothyroïdisme (Moog et al.,
2017).
- D’autres modèles de déficience modérée par l’apport de faibles doses de PTU à
la mère ont aussi été utilisés afin de représenter la diminution dose-dépendante de
T4 seulement, qui représente plus adéquatement l’hypothyroxinémie maternelle
(Gilbert and Sui, 2006; Goodman and Gilbert, 2007). L’hypothyroxinémie reste
cependant principalement causée par le manque d’iode chez la mère au cours de
la grossesse (Morreale de Escobar et al., 2004). Un manque d’iode chez la mère
au cours de la grossesse engendre une diminution des niveaux de T4 tant chez la
mère que chez le fœtus. Les syndromes neurologiques tels que des défauts
cognitifs, moteurs et retard de croissance ne sont pas corrigés par une
supplémentation en hormones thyroïdiennes après la naissance (Gilbert et al.,

19
 2012; Morreale de Escobar et al., 2004). Au cours de la gestation, les femmes
représentent un groupe très vulnérable à toute déficience en iode puisque leur
besoin augmente de 50% à 75% (Glinoer, 2007; McLeod and McIntyre, 2010).
Très peu de femmes prennent des suppléments d’iode au cours de la grossesse et
c’est pourquoi près de une femme sur trois est considérée comme déficiente en
iode aux États-Unis et en Angleterre (Bath et al., 2013; Caldwell et al., 2011).

L’apport d’hormones thyroïdiennes par la mère peut être coupé de manière autre que
par la perturbation de la synthèse des hormones maternelles. Un retrait précoce du fœtus
assure parfois cette interruption.

1.4.2 Prématurité et production d’hormones thyroïdiennes

Outre l’impact de l’hypothyroïdisme sur la mère, il a été démontré que cette

déficience en hormones thyroïdiennes augmente le risque de naissance prématurée chez le
nouveau-né (Shinohara et al., 2018). Le rôle des hormones thyroïdiennes dans ce phénomène
est cependant encore méconnu. Malgré tout, puisque l’importance des hormones maternelles
dans la gestation a été amplement discutée, il n’est pas surprenant de noter qu’une coupure
précoce du fœtus de la source maternelle d’hormones par la naissance prématurée engendre
de grave conséquences dans le développement du système nerveux, augmente les risque de
paralysie cérébrale et cause d’importants dommages à la matière blanche (Den Ouden et al.,
1996; Leviton et al., 1999; Reuss et al., 1996). La naissance prématurée engendre non
seulement une baisse des niveaux de TSH, T4 et T3 de près de 75% chez le nouveau-né, mais
empêche aussi l’importante élévation de production des hormones thyroïdiennes suite à la
naissance (Biswas et al., 2002; Lain et al., 2016). Aussi, plus la naissance est prématurée,
plus faibles seront les niveaux d’hormones thyroïdiennes chez l’enfant (Biswas et al., 2002).
Une importante relation a d’ailleurs été effectuée entre les faibles niveaux de T4 chez les
nouveau-nés prématurés et la sévérité de maladies pulmonaires amenant à la dépendance
ventilatoire suite à la naissance ou même la mort (Biswas et al., 2002).

20
 Il n’est pas difficile de croire que le système respiratoire est sensible aux hormones
thyroïdiennes lors du développement et que les multiples perturbations de la synthèse de T4
et T3 pendant la gestation peuvent engendrer certains désordres respiratoires observés chez
les nouveau-nés. Bien que plausible, cette idée n’a pas encore été testée de façon directe en
laboratoire.

2. Système de contrôle respiratoire

La respiration chez les mammifères est un procédé qui paraît simple alors qu’il s’agit
d’un comportement remarquablement complexe où des échanges gazeux sont effectués au
niveau des poumons afin de supporter le métabolisme de l’organisme et contrôler son pH
(Feldman and Del Negro, 2006). Le niveau des gaz sanguins dépend donc pour une part de
l’activité métabolique – consommation d’oxygène et production de CO2, et pour autre part
des échanges avec l’air ambiant qui sont réalisés par les poumons. Des cellules spécialisées
mesurent en permanence le niveau des gaz artérielles, et sont capable d’ajuster l’activité
respiratoire selon les besoins métaboliques (Figure 8). C’est par exemple le cas lors d’une
activité physique soutenue qui augmente le métabolisme et crée une augmentation rapide du
rythme respiratoire (Feldman and Del Negro, 2006). En revanche, le rythme respiratoire peut
aussi s’adapter facilement à des changements plus lents associés par exemple au
développement, à la grossesse, au vieillissement ou à la maladie (Feldman and Del Negro,
2006). Les muscles respiratoires impliqués dans la ventilation des poumons seront abordés
dans la section suivante.

2.1 Principes de base de la ventilation pulmonaire

Les échanges gazeux sont assurés par la ventilation des poumons, résultat d’une
variation rythmique du volume thoracique divisée en trois phases principales : inspiration,
expiration et post-inspiration (Ballanyi et al., 1999). Au cours de l’inspiration, la contraction

21
du diaphragme et des muscles intercostaux externes crée une pression négative à l’intérieur
de la cavité thoracique, ce qui engendre un accroissement du volume pulmonaire et un influx
d’air dans les voies aériennes supérieures (Figure 8) (Feldman and Del Negro, 2006). Une
fois passé les voies aériennes supérieures, l’air entre dans les voies aériennes inférieures qui
incluent la trachée, les bronches et les bronchioles jusque dans les alvéoles pulmonaires où
les échanges gazeux sont effectués avec le système sanguin (Del Negro et al., 2018). Par la
suite, l’expiration est habituellement effectuée sous forme passive lorsque les poumons et la
cage thoracique reviennent à leur position d’équilibre et l’air est expulsé du corps (Feldman
and Del Negro, 2006). Si le métabolisme augmente, l’expiration est effectuée sous forme
active par le recrutement des muscles expiratoires incluant les muscles abdominaux et
intercostaux internes (Del Negro et al., 2018). Au cours de l’inspiration et de l’expiration, les
muscles squelettiques de la bouche, du nez et de la gorge ainsi que les muscles lisses des
bronches produisent une résistance qui modifie le flux d’air (Figure 8) (Feldman and Del
Negro, 2006). La post-inspiration peut survenir à la fin de l’inspiration et ralentie le
dégonflement des poumons par un allongement de la contraction du diaphragme et une
adduction des muscles laryngés (modification de la résistance aérienne) (Del Negro et al.,
2018). Elle permet donc à l’air de rester plus longtemps dans les poumons, étape qui est
bénéfique aux échanges gazeux dans les alvéoles (Dutschmann et al., 2014). Cette phase
n’est cependant pas nécessaire à la respiration considérant que l’activité musculaire post-
inspiratoire s’arrête de façon intermittente au cours du sommeil et en cas d’anesthésie
(Dutschmann et al., 2014). La coordination de ces phases respiratoires requière une
génération adéquate du rythme respiratoire effectuée dans les réseaux neuronaux du tronc
cérébral. Les composantes de la génération seront abordées dans le paragraphe ci-dessous.

22
Figure 8. Le système respiratoire. Représentation anatomique des multiples composantes
dans le contrôle de la ventilation pulmonaire. Ceci inclut les muscles et nerfs respiratoires
responsables des mouvements ventilatoires, les voies aériennes, les centres de
chémoréception centrale (pF) et périphérique (corps carotidien) ainsi qu’un des noyaux de
génération du rythme respiratoire situés dans le tronc cérébral (complexe pré-Bötzinger). Tiré
de (Del Negro et al., 2018).

23
2.2 Composantes centrales de la commande respiratoire

Les mouvements ventilatoires sont produits de façon très coordonnée par l’activité
motrice rythmique générée dans les réseaux neuronaux semi-autonomes du tronc cérébral et
de la moelle épinière, appelés générateurs de patron central (central pattern generator; CPGs)
(Smith et al., 2013). Ces réseaux sont constitués de microcircuits générateurs de rythme et de
patron respiratoire qui transmettent leur signal vers les muscles en effectuant une constante
intégration sensori-motrice des afférences provenant des voies aériennes, des poumons, des
gaz sanguins ainsi que des mécano et chémorécepteurs (Figure 9) (Grillner, 2006). L’activité
respiratoire est aussi modulée par les régions supérieures qui incluent le cortex moteur et
sensoriel, le ganglion basal, le cervelet et l’hypothalamus (Pattinson et al., 2009a, 2009b).
Les signaux respiratoires sont acheminés aux motoneurones crâniens et spinaux qui
contrôlent respectivement les muscles des voies aériennes supérieures et les muscles
abdominaux, thoraciques et le diaphragme (Smith et al., 2013).

24
Figure 9. Générateur de patron central (CPG). Représentation schématique d’un
générateur de patron central incluant les microcircuits générateurs de rythme et de patron
respiratoire. L’influx nerveux est transmis par les motoneurones respiratoires. Le signal du
CPG est influencé par les afférences périphériques provenant des diverses composantes du
système cardio-respiratoire. Tiré de (Del Negro et al., 2018)

On retrouve le CPG respiratoire de façon bilatérale et étendue sur deux régions du

tronc cérébral : le pont et la moelle allongée (medulla oblongata; anciennement nommée
bulbe rachidien) (Smith et al., 2013). Au cœur du CPG respiratoire se trouvent des
microcircuits générateurs de rythme composés de plusieurs populations neuronales
respiratoires inhibitrices et excitatrices (Smith et al., 2013). Ces microcircuits possèdent une
multitude d’interactions avec les noyaux de la moelle allongée et du pont (Figure 10). Ces
groupes et noyaux sont définis par leur localisation et leur(s) fonction(s) : les régions
rythmogéniques incluent le complexe pré-Bötzinger (préBötC), le noyau
rétrotrapézoïde/groupe respiratoire parafacial (RTN/pFRG) et le complexe post-inspiratoire
(PiCo). Les sites qui influencent la genèse du rythme incluent le complexe Bötzinger (BötC),
les groupes respiratoires rostral-ventral (ventral respiratory group; rVRG/cVRG), le noyau
du tractus solitaire (NTS), les noyaux du raphé et les groupes respiratoires du pont.

25
Figure 10. Noyaux et groupes respiratoires du tronc cérébral impliqués dans la
génération et régulation du rythme respiratoire. Illustration des compartiments
respiratoires du tronc cérébral représentés sous forme anatomique par des coupes coronales
et parasagittales. À noter que ces derniers sont tous retrouvés de façon bilatérale dans le tronc
cérébral. Les régions rythmogéniques sont indiquées en rouge : complexe pré-Bötzinger
(préBötC), noyau rétrotrapézoïde/groupe respiratoire parafacial (RTN/pFRG) divisé en
noyau parafacial ventral et noyau parafacial latéral (pFv/pFL), complexe post-inspiratoire
(PiCo). Les noyaux moteurs sont indiqués en vert : noyau moteur de l’hypoglosse (XII),
noyau moteur facial (VII) et trijumeau (V). Les sites qui influencent la genèse du rythme sont
indiqués en gris : groupes respiratoires ventraux (rVRG/cVRG), complexe Bötzinger (BötC),
noyau du tractus solitaire (NTS), noyau Kölliker-Fuse (KF), locus coeruleus (LC). Modifié
de (Del Negro et al., 2018).

26
2.2.1 Le complexe pré-Bötzinger

Le complexe pré-Bötzinger est situé dans la partie ventro-latérale de la moelle

allongée et est considéré comme le générateur de rythme inspiratoire dominant (Figure 10 )
(Feldman and Del Negro, 2006; McKay et al., 2005). En effet, l’enregistrement
électrophysiologique de coupes de cerveaux contenant la région du préBötC produit un
rythme de décharge impossible à distinguer du rythme produit par la préparation en bloc de
tronc cérébral et moelle épinière isolés. Ce rythme est bien sûr différent de celui enregistré
in-vivo puisqu’il est dépourvu des afférences périphériques (Ramirez et al., 2002; Richter
and Spyer, 2001; Smith et al., 1990). La nécessité du préBötC dans la génération du rythme
respiratoire a été supportée par différentes études in-vivo et in-vitro. Ces dernières ont
démontré qu’une lésion bilatérale des neurones du préBötC engendre un patron respiratoire
ataxique chez des rats adultes, que la suppression de l’activité neuronale excitatrice du
préBötC élimine le rythme inspiratoire et qu’une réduction du nombre de neurones du
préBötC produit une respiration anormale ponctuée d’apnées centrales chez des souris
nouveau-nés (Blanchi et al., 2003; Gray et al., 2001; Tan et al., 2008). Par la suite, sa
dominance dans la génération du rythme a été mise en évidence lorsqu’un patron de décharge
inspiratoire normal a pu être observé sur une préparation de tronc cérébral de rat ayant subi
une ablation des régions rostrales au préBötC qui incluent des circuits respiratoires pontiques
et supra-pontiques tels que le RTN/pFRG (discuté ci-dessous) (Janczewski and Feldman,
2006).

Le préBötC est composé de neurones glutamatergiques excitateurs qui représentent

la principale source de signal rythmique inspiratoire et qui expriment le récepteur
neurokinine-1 (NK1), le peptide somatostatine (SST) et le facteur de transcription du
développement cérébral Homeobox 1 (DbX1) (Bouvier et al., 2010; Gray et al., 2010; Tan
et al., 2010). Le ciblage de ces marqueurs de neurones a largement été utilisé afin de
déterminer les fonctions du préBötC. Une mort ciblée et étalée sur plusieurs jours des
neurones de la région du préBötC exprimant le récepteur NKI (NK1R) mène progressivement
à une pathologie respiratoire sévère chez le rat adulte (Gray et al., 2001; McKay et al., 2005).
Pour sa part, une neutralisation rapide des neurones exprimant le marqueur SST engendre
des apnées sévères chez le rat éveillé (Tan et al., 2008). Enfin, les neurones exprimant DbX1

27
possèdent de fortes propriétés de génération de décharges respiratoires et d’excitabilité et
sont considérés comme cruciaux pour la génération au rythme du préBötC (Cui et al., 2016).
L’inhibition du gène DbX1 lors du développement de souris transgéniques empêche la
formation du préBötC et entraîne la mort de l’animal à la naissance étant incapable de générer
un rythme respiratoire (Bouvier et al., 2010; Gray et al., 2010). Des neurones glycinergiques
et GABAergiques sont aussi présents dans le préBötC, composent environ 37% de la
population neuronale et inhiberaient les neurones expiratoires lors de l’inspiration (Baertsch
et al., 2018; Kuwana et al., 2006; Morgado-Valle et al., 2010; Winter et al., 2009).

Le signal respiratoire produit par le préBötC est fréquemment modulé afin

d’accommoder la respiration face à l’environnement ou à la demande de l’organisme. Les
modifications peuvent être apportées sur la génération du rythme, mais aussi du patron
respiratoire et ce de façon distincte. In-vitro, le rythme inspiratoire «brut» du préBötC est
transformé en jouant sur l’excitabilité neuronale qui change la fréquence respiratoire produite
(Del Negro et al., 2009). Cependant, ce changement n’affecte pas le patron respiratoire, car
les propriétés des décharges respiratoires telles que la durée du pic, l’amplitude et l’aire sous
la courbe restent inchangées (Del Negro et al., 2009). Il est important de noter qu’en dépit du
large support que possède la notion de mécanismes de génération de rythme et de patron
distincts, ces deux procédés peuvent être modulés de façon interdépendante (Baertsch et al.,
2018). À ce jour, plusieurs peptides modulateurs du rythme et patron inspiratoire produit par
le préBötC ont été révélés : DAMGO (récepteur µ-opioide;  rythme), substance P (récepteur
NK1;  rythme), TRH ( rythme) et SST (modifie le patron).

La mise en forme du signal inspiratoire généré par le préBötC est aussi effectuée par
certains sites neuronaux en amont de ce dernier ; ces sites seront détaillés dans les sections
suivantes. Le signal est par la suite acheminé vers les muscles respiratoires par deux voies
différentes qui elles aussi participent à sa modification : il est projeté via des circuits pré-
moteurs vers les motoneurones crâniens incluant le nerf hypoglosse (XII) et vague (X) ou via
des neurones pré-moteurs bulbo-spinaux des groupes respiratoires ventraux (détaillés ci-
dessous) (Smith et al., 2013).

28
2.2.2 Le complexe Bötzinger

Parmi les groupes neuronaux qui modulent le rythme respiratoire, le complexe

Bötzinger se situe rostralement au préBötC (Figure 10). Il est composé en majorité de
neurones expiratoires de type GABAergique et glycinergique dont les projections inhibitrices
atteignent entre autres les groupes respiratoires dorsaux, ventraux, du pont ainsi que la moelle
épinière (Alheid and McCrimmon, 2008; Smith et al., 2007). Son rôle est principalement
d’inhiber les neurones inspiratoires, assurant ainsi l’alternance des phases inspiration-
expiration (Smith et al., 2009). L’ablation des neurones du BötC ou l’élimination de l’influx
excitateur glutamatergique vers cette région entraîne la disparition du rythme respiratoire
couplée à une importante activité inspiratoire tonique (Mutolo et al., 2002, 2005). Son action
inhibitrice est principalement effectuée par l’entremise des récepteur GABAA (Bongianni et
al., 2010). La modulation des récepteurs GABAergiques et glycinergiques dans la région du
BötC et l’effet sur la respiration seront expliqués en détails dans la section 3.5 de
l’introduction. Il est proposé que le BötC reçoit aussi des afférences inhibitrices de plusieurs
régions incluant les groupes respiratoires du pont, le noyau rétrotrapézoïde, le noyau rétro-
facial controlatéral, la région ventro-latérale du noyau du tractus solitaire (NTSVL), le noyau
ambigu et le raphé magnus (Ezure et al., 2003; Gaytán et al., 1997; Smith et al., 1989). La
nature et le rôle fonctionnel de ces projections restent cependant à être définis.

2.2.3 Le noyau rétrotrapézoïde/groupe respiratoire parafacial

Le RTN/pFRG sont deux groupes neuronaux qui ont longtemps été associés par leur
caractéristiques communes telles que la chémosensibilité à l’hypercapnie, une composition
principalement faite de neurones glutamatergiques ainsi qu’une proximité de localisation
(Guyenet et al., 2005; Onimaru and Homma, 2003; Weston et al., 2004). Ils sont situés aux
marges ventrales et latérales du noyau facial, disposés de façon latérale au préBötC et rostrale
par rapport au BötC (Figure 10). Ce regroupement a été considéré comme un générateur de
rythme qui interagit avec le préBötC afin de produire le rythme respiratoire (Onimaru et al.,
1989). Aujourd’hui, les caractéristiques et fonctions du RTN/pFRG ont été revues et le site

29
est maintenant divisé en deux groupes neuronaux : le noyau parafacial ventral et le noyau
parafacial latéral (pFv et pFL).

Le noyau parafacial ventral, encore aujourd’hui appelé RTN, contient des neurones
qui expriment le marqueur apparié à homeobox 2B (PHOX2B) et qui détectent les signaux
reliés aux niveaux de CO2 et/ou de pH afin de les transmettre au préBötC et autres sites
(Guyenet and Bayliss, 2015; Guyenet et al., 2016). Dans les derniers stades gestationnels
ainsi qu’à l’âge postnatal précoce, les neurones du pFv produisent spontanément des
décharges expiratoires tardives qui entraînent le rythme respiratoire du préBötC et
augmentent son excitabilité (Onimaru and Homma, 2003; Onimaru et al., 2008; Ruffault et
al., 2015; Thoby-Brisson et al., 2009). Elles vont par la suite perdre ce rôle de générateur de
rythme avec l’avancement en âge et vont maintenir un rôle de chémoréception (Fortuna et
al., 2008; Stornetta et al., 2006).

Quant à lui, le noyau parafacial latéral semble demeurer silencieux au repos, mais
serait potentiellement recruté lors de l’expiration active afin de générer des décharges
d’expiration tardives de manière rythmique (Abdala et al., 2009; Huckstepp et al., 2016,
2015; Janczewski and Feldman, 2006; Pagliardini et al., 2011). Ses neurones se projettent
vers les neurones pré-moteurs expiratoires du groupe respiratoire ventral-caudal (voir-ci-
dessous) afin d’innerver les muscles abdominaux utilisés dans la phase expiratoire
(Janczewski et al., 2002; Silva et al., 2016). Ce noyau est en constante coordination avec le
préBötC et l’activité du pFL semble dépendante à l’influx excitateur du préBötC chez l’adulte
puisque l’expiration active ne peut être produite lorsque le signal du préBötC est supprimé
(Huckstepp et al., 2016). Dans le cas des jeunes rongeurs, tout comme le pFV, l’activité du
pFL peut être produite de façon rythmique et autonome, mais elle serait en partie inhibée par
le préBötC en conditions normales pour éviter l’activation simultanée des muscles
inspiratoires et expiratoires. Parallèlement, la réduction de l’activité du préBötC chez ces
animaux permet d’observer une expiration tardive produite par les neurones du pFL
ininterrompue (Janczewski and Feldman, 2006; Mellen et al., 2003; Sears et al., 1982;
Takeda et al., 2001).

30
2.2.4 Le complexe post-inspiratoire

La phase post-inspiratoire est contrôlée par des réseaux neuronaux impliquant les
mécanorécepteurs des poumons ainsi que l’influence de circuits pontiques, mais a récemment
été reliée à un oscillateur conditionnel nommé complexe post-inspiratoire (PiCo)
(Dutschmann and Dick, 2012; Dutschmann and Herbert, 2006; Dutschmann et al., 2014;
Poon and Song, 2014). Ce dernier est situé de façon médiane au noyau parafacial et au noyau
du nerf VII (Figure 10) (Anderson et al., 2016). Le PiCo est composé de neurones
glutamatergiques et cholinergiques qui répondent à la présence du peptide SST ainsi que des
opioïdes (Janczewski and Feldman, 2006; Janczewski et al., 2002; Mellen et al., 2003;
Takeda et al., 2001). Son activité se démarque de celles de ses voisins (BötC et pFL) et n’est
pas dépendante de l’excitation du préBötC. Il a effectivement été démontré avec l’utilisation
de tranches de cerveaux de rongeurs nouveau-nés que le rythme de PiCo est modifié de façon
indépendante de celui du préBötC en présence de différents peptides et le rythme généré par
PiCo est maintenu lorsqu’il est isolé (Anderson et al., 2016). De plus, les neurones de PiCo
in-vitro produisent des décharges post-inspiratoires suite à leur stimulation sans produire de
décharges inspiratoires (Anderson et al., 2016). Malgré ses caractéristiques rythmiques
autonomes, l’activité post-inspiratoire de PiCo doit être coordonnée avec l’inspiration du
préBötC et l’expiration active du pFL. Elle serait potentiellement inhibée par le préBötC et
inhiberait ce dernier en retour, le tout afin de s’assurer qu’en conditions respiratoires
normales, l’activité post-inspiratoire n’entre pas en concurrence avec l’inspiration (Anderson
et al., 2016).

2.2.5 Les groupes respiratoires ventraux

Suite à la génération du rythme respiratoire, la transmission du signal passe par les

groupes respiratoires ventral-rostral (rVRG) et ventral-caudal (cVRG) (Figure 10). Le rVRG
contient une population de neurones pré-moteurs bulbospinaux qui acheminent le signal
inspiratoire vers les motoneurones phréniques afin d’innerver le diaphragme (Smith et al.,
2013). Son activité est principalement contrôlée par le signal excitateur du préBötC et le

31
signal inhibiteur des neurones expiratoires du BötC afin de façonner le patron inspiratoire
(Smith et al., 2013). De son côté, le cVRG contient des neurones bulbospinaux excitateurs
qui transmettent le signal expiratoire vers les motoneurones spinaux thoraciques et lombaires
(Smith et al., 2013). Le RTN/pFRG et le BötC sont les principaux éléments qui modifient le
patron respiratoire y circulant (Alheid and McCrimmon, 2008).

2.2.6 Le noyau du tractus solitaire

À l’opposé des groupes neuronaux situés dans la partie ventrale de la moelle allongée,
le noyau du tractus solitaire (NTS) se trouve dans la partie dorsale, allongé rostro-
caudalement à travers cette région (Figure 10). Sa large distribution fait de lui le principal
intégrateur des influx gustatifs, viscéro-sensoriels et somatosensoriels ainsi qu’un site central
intégré pour la régulation cardiovasculaire (Hayakawa et al., 2001; Lawrence and Jarrott,
1996). Sur le plan anatomique, des exemples d’afférences qui atteignent le NTS incluent,
mais ne sont pas limités à : les afférences somatosensorielles du nerf trijumeau (V) dans la
partie latérale, les afférences gustatives du nerf facial (VII) dans la partie antérieure latérale
et les afférences viscéro-sensorielles du nerf vague (X) dans la partie médiale postérieure.
Les afférences des récepteurs de la muqueuse laryngée qui innervent la partie caudale du
NTS et engendrent d’importantes inhibitions cardio-respiratoires seront abordées en
profondeur dans la section 2.6.2 de l’introduction. La région dorsomédiale du NTS reçoit les
innervations des barorécepteurs, sensibles aux changements dans la pression artérielle et la
région médiane caudale au calamus scriptorius reçoit les afférences des chémorécepteurs
périphériques et plus particulièrement le signal des corps carotidiens, importants senseurs du
CO2 et O2 sanguin (expliqué dans la section 2.5.1 de l’introduction) (Donoghue et al., 1984;
Guyenet, 2006).

Pour sa part, le noyau caudal du NTS, en association avec les groupes respiratoires
dorsaux, reçoit plusieurs afférences périphériques reliées à l’activité respiratoire (Alheid et
al., 2011). Ceci inclus plusieurs signaux provenant des voies aériennes supérieures et des
poumons, capables de modifier le rythme respiratoire. Le NTS reçoit et redistribue ces

32
signaux, contribuant ainsi à l’initiation de divers réflexes respiratoires et parmi ceux-ci, le
réflexe Hering-Breuer, initié en réponse à l’activation des récepteurs de distension des
poumons (adaptation lente), mérite d’être décrit. Brièvement, lorsque les poumons sont
gonflés au maximum, ce réflexe consiste en l’inhibition de l’activité inspiratoire du préBötC,
la transition de la phase inspiratoire vers expiratoire et la prolongation de l’expiration (Kubin
et al., 2006; Luck, 1970). Au niveau du réseau neuronal, le réflexe s’explique par un signal
des récepteurs de distension pulmonaire situés dans la couche de muscle lisse trachéo-
bronchiale qui est acheminé par le nerve vague pour terminer dans le noyau du NTS dans les
cellules de type pompe (Bonham and McCrimmon, 1990; Schelegle and Green, 2001). Ces
cellules se projettent vers les neurones du noyau Kolliker-Fuse (explication du noyau ci-
dessous) ainsi que dans le BötC et préBötC (Bonham and McCrimmon, 1990).

2.2.7 Les noyaux du Raphé

Les noyaux du raphé constituent un regroupement de neurones situés au centre du

tronc cérébral qui s’étendent de la région caudale vers rostrale (Smith et al., 2013). Ils
incluent le raphé magnus impliqué dans le contrôle sensoriel, le raphé pallidus et la région
parapyramidale qui maintiennent la thermorégulation du corps ainsi que le raphé obscurus
qui joue un rôle dans le contrôle moteur somatique et autonome et qui facilite la respiration
(Madden and Morrison, 2006; Mason, 2001). Les noyaux du raphé projettent dans les
compartiment ventraux respiratoires ainsi que sur les motoneurones respiratoires (Smith et
al., 2013). Les neurones stimulent la respiration en produisant principalement de la sérotonine
(5-HT), mais il est connu qu’elles peuvent aussi produire d’autres peptides connexes tel que
la substance P et la TRH et ce, dès les premières phases de la gestation où l’activité rythmique
respiratoire apparaît (Al-Zubaidy et al., 1996; Di Pasquale et al., 1996; Pagliardini et al.,
2003). Il est d’ailleurs démontré que l’activation par optogénétique des populations de
neurones 5-HT active la respiration chez des souris éveillées ou anesthésiées (DePuy et al.,
2011). Elles jouent aussi un rôle de chémoréception puisque la réponse au CO2 est réduite
lorsque les neurones 5-HT du raphé sont inhibés (Hodges et al., 2008, 2009). Le rôle des
noyaux du raphé serait donc considérable afin de stabiliser la respiration selon les niveaux

33
de gaz sanguins et selon l’activité des autres groupes respiratoires. Un défaut dans leur
fonctionnement serait relié à certains désordres respiratoires tel que le syndrome de la mort
subite du nourrisson défini comme la mort inattendue d’un enfant âgé de 1 an et moins (SIDS;
détaillé dans la section 6 de la discussion) (Hodges et al., 2009; Paterson et al., 2006).

2.2.8 Les groupes neuronaux respiratoires du pont

La région pontique du tronc cérébral est située de façon rostrale à la moelle allongée
et possède trois noyaux principaux qui interagissent avec les CPGs afin de modifier
l’expression du rythme respiratoire. Ces noyaux incluent le locus coeruleus (LC), la région
intertrigéminale (ITR) et le noyau Kölliker-Fuse (KF) (Figure 10). Le LC facilite
l’expression du rythme respiratoire par les CPGs et semblerait participer à la chémoréception
centrale puisque l’hypercapnie provoque augmentation de son rythme de décharges
(Guyenet, 2014). La lésion de cette région réduit la ventilation de base ainsi que la réponse
ventilatoire à l’hypercapnie (Li and Nattie, 2006). Les fonctions de l’ITR sont moins bien
définies, mais sa stimulation provoquerait un arrêt de l’activité respiratoire laissant croire
qu’elle joue un rôle dans les réflexes respiratoires en réponse à un stimulus des voies
aériennes (Chamberlin, 2004; Chamberlin and Saper, 1998).

Finalement, le noyau Kölliker-Fuse (KF) est un des multiples noyaux qui composent
le complexe parabranchial. Ce dernier est défini comme une bande de matière grise situé de
manière dorsolatérale à la jonction entre le pont et le mésencéphale (Dutschmann and Dick,
2012). Le rôle du complexe parabranchial est mieux défini que ses voisins alors qu’il est
reconnu comme un noyau majeur pour l’adaptation de la respiration en réponse à la
nociception, la stimulation nasopharyngée, le chémoréflexe du corps carotidien ainsi que le
réflexe Hering-Breuer (Dutschmann and Herbert, 1998, 2006; Ezure et al., 1991; Jiang et al.,
2004; Shannon et al., 2004; Shaw et al., 1989). Ce dernier traiterait les multiples entrées
sensorielles reliées à la respiration afin de modifier le patron selon l’environnement externe
et le comportement de l’animal (Dutschmann et al., 2004). Parmi le complexe parabranchial,
le KF est le seul sous-noyau dont les neurones se projettent vers les noyaux respiratoires

34
ventraux et leur activité est coordonnée avec celle du préBötC (Browaldh et al., 2016). En
effet, une lésion de KF provoque un allongement de la phase inspiratoire chez l’animal
anesthésié démontrant ainsi une influence inhibitrice de ce dernier sur les groupes
responsables de l’inspiration (Dutschmann and Herbert, 2006). Les afférences descendantes
de KF seraient essentielles pour l’activité post-inspiratoire et donc le contrôle des phases
respiratoires, le tout en tenant constamment compte des signaux provenant des récepteurs de
distension pulmonaire (réflexe Hering-Breuer) (Dutschmann and Herbert, 2006). Plusieurs
neurones laryngés pré-moteurs de type post-inspiratoire se trouvent aussi dans le noyau KF
laissant croire un rôle de ce dernier dans la régulation de la résistance des voies aériennes
(Dutschmann and Herbert, 2006).

Ensembles, tous ces noyaux du tronc cérébral forment un réseau neuronal complexe
pour maintenir une ventilation de l’organisme convenable selon son environnement. Malgré
tout, les mécanismes inclus dans ces noyaux et sous-jacents à la rythmogenèse respiratoire
sont à ce jour encore source de débat et seront abordés dans la section suivante.

2.3 La genèse du rythme respiratoire

Comme il a été mentionné auparavant, la génération du rythme respiratoire est

contrôlée par un CPG composé de différents éléments spécifiques qui le rendent rythmique.
Le CPG est constitué de neurones qui doivent répondre à deux critères primordiaux afin de
les considérer comme des acteurs dans la genèse du rythme : 1) l’activité des neurones ou
groupes de neurones doit être en phase avec le rythme respiratoire et 2) les neurones doivent
réinitialiser le rythme de manière phasique en réponse à différents stimuli (Ramirez and
Baertsch, 2018). Si le neurone possède les deux caractéristiques, il sera en mesure de modifier
la fréquence du rythme respiratoire selon le stimulus et pourra entraîner le rythme lorsqu’il
est stimulé de façon répétitive.

35
2.3.1 Les neurones rythmiques

Les neurones rythmiques sont à la base des trois phases du cycle ventilatoire, c’est-à-dire
l’inspiration, la post-inspiration et l’expiration active. Ces derniers sont classés selon le profil
de leur patron de décharge (diminution ou augmentation de la fréquence de décharge) ainsi
que la phase ventilatoire où leur activité est dominante (Figure 11A, B) (Smith et al., 2013) :

- Les neurones pré-inspiratoires/inspiratoires (pre-I/I) commencent à décharger à la fin

de l’expiration et avant le début de l’inspiration. Ils activent les muscles de la langue
via le nerf de l’hypoglosse. L’innervation de l’hypoglosse est maintenu au cours de
l’inspiration afin d’empêcher l’obstruction de la voie oropharyngée. Le nerf vague
est aussi innervé afin d’activer les muscles laryngés qui contrôlent la glotte et les
cordes vocales et ainsi maintenir une ouverture des voies aériennes supérieures.
- Les neurones inspiratoires précoces (early-I) produisent un maximum de décharges
en début d’inspiration pour ensuite être actifs de manière décroissante.
- Les neurones inspiratoires tardifs (aug-I) déchargent de manière croissante jusqu’à la
transition de la phase inspiratoire vers post-inspiratoire. Ils innervent les
motoneurones phréniques afin de provoquer la contraction du diaphragme et
l’inflation des poumons.
- Les neurones post-inspiratoires (post-I) déchargent de façon décroissante durant la
phase post-inspiratoire. Ils innervent le nerf vague afin de modifier l’activité du
larynx.
- Les neurones expiratoires (aug-E) déchargent de manière croissante à partir de la fin
de la phase post-inspiratoire et ce jusqu’à la fin de l’expiration. Ils activent les
muscles intercostaux internes et abdominaux afin de provoquer l’expiration.

Seules, ces populations de neurones ne peuvent expliquer la complexité de la

rythmogenèse respiratoire. Chaque groupe peut comprendre des interneurones
excitateurs et inhibiteurs qui seront réparties dans différents noyaux respiratoires. C’est
en considérant les interactions entre chaque groupe neuronal ainsi que l’intégration des
afférences qu’on peut définir un potentiel modèle de genèse du rythme respiratoire.

36
Figure 11. Les types de neurones rythmiques selon les phases de ventilation. A)
Représentation schématique des patrons de décharges des différents neurones
respiratoires rythmiques. Classement selon leur patron de décharge et la phase où se
produit leur activité. Les résultats sont basés sur les enregistrements typiques de rats
anesthésiés. L’activité des neurones pre-I/I, early-I et aug-I est située dans la région du
préBötC. L’activité des neurones post-I et aug-E est située dans le BötC mais peut
provenir aussi du PiCo et pFL récemment définis. Post-I : neurones post-inspiratoires,
aug-E : neurones expiratoires, pre-I/I : neurones pré-inspiratoires/inspiratoires, early-I :
neurones inspiratoires précoces, aug-I : neurones inspiratoires tardifs. B) Représentation
des phases respiratoires reliées aux nerfs innervés et muscles activés pendant chacune des
phases. Ph : nerf phrénique, X : nerf vague, XII : nerf de l’hypoglosse, Dia : diaphragme,
Abd : muscles abdominaux. Modifié de (Del Negro et al., 2018; Smith et al., 2013).

37
2.3.2 Débats sur la génération du rythme

Les mécanismes responsables de la rythmogenèse respiratoire ont longtemps été

étudiés depuis le moment où il a été démontré que le préBötC peut produire son propre
rythme de décharge (~1990). Le parcours a depuis été parsemé de controverses et débats en
ce qui a trait au lieu et à la façon dont le rythme émerge (Feldman, 2011). C’est en partie dû
au fait que les modèles d’inhibition synaptique et de «pacemaker» ont longtemps, et encore
à ce jour, été considérés comme essentiels à la rythmogenèse alors que plusieurs preuves
démontrent le contraire (Del Negro et al., 2018). Le modèle d’inhibition voudrait que
l’activité inspiratoire produite par une excitation récurrente aille au-delà du seuil établi, ce
qui déclenche un puissant réseau inhibiteur qui force le système à se réinitialiser. Le tout est
suivit d’une période réfractaire, dans ce cas-ci l’expiration, avant de passer à la prochaine
phase inspiratoire (von Euler, 1983). L’utilisation de préparations réduites in-vitro a
cependant démontré que le blocage des récepteurs GABAA, GABAB et glycinergiques sur
des tranches rythmiques ne bloque pas et ne change pas la fréquence de génération du rythme
respiratoire, indiquant ainsi que l’inhibition post-synaptique n’est pas nécessaire à la
rythmogenèse du préBötC in-vitro (Brockhaus and Ballanyi, 1998; Feldman and Smith,
1989; Zhang et al., 2002).

Le second modèle, de type autorythmique ou «pacemaker», propose que des neurones

possédant des propriétés autorythmiques se situent dans le préBötC et gèrent le rythme
inspiratoire, le tout dépendamment des courants persistants de Na+ (INaP) et des courants
cationiques non-spécifiques Ca2+ (ICAN) (Del Negro et al., 2002, 2005; Peña et al., 2004;
Thoby-Brisson and Ramirez, 2001). Toutefois, les deux courants INaP et ICAN ne sont pas
limités aux neurones autorythmiques et la perturbation des courants va affecter tous les
neurones du préBötC (excitateurs et inhibiteurs) (Koizumi et al., 2013; Morgado-Valle et al.,
2010; Picardo et al., 2013). Au cours des 20-30 dernières années, les recherches n’ont pas
permis de démontrer de manière définitive et convaincant l’implication de neurones
« pacemakers » qui auraient un rôle déterminant pour la génération du rythme respiratoire en
conditions normales (Del Negro et al., 2018).

38
 Aujourd’hui, un nouveau principe de rythmogenèse a été proposé entre autre par Le
Dr. Jan-Marino Ramirez et son équipe. Il se nomme triangle rythmogénique et sera
brièvement abordé dans les prochains paragraphes.

2.3.3 Le triangle rythmogénique

Contrairement aux principes d’inhibition ou d’autorythmicité, l’hypothèse du triangle

rythmogénique est composée de trois mécanismes interdépendants : l’excitation récurrente,
l’inhibition et les décharges intrinsèques. Ces trois mécanismes ainsi que leurs interactions
ont d’ailleurs été observés dans le préBötC.

2.3.3.1 L’excitation récurrente

Le mécanisme d’excitation récurrente, en lien avec la période réfractaire est expliqué

par le fait que les neurones excitateurs du préBötC se synchronisent et désynchronisent de
façon périodique afin de produire une décharge (Ramirez and Baertsch, 2018). Suite à une
décharge eupnéique normale, l’excitation synaptique récurrente et les courants intrinsèques
synchronisent fortement les neurones du préBötC, créant ainsi la période réfractaire. Alors
que les neurones se rétablissent pendant cette période, l’excitation récurrente initie déjà la
prochaine décharge inspiratoire (Ramirez and Baertsch, 2018). Le procédé est tout d’abord
influencé par la phase respiratoire. Au cours de l’expiration précoce, c’est-à-dire suite à la
décharge inspiratoire par la synchronisation des neurones du préBötC, l’activation par
optogénétique des neurones Dbx1 a peu de chance de susciter une nouvelle décharge
inspiratoire alors que leur stimulation dans la phase expiratoire tardive va presque toujours
produire une nouvelle décharge inspiratoire (Figure 12A) (Baertsch et al., 2018; Kottick and
Del Negro, 2015). Ce phénomène peut être expliqué par deux principes. 1) les vésicules pré-
synaptiques sont épuisées par les fortes décharges inspiratoires, ce qui limite la transmission
synaptique entre les neurones excitateurs du préBötC d’ici à ce que le bassin de vésicules soit

39
restauré (Guerrier et al., 2015). 2) Chaque décharge inspiratoire active des caractéristiques
intrinsèques membranaires qui causent une hyperpolarisation et donc une excitabilité réduite
des neurones excitateurs du préBötC, ce qui empêche la nouvelle décharge avant que le
potentiel de repos de la membrane soit rétabli (Baertsch et al., 2018). Ensuite, l’étendue de
l’influence de la période réfractaire sur la rythmogenèse est aussi déterminée par l’intensité
de l’activité synchronisée des populations neuronales excitatrices, intensité qui varie selon le
type de décharge effectuée. Contrairement à la décharge eupnéique, une faible
synchronisation est créée lors d’une décharge nommée «burstlet», ce qui mène à une courte
période réfractaire afin de reproduire rapidement une décharge inspiratoire (Figure 12B). À
l’opposé, une importante synchronisation de cellules est produite lors d’une décharge menant
à un soupir où la longue période réfractaire qui s’en suit se déduit en apnée post-soupir
(Figure 12B) (Baertsch et al., 2018; Tryba et al., 2008). Par son action, ce mécanisme dirige
non seulement le rythme respiratoire, mais aussi le patron respiratoire (Ramirez and Baertsch,
2018).

40
Figure 12. Interactions entre la synchronisation, la décharge et la période réfractaire
des cellules du préBötC. A) Le moment à travers la période réfractaire où les neurones du
préBötC sont stimulés optogénétiquement détermine la probabilité de susciter une décharge
inspiratoire. La probabilité de produire une décharge est beaucoup plus faible suivant la
précédente décharge. B) Représentation schématique de la synchronisation des neurones du
préBötC et de la phase réfractaire selon les différents patrons d’activité (mauve). Le signal
moteur envoyé au nerf de l’hypoglosse est représenté en noir. Modifié de (Ramirez and
Baertsch, 2018)

2.3.3.2 Les décharges intrinsèques et l’inhibition

Les décharges intrinsèques aussi appelées propriétés «pacemaker» sont utiles pour la
synchronisation des neurones du préBötC. Le mécanisme serait différent des hypothèses
précédentes concernant les neurones autorythmiques du préBötC qui produisent un rythme
sans l’apport synaptique nécessaire. Il est ici reconnu que les neurones «pacemaker» du

41
préBötC sont trop souvent bombardés d’influx excitateurs et inhibiteurs pour simplement
produire un rythme d’eux-mêmes (Ramirez and Baertsch, 2018). Dans ce contexte, leur rôle
serait plutôt d’amplifier l’influx synaptique afin de provoquer la transition des «burstlets»
faiblement synchronisés vers la décharge inspiratoire normale (Ramirez and Pearson, 1993;
Ramirez and Richter, 1996). L’action des décharges intrinsèques est entre autre modifiée par
les courants INaP et ICAN ainsi que les différents neuromodulateurs qui jouent sur ces courants
(Ben‐Mabrouk and Tryba, 2010; Crowder et al., 2007; Hayes et al., 2017; Peña and Ramirez,
2002; Peña et al., 2004; Viemari and Ramirez, 2006; Viemari et al., 2011, 2013).

Enfin, l’inhibition synaptique joue un rôle important, mais non essentiel dans la
synchronisation. En absence d’inhibition, les neurones excitateurs du préBötC deviennent
hyperactifs et se synchronisent efficacement. Cependant, le tout mène à de longues périodes
réfractaires qui ralentissent le rythme respiratoire (Tryba et al., 2003). Inversement,
l’augmentation de l’activité inhibitrice pendant l’inspiration réduit la synchronisation des
neurones et accélère la respiration (Baertsch et al., 2018). Le tout dépend bien sûr de la phase
respiratoire dans laquelle le phénomène a lieu. Si l’inhibition est augmentée pendant la phase
expiratoire, la respiration est ralentie puisque la propagation de l’excitation à travers le réseau
est perturbée (Baertsch et al., 2018). Dans le cas des décharges intrinsèques, la balance
excitation/inhibition doit être maintenue sans quoi, si l’inhibition est trop importante, le seuil
de décharge ne pourra être atteint et la transition du «burstlet» vers la décharge inspiratoire
normale ne pourra être effectuée (Kam et al., 2013a, 2013b; Ramirez and Richter, 1996;
Ramirez et al., 1996). En contrôlant ainsi la synchronisation des neurones excitateurs du
préBötC, l’activation des propriétés de décharge des neurones et la période réfractaire qui
s’en suit, l’inhibition possède une puissante influence sur le rythme respiratoire (Ramirez and
Baertsch, 2018).

En bref, l’intégration dynamique de ces trois mécanismes, c’est-à-dire l’excitation,

l’inhibition et les décharges intrinsèques, permet d’assembler un rythme respiratoire. Le
cycle respiratoire doit être en mesure de survenir sans l’inhibition ou sans les décharges
intrinsèques, mais c’est la combinaison des trois mécanismes qui donne à la rythmogenèse la
capacité d’adapter le rythme à l’environnement externe (Ramirez and Baertsch, 2018). Ces
mécanismes ont été démontrés dans le préBötC, mais ce microcircuit ne peut à lui seul gérer

42
la respiration, car cette dernière n’est pas seulement constituée de la phase inspiratoire, mais
aussi de la post-inspiration et l’expiration. Le préBötC ferait plutôt partie d’un réseau bien
plus large qui contrôle la respiration et qui se base sur l’interaction entre trois oscillateurs.

2.3.4 L’hypothèse du triple oscillateur

Le contrôle que possède l’inhibition synaptique sur la synchronisation de décharge

des neurones respiratoires a été amplement discuté dans la phase inspiratoire, mais son action
doit aussi être considérée à plus grande échelle pour le contrôle des trois phases respiratoires.
Comme il a été mentionné ci-haut, le préBötC ne peut à lui seul gérer la coordination des
trois phases respiratoires et il en est de même pour l’inhibition à l’intérieur de ce noyau
(Harris et al., 2017; Richter and Smith, 2014). Cette affirmation se base sur le principe que
pour générer des neurones qui sont inhibés pendant l’inspiration et activés pendant
l’expiration à l’intérieur du même noyau, la fraction de neurones inhibiteurs dans le noyau
doit être drastiquement augmentée (Harris et al., 2017). Le préBötC n’est pas en mesure de
contenir ce taux de neurones inhibiteurs puisque seulement 15% des neurones peuvent être
activés au cours de l’expiration active au-delà de quoi la rythmicité peut être perdue (Harris
et al., 2017). Il est donc prédit qu’afin de produire un rythme multiphasique, plusieurs réseaux
rythmiques indépendants doivent être couplés par l’inhibition synaptique (Ramirez and
Baertsch, 2018). Ces réseaux ont été identifiés dans la moelle allongée : préBötC, PiCo et
pFL.

Tout comme le préBötC, PiCo et pFL sont en mesure de produire leur propre rythme
sans l’influence d’autres noyaux et leur stimulation redémarre le rythme respiratoire. Ainsi,
les deux structures répondent aux caractéristiques principales pour qu’un noyau soit
considéré dans la rythmogenèse (Anderson et al., 2016; Pagliardini et al., 2011). Le concept
contemporain de l’organisation du réseau respiratoire voudrait donc que trois oscillateurs
interagissent ensembles afin de faire émerger le rythme respiratoire (Figure 13) (Anderson
and Ramirez, 2017). Chacune des phases de la respiration serait générée par son propre
oscillateur, c’est-à-dire l’inspiration pour préBötC, la post-inspiration pour PiCo et

43
l’expiration active pour pFL. À l’intérieur de chaque microcircuit, le triangle rythmogénique
qui consiste en la balance de l’excitation récurrente, les décharges intrinsèques et l’inhibition,
contrôlerait la synchronisation des neurones (Figure 13). Ce serait de façon généralisée les
interactions inhibitrices mutuelles entre chaque microcircuit qui contrôleraient la séquence
temporelle du rythme respiratoire généré par le réseau. Alors que le tout est déjà défini de
façon claire dans le préBötC, le principe du triangle rythmogénique reste à être démontré
dans PiCo et le pFL ainsi que l’interaction entre ces deux microcircuits (Ramirez and
Baertsch, 2018). Fait intéressant, le BötC, un important noyau inhibiteur reconnu dans la
génération du rythme respiratoire, reste encore à être intégré à ce concept.

44
Figure 13. Vision contemporaine de l’origine du rythme respiratoire. Hypothèse du triple
oscillateur où chaque microcircuit dirige sa propre phase respiratoire. Chaque microcircuit
interagit avec son voisin à travers des signaux excitateurs et inhibiteurs même si l’inhibition
est considérée comme l’acteur majeur dans la coordination des phases. La rythmogenèse à
l’intérieur de chaque microcircuit est contrôlée par la balance entre l’excitation récurrente,
les décharges intrinsèques et l’inhibition, le tout surnommé le triangle rythmogénique. Tiré
de (Ramirez and Baertsch, 2018).

La génération d’un rythme respiratoire flexible face à l’environnement de l’animal

est nécessaire afin d’assurer un apport adéquat d’O2 à l’organisme. Cette genèse demande la
coordination et synchronisation de multiples régions respiratoires du tronc cérébral ainsi que
la contribution de plusieurs composantes périphériques respiratoires. L’organisation de ce
système de contrôle respiratoire débute en période fœtale et les composantes neuronales et
musculaires continuent de se développer suite à la naissance.

45
2.4 Développement du réseau de contrôle respiratoire

Dès la naissance, le réseau neuronal responsable du contrôle de la respiration est en

mesure de produire une ventilation robuste et capable de s’accommoder aux besoins
homéostatiques de l’animal. Cette capacité demande une organisation précise du réseau de
contrôle respiratoire et muscles respiratoires au cours de la gestation. Suite à la naissance, la
maturation postnatale du système respiratoire se poursuit afin de s’adapter à l’environnement
extra-utérin. Pour ce faire, des changements cellulaires et moléculaires sont orchestrés en
phase prénatale et postnatale et ces changements se reflètent par une physiologie respiratoire
qui change à travers le développement.

2.4.1 Modification cellulaire du réseau de contrôle respiratoire au cours

du développement

Grâce aux enregistrements électrophysiologiques in-vitro sur des préparations fœtales

de tronc cérébral-moelle épinière isolés, il a été observé que la rythmogenèse respiratoire du
rat débute à l’âge gestationnel GD16.5-17 (Greer et al., 1992). Ces résultats ont été confirmés
par des enregistrements échographiques de mouvements respiratoires fœtaux de rongeur in
utero ainsi que des enregistrements électrophysiologiques du préBötC directement sur des
tranches médullaires fœtales (Kobayashi et al., 2001; Pagliardini et al., 2003). Le marquage
de NK1R associé spécifiquement aux neurones du préBötC indique que les neurones du
complexe se forment tout d’abord dans la zone ventriculaire de la moelle allongée à l’âge
gestationnel GD12-13. Elles migrent ensuite vers la région du préBötC pour terminer leur
parcours entre GD16 et GD18.5 (Figure 14) (Pagliardini et al., 2003). Le préBötC est
considéré comme nécessaire à la rythmogenèse en phase prénatale et ce dernier semblerait
coopérer avec un noyau du pFRG pour créer les mouvements respiratoires fœtaux. Comme
il a été mentionné dans la section 2.2.2, le noyau parafacial ventral possède des
caractéristiques de rythmogenèse en période prénatale (Thoby-Brisson et al., 2009). Son
ontologie a pour le moment seulement été caractérisée chez la souris par l’utilisation du
facteur de transcription PHOX2B. Une population de neurones embryonnaires parafaciaux

46
(e-pF) capable de produire un rythme de décharge est retrouvée à partir de l’âge gestationnel
GD14.5, une journée avant l’émergence du préBötC chez la souris (GD15.5) (Thoby-Brisson
et al., 2009). La ligne du temps serait potentiellement semblable chez le rat et ces données
établissent un principe de double oscillateur en période prénatale afin de démarrer les
mouvements respiratoires fœtaux.

Figure 14. Ontogenèse du réseau neuronal responsable de la rythmogenèse respiratoire.

Ligne du temps des différents évènements dans la formation du réseau neuronal afin de
générer le rythme respiratoire in-utero. Tiré de (Greer et al., 2006)

De façon générale, la respiration du fœtus est beaucoup plus lente que celle du
nouveau-né. Afin d’expliquer cette caractéristique, trois hypothèses ont été soulevées : 1) les
réseaux neuronaux doivent se développer, ce qui engendre l’effet âge-dépendant sur la
respiration, 2) le réseau est inhibé par des modulateurs endogènes et 3) le système modulateur
qui doit générer l’excitation du réseau n’est pas encore développé (Greer et al., 2006). Alors
que la première hypothèse est plus que logique et sera abordée dans la section suivante, l’effet
âge-dépendant des neurotransmetteurs sur la genèse respiratoire est aussi plausible.
L’expression de différents neurotransmetteurs est effectivement modifiée à travers le
développement de la commande respiratoire où l’inhibition semble forte et l’excitation faible

47
dans la phase prénatale. Brièvement, le rythme respiratoire généré par le fœtus peut être
amené à des valeurs semblables au nouveau-né si des antagonistes des modulateurs
inhibiteurs sont ajoutés ; la situation est similaire lorsque des agonistes des modulateurs
excitateurs sont utilisés. L’application des neurotransmetteurs excitateurs in-vitro tels que 5-
HT et la substance P augmente drastiquement la fréquence du rythme respiratoire prénatal
(Ballanyi, 2004; Pagliardini et al., 2003). Suite à la naissance, plusieurs modulateurs (e.g.:
GABA , récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA), glutamate, 5-HT) subissent
d’importants changements dans leur expression vers l’âge postnatal P12-13 qui semble être
une fenêtre critique de la plasticité respiratoire (Wong-Riley and Liu, 2008).

2.4.2 Maturation physiologique du réseau de contrôle respiratoire en

période périnatale

La mise en place de la rythmogenèse respiratoire dans les circuits neuronaux de

contrôle respiratoire se reflète par des mouvements ventilatoires fœtaux dont le rythme est
lent et instable. Plus le fœtus se développe, plus la fréquence de décharges in-vitro des noyaux
respiratoires va augmenter (~5 fois plus rapide entre GD17 et GD20) et le patron est similaire
pour les mouvements ventilatoires in-utero (~10 fois plus rapide entre GD17 et GD20)
(Figure 15) (Kobayashi et al., 2001; Pagliardini et al., 2003). L’amplitude et la durée des
décharges respiratoires augmentent aussi avec l’âge alors que la variabilité de la fréquence
et de l’amplitude diminue (Greer et al., 1992; Hilaire and Duron, 1999).

48
Figure 15. Enregistrements in-vitro et in-utero de l’activité respiratoire fœtale du rat.
A) Préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés avec le signal rectifié/intégré de
l’activité du nerf phrénique (C4) à différents âges embryonnaires. B) Image de l’échographie
du fœtus utilisée pour compter la fréquence des mouvements respiratoires fœtaux selon l’âge.
H : cœur, S : estomac, D : diaphragme, SC : moelle épinière. Modifié de (Greer et al., 2006)

En période postnatale, la ventilation de l’animal est élevée dans les premiers jours de
vie et cette dernière va diminuer avec l’avancée en âge. Il en est de même pour la
consommation d’O2, ce qui représente un taux métabolique plus important chez les nouveau-
nés que l’adulte (Niane and Bairam, 2011). L’instabilité respiratoire est encore importante
suite à la naissance et elle diminue avec l’avancée en âge. Le tout est représenté par une
diminution du coefficient de variation de la ventilation ainsi qu’une diminution des épisodes
d’apnées (Niane and Bairam, 2012). Les apnées et la respiration périodique, caractérisée par
un groupe de mouvements respiratoires interrompus par des apnées en intervalle,
représentent fortement l’immaturité du système respiratoire (Rigatto and Brady, 1972a).
Elles sont souvent associées avec une grande variabilité dans la saturation en O2 et en CO2

49
alvéolaire (Al-Hathlol et al., 2000). Elles sont fréquemment retrouvées chez des nouveau-nés
prématurés où elles altèrent le développement du réseau de contrôle respiratoire (Rigatto and
Brady, 1972b). Il est cependant important de noter que toute apnée n’est pas reliée à une
désaturation en O2. Des facteurs qui intensifient l’immaturité du système de contrôle
respiratoire (e.g. stress gestationnel) peuvent augmenter la proportion d’apnées couplées à
des désaturations en O2 (Fournier et al., 2013). En plus de l’immaturité des circuits qui
génèrent le rythme respiratoire, une réponse à l’hypoxie sous-développée est aussi retrouvée
chez le nouveau-né où la chémosensibilité de l’animal est exagérée et provoque les apnées
(Al-Hathlol et al., 2000; Nock et al., 2004).

2.5 Physiologie de la réponse à l’hypoxie

La stimulation de la respiration par l’hypoxie a été démontrée dès les années 1860 et
cette découverte a déclenché de nombreux questionnements afin d’identifier les structures
responsables de la surveillance de l’O2 dans le corps (Pflüger, 1868). L’O2 est essentiel au
bon fonctionnement de l’organisme et le cerveau est particulièrement sensible à toute
privation des réserves d’O2. Afin de surveiller de près les fluctuations des niveaux d’O2 dans
le corps, des chémorécepteurs périphériques sont positionnés de façon stratégique dans la
bifurcation carotidienne ainsi que l’arche aortique. Ensembles, ils détectent toute diminution
de la pression partielle artérielle d’O2 (PaO2) et provoquent en réponse un changement de la
respiration (Kumar and Prabhakar, 2012; Prabhakar, 2013). Puisque ces senseurs ne peuvent
détecter les taux d’O2 dans le SNC, il est proposé qu’un senseur d’O2 se trouve dans certaines
régions du tronc cérébral. Ces différents sites de chémoréception seront discutés dans les
sections suivantes. Il est important de mentionner que la réponse à l’hypoxie est étroitement
liée aux changements de la pression partielle artérielle en CO2 (PaCO2) et du pH. La
diminution en O2 augmente l’activité des cellules, ce qui produit une élévation du CO2 et une
diminution du pH (Nattie and Li, 2012). Bien que les chémorécepteurs peuvent parfois réagir
tant aux changements des niveaux d’O2 que de CO2 ou du pH, la réponse à la baisse d’O2
sera le principal point abordé dans ce texte.

50
2.5.1 Les corps carotidiens

Les corps carotidiens sont des petits organes sensoriels situés de façon bilatérale à la
bifurcation de l’artère carotidienne, considérés comme les principaux senseurs des taux d’
O2 artériels (Figure 8) (Kumar and Prabhakar, 2012). Le tissu du corps carotidien est
constitué de deux types de cellules : les cellules chémosensibles (cellules de type I) qui sont
d’origine neuronale et les cellules de soutien (cellules de type II) qui ressemblent aux cellules
gliales du cerveau (Prabhakar et al., 2018). Les cellules de type I, en association avec la
terminaison rapprochée du nerf sensoriel, détectent la diminution de la PaO2 (Kumar and
Prabhakar, 2012). Elles détectent aussi l’augmentation de la PaCO2, la diminution du pH
artériel et même les taux sanguins de glucose (Shirahata et al., 2015). Face au changement
de la PaO2, les corps carotidiens envoient un signal à travers le nerf du sinus carotidien, qui
va le transmettre au NTS (région médiane caudale au calamus scriptorius) pour ensuite
relayer le tout au CPG du tronc cérébral (Guyenet et al., 2010). En conditions de base (PaO2
~100 mmHg), la fréquence de décharges envoyées à travers le nerf sensoriel est très faible.
Cependant lorsque la PaO2 diminue, la fréquence des décharges augmente afin de produire
une réponse rapide (quelques secondes) (Kumar and Prabhakar, 2012). La fréquence des
décharges est maintenue sur la durée entière de l’hypoxie et peut même augmenter si
l’hypoxie est soutenue (Nielsen et al., 1988). Ces trois caractéristiques (sensibilité, vitesse et
faible adaptation) sont uniques à la réponse des corps carotidiens en cas d’hypoxie.

Les mécanismes cellulaires de réponse à l’hypoxie par les cellules de type I implique
en partie les canaux K+ et Ca2+ ainsi que le relâchement de divers neurotransmetteurs (Figure
16). Il a été démontré que l’hème oxygénase-2 (HO-2) serait remarquablement sensible aux
niveaux sanguins de l’O2. En réponse à l’hypoxie, HO-2 réduit la production de monoxyde
de carbone (CO) (Yuan et al., 2015). Une réduction en CO stoppe son inhibition sur la
cysthationine gamma-lyase (CSE), une enzyme qui catalyse la production du sulfure
d’hydrogène (H2S). H2S est connu comme étant un important stimulateur de l’activité du nerf
du sinus carotidien (Peng et al., 2010; Yuan et al., 2015). Une diminution de H2S dans la
cellule provoquerait la fermeture des canaux potassique K+ et engendrerait une dépolarisation
de la membrane. Cette dépolarisation cause l’ouverture des canaux calciques (Ca2+) ainsi
qu’une entrée de calcium dans la cellule. L’augmentation de Ca2+ intracellulaire crée le

51
relâchement de divers neurotransmetteurs par les vésicules dépendantes au calcium qui
stimulent le nerf afférent et augmentent donc l’activité du nerf du sinus carotidien (Kumar
and Prabhakar, 2012). Les neurotransmetteurs relâchés sont multiples et incluent l’adénosine
triphosphate (ATP), l’acétylcholine (ACh), la sérotonine, le GABA, la dopamine,
l’adénosine et l’histamine (Nurse, 2010; Nurse and Piskuric, 2013).

52
Figure 16. Illustration schématique de l’activité sensorielle du corps carotidien en
réponse à l’hypoxie. Une baisse des niveaux d’O2 (hypoxie) dans le sang est détectée par
HO-2 qui diminue la production de CO. La diminution de CO en cas d’hypoxie supprime
l’inhibition sur CSE, ce qui augmente la production de H2S. Les canaux K+ sont alors inhibés
et la dépolarisation qui en résulte active le relâchement des neurotransmetteurs par Ca2+.
Modifié de (Prabhakar, 2013)

2.5.2 Les corps aortiques

L’implication de senseurs extra-carotidiens a fait son entrée dans les années 1930
lorsqu’une réponse à l’anoxémie a été observée sur des animaux dont les corps carotidiens
étaient dénervés (Comroe, 1939). Ces senseurs sont regroupés en structures similaires au

53
corps carotidiens qui se situent dans l’arche aortique, d’où leur nom : corps aortiques
(McDonald and Blewett, 1981). Contrairement aux corps carotidiens, les corps aortiques
surveilleraient la saturation en O2 plutôt que la PaO2 et leur rôle ne serait apparemment pas
nécessaire pour la réponse ventilatoire à l’hypoxie du rat adulte en conditions normales
(Comroe, 1939; Martin-Body et al., 1985). Cependant, en cas de réduction des fonctions des
corps carotidiens, les corps aortiques peuvent prendre la relève pour restaurer la réponse
ventilatoire à l’hypoxie (Forster, 2003). À ces chémorécepteurs de support s’ajoutent aussi
des tissus du thorax et de l’abdomen, nommés paraganglions, qui possèdent des
caractéristiques de chémoréception par leur morphologie similaire aux corps aortiques et
carotidiens et qui pourraient ainsi agir en tant que chémorécepteurs auxiliaires (Deane et al.,
1975; Easton and Howe, 1983). Ces derniers ne seront cependant pas abordés plus amplement
dans ce texte.

2.5.4 Réponse centrale à l’hypoxie

Suite aux études approfondies de la chémoréception périphérique, il a longtemps été

considéré que la détection de PaO2 par les senseurs en périphérie est suffisante pour ajuster
la respiration à l’environnement et assurer une oxygénation adéquate de toutes les régions du
cerveau (Gourine and Funk, 2017). Plusieurs ont même proposé que le SNC serait dépourvu
de tout senseur d’O2 et donc incapable de stimuler la respiration lors d’une diminution de la
Po2 dans le parenchyme du cerveau (Angelova et al., 2015). Il a cependant été démontré que
des animaux éveillés dont les chémorécepteurs périphériques d’O2 ont été retirés ou réduits
au silence présentent tout de même une réponse ventilatoire à l’hypoxie (Bisgard et al., 1980;
Curran et al., 2000; Del Rio et al., 2013; Olson et al., 1988; Soliz et al., 2005). Bien que chez
certaines espèces des mécanismes complémentaires aux corps carotidiens (ex. corps
aortiques) pourraient prendre la relève pour maintenir une réponse à l’hypoxie, le phénomène
serait vraisemblablement provoqué par une réponse centrale. L’utilisation du tronc cérébral
isolé et donc dépourvu des afférences périphériques a aussi permis d’affirmer que le tronc
cérébral peut détecter les variations d’O2 et y répondre directement (Gestreau et al., 2010;

54
Voituron et al., 2006). Les sites responsables de la réponse sont présentés dans la section
suivante.

2.5.4.1 Sites centraux sensibles à l’oxygène

Alors qu’il est accepté de façon générale que les neurones centraux répondent à
l’hypoxie par une diminution de leur excitabilité, il a été observé dans les années 1990 que
certains neurones parasympathiques du tronc cérébral augmentent leur activité en réponse à
la baisse de Po2 (Sun and Reis, 1994; Sun et al., 1992). Des études ultérieures ont ensuite
démontré qu’en addition à ces neurones parasympathiques, des circuits de contrôle
respiratoire du tronc cérébral répondraient aussi à la diminution locale de la Po2 du
parenchyme (Neubauer and Sunderram, 2004; Peña et al., 2004; Ruangkittisakul and
Ballanyi, 2012; Solomon, 2005; Solomon et al., 2000; Thoby-Brisson and Ramirez, 2000).
Le type réponse à l’hypoxie (excitation ou inhibition) varie selon les régions en jeux ainsi
que l’âge développemental de l’animal.

Excitation : L’utilisation de la technique d’expression de c-fos a permis de

déterminer les régions excitées par l’hypoxie tant in-vivo que in-vitro (Berquin et al., 2000;
Bodineau et al., 2001; Erickson and Millhorn, 1991, 1994; Hirooka et al., 1997; Horn et al.,
2000; Teppema et al., 1997). Un premier groupe de neurones sensibles à l’O2 se trouverait
dans la région caudale de l’hypothalamus. Ses projections sont retrouvées dans la région
ventrale respiratoire de la moelle allongée et son activation au cours de l’hypoxie
augmenterait la respiration (Horn and Waldrop, 1997; Kramer et al., 1999). La région du
NTS serait aussi sensible à l’O2 puisque le tiers des neurones retrouvés dans ce site sont
dépolarisés lors de l’hypoxie (Pascual et al., 2002). Le préBötC présente des caractéristiques
de sensibilité à l’O2 et serait excité par l’hypoxie (Solomon et al., 2000). Sa réponse à
l’hypoxie serait étroitement reliée aux réflexes de soupirs ou d’halètement, deux mécanismes
importants pour aider à l’efficacité des échanges gazeux (Neubauer and Sunderram, 2004).
Le préBötC pourrait aussi recevoir des projections de sites rostraux qui sont sensibles à l’O2
et modifient le rythme inspiratoire généré. Enfin, le RTN/pFRG est généralement reconnu

55
pour sa chémosensibilité centrale au CO2. En réponse à la diminution du pH causée par un
fort taux de CO2 dans le liquide céphalo-rachidien, il augmenterait la respiration par ses
influx vers les centres de rythmogénèse (Guyenet, 2014). Il aurait aussi été démontré que le
RTN/pFRG possède une chémosensibilité à l’O2 puisque l’activité des neurones de la région
est augmentée en présence de faibles taux d’O2 et la lésion du site affecte la réponse à
l’hypoxie (Voituron et al., 2006). De plus, des souris qui n’expriment pas le canal TASK-2
situé dans le RTN/pFRG sont incapables de produire la dépression ventilatoire lors de
l’hypoxie (Gestreau et al., 2010).

Inhibition : Bien que les régions du tronc cérébral soient généralement excitées par
l’hypoxie, ces résultats proviennent principalement d’adultes et le concept est très différent
dans le cas du fœtus, où une augmentation des efforts respiratoires serait contreproductive.
Chez ce dernier, l’inhibition de la respiration représente la réponse naturelle à l’hypoxie et le
phénomène ne serait pas dû à l’immaturité des chémorécepteurs périphériques, mais plutôt à
l’action d’un site inhibiteur central puisque la réponse est aperçue même en absence
d’afférences périphériques (Blanco et al., 1984; Koos and Sameshima, 1988). Le réseau
chémosensible inhibiteur serait retrouvé dans le pont et le thalamus puisque la lésion de la
région rostrale du pont renverse la réponse à l’hypoxie du fœtus (Dawes et al., 1983). Des
zones nécessaires à l’inhibition se situeraient plus précisément au niveau dorsal du pont
proche du locus coeruleus (LC) et au niveau ventral proche du noyau Kölliker-Fuse (Breen
et al., 1997; Moore et al., 1996). Il est encore incertain si ces régions agissent directement en
tant que chémorécepteurs à l’O2 ou si elles transmettent un influx provenant de sites
supérieurs. Chez le rongeur, la dépression du rythme inspiratoire apparaîtrait à l’âge
gestationnel GD18 puisqu’aucune réponse n’est enregistrée sur des préparations de tronc
cérébral plus jeunes (Viemari et al., 2003). Elle se poursuit à travers les stades postnataux
précoces et laisse croire que le réseau inhibiteur pourrait être maintenu suite à la naissance et
agirait dans la réponse biphasique du nouveau-né (voir section 2.5.5) (Viemari et al., 2003).

Le fonctionnement du réseau respiratoire est modifié de façon très variable face à la

baisse d’O2 dans le SNC. Les mécanismes cellulaires responsables de cette modification
incluent les canaux ioniques (K+, Na+, Ca2+), les neurotransmetteurs (catécholamine, 5-HT,
GABA, glycine, adénosine) et différentes voies de signalisation ou procédés génomiques.

56
Bien que l’objectif de cette thèse n’est pas de faire une description détaillée de ces
mécanismes, un senseur d’O2 a récemment été présenté afin d’expliquer la chémosensibilité
centrale des mammifères et sera abordé brièvement dans la section suivante.

2.5.4.2 Potentiel senseur central de l’oxygène

Le rôle des structures de contrôle respiratoire dans la détection et la réponse à

l’hypoxie est aujourd’hui bien détaillé, mais l’identité du senseur au niveau central reste
encore à être établie. Des récentes études suggèrent que le mécanisme de détection d’O2 ne
serait pas de type neuronal, mais plutôt glial et plus particulièrement les astrocytes (Angelova
et al., 2015). Ces cellules enveloppent les artères et capillaires du cerveau et supportent
l’activité neuronale en contrôlant les niveaux de neurotransmetteurs (Haydon and
Carmignoto, 2006). Elles sont en mesure de détecter les niveaux artériels d’O2 et répondent
à de très faibles changements dans la Po2 du parenchyme cérébral (quelques mmHg sous la
normale) par une augmentation du Ca2+ intracellulaire. Cette augmentation provoque une
libération accrue d’ATP dans le milieu extracellulaire qui active les neurones du préBötC par
exemple. L’importance de ces cellules a été éprouvée par des études où la réponse à
l’hypoxie, qui subsiste malgré la dénervation des chémorécepteurs périphériques, est abolie
lorsque la signalisation purinergique est supprimée, signalisation nécessaire pour les cellules
gliales (Angelova et al., 2015). Parallèlement à ces résultats, la réponse ventilatoire à
l’hypoxie en présence ou non des corps carotidiens est réduite lorsque le relâchement de
l’ATP par les astrocytes est bloqué de façon spécifique (Angelova et al., 2015). Par la
libération d’ATP, les astrocytes seraient responsables de la réponse ventilatoire à l’hypoxie
grâce à leurs multiples connections avec les circuits neuronaux responsables de la genèse
respiratoire.

De façon conjointe, les chémorécepteurs périphériques et centraux agissent sur la

commande respiratoire pour modifier le rythme généré en réponse à une diminution des taux
d’O2 dans le sang. Cette commande se reflète par une altération de la ventilation de l’animal
entier qui sera présentée dans le paragraphe suivant.

57
2.5.5 Réponse ventilatoire à l’hypoxie

Chez l’animal entier, la réponse ventilatoire à une hypoxie modérée est généralement
de type biphasique (Figure 17). Au cours des premières minutes, un important effort
respiratoire fait augmenter la ventilation. Cette première phase serait principalement
contrôlée par l’activation des chémorécepteurs périphériques (Gourine and Funk, 2017). Par
la suite, le pic de ventilation est accompagné d’une réduction de l’activité respiratoire sur
plusieurs minutes afin d’atteindre un plateau qui se maintient au-dessus des valeurs initiales
(~25%-40%). Au cours de la deuxième phase, l’activité des chémorécepteurs périphériques
diminue, mais reste supérieure à ses valeurs de base. La diminution de la ventilation serait
plutôt attribuée à la dépression du réseau de contrôle respiratoire situé dans le tronc cérébral
(Gourine and Funk, 2017).

La réponse à l’hypoxie change au cours du développement (Figure 17). Les nouveau-

nés à l’âge postnatal très précoce (P4-P7) présentent une rapide augmentation initiale de la
respiration alors que cette augmentation est plus faible, mais soutenue chez des animaux plus
âgés (Niane and Bairam, 2011). L’augmentation de la ventilation au jeune âge P1-P10 est
aussi produite par une augmentation du volume courant alors qu’avec l’avancée en âge, c’est
l’augmentation de la fréquence respiratoire qui est en jeu (Bissonnette and Knopp, 2001). Par
la suite, alors que la dépression respiratoire en phase deux chez les rats plus âgés se maintient
au-dessus de la valeur de base, celle des jeunes rats diminue pour passer sous les valeurs
initiales (Niane and Bairam, 2011). Cette dépression respiratoire en hypoxie rend en théorie
le nouveau-né plus à risque face à l’hypoxie. Cette réponse est cependant accompagnée par
une dépression métabolique importante faisant en sorte que, contrairement à l’adulte, la
demande en O2 est réduite de façon très importante. L’animal est donc moins atteint par la
réduction de l’O2 disponible. Ces différences peuvent démontrer des systèmes de
chémoréception immatures qui vont se développer avec l’avancée en âge de l’animal (Niane
and Bairam, 2011). L’immaturité du système peut aussi compromettre la coordination de la
respiration avec la déglutition dont l’ensemble des réponses cardio-respiratoires incluent le
chémoréflexe laryngé.

58
Figure 17. Réponse ventilatoire à l’hypoxie. La réponse ventilatoire à l’hypoxie est
biphasique. Elle est constituée d’une phase initiale où la ventilation augmente de façon
soudaine puis diminue afin d’atteindre un plateau. La physiologie de la réponse varie selon
l’âge de l’animal. Tiré de (Funk, 2013)

2.6 Le chémoréflexe laryngé

Le développement adéquat du contrôle de la respiration est nécessaire chez le

nouveau-né afin de maintenir une génération du rythme respiratoire adaptée à
l’environnement, une réponse à l’hypoxie appropriée selon les niveaux artériels d’O2 et la
coordination de la respiration avec la déglutition. Si cette coordination est défectueuse, des
substances étrangères (plus particulièrement du liquide) peuvent se loger dans le larynx et
provoquer le chémoréflexe laryngé (CRL).

2.6.1 Définition et développement du chémoréflexe laryngé

Le chémoréflexe laryngé se défini comme un ensemble de réponses qui préviennent

l’aspiration de substances étrangères dans les voies aériennes et les poumons (Reix et al.,

59
2007). Le but est de protéger les voies aériennes en cas de reflux gastrique, de régurgitation
de lait ou de déglutition de liquides qui pourraient malencontreusement passer de l’œsophage
vers le larynx.

Chez un animal dont le système de contrôle respiratoire est mature, le CRL se traduit
par une toux accompagnée de déglutition et une augmentation du rythme cardiaque et de la
pression artérielle systémique. En phase de sommeil, ce réflexe provoque souvent l’éveil de
l’animal et une modification de la position de la tête pour libérer les voies (Praud, 2010).
Comme il a été mentionné, le CRL nécessite une coordination adéquate de la respiration et
la déglutition qui ne peut être effectuée si le développement du système de contrôle
respiratoire est immature ou anormal. Dans ce cas, l’activation du CRL mène à la cessation
des mouvements respiratoires (apnée), accompagnée de bradycardies, de laryngospames,
d’une hypertension systémique et d’une redistribution du flux sanguin (Thach, 2008). Les
apnées provoquées par le CRL sont souvent associées aux désordres respiratoires des
nouveau-nés tels que l’apnée du prématuré et les défaillances cardio-respiratoires sont au
cœur des problèmes incluant le SIDS (Praud, 2010). Heureusement, l’intensité de cette
inhibition cardio-respiratoire diminue avec l’avancée en âge et il en est de même pour son
incidence sur les désordres respiratoires.

Il est supposé que le CRL immature provienne de la prolongation d’un réflexe de

protection du fœtus (Thach, 2001). Au cours de la gestation le fœtus baigne dans le liquide
amniotique qui est parfois avalé, alors que ses poumons sont remplis d’un liquide pulmonaire
produit par l’épithélium pulmonaire. La concentration en ions chlorure de chaque milieu est
très différente : elle est plus élevée dans le liquide pulmonaire et plus basse dans le liquide
amniotique (Reix et al., 2007). Les récepteurs du larynx sont sensibles à la concentration des
ions chlorures dans le liquide pulmonaire et activent le chémoréflexe laryngé et ainsi
provoquer un arrêt des mouvements respiratoires et une fermeture de la glotte. Le tout
provoque une apnée qui peut être prolongée dans le cas du fœtus puisqu’il ne dépend pas des
échanges gazeux au niveau des poumons, dû à sa connexion avec le système sanguin de la
mère par le cordon ombilicale (Thach, 2001). En période postnatale, ce réflexe peut être
provoqué par la présence de liquides à faible concentration en chlorure tels que l’eau, les
fluides gastriques et la salive. Il a aussi été démontré que des substances très acides ou très

60
alcalines peuvent activer le réflexe même si le niveau d’ions chlorure est normal (Boggs and
Bartlett, 1982). Le problème ici est que le fœtus est adapté à son environnement in-utero et
peut supporter l’activation du CRL. Dans le cas du nouveau-né, l’apnée provoquée peut être
néfaste puisque l’animal dépend des échanges gazeux au niveau des poumons. Il est reconnu
que le CRL immature et pathophysiologique n’est pas présent chez le nouveau-né humain à
terme, mais il peut être retrouvé chez un enfant prématuré ou chez le rongeur quelques jours
après la naissance, où le système de contrôle respiratoire n’est pas complètement développé
(Thach, 2001, 2008).

Les afférences du CRL sont étroitement reliées aux noyaux respiratoires du tronc
cérébral afin de modifier les mouvements respiratoires lors de son activation. Les
mécanismes en jeu seront expliqués dans la section suivante.

2.6.2 Physiologie du chémoréflexe laryngé

La région du larynx est très riche en terminaisons nerveuses, ce qui explique son
importance dans le rôle de protection des voies aériennes et régulation de la respiration. La
muqueuse laryngée contient plusieurs types de méchanorécepteurs et chémorécepteurs
distribués de façon hétérogène dans la région (Reix et al., 2007). Les méchanorécepteurs
envoient en continue un signal vers les régions supérieures afin de contrôler les décharges
respiratoires. On les retrouves sous trois formes dans la région du larynx : récepteurs de
pression (sensibles à la pression négative ; 70% des récepteurs), récepteurs de mouvements
(sensibles aux mouvements laryngés ; 28% des récepteurs) et récepteurs de flux (sensibles
au froid ; 2% des récepteurs) (Bradley, 2000). L’activation des méchanorécepteurs est
essentielle à la coordination des muscles dilatateurs des voies aériennes supérieures et des
muscles inspiratoires thoraciques (Sant’Ambrogio et al., 1995). Pour leur part, les
chémorécepteurs laryngés sont les principaux acteurs dans l’ensemble des réponses qui
constituent le CRL. Ils incluent les récepteurs sensibles aux irritants (e.g. le touché et
l’étirement), les récepteurs sensibles à l’eau (hypoosmolarité, faible concentration de
chlorure) et les terminaisons des fibres C sensibles à plusieurs agents nuisibles (e.g.

61
capsaïcine, température élevée, ion H+ extracellulaires élevés, produits inflammatoires)
(Anderson et al., 1990; Forsberg et al., 1988; Widdicombe, 2001).

Les influx nerveux provenant des récepteurs de la muqueuse laryngée voyagent par
le nerf laryngé supérieur pour ensuite passer dans le ganglion du nerf plexiforme et terminer
leur course dans la partie caudale du NTS (Figure 18) (Reix et al., 2007). Le NTS est reconnu
pour son lien étroit avec les noyaux respiratoires ventraux induisant ainsi l’inhibition cardio-
respiratoire lors du CRL. Pour se faire, l’information intégrée par les noyaux centraux est
relayée aux motoneurones du noyau phrénique au niveau de la 3e vertèbre cervicale (apnée)
et aux motoneurones laryngés (fermeture du larynx) et neurones pré-ganglionniques
cardiaques vagaux (bradycardies) situés dans le noyau ambigu (Praud, 2010).

Figure 18. Circuits neuronaux impliqués dans le chémoréflexe laryngé fœtal. Schéma
des afférences sensorielles et transmission du signal par les noyaux respiratoires lors de
l’activation du CRL immature. Phr : neurones phréniques, NTS : noyau du tractus solitaire,
NA : noyau ambigu, RLN : nerf laryngé récurrent PRCV : neurones pré-ganglionniques
cardiaques vagaux, HCL acide chlorhydrique. Tiré de (Praud, 2010) .

62
 Le développement du CRL est influencé par de multiples facteurs environnementaux
incluant la cigarette, l’hypoxie, le stress et la température (Baldy et al., 2017; St-Hilaire et
al., 2010; Xia et al., 2008, 2009). Puisque le CRL est aussi étroitement relié à l’activité des
noyaux respiratoires, la modulation de ces derniers, entre autre par les hormones
thyroïdiennes, au cours du développement, peut modifier la réponse cardio-respiratoire du
nouveau-né.

2.7 Neuromodulation de la respiration par les hormones

thyroïdiennes

Tout comme le développement du système nerveux et de ses fonctions cognitives, la

mise en place du système respiratoire incluant les composantes de contrôle centrales et les
composantes périphériques est influencée par l’action des hormones produites par l’axe HPT
au cours de la gestation et suite à la naissance. Malheureusement, peu nombreuses sont les
études qui mettent en évidence cette influence. Il est reconnu que dès l’apparition de la
commande respiratoire vers l’âge gestationnel GD18, l’application du neurotransmetteur
excitateur TRH sur des préparations in-vitro de rats augmente drastiquement la fréquence du
rythme respiratoire et l’effet est aussi observé sur des préparations de tranches médullaires à
2 jours de vie (Greer et al., 1996). TRH modifie la genèse du rythme respiratoire dès la
gestation et agit directement sur le préBötC.

Les hormones thyroïdiennes sont aussi nécessaires au bon développement des

poumons du nouveau-né. Le traitement de ratons au premier jour de vie avec T3 augmente
le ratio surface/volume ainsi que la surface des poumons afin d’améliorer les échanges
gazeux. L’effet contraire est observé lors de l’ajout de PTU dans l’eau de la mère gestante
du jour gestationnel GD22 jusqu’au jour postnatal P14 (Massaro et al., 1986). Les hormones
thyroïdiennes jouent un rôle important dans l’absorption du fluide pulmonaire à la naissance
et la production du surfactant par les cellules épithéliales des poumons (Hillman et al., 2012;

63
Mendelson and Boggaram, 1991). Le surfactant pulmonaire est essentiel au bon
fonctionnement des poumons et est souvent déficient dans les cas de désordres respiratoires
des poumons (syndrome de détresse respiratoire). Une étude effectuée cette fois-ci sur des
lapins nés prématurément a démontré que la supplémentation de la femelle gestante en TRH
améliore les fonctions pulmonaires, résultat qui n’est pas observable lors de la
supplémentation seule de T3 ou de corticostéroïdes (Ikegami et al., 1987). Lorsqu’un
traitement de surfactant est ajouté aux trois types d’hormones, les fonctions pulmonaires sont
grandement améliorées démontrant l’effet bénéfique de ce dernier sur les performances
respiratoires. Dans un modèle d’agneau prématuré, l’injection du fœtus avec une dose de T3
est suffisante pour améliorer les échanges gazeux par ses effets sur le développement
structural des poumons (Chan et al., 1998). Ces résultats divergent selon les espèces, mais
démontrent tous un certain effet périnatal des hormones produites par l’axe HPT sur le
développement du système respiratoire

Chez l’humain, l’effet périnatal des hormones thyroïdiennes est effectivement

différent. Une cohorte de nouveau-né prématurés (< 30 semaines de gestation) avec des très
faibles taux de T3 et T4 à la naissance exhibe une dysfonction des poumons plus sévère
nécessitant le support ventilatoire ainsi qu’un taux de mortalité plus important (Biswas et al.,
2002). Dans ce cas, la supplémentation en TRH suite à la naissance n’est pas en mesure de
récupérer les fonctions physiologiques normales et ce, même lorsque le traitement est
effectué en combinaison avec des cortocostéroïdes (Ballard et al., 1992; Crowther et al.,
2013; van Wassenaer et al., 1998). Un traitement contenant la combinaison de T3 et de
cortocostéroïdes donne des résultats similaires (Biswas et al., 2003).

Plusieurs études concernant l’effet des hormones thyroïdiennes sur le contrôle

respiratoire proviennent de modèles animaux adultes. Les résultats issus de ces dernières
démontrent que la déficience en hormones thyroïdiennes réduit la ventilation de l’animal
ainsi que la force produite par les cellules musculaires du diaphragme (Geiger et al., 2002;
Ianuzzo et al., 1984). Cette déficience peut aussi réduire la réponse ventilatoire à l’hypoxie
et l’hypercapnie de l’animal entier ainsi que l’activité in-vitro du corps carotidien en réponse
à l’hypoxie représentée par une faible activité du nerf du sinus carotidien (Olea et al., 2007).
La structure et fonctions des poumons sont aussi altérées par la déficience en hormones

64
thyroïdiennes qui crée une diminution du ratio surface/volume par l’augmentation de la taille
des alvéoles (Schlenker, 2012). Malgré les différences entre les adultes et les nouveau-nés,
les résultats provenant de chaque groupe suggèrent une importante influence des hormones
thyroïdiennes sur le développement du système respiratoire et ce, tant sur ses composantes
pulmonaires que neuromotrices. Ceci ouvre la porte à l’expansion des observations sur
l’entièreté de la fenêtre développementale et sur les multiples composantes du système
respiratoire influencées.

En addition à leur important impact tant sur la commande respiratoire et les fonctions
des poumons que sur l’activité des muscles respiratoires, les hormones thyroïdiennes
influencent grandement le métabolisme de multiples neurotransmetteurs qui modifient la
respiration. Ces derniers incluent 5-HT, la dopamine, les opioïdes, mais aussi le GABA et la
glycine, principaux modulateurs inhibiteurs du rythme respiratoire qui seront abordés dans
la section suivante.

3. Neurotransmission GABAergique

3.1 Action générale du GABA dans le développement

L'acide y-aminobutyrique (GABA) est connu pour son importante influence sur le
SNC. L’action inhibitrice du GABA joue un rôle majeur sur la physiologie du cerveau en
réduisant l'excitabilité du système. La neurotransmission du système GABAergique est
extrêmement particulière considérant que la polarité de son action lors de l’ouverture des
canaux par la liaison du ligand au récepteur dépend en majeure partie de la concentration
intracellulaire de l'ion chlore [Cl-]i (les mécanismes seront détaillés dans la section 3.3.3 de
l’introduction) (Ben-Ari et al., 2012). Cette polarité engendre un vaste éventail de réactions
du système au GABA pouvant même passer par une action dépolarisante au cours du
développement. En effet, tôt dans le développement, le signal GABAergique dépolarise et
augmente l’entrée de calcium dans la cellule, jouant ainsi un important rôle excitateur (Ben-
Ari et al., 2012). Il a d’ailleurs été démontré que l’activité GABAergique serait exprimée en

65
premier dans le système nerveux et précéderait la transmission synaptique glutamatergique
(dont l’action passe habituellement par les récepteurs AMPA) (Ben-Ari et al., 1989). Avant
même la formation des synapses, le GABA est relâché par les cônes de croissance et les
astrocytes pour ensuite activer par la signalisation de type paracrine les récepteurs
extracellulaires du milieu avoisinant et ainsi modifier la migration neuronale (Demarque et
al., 2002). Puisqu’à cette période, le système de récupération des neurotransmetteurs n’est
pas encore en place, le GABA s’accumule dans l’espace extra-synaptique et déploie son effet
dépolarisant sur les neurones distaux (Demarque et al., 2002; Young et al., 2010). Il a
d’ailleurs été démontré que le blocage de cette excitation tôt dans le développement affecte
de façon significative la migration neuronale et la formation des circuits nerveux, suggérant
un important rôle du GABA à ce niveau (Cancedda et al., 2007; Manent et al., 2005; Wang
and Kriegstein, 2011). De manière générale, le changement de réponse au GABA
(dépolarisante vers hyperpolarisante) est effectué vers l’âge de 5-7 jours postnataux chez le
rongeur. Bien que plusieurs études ont révisé le concept selon l’espèce et la région ciblée, les
principes de base sont reconnus et prouvent que la règle de changement développemental du
GABA est conservée à travers l’évolution (Ben-Ari et al., 2007).

Le GABA est relâché par les mêmes axones terminaux et agit en grande partie de
façon conjointe avec la glycine, un neurotransmetteur dont la liaison avec son récepteur
permet aussi le passage de l’ion Cl- (Ben-Ari et al., 2007). Le cours de leur action (effet
dépolarisant vers hyperpolarisant) est similaire lors du développement pour une majorité des
régions du SNC incluant le tronc cérébral (Ben-Ari et al., 2007). Cependant, il a été démontré
que les mécanismes du GABA seraient majoritairement dominants à la période néonatale du
rat (0 à 14 jours de vie) (Baccei and Fitzgerald, 2004). Il y aurait alors, un transfert au cours
du développement d’une action de longue durée par les courants synaptiques GABAergiques
vers les courants de courte durée engendrés par la glycine (Gao et al., 2001). Bien que l’effet
de la glycine au cours du développement ne puisse être ignoré dans le contexte du contrôle
de la respiration, seule la physiologie du GABA sera abordée dans cette thèse. Malgré tout,
l’action conjointe du GABA et de la glycine sera considérée dans le cadre du contrôle
respiratoire dans la section 3.5 de l’introduction.

66
 Afin de comprendre l’effet du GABA sur les fonctions nerveuses et le développement
du réseau neuronal, il est important de tout d’abord connaître les principes généraux de son
métabolisme, ainsi que les caractéristiques de ses récepteurs. Ces deux sujets seront abordés
dans les sections suivantes.

3.2 Métabolisme du GABA

La synthèse du GABA se fait à partir de l’a-cétoglutarate, qui est produit par la

glycolyse et le cycle de Krebs (Figure 19). Il est ensuite transformée en glutamate grâce à
l’action de l’enzyme GABA-oxoglutarate transaminase (GABA-T) qui transfert le groupe
aminé du GABA sur l’α-cétoglutarate (Olsen and DeLorey, 1999). La production du GABA
nécessite une réaction qui est catalysée à partir de l’enzyme nommée glutamate
décarboxylase (GAD). GAD est retrouvée sous deux isoformes dans le cytosol des neurones :
GAD65 et GAD67 (Erlander et al., 1991). L’enzyme GABA-T se trouve dans la
mitochondrie où le glutamate est par conséquent produit. Ceci signifie que le glutamate doit
être exporté hors de la mitochondrie pour être transformé en GABA par GAD (Roth and
Draguhn, 2012).

Figure 19. Métabolisation du GABA. Représentation schématique de la production directe

du GABA à partir du cycle de Krebs. Tiré de (Olsen and DeLorey, 1999)

67
 Le GABA est par la suite emmagasiné dans une vésicule synaptique par un
transporteur vésiculaire de neurotransmetteurs (VGAT) selon le gradient de H+ et est relâché
dans la fente synaptique par le procédé d’exocytose calcium-dépendant (Fon and Edwards,
2001). Cependant, lors d’une importante dépolarisation ou d’un déséquilibre dans
l’homéostasie ionique, sa libération pourrait aussi être effectuée à partir du compartiment
cytoplasmique en passant par des transporteurs membranaires qui jouent habituellement un
rôle dans la recapture du GABA (GATs) (Wu et al., 2007). L’action du GABA sera
engendrée par la liaison avec des récepteur ionotropiques (GABAA; réponse rapide) ou
métabotropiques (GABAB; réponse lente), localisés dans la région pré- ou post-synaptique
(Owens and Kriegstein, 2002). Son signal sera interrompu avec la recapture du GABA dans
la terminaison nerveuse et/ou dans les cellules gliales à travers les GATs, des protéines à 12
segments membranaires sensibles au sodium. Pour se faire, le transporteur provoque l’entrée
d’ions Na+ avec la molécule de GABA (Roth and Draguhn, 2012). Suite à la recapture du
GABA, il sera métabolisé par GABA-T (Figure 20) (Cherubini and Conti, 2001). GABA-T
est considérée comme une enzyme de synthèse et de dégradation puisqu’elle dégrade le
GABA en semi-succinique aldéhyde et utilise le groupe aminé pour transformer l’α-
cétoglutarate en glutamate (Roth and Draguhn, 2012). Le semi-succinique aldéhyde sera
oxydé en acide succinique qui va entrer dans le cycle de Krebs pour être éventuellement re-
synthétisé en GABA et ainsi fermer la boucle de synthèse et maintenir la concentration intra-
neuronale de GABA (Figure 20) (Roth and Draguhn, 2012).

68
Figure 20. Diagramme schématique de la synthèse et le transport du GABA dans la
synapse. Mécanisme de libération du GABA, position des récepteurs GABAergiques dans
la fente synaptique et mécanisme de recapture du GABA afin de le métaboliser. Tiré de
(Owens and Kriegstein, 2002).

3.3 Récepteur GABAA

La voie classique d’action du GABA passe par sa liaison avec le récepteur GABA A
pour ensuite engendrer le changement de conformation de ce dernier. Le récepteur GABAA
est un assemblage pentamérique de sous-unités distinctes qui ensembles, forment un canal
ligand-dépendant permettant le passage passif de Cl- et qui possède aussi une certaine
perméabilité pour le bicarbonate (HCO-3) (Ben-Ari et al., 2007). Chaque sous-unité est
formée d’un long terminal N extracellulaire qui interagit avec plusieurs drogues
(benzodiazépines, barbituriques et neurostéroïdes), quatre domaines transmembranaires
(TM1-4) et un petit terminal C extracellulaire (Figure 21C) (Chuang and Reddy, 2018).
Ensembles, les domaines TM2 de chaque sous-unité forment le canal permettant le passage
des ions Cl- (Chuang and Reddy, 2018).

Il a longtemps été cru que le récepteur GABAA est localisé exclusivement aux sites
post-synaptiques du système nerveux (Sigel and Steinmann, 2012). Le relâchement massif

69
du GABA par les vésicules pré-synaptiques est suivi par la liaison à un faible nombre de
récepteurs groupés sur la membrane post-synaptique de façon très étroite (Farrant and
Nusser, 2005). Cette forte augmentation de la concentration de GABA sur le récepteur ouvre
le canal chlorure et engendre une courte (millisecondes) augmentation dans le flux des ions
à travers la membrane (activation phasique) (Farrant and Nusser, 2005). Il a récemment été
démontré que le récepteur GABAA peut se trouver sur des sites pré-synaptiques et extra-
synaptiques et se lierait au GABA qui s’échappe de la zone synaptique et pour engendrer une
activation persistante ou tonique (Farrant and Nusser, 2005). Ces deux évènements
(activation phasique vs tonique) ont des rôles très différents dans le contrôle du réseau
neuronal, mais ne seront pas abordés plus en profondeur dans ce texte. Outre son
emplacement dans la synapse, la structure du récepteur détermine son rôle dans la
modification de l’activité neuronale.

3.3.1 Structure du récepteur GABAA

Bien qu’il existe une multitude de compositions possibles du récepteur GABAA,

certaines combinaisons des sous-unités sont préférées dans le SNC (McKernan and Whiting,
1996). Le récepteur est souvent constitué de deux sous-unités α, deux β ainsi qu’une
cinquième sous-unité qui peut être soit une troisième β, une γ ou une δ (Figure 21A)
(Baumann et al., 2001; Farrar et al., 1999; Klausberger et al., 2001). Le site de fixation du
GABA se situe sur les deux interfaces entre les sous-unités α et β. La composition du
récepteur GABAA peut être engendrée à partir d’un répertoire de 19 sous-unités (α1-6, β1-3,
γ1-3, δ, ε, θ, π, et ρ1-3) (Chuang and Reddy, 2018; Rabow et al., 1995). Ce mélange de sous-
unités dans la composition du récepteur lui procure une multitude de propriétés incluant le
passage d’ions, la modulation allostérique ainsi que la désensibilisation (Ben-Ari et al., 2007;
Hill-Venning et al., 1997; Verdoorn et al., 1990). La composition du récepteur GABAA est
très hétérogène à travers le cerveau et certaines combinaisons spécifiques de sous-unités sont
distribuées largement dans le système nerveux alors que d’autres peuvent être retrouvées
seulement dans les neurones de régions précises telles que l’hippocampe ou le cortex cérébral
(Rabow et al., 1995). Une variante du récepteur ionotropique GABAA (nommée GABAC) a

70
aussi été identifiée dans le système nerveux. Ce récepteur est aussi sélectif pour le passage
du chlore à travers son canal, mais est classé indépendamment de son confrère puisqu’il ne
réagit pas à l’antagoniste du récepteur GABAA ; la bicuculline (Bormann and Feigenspan,
1995). Il serait aussi principalement composé d’un ou plusieurs types de sous-unités ρ, qui
partagent des séquences homologues avec les sous-unités du récepteur GABAA (Bormann,
2000; Mehta and Ticku, 1999). Bien que le récepteur GABAC ne sera pas abordé en
profondeur dans cette thèse, il est important de reconnaître qu’il représente une variante
pharmacologique potentielle au récepteur GABAA dans l’action du GABA sur le système
nerveux.

Figure 21. Le récepteur GABAA. A) Représentation schématique du récepteur GABAA

typique incluant ses sous-unités α, β et γ. B) Assemblage possible des sous-unités afin de
former le canal du chlore et les différents sites de liaison des modulateurs du récepteur. NS :
neurostéroïdes. BZ : benzodiazépines. C) Composition d’une sous-unité avec ses domaines
transmembranaires. Tiré de (Chuang and Reddy, 2018).

71
 Les combinaisons du récepteur changent non seulement d’une région à l’autre, mais
seront aussi modifiées au cours du développement (Laurie et al., 1992). Un des principaux
changement au cours du développement concerne la sous-unité α, avec une diminution de
l’expression de la sous-unité α2 ou α3 parallèlement à l’augmentation de la sous-unité α1
(Bosman et al., 2002; Laurie et al., 1992). Dans la région spécifique du préBötC, cette
modification a lieu sur l’expression des sous-unités α1 et α3 alors que celle de la sous-unité
α2 reste stable au cours de la période postnatale (Figure 22) (Liu and Wong-Riley, 2004).
Chez le rat, l’âge auquel les courbes d’expression des sous-unités α1 et α3 se croisent se situe
à près de 12 jours de vie (Liu and Wong-Riley, 2004, 2005). Cette tendance est similaire dans
le NTSVL (Liu and Wong-Riley, 2006).

Figure 22. Expression des sous-unités α du récepteur GABAA à travers le

développement. Mesure de densité optique des produits immunoréactifs pour les sous-unités
du récepteur GABAA (α1, α2 et α3) dans le préBötC. Évaluation en fonction de l’âge de rats
Sprague-Dawley. Tiré de (Liu and Wong-Riley, 2004).

L’expression transitoire de chaque sous-unité du récepteur GABAA au cours du

développement engendre réponse synaptique qui change avec l’âge. Ceci s’explique par le
fait que l’expression des différentes sous-unités causerait en partie un changement dans le
temps de décroissance du courant inhibiteur post-synaptique spontané (sIPSC) (Bosman et
al., 2002). Ce temps de décroissance est en partie contrôlé par la désactivation du récepteur,

72
c’est-à-dire le temps de fermeture du canal ionique suite au détachement du ligand de son
site de liaison (McClellan and Twyman, 1999). Il a été démontré qu’un récepteur GABAA
contenant la sous-unité α2 ou α3 aurait un temps de décroissance plus lent que celui qui
contient la sous-unité α1 (Bosman et al., 2002; Lavoie et al., 1997; Verdoorn, 1994).
L’inhibition engendrée par la liaison du GABA sur un récepteur où la sous-unité α3
prédomine serait alors moins efficace puisqu’elle serait gênée par la cinétique et le temps de
décroissance tous deux lents ainsi qu’une saturation des récepteurs GABAA post-synaptiques
(Liu and Wong-Riley, 2004). Au contraire, l’efficacité de l’action inhibitrice engendrée par
un récepteur GABAA comprenant une majorité de sous-unités α1 serait augmentée
dramatiquement dû à sa cinétique et son temps de décroissance bien plus rapides (Liu and
Wong-Riley, 2004). Cette augmentation d’efficacité de l’inhibition engendrerait un
déséquilibre dans la balance excitation/inhibition, c’est-à-dire une plus forte inhibition et plus
faible excitation (Liu and Wong-Riley, 2004). De plus, les propriétés cinétiques des sIPSC
peuvent être différentes d’une synapse à l’autre. C’est en partie due au fait qu’une même
synapse peut avoir plus d’un type de sous-unités α à l’intérieur du même récepteur GABAA
ou à travers plusieurs récepteurs (Araujo et al., 1996; Verdoorn, 1994). Une synapse qui
contient plus de sous-unités α1 en combinaison avec α3 aura un temps de décroissance plus
court et donc des sIPSC plus rapides qu’une synapse constituée majoritairement de sous-
unités α3.

La composition du récepteur ne détermine pas seulement la réponse synaptique

engendrée lors de son activation, mais aussi la diversité de modulateurs qui peuvent
influencer son activité. Ces modulateurs seront introduits dans le paragraphe ci-dessous.

3.3.2 Modulation du récepteur GABAA

Le récepteur GABAA est très sensible à plusieurs modulateurs allostériques incluant

les benzodiazépines, les barbituriques, les drogues d’anesthésie et l’éthanol. Ces modulateurs
augmentent la réponse au GABA, activent directement le récepteur ou affectent sa stabilité
membranaire et son trafic à travers la cellule (Kittler and Moss, 2003; Sigel and Steinmann,

73
2012). Cette affinité étendue est en partie due au fait que le récepteur membranaire possède
un nombre élevé de cavités auxquelles les modulateurs peuvent se lier (Ernst et al., 2005).
Le tout dépend de la composition des sous-unités du récepteur ainsi que leur arrangement
Les benzodiazépines possèdent une grande affinité pour le site de liaison à l’interface des
sous-unités α et γ (Sigel and Buhr, 1997; Sigel and Lüscher, 2011). Par la liaison à leur site
d’intérêt, les benzodiazépines n’ouvrent pas directement le canal du récepteur GABAA, mais
provoquent plutôt un changement de conformation du récepteur afin d’augmenter l’affinité
du GABA pour son site de liaison, augmentant ainsi la fréquence d’ouverture du canal en
présence du GABA (Sigel and Steinmann, 2012). La majorité des benzodiazépines exercent
des fonctions de sédation, réduisent l’anxiété et aident au sommeil (Olsen and Sieghart,
2009).

Un groupe de modulateurs endogènes reconnus pour leur action sur le récepteur

GABAA sont les neurostéroides. Ces derniers peuvent être produits par les glandes
endocrines et traversent la barrière hémato-encéphalique pour agir sur le SNC, mais il est
aussi démontré que certaines neurones et cellules gliales peuvent synthétiser les
neurostéroides localement (Mellon et al., 2001; Purdy et al., 1991). Suite à leur liaison au
récepteur GABAA, les neurostéroïdes n’agissent pas directement sur la conductance du canal,
mais amélioreraient plutôt l’inhibition neuronale en maintenant le stade ouvert du canal lors
de la liaison du récepteur avec le GABA (Callachan et al., 1987). Les compositions du
récepteurs GABAA qui présentent un forte sensibilité aux neurostéroïdes incluent les sous-
unités α1 et α3 (Belelli et al., 2002). La production de neurostéroïdes est grandement affectée
par différents stades physiologiques incluant le stress, la grossesse, le développement et le
vieillissement (Paul and Purdy, 1992; Purdy et al., 1991; Schumacher et al., 2003). Les
niveaux synaptiques de neurostéroïdes sont encore inconnus à travers le développement, mais
il est démontré que les niveaux plasmatiques peuvent passer de 10nM à 100nM juste avant
l’accouchement (Paul and Purdy, 1992). Puisqu’une trop grande concentration de
neurostéroïdes peut inhiber l’extension des neurites et modifier la localisation des
interneurones corticaux dans le développement, des niveaux anormaux causés par le stress
ou l’abus d’alcool peuvent être alarmants lors de la gestation (Brinton, 1994; Grobin et al.,
2003).

74
 En plus de la réponse synaptique qui peut changer selon la composition du récepteur
GABAA et selon ses différents ligands, la concentration de chlore intracellulaire est aussi
déterminante pour le type de réponse effectuée.

3.3.3 Changement développementaux de l’homéostasie du chlore

Comme il a été mentionné précédemment, la liaison du GABA à son récepteur

engendre le changement de conformation de ce dernier, ce qui permet le passage des ions Cl-
(Ben-Ari et al., 2012). La direction du mouvement des ions chlorure dépend de la [Cl-]i qui
est en majeur partie régulée par l’action des co-transporteurs de cation-chlore NKCC1 et
KCC2 (Ben-Ari et al., 2007). Le co-transporteur NKCC1 effectue l’entrée du chlore par
l’internalisation d’un ion sodium (Na+), un ion potassium (K+) et deux ions Cl- (Payne et al.,
2003). Ce dernier est exprimé dans presque toutes les cellules des mammifères et joue un
important rôle dans l’homéostasie du volume cellulaire et le contrôle du contenu en ions
cytosoliques (Ben-Ari et al., 2007). Cependant, parmi la liste de tous les co-transporteurs qui
dirigent les ions Cl- vers l’intérieur de la cellule (NKCC1, NKCC2 et NCC1), seul le NKCC1
est exprimé de façon significative dans le SNC (Ben-Ari et al., 2007). Sa mise en marche ne
requière pas l’utilisation d’ATP puisqu’il utilise le gradient électrochimique de sodium et
potassium produit par la pompe Na+/K+ (Ben-Ari et al., 2007). Pour sa part, le co-transporteur
KCC2 assure la sortie des ions Cl- liés à un ion K+ en utilisant lui aussi le gradient de K+
(Ben-Ari et al., 2007). De la famille des co-transporteurs engendrant la sortie d’ions Cl- de la
cellule, le KCC2 est le principal transporteur dans les neurones. Bien que les isoformes
KCC1, KCC3 et KCC4 soient retrouvés dans le SNC, leur niveau d’expression est très bas
(Payne et al., 2003).

Lorsque [Cl-]i est élevé, le potentiel d’équilibre du chlore (ECl-) est positif
relativement au potentiel de membrane (Vm). L’activation du récepteur GABAA engendre
alors une fuite de Cl- par le canal, créant ainsi une dépolarisation du neurone. Inversement,
lorsque [Cl-]i est négatif par rapport à Vm, l’activation du récepteur GABAA provoque l’entrée
de Cl- et l’hyperpolarisation du neurone (Ben-Ari et al., 2012). Par leur expression en

75
constant changement à travers le développement causant ainsi la différente [Cl -]i dans la
cellule selon l’âge, NKCC1 et KCC2 jouent un rôle central dans la modification du potentiel
d’inversion de la cellule lors de l’activation du récepteur GABAA (EGABA) comparativement
au potentiel de repos de la membrane (EM), qui engendre donc le transfert âge-dépendant de
l’action dépolarisante vers hyperpolarisante des neurones (Figure 23) (Ben-Ari et al., 2007).

Figure 23. Changements de l’homéostasie du chlore au cours du développement. A)

mouvement des ions Cl- à travers le canal du récepteur GABAA suite à la liaison du ligand
au récepteur. Modification de la direction du déplacement selon le gradient du chlore
intracellulaire au cours du développement. B) Changement de l’expression des co-
transporteurs de chlore (NKCC1 et KCC2) au cours du développement, affectant ainsi le
gradient du chlore intracellulaire. Tiré de (Ben-Ari et al., 2007).

Il est important de noter ici que cette évolution d’expression peut changer entre les
régions du cerveau et est aussi différente selon les espèces (Ben-Ari et al., 2007; Plotkin et
al., 1997). L’évaluation de NKCC1 et KCC2 par western blot dans le cortex du rat a démontré

76
que l’expression de la protéine NKCC1 est élevée à 3 jours de vie (P3) avec le climax
d’expression atteint à P14. Par la suite, l’expression diminue jusqu’à l’âge adulte (Dzhala et
al., 2005). Quant à elle, l’expression de KCC2 reste relativement faible pendant les deux
premières semaines de vie du raton (P3 à P14), pour ensuite augmenter drastiquement vers
20 jours de vie (P20) et atteindre les niveaux de l’adulte (Dzhala et al., 2005). Une analyse
par immunobuvardage northern de l’ARNm extrait de l’hippocampe du rat démontre une
courbe semblable de développement pour la protéine KCC2 avec cependant une forte
augmentation de l’expression à P5 pour atteindre les niveaux semblables à l’adulte à P15
(Rivera et al., 1999). Malgré les méthodes d’analyse et les régions qui diffèrent, ces résultats
indiquent que la transition de l’action dépolarisante vers hyperpolarisante est en partie
modulé par le changement d’expression de NKCC1 vers KCC2 vers 2 semaines de vie chez
le rongeur. Cette tendance est similaire dans les différentes régions du tronc cérébral incluant
le préBötC, le noyau ambigu, le noyau de l’hypoglosse (XII), le NTSVL, le RTN/pFRG et le
noyau moteur dorsal du nerf vague (DMNV) (Liu and Wong-Riley, 2012). De légères
différences peuvent être observées comparativement à l’expression corticale puisque les
niveaux de NKCC1 sont élevés dans la première semaine et demie de vie pour réduire à partir
de l’âge postnatal P12 et maintenir un plateau par la suite (Figure 24). De même, l’expression
de KCC2 augmente à partir de P0 pour atteindre son climax à P12 (Liu and Wong-Riley,
2012).

77
Figure 24. Expression des co-transporteurs NKCC1 et KCC2 à travers le
développement. Mesure de densité optique des produits immunoréactifs pour les co-
transporteurs de cation-chlore NKCC1 et KCC2 dans le préBötC. Évaluation en fonction de
l’âge de rats Sprague-Dawley. Tiré de (Liu and Wong-Riley, 2012)

3.4 Récepteur GABAB

En plus de son effet par le récepteur ionotropique, il a été démontré dans les années
1980 que le GABA peut aussi agir par un récepteur métabotropique, insensible à la
bicuculline et qui ne dépend pas de la concentration intracellulaire du chlore (Bowery et al.,
1980; Hill and Bowery, 1981). Ce dernier est le récepteur GABAB, un récepteur à sept
domaines transmembranaires dont le signal passe par l’activation de protéines Gi et Go
(LeVine, 1999). Le récepteur GABAB est localisé tant sur la membrane pré- que post-
synaptique avec un effet diverse selon le site (Ben-Ari et al., 2007). Au niveau pré-
synaptique, l’inhibition est produite par une coupure du courant calcique au terminal nerveux
causant ainsi une réduction dans la libération des neurotransmetteurs (Bormann, 1988). Pour
sa part, l’inhibition post-synaptique est causée par l’activation de canaux rectifiants de
potassium (GIRK ou Kir3) qui sont à la base de la phase tardive du potentiel inhibiteur post-
synaptique (Dutar and Nicoll, 1988; Lüscher et al., 1997). L’activation des récepteurs

78
GABAB affecte aussi la production d’AMP cyclique (cAMP), engendrant ainsi un vaste
éventail d’actions sur les canaux ioniques et protéines qui sont la cible de la kinase liée à
cAMP (PKA) et par la fait même modulant les fonctions synaptiques et neuronales (Gerber
and Gähwiler, 1994; Sakaba and Neher, 2003). Afin d’être fonctionnel, le récepteur nécessite
l’assemblage de ses deux sous-unités respectives GABAB1 et GABAB2 (Filippov et al., 2000;
Jones et al., 1998; Kaupmann et al., 1998; Kuner et al., 1999; Robbins et al., 2001; White et
al., 1998). Lorsque assemblé, le récepteur recombiné GABAB1, 2 peut alors produire la variété
de fonctions mentionnées ci-haut. Il est proposé que le récepteur ne peut agir sans la
combinaison des deux sous-unités, mais ce concept a été contesté par certaines études qui ont
démontré une réponse du récepteur dont les sous-unités étaient exprimées de façon isolée
(Gassmann et al., 2004; Martin et al., 1999). Tout comme le récepteur GABAA, l’action du
récepteur GABAB est mise en place tôt dans le développement néocorticale, mais présente
une maturation au niveau des propriétés physiologiques, pharmaceutiques ainsi que dans le
mode d’activation du récepteur qui change et dépend de la région. Il a été démontré dans le
néocortex et l’hippocampe qu’une réponse pré-synaptique du récepteur GABAB est observée
à la période prénatale, mais la réponse post-synaptique n’est présente que suite à la naissance
entre une et deux semaines de vie chez le rongeur (Fukuda et al., 1993; Gaiarsa et al., 1995;
Luhmann and Prince, 1991; McLean et al., 1996). Malgré tout, des études
d’immunohistochimie indiquent la présence des sous-unités du récepteur GABAB dans le
cortex à la période embryonnaire dont l’activation pourrait influencer la migration des
neurones indiquant ainsi que l’expression et l’activation du récepteur GABAB auraient lieu
dans la période prénatale (Behar et al., 1996, 2001).

Ensemble, les récepteurs GABAA et GABAB, par leur activation, agissent de façon
considérable sur la modulation de la respiration au cours du développement. Ce sujet est
introduit dans la section suivante.

79
3.5 Modulation de la respiration par le GABA au cours du
développement

Comme il a été mentionné précédemment, la ventilation pulmonaire chez le

mammifère est une fonction physiologique qui est continuellement ajustée par le SNC afin
de répondre à la demande métabolique selon la situation (Doi and Ramirez, 2008; Ramirez
et al., 2012). Le cycle périodique du préBötC est contrôlé par plusieurs neuromodulateurs
incluant 5-HT, l’adénosine, la noradrénaline ainsi que le système
GABAergique/glycinergique. Alors que l’inspiration repose grandement sur l’activité de
neurones excitateurs, une majorité des neurones impliqués dans la génération du rythme
respiratoire eupnéique sont GABAergiques et/ou glycinergiques (Smith et al., 2013). Il est
proposé que l’inhibition respiratoire par les neurones GABAergiques soit engendrée suite à
l’inflation des poumons qui provoque l’activation d’afférents méchanosensoriels (réflexe
Hering-Breuer) (Murakoshi and Otsuka, 1985). Au cours du développement, la densité des
récepteurs GABAA dans le tronc cérébral est plus importante aux premiers jours de vie du rat
qu’à l’âge adulte (Xia and Haddad, 1992). À l’âge gestationnel GD16, un faible nombre de
neurones GABAergiques sont retrouvés dans le noyau de l’hypoglosse et le noyau ambigu
(Friedland et al., 1995a, 1995b). À la naissance, les récepteurs GABAA sont distribués dans
une majorité des régions du tronc cérébral et leur densité augmente jusqu’à atteindre un pic
à P10 pour ensuite réduire vers l’âge adulte (Xia and Haddad, 1992).

Le rôle du système GABAergique/glycinergique dans la génération du rythme

respiratoire au cours de la maturation a amplement été exploré au fil des années, mais
l’importance de l’inhibition dépendante au chlore reste encore incertaine (Alheid and
McCrimmon, 2008; Ballanyi et al., 1999; Bianchi et al., 1995; Büsselberg et al., 2001, 2003;
Haji et al., 2000; Markstahler et al., 2002). Alors que des études in-vivo sur le chat adulte ont
démontré que l’arrêt des courants inhibiteurs GABA/glycine affecte grandement la
génération du rythme respiratoire, l'utilisation de préparations de tronc cérébral-moelle
épinière isolés chez le rongeur nouveau-né montrent que le rythme respiratoire persiste
malgré l’inactivation des récepteur GABA/glycine (Feldman and Smith, 1989; Onimaru et
al., 1990; Ramirez et al., 1997; Schmid et al., 1996). Puisque l’expression des récepteurs

80
GABA/glycine a été observée dans les régions contrôlant la respiration telles que le préBötC,
ces résultats divergents ont engendré la nécessite de revoir l’hypothèse proposée concernant
l’importance du rôle inhibiteur dans le contrôle respiratoire (Liu et al., 2001, 2002). Il est
tout d’abord faux de conclure que le système respiratoire isolé de rat nouveau-né est
insensible à la modulation par des acides aminés inhibiteurs. Le blocage des mécanismes de
récupération du GABA augmentant ainsi sa concentration dans le système, de même que
l’exposition de la préparation de tronc cérébral isolé à de fortes doses de muscimol (agoniste
récepteur GABAA) ont tous deux engendrés une dépression de la fréquence de décharges
respiratoires menant à l’arrêt du rythme respiratoire (Brockhaus and Ballanyi, 1998; Feldman
and Smith, 1989). Considérant ces résultats, il est proposé que l’importance des mécanismes
d’inhibition synaptique du rythme respiratoire augmente avec l’âge (Paton and Richter,
1995a, 1995b). Il reste malgré tout à déterminer si la forte sensibilité de l’adulte in-vivo au
blocage des systèmes inhibiteurs est due au plus haut taux de neurones inhibiteurs (et de
récepteurs GABAA) ou à la présence de structures périphériques qui sont absente dans la
préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés (Ballanyi et al., 1999). La deuxième
option est mise en évidence par les travaux de Ren et Greer (2006) qui ont procédé à
l’enregistrement de la respiration de rats nouveau-nés (1 jour) par pléthysmographie sur
animal entier et ont noté l’absence d’effet d’une injection de bicuculline sur le rythme
respiratoire en condition de base (Ren and Greer, 2006).

Afin de développer et préciser les résultats concernant le rôle des récepteurs de GABA
et glycine chez l’adulte, l’équipe de Bongianni (2010) a utilisé un modèle de lapin adulte
anesthésié, vagotomisé et ventilé artificiellement. Ils ont procédé à l’injection d’antagoniste
des récepteurs GABAA et GABAB dans la région du BötC et préBötC afin d’évaluer leur rôle
sur la respiration (Bongianni et al., 2010). Ils ont démontré que l’injection de bicuculline
dans le BötC induit une importante dépression respiratoire amenant à l’apnée alors que
l’injection dans le préBötC venait réduire la fréquence respiratoire sans la stopper (Bongianni
et al., 2010). L’injection de l’antagoniste du récepteur GABAB (CGP-35348) dans les deux
régions n’affecte pas la respiration en condition de base (Bongianni et al., 2010).

Le système GABAergique est reconnu pour son passage d’une action dépolarisante
vers hyperpolarisante lors du développement. Les mécanismes en jeu ont été abordés dans

81
les sections précédentes et le réseau de contrôle respiratoire n’est pas épargné par ce
phénomène. À travers l’utilisation de tranches médullaires in-vitro ainsi que la préparation
de tronc cérébral-moelle épinière isolés, l’équipe de Ren et Greer (2006) a démontré que le
changement de l’effet conducteur de Cl- se produit pendant la gestation (Figure 25). Selon
les résultats obtenus, le changement d’action dépolarisant/hyperpolarisante a lieu à l’âge
gestationnel GD18 pour atteindre une inhibition du rythme respiratoire maximale à GD20.
Par la suite, la sensibilité du système au muscimol semble diminuer avec l’avancement en
âge jusqu’à un potentiel plateau (Ren and Greer, 2006). À noter que c’est à l’âge GD17 que
débute la rythmogenèse respiratoire dans le préBötC (Pagliardini et al., 2003). Contrairement
à la préparation de tronc cérébral, la fréquence respiratoire provenant de la tranche médullaire
en réponse au muscimol ne semble jamais effectuer la transition vers une action
hyperpolarisante (Figure 25). Cet effet peut être expliqué par les différentes concentrations
de potassium dans les bains d’organes pour chaque préparation. En effet, un taux plus élevé
de potassium est retrouvé lors de l’enregistrement sur tranche médullaire (9 mM [K+]o)
comparativement à la préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés (3 mM [K+]o), ce
qui engendre la dépolarisation des cellules lors du contact avec le muscimol (Ren and Greer,
2006). Puisque le récepteur GABAA possède aussi une certaine perméabilité pour le
bicarbonate (HCO3-), il est intéressant de déterminer si cet ion peut affecter la réponse
respiratoire lors de l’activation du récepteur. L’absence de bicarbonate dans les bains
contenant les tranches médullaires de rat P2 n’affectait pas la réponse respiratoire au
muscimol (Ren and Greer, 2006). Brièvement, le GABA et la glycine agiraient donc comme
neurotransmetteurs excitateurs, avant leur transition d’action vers l’effet inhibiteur habituel,
pour augmenter la fréquence respiratoire et promouvoir l’émergence du rythme respiratoire
(Ren and Greer, 2003).

L’influence du système GABAergique sur la mise en place de la genèse respiratoire

est considérable, mais le système est très sensible à l’action de différents modulateurs
environnementaux qui incluent entre autre les hormones thyroïdiennes produites par l’axe
HPT.

82
Figure 25. Changement âge-dépendant de l’effet conducteur du chlore suite à
l’exposition au muscimol. A) Enregistrements des décharges respiratoires du nerf de
l’hypoglosse sur la préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés à différentes périodes
prénatales. B) Moyenne par âge du changement de la fréquence respiratoire relatif au control
en réponse à l’application du muscimol (0.3µM; agoniste du récepteur GABAA) sur la
tranche médullaire et la préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés. Tiré (Ren and
Greer, 2006).

3.6 Régulation du système GABAergique par les hormones

thyroïdiennes

La régulation du système GABAergique par les hormones thyroïdiennes a été

reconnue dans la fin des années 1960 (Ramírez de Guglielmone and Gómez, 1966) et depuis,
de nombreuses études ont examiné in vivo et in vitro l’impact des hormones sur différentes
fonctions GABAergiques (Balázs et al., 1968; Berbel et al., 1996; Chapa et al., 1995; Chapell
et al., 1998; García Argiz et al., 1967; Go et al., 1988; Hashimoto et al., 1991; Kalaria and
Prince, 1985; Martin et al., 1996, 2004; Mason et al., 1987; Medina and De Robertis, 1985;
Ortiz-Butron et al., 2003; Patel et al., 1980; Sandrini et al., 1993; Thompson et al., 1998;
Upadhyaya and Agrawal, 1993; Virgili et al., 1991). Le rôle de l’axe HPT sur le système
GABAergique est bien connu et il est intéressant de mentionner que le GABA peut lui aussi

83
avoir une action sur l’axe en réponse aux effets des hormones thyroïdiennes (Figure 26). Les
mécanismes de production et de dégradation du GABA sont retrouvés dans la glande thyroïde
et leurs fonctions sont toutes diminuées par l’administration de PTU engendrant une
déficience en hormones thyroïdiennes, un résultat similaire aux données collectées dans le
SNC (Gebauer, 1981; Gebauer and Haas, 1980). De manière générale, le GABA réduit la
production de TSH stimulée par la TRH (Elias et al., 1981).

L’effet des hormones thyroïdiennes sur le système GABAergique incluent la

modification de son métabolisme ainsi que des fonctions de ses récepteurs.

Figure 26. Représentation des possibles interactions entre l’axe HPT et le système
GABAergique. Les deux systèmes sont reconnus comme ayant des influences l’un sur
l’autre. L’activation et l’inhibition des systèmes sont représentées par les symboles + et -.
Tiré de (Wiens and Trudeau, 2006).

84
3.6.1 Effet sur le métabolisme du GABA

L’observation des mécanismes de synthèse et de métabolisation du GABA indique

qu’une déficience en hormones thyroïdiennes par administration d’inhibiteurs thyroïdiens
(PTU et MMI) chez le nouveau-né diminue l’activité de GAD, principale enzyme de synthèse
du GABA. Cette dernière n’est pas affectée lorsque le traitement est induit à l’âge adulte
(Balázs et al., 1968; García Argiz et al., 1967; Kalaria and Prince, 1985; Patel et al., 1988;
Virgili et al., 1991). L’effet est présent dans le cortex frontal, préfrontal et dans la zone
antérieure basale du cerveau, mais les régions de l’hippocampe, du cervelet et de la moelle
épinière sont intouchées (Patel et al., 1988; Virgili et al., 1991). Pour sa part, l’enzyme de
dégradation du GABA (GABA-T) est réduite dans le cortex et cervelet de rats âgés de 50
jours ayant subi une thyroïdectomie suite à la naissance (García Argiz et al., 1967). Ces
résultats peuvent sembler contradictoires, mais l’action similaire de l’hypothyroïdisme sur
les enzymes qui synthétisent et dégradent le GABA démontre que les hormones
thyroïdiennes sont principalement une composante nécessaire à la bonne expression des
gènes. Elles modifient donc l’activité normale des enzymes plutôt que simplement être des
régulateurs qui augmentent ou diminuent de façon unilatérale les niveaux de GABA (Wiens
and Trudeau, 2006). Enfin, le mécanisme de récupération du GABA est aussi affecté, mais
cette fois de façon similaire chez le nouveau-né et l’adulte. Une réduction des niveaux
d’hormones thyroïdiennes par l’administration de PTU ou thyroïdectomie, de manière
respective, ont toutes deux augmenté le taux de récupération du GABA dans le corps strié
des nouveau-nés et le cortex cérébral des adultes (Kalaria and Prince, 1985; Mason et al.,
1987). La modulation de ces procédés par les hormones thyroïdiennes engendre bien sûr un
changement dans les niveaux de GABA à travers le cerveau. L’injection d’iode-131 (131I)
chez le raton quelques heures suivant sa naissance provoque une diminution des niveaux de
GABA à travers le cerveau entier jusqu’à 30 jours de vie après lesquels le niveau revient
équivalent au groupe témoin (Ramírez de Guglielmone and Gómez, 1966). À l’inverse, une
thyroïdectomie et injection de 131I chez l’adulte résulte en augmentation des taux de GABA
dans le cortex et l’hypothalamus (Chapa et al., 1995; Upadhyaya and Agrawal, 1993).

85
3.6.2 Effet sur la fonction des récepteurs GABAergiques

Les effets d’une déficience en hormones thyroïdiennes ont principalement été

examinés au niveau des récepteurs GABAA et plus précisément sur leur site de liaison pour
le muscimol (GABA) et les benzodiazépines. Un hypothyroïdisme néonatale réduit la densité
des sites de liaison du GABA au cours du développement jusqu’à l’âge de 12 jours
postnataux, mais l’effet est spécifique au cervelet (Kalaria and Prince, 1985; Patel et al.,
1980). La relation avec les récepteurs de benzodiazépines et l’hypothyroïdisme n’a pas été
observée en période néonatale, mais l’ajout de T3 et T4 in-vitro diminue la densité de
récepteurs dans une culture de neurones du néocortex (Go et al., 1988). Chez l’adulte,
l’hypothyroïdisme induit par l’ajout de PTU dans la nourriture sur 12 semaines réduit la
quantité de sites de liaison du GABA dans le cortex visuel (Kalaria and Prince, 1986). Une
thyroïdectomie sur deux semaines augmente le nombre de site de liaison des benzodiazépines
dans le cortex cérébral, mais l’ajout de méthimazole dans l’eau réduit le nombre de sites dans
l’amygdale médiale (Medina and De Robertis, 1985; Ortiz-Butron et al., 2003). Ceci
démontre la diversité de l’effet selon le mode modification des hormones et la région ciblée.

En plus de leur effet sur la densité des récepteurs GABAA, les hormones thyroïdiennes
agissent de façon non génomique sur le courant du chlore lors de l’activation du récepteur
modulant ainsi l’activité GABAergique. La T3 n’agit pas directement de manière compétitive
en bloquant le site de liaison du GABA, mais sa présence réduit le courant Cl - induit par la
présence de GABA dans les membranes du cerveau antérieur (Martin et al., 1996). Il est
supposé que la T3 agit plutôt par un mécanisme de blocage du canal et par la sous-unité α1
du récepteur GABAA qui présente une sensibilité élevée aux hormones thyroïdiennes
(Chapell et al., 1998). Sans la présence de GABA, la T3 agit différemment et engendre un
courant Cl- (Chapell et al., 1998). Puisque l’antagoniste bicuculline n’empêche pas cette
action, il est proposé que la T3 crée ce courant par un autre mécanisme que la modulation
directe du récepteur (Chapell et al., 1998).

Les hormones thyroïdiennes influencent en période périnatale une quantité

importante d’organes, de cellules et de mécanismes moléculaires qui ne peuvent être tous
énumérés ici. Cependant, il a récemment été démontré que les hormones thyroïdiennes

86
agissent pendant cette période sur une certaine cellule de nettoyage du SNC, action qui passe
entre autre par le système GABAergique.

4. Les microglies : effecteurs de plasticité au cours du

développement

4.1 Description des microglies

Les microglies constituent une sous-population des macrophages qui résident dans le
SNC. Elles sont présentes tout au long de l’axe neural et sont caractérisées par des fines
ramifications qui émanent d’un petit corps cellulaire et chaque cellule semble occuper son
propre territoire (Perry, 2016). Contrairement aux autres macrophages du SNC, elles sont en
contact direct et interagissent avec les neurones, les synapses et les autres cellules gliales. Par
conséquent, elles peuvent jouer un rôle important dans la plasticité au cours du
développement, d’où leur intérêt dans le contexte de cette thèse.

4.1.1 Physiologie des microglies

Les microglies se distinguent des macrophages par leur morphologie, leur origine du
sac vitellin et leur interaction avec les autres cellules de la région. Elles expriment cependant
des marqueurs similaires au macrophages incluant : Iba-1 (molécule adaptatrice liant les ions
calcium de type 1) et CD11b/CD45 (cluster de différenciation de type 11b ou 45) (Harry and
Kraft, 2012). Une caractéristique de la microglie est le fait que son corps cellulaire est assez
fixe avec les ramifications actives et mobiles qui effectuent une constante analyse de son
environnement (Nimmerjahn et al., 2005). À travers ses interactions, elle serait
principalement restreinte par les ligands endogènes qui se lient à ses multiples récepteurs
exprimés à la surface incluant : CD200R (lié à CD200), C3XCR1 (lié à CX3CL1; fractalkine)
et CD33 (lié à l’acide sialique) (Ransohoff and Cardona, 2010). Malgré tout, la microglie

87
reste une cellule immunitaire qui répond rapidement à tout signal d’activation tel qu’une
lésion du tissu nerveux, la présence d’ATP ou la liaison du ligand au récepteur purinergique
P2Y12 ou d’adénosine A2A (Haynes et al., 2006; Orr et al., 2009; Rodrigues et al., 2015).
Elle peut passer à tout moment d’une forme ramifiée vers une morphologie constituée de
ramifications moins nombreuses et plus larges pour même adopter une forme amiboïde selon
la sévérité de la lésion. Cette activation est accompagnée de changements dans l’expression
des gènes, d’une augmentation de la prolifération et de la phagocytose et d’un relâchement
de médiateurs pro et anti-inflammatoires (Hanisch, 2013; Kalaria and Prince, 1986; Kierdorf
et al., 2013). Le terme d’activation de la microglie est largement discuté dernièrement
puisque la microglie n’est pas activée selon le même phénotype à tout moment. Une
classification de la cellule a longtemps été utilisée pour diviser les microglies selon un stade
M1 (pro-inflammatoire/neurotoxique) ou M2 (anti-inflammatoire/neuroprotecteur), mais
même la pertinence de cette classification est aujourd’hui débattue et ne fera pas partie du
sujet abordé dans ce texte (Boche et al., 2013). L’origine des microglies sera abordée dans le
paragraphe ci-dessous.

4.1.2 Origine développementale des microglies

Plusieurs hypothèses sur l’origine des microglies ont été discutées depuis le début du
20e siècle. Les récentes preuves indiquent que les microglies dérivent de macrophages
primitifs qui proviennent du sac vitellin extra-embryonnaire, premier site de l’hématopoïèse
(Mosser et al., 2017). Elles apparaissent à l’âge gestationnel GD7 dans les îlots sanguins du
sac vitellin pour ensuite se propager dans l’embryon par le sang une fois que le système
circulatoire est mis en place (GD8-GD10) (Ginhoux et al., 2010). Elles traversent ensuite la
barrière hémato-encéphalique et peuvent même s’infiltrer dans le SNC par les méninges, le
plexus choroïdien ou les ventricules. Les microglies ont à ce moment une morphologie
amiboïde qui aide à la migration et peuvent être retrouvées dans le cerveau au jour
gestationnel GD9.5 (Ginhoux et al., 2010). Une fois dans le parenchyme nerveux, elles vont
s’accumuler en groupe à l’intérieur ou près de la matière blanche où elles vont proliférer
(Figure 27). La colonisation se déroule ensuite en deux étapes : 1) les microglies migrent de

88
façon tangentielle sur la surface pour se distribuer dans l’entièreté du système nerveux, 2)
elles vont ensuite migrer perpendiculairement à la surface afin de pénétrer dans toutes les
couches du SNC (Monier et al., 2007; Pont‐Lezica et al., 2011). Leur nombre va augmenter
drastiquement du jour postnatal P5 à P15 pour atteindre leur climax de densité après la
deuxième semaine de vie et réduire légèrement pour se stabiliser par la suite jusqu’à l’âge
adulte (Nikodemova et al., 2015). Une fois la migration et prolifération effectuées, les
microglies localisées à leur destination finale vont se différentier en cellules ramifiées
(Mosser et al., 2017). Le phénotype de la microglie dépend en partie de son précurseur
d’origine, mais sera grandement influencé par les caractéristiques du territoire occupé
(Schmid et al., 2009). Il est reconnu que la migration et différentiation des microglies sont
régulées par un grand nombre de voies de signalisations qui incluent l’interaction avec
certaines cellules du SNC (particulièrement les astrocytes) et ces procédés seraient
grandement liés à la maturation du réseau neuronal.

89
Figure 27. Migration et différentiation des microglies à travers le développement. Les
précurseurs des microglies provenant du sac vitellin migrent vers le SNC sous une forme
amiboïde et traversent la barrière hémato-encéphalique pour s’accumuler dans le parenchyme
nerveux du rongeur. Elles vont ensuite migrer dans les différentes zones du SNC pour
effectuer une importante prolifération jusqu’à la stabilisation vers l’âge postnatal P20. Le
phénotype de la microglie va changer à travers son développement, mais dépend grandement
de son précurseur original et va changer selon le territoire qu’elle occupe une fois la migration
effectuée. Tiré de (Harry and Kraft, 2012).

90
4.2 Rôles des microglies dans le développement

Les microglies sont considérées comme des cellules immunitaires du SNC, mais elles
sont aussi importantes dans le développement du réseau neuronal. Elles occupent différent
rôle incluant le nettoyage des neurones et le support de leur développement.

4.2.1 Les nettoyeurs du système nerveux central en développement

Les facteurs attirant les microglies lors du développement proviendraient

principalement des cellules en apoptose lors du procédé nommé mort cellulaire programmée.
Au cours de la gestation et tôt en période postnatale, il se produit une surproduction de
neurones qui entrent ensuite en compétition pour les facteurs trophiques du milieu et leur
survie (Oppenheim, 1991). Les cellules en apoptose produisent alors un signal «trouve-moi»
qui attire les microglies. Ce signal inclut la libération de la fractalkine, le lipide
lysophosphatidylcholine (LysoPC), la sphingosine 1 phosphate (S1P), l’ATP et l’UDP
(Elliott et al., 2009; Gude et al., 2008; Lauber et al., 2003; Truman et al., 2008). Une fois
arrivée à la cellule, la microglie reconnaît le message «mange-moi» exprimé par des ligands
à la surface de la cellule en apoptose et procède à la phagocytose de cette dernière (Figure
28A). Il a aussi été démontré que les microglies peuvent induire l’apoptose des neurones par
la libération de médiateurs et elles peuvent aussi effectuer la phagocytose de précurseurs
neuronaux viables (Mosser et al., 2017).

À la période postnatale, il se produit aussi une surproduction des synapses qui doit
être gérée afin que le réseau neuronal mature de façon appropriée. Une élimination des
synapses selon leur activité, appelée élagage synaptique, est effectuée par les microglies afin
d’assurer le fonctionnement adéquat des synapses restantes (Figure 28B) (Hua and Smith,
2004). L’élagage est en partie contrôlé par le ligand fractalkine libéré par la synapse qui doit
être éliminée et récupéré par le récepteur CX3CR1 des microglies. Il serait aussi
potentiellement influencé par les protéines complémentaires C1q et C3 liées au récepteur
C3R ainsi que 5-HT par la liaison avec le récepteur 5-HT2B de la microglie. Une inhibition

91
de ces mécanismes se conclue dans tous les cas par un mauvais élagage des synapses et une
maturation inadéquate du réseau neuronal (Kolodziejczak et al., 2015; Paolicelli et al., 2011;
Schafer et al., 2012; Zhan et al., 2014). En plus de leur rôle de nettoyage et raffinement du
système nerveux, les microglies peuvent aider à la maturation des cellules du SNC.

Figure 28. Fonctions des microglies au cours du développement du SNC. A) Phagocytose

des neurones en apoptose qui expriment le signal «mange-moi» (rouge) et induction de
l’apoptose d’un neurone viable par différentes voies de signalisations (bleue). B) Élagage
d’une synapse surnuméraire par le mécanisme de protéine complémentaire. C) Aide à la
formation de synapses par l’expression de BDNF ou IL-10. D) Aide à la survie neuronale par
l’expression de IGF-1. Modifié de (Mosser et al., 2017)

92
4.2.2 Support de la survie et prolifération des neurones en développement

Comme il a été mentionné précédemment, les microglies peuvent provoquer la mort

cellulaire par la libération de médiateurs, mais elles peuvent aussi soutenir la maturation des
neurones par des mécanismes semblables. Il a été démontré par l’utilisation de techniques in-
vitro et in-vivo qu’elles peuvent aider à la survie neuronale grâce au relâchement de IGF-1
(Figure 28D) (Ueno et al., 2013). La formation de synapses peut aussi être stimulée par les
microglies entre autre par la libération du BDNF ou l’interleukine IL-10 (Figure 28C) (Lim
et al., 2013; Parkhurst et al., 2013). Finalement, les microglies peuvent influencer
indirectement la maturation des neurones et formation de synapses par la mobilisation
d’autres cellules du SNC telles que les astrocytes, importants modulateurs de la
synaptogénèse lors de l’activation de leurs récepteurs purinergiques P2Y1 (Pascual et al.,
2012).

Les microglies sont maintenant reconnues comme d’importants modulateurs du

développement du réseau neuronal, mais leur action est constamment modulée par différents
mécanismes incluant la libération d’hormones thyroïdiennes par l’axe HPT.

4.3 Influence des hormones thyroïdiennes sur les microglies

Le phénotype et l’activité des microglies est grandement dépendant de

l’environnement où la cellule se situe et cet environnement est modifié par différents facteurs
qui reflètent de l’état du SNC (sain ou perturbé par une pathologie). L’environnement
neuronal change aussi au cours du développement et la croissance/maturation des microglies
sont influencées par les hormones thyroïdiennes qui sont essentielles au bon développement
du réseau neuronal (Lima et al., 2001). Les récepteurs TRα et TRβ ont effectivement été
retrouvés dans le noyau de microglies en culture cellulaires suggérant que les microglies sont
sensibles à la présence d’hormones thyroïdiennes. L’analyse de cerveaux fixés de rats à
différents âges postnataux (P0 à P22) démontre que la déficience en hormones thyroïdiennes
à partir du jour gestationnel GD16 réduit la densité des microglies dans le cerveau antérieur

93
et perturbe la formation de leurs ramifications. La présence d’hormones thyroïdiennes
inverse cette tendance et la première semaine de vie semble être critique au bon
fonctionnement des microglies. Des résultats de culture cellulaires d’embryons de rats ont
confirmé les résultats où la présence de T3 dans la culture favorisait la survie des microglies
ainsi que la croissance de leurs ramifications (Lima et al., 2001).

L’équipe du Dr. Noda a aussi démontré par l’utilisation de la culture cellulaire du

cortex que la migration des microglies, leur remodelage ainsi que la phagocytose des cellules
nerveuses sont tous renforcés par l’application de T3 à la culture. Il est proposé qu’une partie
de la réponse serait due à l’effet non-génomique des hormones thyroïdiennes, mais le retrait
des récepteurs TRs et des transporteurs d’hormones thyroïdiennes dans la cellule ont aussi
supprimé la migration et les changements morphologiques des microglies (Mori et al., 2015).
Les effets des hormones thyroïdiennes sur l’activité et physiologie des microglies passent par
de multiples mécanismes cellulaires qui ne seront pas discutés dans ce texte, mais il est
pertinent d’indiquer que la T3 module la migration des microglies entre autre par son action
sur les récepteurs GABAA et GABAB (Mori et al., 2015).

L’activité des microglies est importante pour la formation adéquate du réseau

neuronal ainsi que son bon fonctionnement avec l’avancée en âge. Le rôle de la microglie a
été observé dans différentes régions du tronc cérébral et il n’est pas difficile de croire qu’elles
facilitent le développement des circuits responsable de la genèse du rythme respiratoire

4.4 Microglie et contrôle respiratoire

Il existe à ce jour un faible nombre d’études qui se sont intéressées à l’implication des
microglies dans la commande respiratoire et aucune d’elles ne porte sur leur rôle dans le
développement précoce du réseau de contrôle respiratoire (Lorea-Hernández et al., 2016;
MacFarlane et al., 2016).

Il a été démontré que les rats nouveau-nés sont particulièrement sensibles à l’hypoxie
soutenue vers la fin de leur deuxième semaine de vie alors que l’animal présente une réponse

94
ventilatoire à l’hypoxie réduite ainsi qu’un taux de mortalité augmenté (MacFarlane et al.,
2016). Le nombre de microglies était augmenté dans la région du NTS et du DMNV et
l’immunoréactivité de 5-HT réduite dans les neurones des deux sites. Ces conséquences sont
communes aux caractéristiques de certains désordres respiratoires tels que le SIDS et elles
peuvent être empêchées par l’inhibition de l’activité des microglies.

L’enregistrement ventilatoire sur animal entier ainsi que l’utilisation des tranches
médullaires contenant le préBötC ont tous deux démontré que l’activation ou l’inhibition des
microglies affecte la génération du rythme respiratoire et son patron ainsi que la ventilation
résultante sur l’animal entier (Lorea-Hernández et al., 2016). La modification de l’activité
des microglies (e.g. activation par lipopolysaccharides ou réduction par minocycline)
affecterait potentiellement le relâchement de différents modulateurs activateurs ou
inhibiteurs qui contrôlent habituellement la génération du rythme respiratoire. En cas
d’activation des microglies dans le préBötC, l’animal était aussi incapable de procéder à
l’auto-ressuscitation de l’organisme en période d’hypoxie majeure. L’auto-ressuscitation est
provoquée par des périodes de «gasping» où la ventilation est caractérisée par des inspirations
de haut volume et basse fréquence afin de réoxygéner l’organisme (Lorea-Hernández et al.,
2016). Ces conséquences sur la génération du rythme et la capacité d’auto-ressuscitation
pourraient jouer un rôle dans le SIDS.

5. Problématique, objectifs et hypothèses de la recherche

5.1 Problématique

Puisque le cerveau est une cible importante des hormones thyroïdiennes, ce dernier
est extrêmement vulnérable à toute modification des taux circulants lors du développement
(Moog et al., 2017). Une simple carence en hormones chez la mère peut avoir d’importants
effets néfastes sur la formation du cerveau de la progéniture dont certains ne peuvent être
empêchés par une substitution postnatale rapide d’hormones (Gilbert et al., 2012). Selon le

95
moment de l’accouchement, une naissance prématurée peut soustraire le fœtus de l’apport
d’hormones thyroïdiennes provenant de la mère.

Les désordres respiratoires tels que l’apnée du prématuré et l’instabilité respiratoire

sont d’importantes causes d’hospitalisation, de morbidité et de mortalité chez les prématurés.
Ces désordres sont liés à l’immaturité ou à une dysfonction de la commande respiratoire,
mais l’implication des hormones thyroïdiennes n’a pour le moment pas été confirmée. Malgré
l’état actuel des connaissances concernant l’effet de la carence en hormones thyroïdiennes
sur le développement et la fonction du SNC, des poumons et du diaphragme, leur influence
sur les circuits nerveux qui génèrent et régulent la respiration reste méconnue (Schlenker,
2012).

5.2 Objectif général

Le projet vise de façon globale à décrire le rôle des hormones thyroïdiennes en

période périnatale sur la régulation de la commande cardio-respiratoire du rongeur nouveau-
né et observer leurs effets sur les paramètres ventilatoires et cardiovasculaires.

5.3 Hypothèse générale

L’hypothèse générale de cette thèse propose que les hormones thyroïdiennes au cours
de la période périnatale du rat soient nécessaires au bon développement du réseau neuronal
responsable du contrôle cardio-respiratoire.

96
5.4 Objectifs et hypothèses spécifiques

Pour répondre à cette hypothèse, nous avons procédé à deux types de manipulations
des hormones thyroïdiennes à travers la période périnatale (déficience et supplémentation
d’hormones).

Déficience : Afin de créer un carence en hormones, nous avons utilisé un modèle

d’hypothyroïdisme expérimental par l'ajout d’un agent anti-thyroïdien (MMI) dans l’eau de
la mère gestante du premier jour de gestation jusqu’à l’utilisation du raton nouveau-né. Cette
procédure est déjà bien établie dans la littérature et nos résultats confirment l’efficacité du
traitement (Ahmed et al., 2010b, 2012). Les détails du protocole seront décrits dans les
chapitres suivants. Brièvement, le MMI réduit la synthèse des hormones thyroïdiennes (T4
et T3) chez la mère au cours de la gestation et assure un faible apport vers le fœtus avant que
sa glande thyroïde soit fonctionnelle. La drogue traverse aussi la barrière du placenta pendant
la gestation et provoque une inhibition de la synthèse de T3 et T4 par le fœtus (Argumedo et
al., 2012). Suite à la naissance, le MMI est acheminé vers le raton par le lait maternel et
poursuit son effet anti-thyroïdien (Mookadam et al., 2004). Un effet intéressant du MMI est
qu’il réduit l’affinité des récepteurs TRs pour la T3 (Moriyama et al., 2007). La déficience
en hormones thyroïdiennes a été utilisée pour les études des chapitres 1 et 2 de cette thèse.

Supplémentation : L’apport en hormones thyroïdiennes a été réalisé par l’injection

des ratons nouveau-nés avec une seule dose de levothyroxine (L-T4), la forme synthétique
de la thyroxine (T4). L’injection a été effectuée dans la région intrapéritonéale à leur premier
jour de vie postnatal (P0). Ce type de supplémentation est utilisé dans l’étude du chapitre 1
seulement. Une deuxième forme de supplémentation in-vitro a été employée dans le chapitre
3 par l’ajout de T3 directement dans les cultures cellulaires de microglies.

Le chapitre 1 vise à étudier l’impact d’une carence en hormones thyroïdiennes en période

périnatale ou d’une supplémentation suite à la naissance sur le système respiratoire de ratons
dans leurs premiers jours de vie (jour postnatal 1 à 4). Nous déterminerons si les perturbations

97
des composantes respiratoires par la carence périnatale en hormones thyroïdiennes peuvent
être secourues par une simple supplémentation postnatale de L-T4. Finalement des
traitements pharmacologiques permettront de déterminer les mécanismes responsables de la
modulation du contrôle respiratoire par les hormones thyroïdiennes (e.g. GABA). Les
objectifs spécifiques sont énumérés ci-dessous.

- Mesurer l’impact des hormones thyroïdiennes sur la ventilation de l’animal entier en

conditions de base et en réponse à l’hypoxie. Nous serons ainsi en mesure de voir la
contribution des afférences périphériques à la modulation respiratoire.

Hypothèse : L’absence d’hormones thyroïdiennes réduit la ventilation de l’animal et

masque la réponse à l’hypoxie. Une supplémentation en L-T4 suite à la naissance
rétablie la ventilation de base ainsi que la réponse ventilatoire à l’hypoxie chez les
animaux traités au MMI.

- Observer l’effet des hormones thyroïdiennes sur le développement de la commande

respiratoire centrale et sa réponse à l’hypoxie. Par le retrait des afférences
périphériques, nous tenterons de vérifier si l’effet est de source centrale.

Hypothèse : La carence en hormones thyroïdiennes va retarder le développement de

la commande respiratoire et perturber la réponse à l’hypoxie. Une supplémentation
de L-T4 suite à la naissance accélère le développement et rétablit la réponse à
l’hypoxie chez les animaux traités au MMI.

- Déterminer l’effet des hormones thyroïdiennes sur le développement de la

neurotransmission GABAergique et sa modulation de la respiration.

Hypothèse : La carence en hormones thyroïdiennes renforce l’inhibition

GABAergique dans le tronc cérébral et la supplémentation en L-T4 affaiblit cette
inhibition.

98
Le chapitre 2 vise à étudier les effets d’une carence en hormones thyroïdiennes sur les
paramètres ventilatoires et cardiovasculaires du ratons dans une période développementale
plus avancée (deuxième semaine de vie). La deuxième semaine de vie du rongeur est
reconnue comme une étape importante dans le développement du réseau de contrôle
respiratoire et elle coïncide avec le pic de production des hormones thyroïdiennes (Dussault
and Labrie, 1975). Les objectifs spécifiques sont présentés ci-dessous :

- Mesurer l’impact de la carence sur les paramètres ventilatoires de l’animal entier en

conditions de base et sur sa réponse à l’hypoxie. Il est reconnu que le patron de
réponse change avec l’avancée en âge.

Hypothèse : La carence en hormones thyroïdiennes réduit la ventilation de l’animal

et augmente son instabilité respiratoire en période normoxique. Le développement de
la réponse à l’hypoxie suite à la carence en hormones thyroïdiennes sera retardé.

- L’évaluation du chémoréflexe laryngé est un excellent indicateur des fonctions

cardio-respiratoires de l’animal en réponse à la stimulation d’un réflexe respiratoire.
L’objectif est de déterminer l’effet d’une carence en hormones thyroïdiennes sur les
fonctions cardio-respiratoires en réponse à la stimulation d’un réflexe respiratoire sur
un raton anesthésié.

Hypothèse : L’absence de stimulation de l’organisme retrouvée à l’état d’éveil du rat

renforce les conséquences de la carence en hormones thyroïdiennes sur les fonctions
cardio-respiratoires. L’inhibition provoquée par la stimulation du CRL sera plus
profonde chez les animaux déficients en hormones.

- Déterminer le rôle de l’inhibition GABAergique dans la réponse au CRL plus

profonde suite à la carence en hormones thyroïdiennes.

Hypothèse : Le blocage de l’inhibition GABAergique par un antagoniste du récepteur

GABAA (bicuculline) atténue la dépression cardio-respiratoire engendrée par la
stimulation du CRL.

99
 Le chapitre 3 vise à découvrir l’effet de l’hormone T3 sur la physiologie des
microglies du tronc cérébral. Ces cellules ont été reconnues comme d’importantes
modulatrices du développement du réseau neuronal, mais toutes nos connaissances
proviennent d’études sur les régions rostrales au tronc cérébral (e.g. cortex, hypothalamus,
hippocampe, cervelet). Puisque l’activité des microglies dépend de son environnement, elles
pourraient jouer un rôle différent dans la mise en place de la commande respiratoire. Le tout
sera révélé avec l’aide d’une culture de microglie primaire de rongeurs d’âge postnatal P2
exposée à l’hormone T3. Les objectifs spécifiques sont présentés ci-dessous :

- Déterminer l’effet de T3 sur les fonctions des microglies du tronc cérébral. Les
fonctions observées incluent les mouvements des cellules en temps réel ainsi que la
phagocytose de microéléments.

Hypothèse : Les fonctions des microglies seront augmentées lorsque T3 est ajoutée
au milieu de culture.

- Caractériser l’effet de l’environnement cellulaire sur l’influence de T3. Les

conditions incluent la comparaison des fonctions de microglies provenant du cortex
et du tronc cérébral. La comparaison est aussi effectuée selon la présence ou non de
neurones dans le milieu de culture.

Hypothèse : La T3 influence de manière plus marquante les fonctions des microglies

lorsqu’elles proviennent du tronc cérébral et sont en présence de neurones.

100
 Partie 2
Chapitre 1
Thyroid hormones during the perinatal period are
necessary to respiratory network development of
newborn rats.

Jean-Philippe Rousseau1, Luana Tenorio-Lopes2, Richard Kinkead1

1
Department of Pediatrics, Centre de recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et
de Pneumologie de Québec, Université Laval, Québec, G1V 4G5, Canada
2
Department of Physiology and Pharmacology, Hotchkiss Brain Institute, Alberta Children's
Hospital Research Institute, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3330
Hospital Drive NW, Calgary Alberta, T2N 4N1, Canada.

Avant-propos :

L’article du chapitre 1 sera soumis prochainement au journal «Acta Physiologica» ou

«Journal of Physiology».

Je suis premier auteur sur cet article. J’ai participé à toutes les étapes incluant la conception,
la réalisation des expériences, l’analyse et interprétation des résultats, la création des figures,
la rédaction et révision du manuscrit.

Le Dre. Luana Tenorio-Lopes a participé à la réalisation des expériences. Elle a aidé à la

rédaction et a effectué la révision du manuscrit.

Le Dr. Richard Kinkead a aidé à la conception, l’interprétation des résultats, la rédaction et

révision du manuscrit.

101
1.1 Résumé

Puisque les hormones thyroïdiennes sont essentielles au développement normal du

cerveau, nous proposons que le déficit périnatal en hormones thyroïdiennes ou une
supplémentation suite à la naissance modifie le développement du réseau neuronal de
contrôle respiratoire chez le raton. Pour se faire, nous avons utilisé un traitement de
méthimazole (MMI; 0.02% v/w) pendant la gestation et suite à la naissance. Une
supplémentation en T4 a été effectuée à la naissance. À 1 et 4 jours de vie, les fonctions
respiratoires ont été mesurées par pléthysmographie et enregistrement du nerf phrénique sur
tronc cérébral isolé. La déficience en hormones thyroïdiennes réduit la ventilation des ratons
entiers ainsi que la commande respiratoire centrale. La supplémentation en T4 récupère les
fonctions centrales. Le système GABAergique semble jouer un important rôle dans cette
dépression respiratoire. Nous concluons que les hormones thyroïdiennes sont nécessaires au
développement du système de contrôle respiratoire du rat.

102
1.2 Abstract

Thyroid hormones (THs) are essential for proper brain development. During most of
the gestation, the mother is the main source of THs to the foetus. Thus, maternal
hypothyroidism or premature birth disrupt foetal THs supply and compromise maturation of
neurological functions. Respiratory disorders related to neuronal control dysfunction are a
major cause of morbidity in preterm infants; these problems are frequently reported in infants
born to THs deficient mothers. Inadequate THs supply during perinatal life may be sufficient
to delay maturation of the respiratory control network in the offspring; however, this
hypothesis remains untested experimentally. To address this issue, maternal (and foetal)
hypothyroidism was induced by administrating methimazole (MMI; 0.02% w/v) in drinking
water of the pregnant dam from the onset of pregnancy to postpartum day 4. The effect of
thyroid hormone supplementation on respiratory function was tested by injecting
levothyroxine (L-T4) in newborns on their first day of life. Respiratory function was assessed
with plethysmography (in vivo) and recording of phrenic motor output from isolated
brainstem-spinal cord preparation (in vitro). Measurements were performed both at rest and
in response to an acute hypoxic challenge or bath application of GABAA agonist (muscimol:
0.01 to 0.3 µM) or antagonist (bicuculline: 8 µM). Under basal conditions, MMI-treated pups
showed decreased ventilation and higher apnea frequency. Age-dependent increase in basal
phrenic burst frequency was observed in controls but not MMI treated pups. The phrenic
burst frequency responses to GABAergic agents were consistently greater in brainstems from
THs deficient pups. L-T4 supplementation reversed respiratory anomalies related to MMI
treatment in vitro. We conclude that THs deficiency during perinatal period is sufficient to
delay maturation of the respiratory control network development. The data suggest that
excessive GABAergic inhibition contributes to this effect.

103
1.3 Introduction

Thyroid hormones (THs) have an essential role for mammalian central nervous
system (CNS) development (Dussault and Ruel, 1987; Ausó et al., 2004; de Escobar et al.,
2004; Hasebe et al., 2008; Ahmed et al., 2010b; Schroeder and Privalsky, 2014). Two of the
most important THs produced by the thyroid gland are thyroxine (T4; 3,5,3’,5’-
tetraiodothyronine) and triiodothyronine (T3; 3,5,3′-triiodothyronine). T4 is the major
hormone secreted (~93%) and released in the circulation where it will be bound to binding
proteins (thyroxin-binding globulin TBG; transthyretin TTR or albumin) (Moog et al., 2017).
It will then be transported to the specific tissue such as the CNS where it will be converted
into its bioactive form (T3) by glial cells that contain the type 2 iodothyronine 5’-deiodinase
(D2) (Crantz et al., 1982; Mohácsik et al., 2011). While T3 is also secreted in lower amount
by the thyroid gland (~7%), most of T3 present in the brain (~80%) is the product of this
conversion process (Crantz et al., 1982). Thyroid hormones effects are mostly mediated by
the biding of T3 with its nuclear receptor (TR) that acts as a transcription factor (Ahmed et
al., 2008).

The thyroid gland function does not start before gestational day 17.5-18 in rats and
the third trimester in humans (Bernal, 2007). Before that time, the mother is the unique source
of THs for the foetal brain. Thus, the consequences of maternal THs deficiency on foetal
brain development will be more profound during the early stages of gestation (Williams,
2008). Depending on the timing, preterm birth may also withdraw the foetus from maternal
THs supply.

Maternal hypothyroidism is a major disease during pregnancy that affects between

0.3% to 4% of women. Moreover, it increases the risk of premature birth (Shinohara et al.,
2018). In this regard, gestational hypothyroidism can arise from iodine deficiency, chronic
stress during pregnancy (chronic glucocorticoids decrease T4 concentration in the mother),
autoimmune processes (e.g. Hashimoto Thyroiditis) or environmental contaminants (e.g.
BPA, pesticides) (Aliev et al., 1987; Caldwell et al., 2011; Hartoft-Nielsen et al., 2011; Moog
et al., 2017). Interestingly, premature infants (< 30 weeks) which experience a precocious
interruption of maternal hormones supply show a lower level of THs compared to infants

104
born at term as well as the incapacity to initiate the normal postnatal surge of THs usually
seen at 24 hours of life (Biswas et al., 2002). These low levels of THs are related to increased
risk of neurodevelopmental delays and higher severity of lung disease with bigger risks of
mortality (Biswas et al., 2002; Lain et al., 2016).

The neural circuits that generate and regulate breathing must be functional at birth to
ensure viability of the organism (Greer et al., 2006). Neonatal intensive care units regularly
deal with premature infants with inadequate prenatal maturation of the respiratory apparatus
(Greer et al., 2006). Their disorder typically results from deficiencies of central respiratory
rhythmogenesis or poor activation of respiratory musculature (Greer et al., 2006). Thyroid
hormones play a key role in the development of the CNS, the lung and diaphragm and their
functions have been extensively studied in mammals (Canavan et al., 1994; Hume et al.,
2001). However, little is known about their influence on the respiratory control network and
most studies in this field have focused on adults (Olea et al., 2007; Simsek et al., 2004).
Therefore, understanding how THs modulate the development of the respiratory network
located in the brainstem of the newborn rat is of great interest. At the moment, the only
evidences that THs regulate respiratory control development originate from a comparative
study performed on reduced brainstem-spinal cord preparation from Lithobates Catesbeianus
where THs exposure accelerates the emergence of a mature motor command driving air
breathing in pre-metamorphic tadpoles (Rousseau et al., 2016b). Following these promising
results, we hypothesized that this effect can also apply to the mammalian model and THs
deficiency during the perinatal period or supplementation following birth can modify
development of the respiratory system in newborn rats. We addressed this issue using an
established pharmacological treatment to induce THs deficiency in gestating dams. The
consequences of THs deficiency in the offspring was first tested in-vivo in awake,
unrestrained pups at rest and in response to a moderate hypoxic challenge. We also used an
isolated brainstem-spinal cord preparation (in-vitro) to compare the central respiratory
command between groups in baseline conditions and in response to central hypoxia.

THs deficiency severely affects development of the GABAergic system in the

cerebral cortex and hippocampus, but its effects on the brainstem remain unknown (Gilbert
et al., 2007; Friauf et al., 2008; Sawano et al., 2013). THs deficient pups in this study showed

105
profound reductions in respiratory output and it is hypothesized that disruption of
GABAergic neurotransmission is an important mechanism in apnea of prematurity (AoP)
(Abu-Shaweesh and Martin, 2008; Zhao et al., 2011). Thus, we then determined whether THs
deficiency / supplementation changes respiratory neuronal network development through its
remodeling of the GABAergic neurotransmission.

1.4 Methods

1.4.1 Ethical approval

Experiments were performed on 185 Sprague-Dawley rat pups of both sexes aged of
1 and 4 days old (P1-P4); all animals used in this study were born and raised in our animal
care facilities. All animals were maintained in standard laboratory conditions (21°C, 12:12-
h dark-light cycle: lights on at 6:00 and off at 18:00); the access to food and water was ad
libitum during gestation and during experimental treatment. Université Laval Animal Care
Committee approved all the experimental procedures and protocols (CPAC protocol
#2015030) which were in accordance with the guidelines of the Canadian Council on Animal
Care and the ARRIVE guidelines.

1.4.2 Maternal methimazole (MMI) treatment to induce thyroid hormone

deficiency in rat pups.

The experimental design and timeline of the experiments are illustrated in Figure 29.
The adult female rats from the onset of pregnancy [gestation day 1; GD1] were divided into
two groups as followed:

The hypothyroidism protocol is based on the work of Ahmed and collaborators

(Ahmed et al., 2010b, 2012). It was recently used in our laboratory and quantification of THs
hormones achieved in treated dams confirm its pathophysiological relevance (Rousseau etal.

106
2019). Briefly, THs deficiency in the gestating dam (and foetuses) was recreated by
administrating an antithyroid susbstance (Methimazole; MMI; Sigma-Aldrich, Oakville, ON,
Canada) in drinking water of the pregnant dams at concentration of 0,02% (weight per
volume; w/v) from the onset of pregnancy (gestational day 1; GD1) to the day of experiment
with the newborn pups (P1-P4). Low concentrations of salt (NaCl: 0,05%) were added to the
treated water to make it more palatable to the dam. Daily monitoring of water consumption
was performed in the MMI-treated dams (~35 ml/day) and revealed no difference compared
to normal water consumption in pregnant dams (~40 ml/day) (Uriu-Hare et al., 1995). Thus,
dams that received tap water from the onset of pregnancy (gestational day 1; GD1) to the day
of experiment with the newborn pups (P1-P4) was used a reference group (control).

1.4.3 Thyroid hormone supplementation

To determine whether the impact of perinatal THs deficiency on respiratory function

can be reversed by THs supplementation, newborns pups were supplemented with T4 or
vehicle on the first day of birth (P1); efficacy of the treatment was assessed the following
day and at postnatal days 4 (Figure 29). Half the litter born from control and MMI treated
dams were injected with Levothyroxine (L-T4; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)
diluted in 1% Dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) at a
concentration of 10µg / 100g body weight as previously performed in young rats (Oh-Nishi
et al., 2005). Second half were injected with 0.9% saline solution + 1% DMSO. Since
conversion of T4 to T3 is not immediate and TH-induced maturation occurs mainly via
nuclear receptors, assessments of the efficacy of the treatment on the respiratory system were
performed only in 4 days old rats (see results below). Saline injected pups showed no
difference with their corresponding group during all experiments and were therefore pooled
with their respective control or MMI treated group.

107
Figure 29. Schematic representation of the time course of the experimental protocol used to
create all groups of pups born and raised under standard conditions (control), born to mothers
subjected to methimazole treatment (MMI; thyroid hormone deficient pups) or supplemented
with thyroid hormone T4 (levothyroxine; L-T4) on their first day of life. GD: gestational day.
P1-P4: postnatal day 1 and 4.

1.4.4 Assessment of THs inhibition and supplementation efficacy by blood

T4 measurements

Sera from the offspring were taken following birth at P1 and P4 to evaluate the free
and total thyroxine (FT4; TT4) in control and MMI treated groups and at P4 in L-T4
supplemented groups. To confirm the efficiency of L-T4 supplementation on the newborn
development, blood samples were also collected 1 day following L-T4 injections (P2).

108
Measurements were performed by electro-chemiluminescence (Elecsys, Modular E170,
Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) by the clinical biochemistry service of our
institution (Institut Universitaire de Cardiologie et Pneumologie de Québec, Québec, QC,
Canada). Measuring ranges are: TT4: 5.4–320 nmol/l; FT4: 0.3–100 pmol/l.

1.4.5 In-vivo plethysmographic recordings

Respiratory activity was recorded using whole body, flow-through plethysmography

as previously described for newborn pups (Delhaes et al., 2014; Fournier et al., 2013). The
gas flow through the experimental chamber was measured with a mass flowmeter (TSI model
4140, Shoreview, MN, USA) and set at 100 ml/min. Temperature in the chamber was
maintained at 34°C (P1) or 32°C (P4) using a temperature control system (Physitemp,
Clifton, NJ, USA). Calibration of the system was performed by rapidly injecting 0.5 ml of
air into the chamber with a syringe. Respiratory frequency (ƒR) and tidal volume (VT) were
recorded from the plethysmograph signal using a specialized software (Labchart 8, AD
Instruments, Colorado Spring, CO, USA). Barometric pressure, body temperature, chamber
temperature, and humidity were measured to correct and standardize VT and values were
expressed in ml BTPS (Bartlett and Tenney, 1970; Drorbaugh and Fenn, 1955). These values
were subsequently used to calculate minute ventilation (𝑉̇ E = ƒR x VT). Composition of the
gas mixtures flowing in and out of the chamber was analyzed with an oxygen analyzer (model
S-3A, Ametek, Pittsburgh, PA, USA) for subsequent calculation of 𝑉̇ O2 as an index of
metabolic rate (Mortola and Dotta, 1992).

1.4.5.1 Experimental protocol

Rat pup was placed in the plethysmography chamber breathing room air (normoxia;
FIO2 = 0.21). Each rat was given 10 min to acclimate and body temperature was measured by
gently placing a small thermocouple for rodent inside the mouth of the pup (Harvard,
Holiston, MA, USA). Once the pup appeared calm and breathing signal became regular,

109
breathing was then recorded for 20 min (baseline). Room air was then replaced with hypoxic
gas (FIO2 = 0.12) for 15 min to record the hypoxic ventilatory response (HVR).

1.4.6 In-vitro measurements of neural respiratory-related activity

To evaluate the contribution of the central neural networks to the changes in

respiratory function observed in vivo , we then assessed the fictive respiratory activity using
a reduced "en bloc" brainstem-spinal cord preparation as described before (Rousseau and
Caravagna, 2015). Briefly, 1 or 4 days old pups were anesthetized using cold until loss of the
paw withdrawal reflex (~5 min). After decerebration, the brainstem-spinal cord was isolated,
the pons was transected and the preparation was placed ventral side up in the recording
chamber coated with Syglard (Dow Corning; Midland, MI, USA) where it was superfused at
7 ml/min with artificial cerebro-spinal fluid (aCSF; composition in mM): 129 NaCl, 3.35
KCl, 1.26 CaCl2, 1.15 MgCl2, 21 NaHCO3, 0.58 NaH2PO4, and 30 D-glucose; final pH 7.4.
The aCSF was bubbled with a gas mixture of carbogen (95% O2 and 5% CO2) and its
temperature was maintained at 26°C (Temperature Controller TC-324B, Warner Instruments,
Hamden, CT, USA). Pia membranes were then carefully removed and respiratory-related
activity was recorded from the 4th cervical spinal root (C4) using a glass suction electrode.
The signal was amplified (AC amplifier model 1700; A-M Systems, Everett, WA, USA),
band-pass filtered and fed to moving average (Paynter filter, Moving average model MA
821; CWE, Ardmore, PA, USA). The signal was converted from analog-to-digital at 2.5 kHz
and recorded in a data acquisition system for further analysis (model DI-720; Dataq
Instruments, Akron, OH, USA).

1.4.6.1 Series 1: Phrenic burst activity at rest and in response to hypoxia.

Brainstem preparations were given 20 min to acclimate (superfused with carbogen-

bubbled aCSF) followed by 10 min recording under baseline conditions. The perfusion was
then switched from carbogen-bubbled to hypoxic (0% O2 + 95% N2 + 5% CO2) aCSF for 20
min and switched back to carbogen-bubbled aCSF for a recovery period of 20 min.

110
1.4.6.2 Series 2: Effect of GABAA receptor activation/inhibition on phrenic burst
activity.

Brainstem preparations were given 20 min to acclimate (superfused with carbogen-

bubbled aCSF) followed by 10 min recording under baseline conditions. Preparations were
then exposed, in succession, to three increasing doses of muscimol (GABAA receptor agonist;
0.01, 0.1, 0.3 µM; Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) or to a single dose of bicuculline
(GABAA receptor antagonist; 8 µM; Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada). GABAA
receptor antagonist was used as a proof of concept for the GABAergic activity in our animals.
These concentrations were selected based on preliminary results and literature (Ren and
Greer, 2006; Delhaes et al., 2014).

1.4.7 Western blot analysis

These experiments aimed to determine whether manipulation of THs elicits changes

in the expression of proteins that are key to GABAergic neurotransmission in the medulla of
rat pups.

1.4.7.1 Protein quantification for western blotting

After transcardiac perfusion with PBS (pH 7.4), brains were harvested; the medulla
oblongata was dissected and frozen (-80°C) until further analysis. First, tissue was
homogenized in cold lysis buffer (5 µl / mg of tissue; 50 mM Tris, pH 7.5; 150 mM NaCl,
1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA and 0.1% sodium dodecylsulfate)
using a pellet mixer. The homogenate was then centrifuged at 4°C for 1 h at 13,000 r.p.m. (~
24,000 g). Proteins were quantified with a Micro BSA protein assay kit (Fisher
Scientific,Ottawa, ON, Canada; sample dilution 1:200) and a microplate reader (𝜇-Quant;
BioTek, Winooski, VT, USA). Protein concentrations were calculated from a standard curve
linearized by a log-log transformation.

111
1.4.7.2 Western blotting for NKCC1, KCC2 and GABAA R subunit α1

Lysate samples were diluted to obtain the same quantity of protein for each sample.
An equal volume of 2 × Laemmli buffer was added to the samples that were then heated at
95°C for 5 min (GABAA α1) or 45°C for 45 min (NKCC1 and KCC2). Samples were then
migrated on an acrylamide gel (stacking: 4%; separation: 10% NKCC1 and KCC2, 12%
GABAA α1) for ~2h at 100 V. The gel was transferred to a nitrocellulose membrane for 1h30
at 100 V in cold buffer. Before blockage, total protein was revealed with REVERT (total
protein stain kit; LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA) and visualisation was
performed on an imaging system (LI-COR Odyssey; LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE,
USA). The membrane was then incubated in blocking solution (5% non-fat dry milk in TBS-
Tween) for 1 h at room temperature and rinsed with TBS-Tween before being incubated with
primary antibody diluted in blocking solution overnight at 4°C. Primary antibody were as
followed: NKCC1 Antibody Rodent Specific (1:1000, #14581; Cell Signaling Technology,
Danvers, MA, USA), KCC2 (D1R2R) Rabbit mAB (1:1000, #94725; Cell Signaling
Technology, Danvers, MA, USA) and anti-GABA A receptor alpha 1 antibody (1:1000,
ab33299; Abcam, Toronto, ON, Canada). The next day, the membrane was subsequently
rinsed with TBS-Tween and incubated with a secondary antibody in blocking solution
(IRDye 800CW Goat anti-Rabbit, 925-32211; LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA).
Fluorescent protein bands were visualized with an imaging system (LI-COR Odyssey; LI-
COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA) and quantification of band intensity was performed
using Image Studio Lite 5.2 (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA)

1.4.8 Data analyses

1.4.8.1 In-vivo experiments

Respiratory variables (ƒR, VT) were measured by analysing the last 10 min of
recording in baseline conditions and the whole duration of hypoxia, averaged and used to
calculate 𝑉̇ E. Number and duration of apneas were calculated over the last 15 min of each

112
condition. Following a criteria commonly used in rodents (Han et al., 2002; Montandon et
al., 2006), an apnea was defined as an interruption of airflow for at least two breathing cycles.
The apneic frequency is the sum of two types of apneic pauses that have distinct neural
origins: spontaneous and post-sigh apneas. A spontaneous apnea was characterised by an
interruption of flow that was not preceded by any significant change in VT, whereas a post-
sigh apnea was preceded by a high amplitude breath.

1.4.8.2 In-vitro experiments

Phrenic burst frequency and amplitude values were obtained by analysing the last 10
min of baseline and hypoxic periods. Between group comparisons (and graphic
representation) of the magnitude of respiratory depression induced by hypoxia, muscimol
and bicuculline exposure was facilitated by expressing the values obtained at the end of the
measurement as a percent change from the mean value measured in baseline conditions.

1.4.9 Statistics

Each group is composed of at least three litters to avoid litter specific effect. Data
from male and female pups were combined since statistical analysis revealed no sex specific
effect of MMI treatment and/or L-T4 supplementation on any of the respiratory variables
considered.

Results were analysed using a two-way ANOVA for the effect of age and MMI
treatment. One way ANOVA was performed for the effect of L-T4 supplementation. When
ANOVA results indicated that a factor was significant (p<0.05), a Fisher's least significant
difference test was performed for post hoc analysis. Statistical analyses were performed using
StatView 5.0 (SAS Institute, Toronto, ON, Canada). Data are reported as means ± standard
deviation (SD). ANOVA results are mainly reported in the text and Table 1. Results from
post hoc tests are represented by symbols in the table and figures.

113
114
Table 1. Comparison of body weight and temperature, T4 hormone levels and selected
respiratory variables between 1 and 4 days old pups born under standard conditions (control)
or born from mothers subjected to methimazole treatment (MMI; thyroid hormones deficient
pups). Two distinct groups of control and MMI treated pups aged 4 days old were
supplemented with L-T4 on their first day of life. Respiratory measurements were obtained
under resting conditions using whole body plethysmography. Data are reported as means ±
SD. Symbols indicate results from post hoc tests. * Significantly different from corresponding
control value (P=0.05). # Significantly different from corresponding MMI value (P=0.05). †
Significantly different from corresponding P1 value (P=0.05).

1.5. Results

1.5.1 Efficacy of anti-thyroid hormone treatment (MMI) on pup’s

thyroxine (T4) blood levels, weight and body temperature.

Consistent with our previous report and the work of Ahmed et al (Ahmed et al., 2012;
Rousseau et al., 2019), MMI treatment significantly decreased FT4 levels in 1 and 4 days old
offspring and TT4 levels in 4 days old pups (Table 1; Fig 30). Quantification of FT4 or TT4
levels in 4 days old pups initially suggested that L-T4 supplementation had not effect on
circulating THs levels (Table 1; Fig 30). However, evaluation of hormones levels on the
second day of life showed higher levels of FT4 and TT4 in MMI treated pups supplemented
with L-T4 (L-T4 effect; FT4: P=0.0022, F(1,5)=33.20; TT4: P=0.0006, F(1,7)=34.13) and an
increased level of TT4 in control pups supplemented with L-T4 (L-T4 effect; P=0.017,
F(1,10)=8.32) (Figure 30A,B). Thyroid hormones deficient pups showed a decreased body
weight at both P1 and P4 but no changes were observed in body temperature (Table 1).
Postnatal L-T4 supplementation increased body weight compared to their respective group
and body temperature in MMI treated group only (Table 1).

115
Figure 30. Time related changes of blood T4 levels between 2 and 4 days old pups. A) Levels
of free T4 (unbinded hormone; FT4) measured in control, MMI, control + L-T4 and MMI +
L-T4 pups at 2 and 4 days old. B) Levels of total T4 (hormone binded to transport proteins;
TT4) measured in control, MMI, control + L-T4 and MMI + L-T4 pups at 2 and 4 days old.
Data are reported as means ± SD. Symbols indicate results from post hoc tests. *Significantly
different from corresponding control value (P=0.05). # Significantly different from
corresponding MMI value (P=0.05).

116
1.5.2 Thyroid hormones deficiency augments apnea frequency and
duration.

Figure 31A compares original recordings of respiratory activity obtained in 4 days

old from each experimental group. On their first postnatal day, MMI treated and control pups
showed similar values for apnea frequency and duration (MMI effect; Frequency: P=0.50,
F(1,22)=0.47; Duration: P=0.73, F(1,22)=0.12 ) (Figure 31B,C). However, the effect of MMI
treatment became apparent at 4 days old as the frequency and duration of apneas measured
in TH deficient pups was greater than controls (MMI effect; Frequency: P<0.0001,
F(1,39)=27.39; Duration: P<0.0001, F(1,22)=19.96 ) (Figure 31B,C). This increase in apneas
number in P4 animals was mainly due to a higher amount of spontaneous apneas compared
to post-sight apneas (MMI effect; P<0.0001, F(1,39)=24.32) (Figure 31D). L-T4
supplementation did not affect apnea frequency or duration in both MMI treated (L-T4 effect;
Frequency: P=0.66, F(1,24)=0.19; Duration: P=0.50, F(1,27)=0.46) or control groups (L-T4
effect; Frequency: P=0.87, F(1,24)=0.026; Duration: P=0.68, F(1,24)=0.17) (Figure 31B,C).

117
Figure 31. Whole body plethysmography in unrestrained rats. A) Original recordings of
respiratory activity at rest from control, MMI, control + L-T4 and MMI + L-T4 pups (4 days
old) including apneic event (black arrow). Comparison between corresponding groups at
different ages (P1-P4) for B) mean apnea frequency and C) mean apnea duration. D)
Comparison of mean apnea frequency between groups in 4 days old pups for both types of
apneas (spontaneous and post-sight). Data are reported as means ± SD. Symbols indicate
results from post hoc tests. *Significantly different from corresponding control value
(P=0.05). † Significantly different from corresponding P1 value (P=0.05).

118
1.5.3 Thyroid hormones deficiency depresses ventilation at rest.

Under resting conditions, 𝑉̇ E of MMI treated pups was less than controls in both age
groups; this difference was mainly due to a lower breathing ƒR (Table 1). L-T4
supplementation increased VT (and thus 𝑉̇ E) in control group; however, this treatment did not
reverse the ventilatory depression in MMI treated animals (Table 1). MMI treated pups
showed a decreased O2 consumption (𝑉̇ O2) at P1 and P4, which was unaffected by L-T4
supplementation (Table 1). The convective requirement (𝑉̇ E / 𝑉̇ O2) was unchanged by MMI
treatment and was only increased in control group following L-T4 supplementation (Table
1). At both ages, MMI treatment did not modify the 𝑉̇ E response to hypoxia measured in the
early or late phase of the hypoxic period (0 to 5 min and 15 to 20 min, respectively); fR and
VT responses were also unaffected by treatment (MMI effect, early phase; 𝑉̇ E: P=0.895,
F(1,56)=0.018; fR: P=0.370, F(1,56)=0.816; VT: P=0.798, F(1,56)=0.066) (MMI effect, late phase;
𝑉̇ E: P=0.424, F(1,56)=0.648; fR: P=0.286, F(1,56)=1.156; VT: P=0.884, F(1,56)=0.020) (Figure
32A, B, C). Furthermore, L-T4 supplementation decreased the breathing frequency in late
phase of the response (L-T4 effect; P=0.0094, F(1,24)=7.97); however, this did not translate
into significant changes in the HVR (L-T4 effect; P=0.0916, F(1,24)=3.089) (Figure 32A).

119
Figure 32. Ventilatory response to a 12% hypoxic event from control, MMI, control + L-T4
and MMI + L-T4 pups at differents ages (P1-P4). Physiological responses for A) minute
ventilation (𝑉̇ E), B) respiratory frequency (fR) and C) tidal volume (VT) were measured in the
last 5 minutes of hypoxia. Data are reported as means ± SD. Symbols indicate results from
post hoc tests. *Significantly different from corresponding control value (P=0.05).

120
1.5.4 Thyroid hormones deficiency delays development of phrenic motor
output.

Original neurograms presented in figure 33A illustrate integrated phrenic bursts

produced by isolated brainstem-spinal cord preparations from 4 days old pups of each group
under baseline and hypoxic conditions. While the burst frequency from control preparations
increased with age, this was not observed in preparation from MMI treated animals. Thus at
P4, the burst frequency measured in MMI pups was 25% less than controls (Age effect;
Control : P=0.023, F(1,37)=5.597; MMI: P=0.3636, F(1,33)=0.849) (Factorial interaction MMI
X Age; P=0.043, F(1,63)=4.244) (Figure 33B). Phrenic burst amplitude was unaffected by
MMI treatment in either age group (MMI effect; P=0.672, F(1,68)=0.181) (Figure 33C). L-T4
supplementation increased phrenic burst frequency in controls animals and reversed the
depression observed in MMI treated animals (L-T4 effect; Control: P=0.0261, F(1,32)=5.444;
MMI: P=0.003, F(1,25)=10.80); however, this treatment did not affect burst amplitude (Figure
33B, C). At P1, hypoxia had limited effects on phrenic burst frequency. While the respiratory
depression generally becomes more apparent at P4, this response was blunted in MMI treated
pups compared to controls (MMI effect; P=0.0013, F(1,38)=12.06) (Figure 33D). Amplitude
response at both ages was unaffected by MMI treatment (MMI effect; P=0.251, F(1,67)=1.34)
(Figure 33E). Supplementation with L-T4 did not affect the hypoxic phrenic frequency
response in control group, but brought back the normal depression response in MMI treated
pups; amplitude response was unchanged (L-T4 effect; Control: P=0.2642, F(1,28)=1.298;
MMI: P=0.0194, F(1,19)=6.526) (Figure 33D, E).

121
Figure 33. Measurements of phrenic burst activity in isolated brainstem-spinal cord
preparations. A) Original neurograms of phrenic bursts (integrated signal) produced by
isolated brainstem-spinal cord preparations from control, MMI, control + L-T4 and MMI +
L-T4 pups (4 days old) under baseline conditions (normoxia; boxed area), followed by
hypoxia (white arrow) and a recovery period (black arrow). Mean phrenic burst B) frequency
and C) amplitude under baseline conditions. Hypoxic responses from all preparations were
recorded in the last 10 minutes of hypoxia for both D) frequency and E) amplitude. Data are
reported as means ± SD. Symbols indicate results from post hoc tests. *Significantly different
from corresponding control value (P=0.05). † Significantly different from corresponding P1
value (P=0.05). # Significantly different from corresponding MMI value (P=0.05).

122
1.5.5 Enhancement of GABAergic inhibition by thyroid hormones
deficiency is significant at 4 days old.

Bath application of a GABAA receptor agonist (muscimol; 0.01/0.1/0.3 µM) resulted

in a dose dependent depression of phrenic bursting frequency and amplitude in both control
and MMI treated groups at both ages (Muscimol effect; Frequency: P<0.0001, F(1,82)=109.15;
Amplitude: P<0.0001, F(1,82)=35.52) (Figure 34A, B, C, D). However, treatment-related
enhancement of the burst frequency depression was detected only in preparations from 4 days
old pups (MMI effect; P=0.0014, F(1,50)=12.93). Amplitude did not differ between the groups
(Figure 34B, D). As the strongest responses to muscimol in both groups were observed with
the highest concentration (0.3 µM), this dose was used for TH replacement experiments.

123
Figure 34. Dose dependent phrenic burst response to muscimol exposure (GABAA receptor
agonist; 0.01/0.1/0.3 µM). Frequency response produced by control and MMI treated pups
aged of A) 1 day old and B) 4 days old. Amplitude response produced by control and MMI
treated pups aged of C) 1 day old and D) 4 days old. Data are reported as means ± SD.
Symbols indicate results from post hoc tests. *Significantly different from corresponding
control value (P=0.05).

124
 Originals neurograms presented in figure 35A illustrate phrenic bursts produced by
isolated brainstem-spinal cord preparations from 4 days old pups under baseline conditions,
following bath application of muscimol (0.3 µM) or bicuculline (8 µM). At 4 days old, MMI
treatment enhanced phrenic burst frequency depression following muscimol exposure
compared to controls; however, amplitude was unaffected (MMI effect; P=0.0374,
F(1,30)=4.74) (Figure 35B). L-T4 supplementation dampened phrenic burst frequency
depression following muscimol exposure in both groups and amplitude was unchanged (L-
T4 effect; Control P=0.0088, F(1,18)=8.629; MMI: P=0.0003, F(1,25)=17.791) (Figure 35B).
Application of bicuculline increased significantly fictive breathing frequency in the MMI
treated pups compared to controls, but not amplitude (MMI effect; P=0.0458, F(1,21)=4.508)
(Figure 35C). L-T4 supplementation did not affect phrenic burst frequency and amplitude
response to bicuculline exposure in both groups (Figure 35C).

125
Figure 35. Phrenic burst response to muscimol exposure (0.3 µM) in 4 days old pups. A)
Phrenic neurograms (integrated signal) from control, MMI, control + L-T4 and MMI + L-T4
pups (4 days old) illustrating fictive breathing under baseline conditions and in response to
0.3 µM muscimol exposure or 8 µM bicucuclline exposure. B) Phrenic burst frequency and
amplitude response muscimol exposure. C) Phrenic burst frequency and amplitude response
to bicucuclline exposure. Data are reported as means ± SD. Symbols indicate results from
post hoc tests. *Significantly different from corresponding control value (P=0.05). #
Significantly different from corresponding MMI value (P=0.05).

126
1.5.6 Thyroid hormones deficiency increases protein levels of GABAA
receptor subunit α1.

As previously mentioned, the effect of THs deficiency on respiratory response to

GABAergic modulation was greater in older animals (4 days old). Western blot analyses
were therefore performed on medulla oblongata homogenates from P4 pups to investigate
expression of proteins implicated in GABAergic activity. Protein expression of chloride co-
transporter (NKCC1 and KCC2), strongly implicated in cellular response to GABA, was
unchanged by MMI treatment compared to controls (MMI effect; NKCC1: P=0.428,
F(1,13)=0.668; KCC2: P=0.578, F(1,12)=0.327) (Figure 36A, B). L-T4 supplementation in
MMI treated group increased KCC2 expression (L-T4 effect; P=0.0298, F(1,10)=6.403)
(Figure 36B). Evaluation of GABAA receptor subunit α1, dictating the receptor activity
following GABA binding, showed an increased protein expression in MMI treated pups
compared to controls (MMI effect; P=0.0213, F(1,9)=7.737) (Figure 36C). L-T4
supplementation decreased GABAA R α1 protein expression in MMI treated group (L-T4
effect; P=0.0124, F(1,7)=11.163) (Figure 36C).

127
Figure 36. Western blot analysis of proteins expression from medulla oblongata
homogenates originating from control, MMI, control + L-T4 and MMI + L-T4 pups (4 days
old). Proteins expression was measured for A) NKCC1 co-transporter, B) KCC2 co-
transporter and C) GABAA receptor subunit α1. Data are reported as means ± SD. Symbols
indicate results from post hoc tests. *Significantly different from corresponding control value
(P=0.05). # Significantly different from corresponding MMI value (P=0.05).

128
1.6 Discussion

Thyroid hormones are essential for perinatal development of the central nervous
system. Here, we show that a treatment causing maternal hypothyroidism during gestation
and postnatal period compromises respiratory function at birth and its maturation during the
following days. L-T4 supplementation following birth restored normal functions resulting
from THs deficit both in vivo and in vitro, thus highlighting the importance of these
hormones in the regulation of maturation of the respiratory control network and supporting
our main hypothesis. Pharmacological experiments demonstrate that the GABAergic system
is likely implicated in the pathophysiological conditions observed in THs deficient pups.

1.6.1 Effectiveness of thyroid hormones deficiency and L-T4

supplementation protocol

The impact of MMI treatment on the mother was assessed in our previous study.
Briefly, we demonstrated that TT4 levels at 4 days post partum were lower in MMI treated
mother sera compared to controls and the levels achieved were in line with previous research
using this model (Rousseau et al. 2019). Together, these data led to the conclusion that by
comparison with clinical standards, our protocol induced a mild hypothyroidism in the
mother. However, the decreased body weight and altered ventilation in the THs deficient
pups presented here show that the treatment is sufficient to have significant consequences in
the offspring. In fact, MMI treatment virtually eliminated all circulating THs in pups. This
protocol can have broad effects on the pup’s CNS and respiratory system. While the influence
on cognitive or motor behaviors wasn’t investigated in this study, the results presented here
suggest that the MMI treatment mostly affected the respiratory control network. Further
measurements of arterial blood gases for gas exchange capabilities or diaphragm muscle
force observation could shed lights on the effects of THs deficiency on respiratory activity.

The dose of L-T4 used here for thyroid hormone supplementation was in accordance
with a previous study where significant effects of the injection were observed on young rats

129
in-vitro. While this dose was higher than recommended in clinic on human newborns (1.5
µg/100g), maximum blood levels of T4 measured here were lower than the target ranges
aimed by clinician following L-T4 supplementation (LaFranchi, 2011). These ranges are 29
pmol/L for FT4 and 205 nmol/L for TT4. The supplementation used in this study therefore
may seem as moderate, but we know that the protocol is sufficient to increase body weight,
ventilation and central respiratory command. Moreover, higher blood levels of T4 might have
been reached between blood collections. Interestingly, MMI treated pups which received L-
T4 supplementation presented higher blood levels of T4 than controls on the 2nd day of life.
THs deficiency could modulate T4 transport mechanisms in the pups but this hypothesis
remains to be tested. MMI does not interfere with T4 to T3 conversion, which partly explains
the functional effects of THs observed following L-T4 supplementation
(Chiraseveenuprapund et al., 1978; van Doorn et al., 1983).

The blood levels of T4 following L-T4 supplementation mostly drop between the 2nd
and 4th day of life (Figure 30). Thyroxine hormone injected here should be taken in charge
by binding proteins and converted to T3 in the brain. The speed of T4 transport in the blood
and rate of conversion to T3 in the brain are uncertain, but this hypothesis could explain the
low levels of T4 three days after injection. This is in accordance with the L-T4 induced
physiological and functional modifications mentioned previously.

1.6.2 Thyroid hormones deficiency increases respiratory instability and

alters ventilation in newborn pups.

Respiratory disorders such as apnea of prematurity are related to immaturity or

dysfunction of the respiratory neuronal network (Abu-Shaweesh and Martin, 2008; Fournier
et al., 2013). The higher incidence and length of apneas observed in MMI treated groups at
4 days old reveal a possible immature respiratory control system that is vulnerable to the
changing hormones during development. This was in agreement with previous study on
children who suffered of thyroid hormone deficiency and presented high apnea-hypopnea
indices during sleep (Sakellaropoulou et al., 2011). Here, the physiological impact of MMI

130
treatment on apneic events is unseen in the first days of life. This suggests that the effects of
THs deficiency on respiratory maturation are more profound in the postnatal period than
prenatally. Increased apnea can have deleterious pathophysiological consequences on the
newborn, but without additional measurements in this study (e.g. O2 blood saturation, heart
rate), the physiological significance of such apneas remains unclear. An altered HVR is an
important determinant of breathing instability which promotes apnea (Gauda et al., 2004).
Here, HVR was unchanged by THs deficiency which indicates that the higher apnea index
was due to other mechanisms than increased chemoreflex gain. This can include upregulated
inhibitory neurotransmitter (GABA) or decreased central chemosensitivity, both are
important factors in neonatal apnea (Abu-Shaweesh and Martin, 2008). Interestingly, THs
deficiency in our model targeted both GABAergic neuronal sensitivity and central hypoxic
response and L-T4 supplementation reversed the effects of MMI treatment.

Decreased ventilation of MMI treated pups at both age groups illustrates disruption
of the respiratory system by perinatal THs deficiency. It was previously proposed that part
of the lower ventilation following THs deficiency in adult rodents was attributable to reduced
respiratory muscle strength which may result from myopathies, altered nerve conduction, and
neuromuscular dysfunction (Geiger et al., 2002). Here, quantification of respiratory variables
linked to respiratory muscle activity such as VT measured in intact animals and fictive phrenic
bursts amplitude recorded on isolated brainstem were unaffected by THs deficiency. VT was
however increased by L-T4 supplementation in control animals. Thyroid hormones receptors
are widely distributed in the brain and skeletal muscles (Schmidt et al., 1992; Shahrara et al.,
1999) Thyroid hormones could act on muscle activity by different central or peripheral
mechanisms to modulate breathing in newborn rodent.

1.6.3 Putative mechanisms underlying thyroid hormone modulation of

respiratory development.

With normal development, phrenic bursting frequency from the isolated brainstem of
newborn rodents increases and results from our pups born from control dams are in

131
agreement with previous studies (Fournier et al., 2013; Greer et al., 2006). Conversely,
phrenic burst frequency remained similar between both ages in MMI treated pups which
reveals an immature but functional respiratory control system at 4 days old. Decreased
phrenic bursts frequency was only observed in MMI treated 4 days old pups compared to
controls suggesting once again a strong vulnerability of postnatal respiratory maturation to
any THs deficiency, this time targeting the central respiratory command. A slower respiratory
rhythm caused by THs deficiency can lead to weak ventilation and increased apneic events
in the intact animals, as seen in this study. L-T4 supplementation was able to reverse phrenic
burst depression in MMI treated pups, making THs strong activators of respiratory command.
Interestingly, this enhancement of respiratory activity by L-T4 supplementation in MMI
treated pups was unseen in intact animals even though blood levels of T4 in this group
suggest an overall presence and action of the hormone. This probably implies a peripheral
action of THs deficiency on respiratory control untouched by intra-peritoneal L-T4
supplementation.

Thyroid hormones can act on both glutamatergic and GABAergic neurotransmission.

The decreased frequency in phrenic bursting caused by perinatal MMI treatment could
therefore originate from two possible sources: 1) an over excited respiratory central network
punctuated by long refractory periods following depolarisation, therefore limiting the pre-
Bötzinger complex to slow breathing frequency or 2) an increased inhibition of breathing
command by an immature GABAergic system (Baertsch et al., 2018; Ren and Greer, 2006).
Based on the work of Ren and Greer, we opted to evaluate the contribution of the GABAergic
system. Over the normal course of development, sensitivity of respiratory system to
GABAergic activity decreases between the last gestational days and the first postnatal days
(Ren and Greer, 2006). The stronger sensitivity to GABAA agonist (also confirmed with
antagonist application) in the THs deficient model at 4 days old suggests a more immature
GABAergic system compared to the normal age-dependent changes in the effect of chloride-
mediated conductance showed by Ren and Greer (2006). L-T4 supplementation dampened
the inhibition in both control and MMI treated pups therefore demonstrating its strong effect
on GABAergic development enhancement. Thyroid hormones can affect multiple processes
of GABA homeostasis during development including its synthesis, metabolism, re-uptake

132
and it can also modify GABAA receptor density (García Argiz et al., 1967; Go et al., 1988;
Kalaria and Prince, 1985; Patel et al., 1980; Ramírez de Guglielmone and Gómez, 1966).

The changing action of GABA on central respiratory activity over development is in

part due to the changing chloride homeostasis in neuronal cells. Two major chloride co-
transporters (NKCC1: accumulating chloride and KCC2: extruding chloride) play a pivotal
role in this developmental change through their different expression over time (Ben-Ari et
al., 2007). Thyroid hormone deficiency abolished the transient rise of KCC2 (mRNA
expression) in the hippocampus of 4 days old pups (proteins levels undetectable at that age
in the hippocampus). This result differs from the KCC2 expression observed in this study but
it only reflects the high heterogeneity of THs actions and timing in the brain (Quignodon et
al., 2004). The lack of differences in NKCC1 and KCC2 expression in our MMI treated
model compared to controls suggest that 1) chloride homeostasis does not represent the
immature GABAergic system in play or 2) the increased inhibition by muscimol exposure is
linked to another mechanism such as the GABAA receptor composition.

GABAA receptor are composed of many distinct subunits assembled to form a central
ion channel permeable to chloride (Ben-Ari et al., 2007). GABA will usually activate its
receptor by binding itself to the interface between α and β subunits (Chuang and Reddy,
2018). Various compositions of GABAA receptors are known to confer different synaptic
responses to neuronal cells as they modify the kinetics of postsynaptic potentials modulated
by the receptor (Liu and Wong-Riley, 2004). Inhibition in brain region mainly containing α3-
composed GABAA receptor would be less efficient as GABAergic synaptic transmission is
constrained by the slow kinetics and long decay time of the subunit type (Liu and Wong-
Riley, 2004). In contrary, α1 subunits have fast kinetics and fast decay time therefore
increasing its efficiency to inhibit the system. The increased GABAA receptor α1 subunit
protein expression in MMI treated pups could explain the enhanced inhibition of phrenic
burst frequency recorded from isolated brainstem-spinal cord preparations exposed to
muscimol. If this increase in expression represent a higher density of GABAA receptors in
the brainstem is uncertain and would need further investigations to confirm.

133
1.7 Conclusion

According to Schwartz et al (1997), the neonatal rat is defined as the best animal
model for the study of brain development under the influence of THs. Compared with
humans, the brain and hypothalamic-pituitary-thyroid axis of the rat are not fully mature at
birth (Oppenheimer and Schwartz, 1997). Using the THs deficient and supplemented
neonatal rat models, results from this study indicate that THs are important players in proper
perinatal development of both central and peripheral respiratory systems. Impairment of said
development is often related to respiratory disorders in newborn involving reduced
respiratory drive such as apnea of prematurity (AoP) and sudden infant death syndrome
(SIDS).

Funding: This research was supported by a Discovery Grant (RK) and a post graduate
scholarship (JPR) from the Natural Science and Engineering Research Council of Canada
(NSERC).

Conflicts of interest: The authors declare that they have no conflict of interest

134
 Chapitre 2
Maternal thyroid hormone deficiency and
cardiorespiratory disorder in rat pups.

Jean-Philippe Rousseau, Anabel Buteau-Poulin, and Richard Kinkead

Department of Pediatrics, Centre de recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et de

Pneumologie de Québec, Université Laval, Québec, G1V 4G5, Canada

Avant-propos :

L’article de ce chapitre a été publié dans le journal «Experimental Neurology» le 18 Mai

2019; 320:112960. doi: 10.1016/j.expneurol.2019.112960.

Je suis premier auteur sur cet article. J’ai participé à toutes les étapes incluant la conception,
la réalisation des expériences, l’analyse et interprétation des résultats, la création des figures,
la rédaction et révision du manuscrit.

Anabel Buteau-Poulin a participé à la réalisation des expériences lors d’un stage d’été. Elle
a aidé à la rédaction du manuscrit.

Le Dr. Richard Kinkead a aidé à la conception, l’interprétation des résultats, la rédaction et

révision du manuscrit.

135
2.1 Résumé

Puisque les hormones thyroïdiennes sont essentielles au développement normal du

cerveau, nous proposons que le déficit périnatal en hormones thyroïdiennes provoque un
développement anormal du réseau neuronal de contrôle respiratoire chez le raton. Pour se
faire, nous avons utilisé un traitement de méthimazole (MMI; 0.02% v/w) pendant la
gestation et suite à la naissance. À 14-15 jours de vie, la respiration de base et en réponse à
l’hypoxie, ainsi que l’inhibition cardio-respiratoire induite par la stimulation du
chémoréflexe laryngé ont été mesurées. Chez les ratons intacts, la réponse à l’hypoxie des
ratons traités au MMI était inférieure à celle des témoins. À la suite d’une stimulation du
chémoréflexe laryngé, la dépression cardio-respiratoire était plus importante chez les ratons
traités au MMI que chez les témoins. L’inactivation des récepteurs GABAA empêchait la
dépression. Nous concluons que la déficience périnatale en hormones thyroïdiennes interfère
avec les systèmes de contrôle respiratoire et autonome du rat.

136
2.2 Abstract

During gestation, the mother is the main source of thyroid hormones for the foetus.
Thus, hypothyroidism during pregnancy and/or preterm birth compromise thyroid hormone
supply for the foetus. Maternal hypothyroidism increases risk of preterm birth and both
conditions are associated with respiratory distress in infants. Since thyroid hormones are
essential for normal brain development, it is plausible that maternal thyroid hormone
deficiency plays a role in respiratory disorders related to neurological immaturity in the
newborn; however, this hypothesis is yet to be tested. Here, we used methimazole treatment
(MMI; 0.02% v/w) from the onset of pregnancy until two weeks postpartum to induce thyroid
hormone deficiency in rat pups. At 14-15 days of age, we used plethysmography to measure
breathing at rest and in response to hypoxia (12% O2, 20 min) in intact pups. We then used a
urethane/chloralose anesthetised preparation to measure cardiorespiratory inhibition induced
by laryngeal chemoreflex stimulation. In intact pups, basal breathing did not differ between
groups but the breathing frequency response to hypoxia of MMI-treated pups was lower than
controls. Following anesthesia, breathing frequency of MMI pups was 60% lower than
controls; following laryngeal chemoreflex stimulation, the drop in O2 saturation that was
82% greater in MMI-treated pups than controls. Inactivation of GABAA receptors
(bicuculline; 0.5 mg/kg) raised the frequency of anesthetised MMI pups but not control. We
conclude that gestational thyroid hormone deficiency interferes with the respiratory and
autonomic control systems of the offspring. Thyroid hormone supplementation could
alleviate cardiorespiratory disorders in newborn, especially those born preterm.

137
2.3 Introduction

Thyroxine (T4; 3.5.3’.5’-tetraiodothyronine) and triiodothyronine (T3; 3.5.3’-

triiodothyronine) are the most important thyroid hormones. T4 is the main hormone produced
by the thyroid gland. Upon its release in the circulation, T4 binds to transport proteins
(thyroxin-binding globulin TBG; transthyretin TTR or albumin) that ensure delivery to
various tissues, including the central nervous system (CNS) (Moog et al., 2017). Once within
the CNS, glial cells that contain iodothyronine deiodinase (D2) convert T4 into its bioactive
form (T3); it is estimated that ~80% of T3 within the CNS results from this conversion
process (Crantz et al., 1982; Mohácsik et al., 2011).

During the perinatal period, thyroid hormones regulate many aspects of CNS
development including neurogenesis, cell migration, dendrite and axon outgrowth, synapse
formation, and myelination (Koibuchi and Chin, 2000; Oppenheimer and Schwartz, 1997).
It is during these early life stages that the CNS is most vulnerable to thyroid hormone
deficiency. In the foetus, thyroid gland function does not start before embryonic day 17.5-18
in rats and only during the second trimester in humans (Bernal, 2007); thus during early
gestation, the mother is the unique source of thyroid hormones for the foetus.

Hypothyroidism is one of the most common diseases in pregnancy with a prevalence

ranging from 0.3% to 4% of women (Shinohara et al., 2018). Besides its impact on maternal
health, hypothyroidism increases the risk of preterm birth and low birth weight in the infant
(Shinohara et al., 2018). Thus depending on timing, premature birth can compound this
problem by causing a precocious interruption of maternal hormone supply and interfering
with the postnatal surge of thyroid hormones (Biswas et al., 2002). As a result, thyroid
hormones levels of infants born prior to 30 weeks of gestation are 57% lower than those born
at term, a condition that increases the risk of neurodevelopmental delays (Lain et al., 2016).

In neonatal intensive care units, respiratory disorders related to immaturity of the

respiratory control system is an important concern for clinicians (Eichenwald et al., 2016;
Martin and Wilson, 2012). Preterm infants often show recurrent apneas with significant and
potentially life threatening arterial O2 desaturations and bradycardias. In these infants, a

138
reduced responsiveness to respiratory stimuli (O2 and CO2) contributes to this respiratory
disorder. Immaturity also compromises the ability to coordinate breathing with other
functions such as swallowing (Martin and Wilson, 2012). The laryngeal chemoreflex is a set
of responses aiming to prevent aspiration of foreign substances into the airways (Reix et al.,
2007) and in a mature mammal, the presence of foreign substances (mostly liquids) near the
larynx generally triggers coughing and swallowing with brief interruptions of breathing. In
preterm infants, however, laryngeal chemoreflex stimulation leads to cessation of breathing
movements with significant bradycardias, laryngospasm, systemic hypertension, and blood
flow redistribution (Rousseau et al., 2017; Thach, 2001). Excessive laryngeal chemoreflex-
induced cardiorespiratory depression is a significant concern for clinicians since in extreme
cases these events can be fatal. As a result, delayed or abnormal laryngeal chemoreflex
maturation has been linked with sudden infant death syndrome (SIDS) (Leiter and Böhm,
2007; Praud, 2010).

Maternal hypothyroidism has been associated with increased rates of respiratory

distress syndrome in newborn (Biswas et al., 2002; Casey et al., 2005; Männistö et al., 2013).
Furthermore, the severity of respiratory illness measured in preterm infants at birth is
inversely proportional to the level of free T4 (Paul et al., 2010). Together, these observations
suggest that withdrawing the foetus from the maternal source of thyroid hormones
contributes to respiratory disorders related to immaturity of the neural control network. To
the best of our knowledge, however, this hypothesis is yet to be addressed experimentally.
Here, we used maternal methimazole treatment (MMI), an established experimental protocol
that reliably induces thyroid hormone deficiency during gestation and the days following
birth (Ahmed et al., 2010b, 2012; Darbra et al., 2004). The consequences of MMI treatment
on respiratory control was first tested in awake, unrestrained pups at rest and in response to
a moderate hypoxic challenge. We then used an anesthetised pup preparation to compare the
functionality of the laryngeal chemoreflex between groups. Based on the pronounced
inhibitory responses observed in thyroid hormone deficient pups, we then used
pharmacological treatment to determine whether MMI potentiates GABAergic modulation
of respiratory activity in rat pups.

139
2.4 Methods

2.4.1 Ethical approval

Université Laval Animal Care Committee approved all the experimental procedures
and protocols (CPAC protocol #2015030) which were in accordance with the guidelines of
the Canadian Council on Animal Care and the ARRIVE guidelines. Experiments were
performed on 62 Sprague-Dawley rat pups of both sexes aged of 14 to 15 days old. All
animals used in this study were born and raised in our animal care facilities. All animals were
maintained in standard laboratory conditions (21°C, 12:12-h dark-light cycle: lights on at
6:00 and off at 18:00); the access to food and water was ad libitum during gestation and
during experimental treatment. Distinct groups of animals were used for plethysmographic
recordings and laryngeal chemoreflex stimulation protocol.

2.4.2 Maternal treatment and thyroid hormone deficiency in rat pups

Adult nulliparous female rats were randomly assigned to one of two groups: thyroid
hormone deficiency (MMI group) in the foetus was mimicked by administrating
methimazole (MMI; Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) which inhibits thyroid hormone
synthesis. MMI was added to the drinking water of the pregnant dam at concentration of
0.02% (weight per volume; w/v), a dose used previously to induce hypothyroidism in rats
(Ahmed et al., 2010b, 2012). Treatment began on the first day of pregnancy (gestational day
1; GD1) and was maintained until rat pups were used for experimentation at postnatal day 14
or 15 (P14-P15). Low concentrations of salt (NaCl: 0.05%) were added to the treated water
to make the MMI solution palatable; technically, this group should be termed “vehicle” but
will be referred to as “controls” to avoid confusion with saline injected pups in subsequent
experiments. Daily monitoring of water consumption was performed in the MMI-treated
dams (~35 ml/day) and revealed no difference compared to normal water consumption in
pregnant dams (~40 ml/day) (Uriu-Hare et al., 1995).

140
2.4.3 Thyroid hormone measurements

Efficiency of the MMI treatment was determined in the mothers and their pups. To
minimise stress during pregnancy, maternal blood samples were taken 24h after their pups
were taken for experimentation; total thyroxine (TT4) was quantified in MMI-treated dams
and controls to obtain a broad assessment of thyroid function. Sera from the offspring were
taken following plethysmographic recordings; here, we measured free thyroxine (FT4) levels
to compare the bioactive form of the hormone in each experimental group (MM and controls).
In dams and pups, terminal blood samples (~1 ml) were collected through intracardiac
puncture under deep anesthesia (ketamine/xylazine; i.p.). Blood was then transferred into a
serum gel Z/1.1 microtube (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada). Blood serum
was separated by centrifugation at 13 000 r.p.m. and 4°C for 15 minutes before being stored
at -80°C. Thyroid hormone measurements were performed by electro-chemiluminescence
(Elecsys, Modular E170, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) by the clinical
biochemistry service of our institution (Institut Universitaire de Cardiologie et Pneumologie
de Québec, Québec, QC, Canada). The measuring ranges are: TT4: 5.4 – 320nmol/L; FT4:
0.3 – 100 pmol/L.

2.4.4 In-vivo respiratory recordings in intact (non-sedated) pups

Respiratory activity was recorded using whole body, flow-through plethysmography

as previously described for newborn rat pups (Gulemetova and Kinkead, 2011; Niane and
Bairam, 2011). Briefly, the gas flow through the experimental chamber was measured with a
mass flowmeter (TSI model 4140, Shoreview, MN, USA) and set at about 200 ml/min.
Temperature in the chamber was maintained at 28°C using a temperature control system
(Physitemp, Clifton, NJ, USA). Calibration of the system was performed by rapidly injecting
1.5 ml of air into the chamber with a syringe. Respiratory frequency (ƒR) and tidal volume
(VT) were recorded from the plethysmograph signal using a specialized data acquisition

141
software (Labchart 8, AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA). Barometric pressure,
body temperature, chamber temperature, and humidity were measured to correct and
standardize VT and values were expressed in ml BTPS (Bartlett and Tenney, 1970;
Drorbough and Fenn, 1955). These values were subsequently used to calculate minute
ventilation (𝑉̇ E = ƒR x VT). Composition of the gas mixtures flowing in and out of the chamber
was analyzed with an oxygen analyzer (model S-3A, Ametek, Pittsburgh, PA, USA) for
subsequent calculation of 𝑉̇ O2 as an index of metabolic rate (Mortola and Dotta, 1992).

The rat pup was placed in the plethysmography chamber breathing room air
(normoxia; FIO2 = 0.21). Each rat was given 10 min to acclimate and body temperature was
measured by gently placing a small thermocouple for rodent inside the rectum (Harvard,
Holiston, MA, USA). Once the pup appeared calm and the breathing signal became regular,
breathing was then recorded for 20 min (baseline). Room air was then replaced with hypoxic
gas (FIO2 = 0.12) for 20 min to record the hypoxic ventilatory response.

2.4.5 Laryngeal chemoreflex stimulation protocol in anesthetised pups

This procedure was based on a protocol developed previously (Baldy et al., 2017; Xia
et al., 2008). Briefly, each pup was anesthetized with a mixture of urethane (1 mg/kg) and
chloralose (20 mg/kg) by intraperitoneal injection. Once a surgical plane of anesthesia was
reached (~20 min), the animal was placed in the supine position, a small thermistor probe
was inserted into the rectum to record body temperature, which was controlled at 35°C with
a homeothermic blanket (Harvard Appratus, Holliston, MA, USA). O2 saturation (SpO2) and
heart rate were measured continuously with pulse oxymetry (Mouse Ox, Starr Life Sciences,
Oakmont, PA, USA) by placing a sensor onto the thigh of the pup. Hooked silver wires
(diameter of 0.25 mm; World Precision Instrument, Sarasota, FL, USA) were introduced into
the intercostal muscles in the region of the 9th–11th ribs to record electromyography (EMG)
as an index of respiratory activity. A grounding wire was inserted subcutaneously into the
skin over the abdomen. The EMG signal was amplified, filtered (A-M Systems, model 1800,
Sequim, WA, USA), and recorded with a data acquisition system (Windaq, DataQ

142
Instrument, Akron, OH, USA). A midline skin incision was then made in the neck and the
cervical trachea was freed from adjacent tissues. The recurrent and superior laryngeal nerves
were identified and carefully avoided during the dissection. The trachea was cut partially
with a transverse incision so that the lumen was visible. A polyethylene tubing (PE-50, Clay
Adams, Becton Dickinson Mississauga, ON, USA) was inserted slowly into the rostral part
of the trachea until the tip reached the larynx. The pup’s head was then tilted backward
slightly to facilitate breathing via the opened trachea. This ensured that the water injected
near the larynx drains via the nose and mouth and is not aspired into the lower airways and
lungs.

Twenty minutes prior to recordings, animals of each groups (control and MMI) were
randomly assigned to receive intraperitoneal injection of either saline (veh) or the selective
GABAA receptor antagonist bicuculline (0.5 mg/Kg; Tocris (Bio-Techne Canada), Oakville,
ON). This dose was selected based on a previous study demonstrating the efficiency in this
age group (Hiroshi et al., 2018). Once respiratory activity was stable for at least 10 min, three
water injections (10 µl each) were made using a 10-µl Hamilton syringe, starting at the
beginning of inspiration. A 5-min recovery period was allowed between injections. These
multiple injections aimed to obtain a more representative (mean) evaluation of the reflexive
responses. Apnea duration was defined as the period of apneas/respiratory disruption from
the beginning of the stimulus (water injection) until the return of at least five regular,
uninterrupted breaths (Xia et al., 2008). SpO2 and heart rate were measured during baseline
and throughout the laryngeal chemoreflex stimulation protocol.

2.4.6 Data analysis and statistics

Each group is composed of at least three litters to avoid litter specific effect. Data
from male and female pups were combined since statistical analysis revealed no sex specific
effect of MMI treatment and/or bicuculline injection on any of the cardiorespiratory variables
considered.

143
 Breathing variability in the non-sedated pups was calculated using the Poincaré plot
method as described previously (Laouafa et al., 2017); performance analysis was determined
using SD1 and SD2 (standard deviation 1-2) as variability indexes. For each animal, SD1
and SD2 were average from two periods lasting about 450 breaths on a stable portion of the
baseline respiratory trace without sigh or apnea.

Anesthesia normally leads to a reduction in breathing frequency. Here, we noted that

this effect was more important in MMI-treated pups than controls thus revealing a significant
difference in the neural mechanisms that determine breathing frequency. To consider this
aspect in our analysis of apneas, we normalised the apnea duration by first calculating the
period (T=1/ƒR) and then dividing the apnea duration by the period (apnea/T). Based on
animal studies using similar approaches (Fournier et al., 2013), the O2 desaturation and
bradycardia responses consisted of the lowest values achieved following water injection
compared to baseline values. Results were considered only when pups recovered before the
next injection.

Results were analysed using a one way ANOVA for the effect of MMI treatment and
bicuculline injection. ANOVA with repeated measures was used to assess the effect of time
during the hypoxic ventilator response. Analysis of laryngeal chemoreflex protocol revealed
that apnea duration, desaturation (SpO2) and heart rate responses did not change with
repetitive laryngeal chemoreflex stimulations. Therefore, data from the three injections were
averaged and reported as a single value. None of the animals used for in vivo experiments
were excluded from the analyses. Animals that died during the laryngeal chemoreflex
protocol (2/9 MMI and 8/19 controls pups) were not considered in the analysis. Apnea
duration between animals that survived the laryngeal chemoreflex stimulation and those that
died before completion of the protocol were also similar for each group (alive vs dead; Ctrl:
P = 0.2115 and MMI: P = 0.6410) and Chi-square test revealed that mortality and treatment
were not linked (Χ2: P = 0.3051). When ANOVA results indicated that a factor was
significant (p < 0.05), a Fisher’s least significant difference test was performed for post hoc
analysis. Statistical analyses were performed using StatView 5.0 (SAS Institute, Toronto,
ON, Canada). Data are reported as mean ± standard deviation (SD). ANOVA results are

144
mainly reported in the figures legends and Table 2. Results from post hoc tests are
represented by symbols in the table and figures.

145
Table 2. Comparison of body temperature and selected cardiorespiratory variables between 14-15 days
old pups born and raised under standard conditions (Control) or born to mothers subjected to
methimazole treatment (MMI; thyroid hormone deficient pups). On the day of experimentation, pups
were anesthetised and injected either with saline (Veh) or with Bicuculline (Bicu; 0.5 mg/Kg).
Measurements were obtained from under resting conditions. Data are reported as means ± SD. Symbols
indicate results from post hoc tests. * significantly different from corresponding control value (P =
0.05). † significantly different from corresponding vehicle-treated value (P = 0.05).

2.5 Results

2.5.1 Efficacy of maternal methimazole treatment (MMI) on thyroxin

levels (T4) and pups

Total T4 (TT4) levels measured in the dams (post partum day 4) revealed a -52%
decrease in the sera of MMI treated mother compared to controls (Figure 37A). MMI can
pass through the placental barrier and maternal milk, and therefore also affects THs synthesis
in the foetus and pups. Free T4 (FT4) levels were measured in the 14-15 days old offspring;
following MMI treatment FT4 levels were below detection level of the test in all the samples
(Figure 37B). Consistent with other studies using this model (Özgür et al., 2016), thyroid
hormone deficient pups weighed, on average, 50% less than controls (Figure 37C).

146
Figure 37. Maternal methimazole treatment (MMI) reduces thyroid hormone levels and
body weight. A) Comparison of total T4 blood concentration in control and MMI treated
dams (MMI effect: p = 0.0002; F(1,11) = 28.770) and B) free T4 blood concentration in control
and MMI treated pups following birth (MMI effect: p < 0.0001; F(1,10) = 153.072). C)
Comparison of body weight (MMI effect: p < 0.0001; F(1,43) = 287.752) and D) body
temperature (MMI effect: p < 0.0001; F(1,14) = 44.9) between control and TH-deficient pups
(MMI treated). Data are reported as means ± SD. Symbols indicate results from post hoc
tests. * significantly different from control group (p = 0.05).

147
2.5.2 Thyroid hormone deficiency attenuates the breathing frequency
response to hypoxia in intact pups

The original recordings presented in Figure 38 illustrate respiratory activity at rest

(normoxia; boxed area) and the first minutes that follow the onset of hypoxic stimulation
(arrow). Under resting conditions, measurements of 𝑉̇ E, fR, and VT did not differ between
thyroid hormone deficient pups to controls (Figure 38A, B, and C, respectively). Thyroid
hormones are known for their influence on metabolism (Ahmed et al., 2008); while body
temperature of MMI-treated pups was 1.7oC colder than controls (Figure 37D) (33.6oC ± 0.5
and 35.4 oC ± 0.5, respectively; P < 0.0001), neither 𝑉̇ O2 nor the convective requirement
(𝑉̇ E / 𝑉̇ O2) were affect by treatment (Figure 38D-E). Breath-by-breath analysis was
performed under normoxic conditions and stability of the breathing pattern is portrayed in
Poincaré plot (Figure 38F). Evaluation of respiratory activity at rest revealed increased
variability indexes (SD1 and SD2) in MMI treated pups compared to controls (Figure 38G).

When comparing the time course of the fR response to hypoxia (Figure 39A) we first
noticed that at the onset of the hypoxic challenge (first 6 min), the hyperpneic responses were
similar between groups. Unlike controls, MMI-treated pups were then unable to sustain the
initial fR increase over the entire hypoxic period. As a result, the response measured during
the “steady state” phase (last 5 minutes) was 69% lower in MMI-treated pups than controls
(Figure 39B). The VT and 𝑉̇ E responses were unaffected by treatment (Figure 39C, D).
While the anapyrexic response of MMI pups was slightly larger than controls (-2.0 oC ± 1.1
versus -1.1oC ± 0.6, respectively; P = 0.06), the drop in 𝑉̇ O2 did not differ between groups (-
53% ± 15 versus -60% ± 11 for control and MMI, respectively; P = 0.4). Consequently, the
hypoxic 𝑉̇ E / 𝑉̇ O2 values were similar between groups (63 ± 18 versus 66 ± 27 for control
and MMI, respectively; P = 0.8).

148
Figure 38. Whole body plethysmography in unrestrained rats. Thyroid hormone
deficiency does not affect basal respiratory and metabolic variables measured in awake pups
(P14-15). Between group comparisons of A) minute ventilation (𝑉̇ E) (MMI effect: p =
0.7158; F(1,12) = 0.140), B) respiratory frequency (fR) (MMI effect: p = 0.0975; F(1,12) = 3.279),
C) tidal volume (VT) conditions (MMI effect: p = 0.2254; F(1,12) = 1.650), D) O2 consumption
(𝑉̇ O2) (MMI effect: p = 0.1845; F(1,12) = 2.004), and E) convective requirement ratio
(𝑉̇ E / 𝑉̇ O2) (MMI effect: p = 0.4037; F(1,12) = 0.754). F) Typical example of a Poincaré plot
showing individual breath duration as a function of the duration of the preceding breath (both
in milliseconds). Arrows indicate the line on which standard deviations (SD) are calculated.
G) Between group comparisons of SD1: perpendicular to identity (MMI effect: p = 0.0473;
F(1,12) = 4.881) and SD2: identity (MMI effect: p = 0.0134; F(1,12) = 8.387). Data are reported
as means ± SD. Symbols indicate results from post hoc tests. * significantly different from
control group (p = 0.05).

149
Figure 39. Ventilatory response to a 12% hypoxic event between control and MMI-
treated pups. A) Respiratory frequency response over the 15 minutes of hypoxia (MMI
effect: p = 0.6102; F(1,9) = 0.285) (Time effect = p < 0.0001; F(1,14) = 6.097) (Factorial
interaction: p < 0.0001; F(1,14) = 10.361). Box area in panel A represents the last 5 minutes of
hypoxic exposure where physiological responses were determined for B) Respiratory
frequency (fR) (MMI effect: p = 0.0089; F(1,9) = 10.040), C) tidal volume (VT) (MMI effect:
p = 0.5499; F(1,9) = 0.386) and D) minute ventilation (𝑉̇ E) (MMI effect: p = 0.1181; F(1,9) =
2.985) responses in the last 5 minutes of hypoxic exposure. Data are reported as means ± SD.
Symbols indicate results from post hoc tests. * significantly different from control group (p
= 0.05).

150
2.5.3 Effect of anesthesia and thyroid hormone deficiency on
cardiorespiratory activity at rest and in responses to laryngeal chemoreflex
stimulation

While respiratory activity of MMI and control pups did not differ under “standard”
(non-sedated) conditions, anesthesia revealed significant effects of treatment. Comparison of
the original recordings reported in Figure 40A and C illustrate the striking differences in
basal cardiorespiratory activity between MMI and control pups. Prior to laryngeal
chemoreflex stimulation, body temperature and all cardiorespiratory variables of MMI-
treated pups were significantly lower than controls (Tb: -1.7oC; fR: -60%; SpO2: -11%; Heart
rate: -49%) (Table 2; Figure 40A and C). In control pups, inactivation of GABAA receptors
by bicuculline had very limited effects on basal physiological variables; only body
temperature was increased (+0.9oC). The recording also show that the effects of bicuculline
injection were more important in MMI-treated pups (Figure 40); this treatment increased
body temperature and cardiorespiratory variables to values similar to those observed in
control pups (body temperature: +2.6oC; fR: +61%; SpO2: +11%; Heart rate: +31%) (Table
2; Figure 40). The significant factorial interactions (MMI x bicuculline) support this
observation (Table 2).

The recordings presented in Figure 40 also show that water injection near the larynx
activated the laryngeal chemoreflex and provoked significant cardiorespiratory inhibition in
both groups. However, the apneas measured in MMI treated pups were 333% longer than
controls (Figure 41A). Bicuculline injection in control groups did not affect this response,
but in MMI pups, this treatment shortened apnea duration by -38% (Figure 41A). Basal
respiratory activity influences apnea duration. To consider the between-group differences in
basal fR in this evaluation, we then expressed apnea duration as a function of the fR measured
before laryngeal chemoreflex stimulation (apnea duration/period). This normalisation
brought the apneic response of MMI-treated pups to a level similar to controls; yet, the apnea
duration/period ratio of MMI pups injected with bicuculline remained greater than vehicle-
injected pups (Figure 41B). The desaturation response (SpO2 drop) was 82% greater in
thyroid hormone deficient pups than controls; however, bicuculline treatment had not effect

151
on this response (Figure 41C). The laryngeal chemoreflex-induced bradycardia was not
affected by either MMI treatment or bicuculline injection (Figure 41D).

Figure 40. Original recording comparing cardiorespiratory responses to stimulation of

the laryngeal chemoreflex by water injection (10 µl) near the larynx between pups
subjected to A) control conditions, B) control conditions + bicuculline injection before
recording, C) Thyroid hormone deficiency in the form of MMI treatment and D) Thyroid
hormone deficiency (MMI) + bicuculline injection before recording. In each panel, the traces
illustrate (from top to bottom): intercostal EMG, SpO2, and heart rate.

152
Figure 41. Thyroid hormone deficiency augments cardiorespiratory inhibition induced
by laryngeal chemoreflex stimulation. A) Combined apnea duration (MMI effect: p <
0.0001; F(1,40) = 96.642) (Bicuculline effect: p = 0.0024; F (1,40) = 10.425) (Factorial
interaction: p < 0.0001; F (1,40) = 21.623), B) apnea duration normalised to the duration of the
breathing cycle (ratio apnea duration/period) (MMI effect: p = 0.0004; F(1,40) = 14.921)
(Bicuculline effect: p = 0.0386; F (1,40) = 4.558) (Factorial interaction: p = 0.8357; F (1,40) =
0.044), C) combined SpO2 (MMI effect: p = 0,0006; F(1,40) = 13.831) (Bicuculline effect: p =
0.8666; F (1,40) = 0.029) (Factorial interaction: p = 0.0756; F (1,40) = 3.328) and D) combined
heart rate (MMI effect: p = 0.0544; F (1,40) = 3.927) (Bicuculline effect: p = 0.3228; F (1,40) =
1.002) (Factorial interaction: p = 0.7946; F (1,40) = 0.069) responses observed in control,
control + bicuculline, MMI and MMI + bicuculline groups. Data are reported as means ± SD.
Symbols indicate results from post hoc tests. * significantly different from control group (p
= 0.05). †significantly different from corresponding vehicle-treated value (p = 0.05).

153
2.6 Discussion

Thyroid hormone levels of infants born to mother with hypothyroidism (especially

those born preterm) are significantly low at birth, and it is now established that this
population is more likely to require respiratory care during early life (Biswas et al., 2002;
Casey et al., 2005; Männistö et al., 2013). Thyroid hormones regulate several processes but
owing to their primary role in brain development, we hypothesized that deficiency in thyroid
hormones disrupts the neural network that regulates cardiorespiratory function and thus
predispose rat pups to disease. Under resting (non-sedated) conditions, respiratory function
of thyroid hormone deficient pups appeared normal as none of the respiratory parameters
differed from controls even though body temperature was lower, as expected. This suggests
a potential specificity of thyroid hormone deficiency treatment on GABAergic activity in
cardiorespiratory circuits. However, breath-to-breath variability during normoxia was higher
in MMI treated pups. Variability in ventilation can originate from intrinsic properties of the
respiratory rhythm generator and/or sensory afferents influencing its action, including
cardiac output, cerebral blood flow, chemoreflex gain, and chemical drive (Hilaire and
Duron, 1999; Khoo, 2000). Moreover, exposing pups to a respiratory challenge or anesthesia
revealed important deleterious consequences of thyroid hormone deficiency on the
cardiorespiratory control system. Together, these results support our hypothesis and highlight
the cardiorespiratory vulnerabilities associated with perinatal thyroid hormone deficiency.
These observations are significant as they indicate that thyroid hormones are important
players in the pathophysiology of cardiorespiratory disorders of the newborn related to neural
control dysfunction, including apnea of prematurity (AoP) and sudden infant deaths
syndrome (SIDS). Results from pharmacological experimental indicate that potentiation of
GABAergic modulation is an important pathophysiological mechanism.

2.6.1 Critique of the model

Evaluating the pathophysiological/clinical relevance of any experimental model must be

done cautiously owing to the difficulty of transposing human standards to animals.

154
Pharmacological treatment of gestating dams reduced total T4 levels by ~50%. This, in turn,
virtually eliminated circulating free T4 in pups. In humans, hypothyroidism during gestation
is considered clinicTrsally significant when values are below the 5th percentile which,
depending on the stage of the pregnancy, represents a reduction well below the one reported
here (Alexander et al., 2017; Elmlinger et al., 2001). Gestational hypothyroidism is a
significant risk factor for preterm birth, which in itself can impose an additional thyroid
hormone deprivation to the offspring. Our total T4 measurements and the fact that none of
our MMI treated dams gave birth prematurely indicates that the thyroid hormone deficiency
experienced by gestating dams is relatively modest. We know, however, that this protocol is
sufficient to reduce birth weight and interfere with respiratory rhythm generation in newborn
(Rousseau and Kinkead, 2016).

Infants and rats born at term show a significant postnatal elevation of thyroid hormones
that then decline progressively over the following days (Abuid et al., 1973; Biswas et al.,
2002; Dussault and Labrie, 1975; LaFranchi, 1999). Preterm birth interferes with this process
(LaFranchi, 1999) and maintaining MMI treatment following birth aimed to reproduce this
aspect of thyroid hormone deficiency. Considering that the free T4 level of thyroid hormone
deficient pups were below the detection threshold of the test used and that the cut off for
treatment in the clinic is 7.7 pmol/L and the normal range is 11 – 30 pmol/L (~38% drop) the
effect of the treatment used here may be severe (LaFranchi, 2011). In light of the effects of
thyroid hormones on lung development, surfactant synthesis and diaphragm muscle (Ballard
et al., 1998; Holt et al., 1993; Ianuzzo et al., 1984; Massaro et al., 1986), this then raises the
possibility that our protocol had broad (non specific) effects on the respiratory system rather
than its control network. Measurements of arterial blood gas would ensure that the MMI
treatment does not compromise gas exchange but in the absence of such results,
quantification of metabolic demand and baseline breathing are reliable indicators and the lack
of treatment effect indicates that if MMI-treatment had non-specific effects, the physiological
impact is limited. Furthermore, the tidal volume data obtain in both groups do not support a
reduction in diaphragm function following thyroid hormone deficiency. While the reduced
body temperature in MMI-treated pups could modulate laryngeal response to stimulation
under anesthesia (Curran et al., 2005; Xia et al., 2008), comparison between anesthetised and
intact pups show that the impact of temperature on resting breathing frequency was not

155
proportional between preparations, thus pointing to an alternate mechanism than body
temperature. Together, these observations and the fact that anesthesia and stimulation of
respiratory reflexes was necessary to reveal the effects of thyroid hormone deficiency argue
that disruption of the neural control network is the main reason why respiratory anomalies
were observed in thyroid hormone deficient pups.

2.6.2 Hypoxic ventilatory response is attenuated thyroid hormone

deficient pups.

Analysing the time course of the hypoxic ventilatory response provides insight about
the relative contribution of the different components of the respiratory control system (Powell
et al., 1998). The rapid rise in respiratory frequency at the onset of hypoxia reflects activation
of peripheral O2 chemoreceptors and our results do not suggest that MMI-treatment affected
carotid body function in pups. The subsequent changes that take place when hypoxia is
maintained reflect neurological and metabolic adaptions. The hypoxic ventilatory response
undergoes significant changes during early life (Mortola, 2001). When facing sustained
hypoxia, immature/newborn mammals will generally conform to the reduced O2 availability
by lowering 𝑉̇ O2 and ventilation. This response contrasts with the response of adults that
minimise metabolic changes and aim to maintain O2 supply by a sustained hyperventilation.
Based on the temperature and 𝑉̇ O2 responses, thyroid hormone deficiency did not affect
metabolic response to hypoxia. The inability to sustain a hyperpnea through the stimulation
period is suggestive of an abnormal central response potentially driven by diverse changes in
neurochemical levels including GABA and adenosine, both modified by thyroid hormone
availability (Ahmed et al., 2008). Thus, the lower frequency response observed in thyroid
hormone deficient pups indicates that the neural control network of these animals is less
mature than controls, an effect consistent with the role of thyroid hormones on brain
development.

156
2.6.3 Thyroid hormone deficiency augments anesthesia-induced
respiratory depression.

In the anesthetized rat, body temperature, respiratory frequency, oxygen saturation,

and heart rate were all reduced in normal conditions by perinatal MMI treatment. Except for
body temperature, these observations are quite different from similarity of respiratory
variables in control and MMI-treated pups under intact conditions. Such striking effect of
anesthesia was unexpected; however, it shows that cardiorespiratory function of thyroid
hormone deficient rat pups is very vulnerable once the respiratory drive related to
wakefulness is eliminated. Urethane and chloralose both potentiate GABAergic currents
(Garrett and Gan, 1998; Hara and Harris, 2002). Here, we showed that inactivation of
GABAA receptors by bicuculline restores body temperature and cardiorespiratory values of
anesthetised thyroid hormone deficient pups to near normal level but has limited effects in
controls. These data indicate that thyroid hormone deficiency potentiated this inhibitory
neurotransmission and that despite being injected intraperitoneally, bicuculline can act on
brain regions regulating cardiorespiratory functions. GABAA receptors being ubiquitous in
the hypothalamus, brainstem, and medulla, the present data does not provide the information
allowing us to propose a specific site of action. Changes in temperature alone can influence
breathing and heart rate but a 1.7oC difference is not sufficient to account for the large
changes reported here (Schaeffer, 1998). We therefore propose that the treatment-related
effects are mainly due to an enhanced GABAergic inhibition in regions regulating
cardiorespiratory function. This effect could be direct or via actions on structures regulating
arousal states, including the serotonergic and/or the orexinergic system. This interpretation
is based on the consequence of thyroid hormone deficiency on the development of the
GABAergic system in the cerebral cortex and the hippocampus (Friauf et al., 2008; Gilbert
et al., 2007). Deletion of thyroid hormone receptors (Tr-/-) in mice is also associated with a
decrease in body temperature and heart rate, a result in agreement with our data from perinatal
thyroid hormone deficiency in rats (Forrest and Vennström, 2000). Interestingly, baseline
SpO2 levels in thyroid hormone deficient rats (82% O2) were close to the 80% limit
considered as clinically significant for adverse effects in infants (Eichenwald et al., 2016).
With such low SpO2, MMI-treated pup are potentially hypoxemic. The reduced response to

157
hypoxia discussed previously may contribute to the abnormally low breathing frequency that
characterized this group (Figure 39A).

2.6.4 The GABAergic regulation of the laryngeal chemoreflex following

thyroid hormone deficiency

An abnormal or immature laryngeal chemoreflex can lead to prolonged, life

threatening apneas and severe bradycardias. It is not surprising therefore that an excessive
laryngeal chemoreflex has been associated with sudden infant death (Kinney and Thach,
2009). Such profound cardiorespiratory depression generally reflects the activation of
powerful inhibitory signals converging onto the cardiorespiratory network during early life
(Praud, 1999; Xia et al., 2013). This principle was observed in our experiments where
laryngeal chemoreflex-induced apneas were longer in MMI treated pups than controls. This
strong response was concomitant to more profound O2 desaturation. Since apnea duration is
greatly determined by basal respiratory frequency, we expressed these results as function of
basal breathing frequency. With this approach, apnea duration was now similar between
groups but interestingly, this normalization procedure showed that bicuculline treatment
prolonged laryngeal chemoreflex-induced apneas in thyroid hormone deficient pups but not
controls. The lack of effect in controls is consistent with other observations in this group
prior to laryngeal chemoreflex stimulation. However, the prolonged apneas in thyroid
hormone deficient pups treated with bicuculline are difficult to reconcile with the overall
increase in body temperature and cardiorespiratory function observed prior to laryngeal
chemoreflex stimulation. They suggest, however, that the influence that GABAergic
neurotransmission exerts on laryngeal chemoreflex responses is different and could take
place more selectively by acting on distinct structure that regulates the apneic response.
Because it receives numerous sensory afferents from the layngeal mucosa, the caudal region
of the NTS could be contributing to this differential effect. Conversely, neither the O 2
desaturation nor the bradycardia responses triggered by laryngeal chemoreflex stimulation
were affected by bicuculline treatment in MMI treated pups. Based on the rationale
developed previously, this indicates that other structures are involved; the nucleus ambiguous

158
and motor nucleus of the vagus are potential candidates owing to their role in the cholinergic
regulation of cardiovascular function.

2.7 Conclusion
Adequate supply of thyroid hormones is essential to brain development during early
life. Owing to its multiple roles, thyroid hormone deficiency can compromise several aspects
of maternal and infant health; however, the results reported here provide support to the
hypothesis proposing that this condition can contribute to respiratory disorder by
predominantly compromising the function of the cardiorespiratory control network. Thyroid
hormone supplementation is frequently used in the clinic, but these data provide the basis
necessary to evaluate the therapeutic values of this treatment to address respiratory disorders
related to neural control dysfunction more specifically.

Funding: This research was supported by a Discovery Grant (RK) and a post graduate
scholarship (JPR) from the Natural Science and Engineering Research Council of Canada
(NSERC).

Conflicts of interest: The authors declare that they have no conflict of interest

159
 Chapitre 3
Is regulation of microglial functions by thyroid hormone
dependent on the micro-environment?: insights from the
cortex and brainstem of newborn mice

Jean-Philippe Rousseau1, Mami Noda2, Richard Kinkead1

1 : Department of Pediatrics, Centre de recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie

et de Pneumologie de Québec, Université Laval, Québec, G1V 4G5, Canada

2: Laboratory of Pathophysiology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu

University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan.

Avant-propos:

Cet article a été accepté pour publication dans le journal Brain Research Bulletin le 13 janvier
2020.

Je suis premier auteur sur cet article. J’ai participé à toutes les étapes incluant la conception,
la réalisation des expériences, l’analyse et interprétation des résultats, la création des figures,
la rédaction et révision du manuscrit.

Le Dr. Mami Noda a aidé à la conception, l’interprétation des résultats et la révision du

manuscrit.

Le Dr. Richard Kinkead a aidé à la conception, l’interprétation des résultats, la rédaction et

révision du manuscrit.

160
3.1 Résumé

Les microglies sont essentielles au raffinement du réseau neuronal dans la période

périnatale et sont influencées par les hormones thyroïdiennes. Nous proposons que les
microglies du tronc cérébral répondent à la présence d’hormones thyroïdiennes de façon
dépendante à l’environnement qui les entoure. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé
une culture primaire de microglie du tronc cérébral en combinaison ou non avec des
neurones. Nous avons observé la motilité et la phagocytose des cellules microgliales en
réponse à la T3. L’exposition à la T3 augmente la motilité des microglies du tronc cérébral
seulement lorsqu’elles sont en co-culture avec des neurones. La phagocytose du Dextran
Rhodamine B par les microglies est augmentée par la T3. Nous concluons que les hormones
thyroïdiennes facilitent les réponses fonctionnelles multiples de la microglie dont certaines
d’entre elles sont spécifiques à l’environnement.

161
3.2 Abstract

Microglial cells are critical for the refinement of neural networks that takes place
during perinatal period. Their phenotype and actions are modified by the surrounding milieu
which is influenced by the presence of other cell types and varies between brain regions.
Thyroid hormones (THs) are considered as strong modulators of the brain development and
their influence on neural mechanisms expands to the glial cells including microglia. While
effects of THs on microglia in developing brain have been demonstrated, the effect of THs
on brainstem circuits remains unknown. Using newborn mice, we first tested the hypothesis
that microglia originating from the brainstem are responsive to THs. We then determined if
this effect is 1) region dependent (cortex vs brainstem) and 2) influenced by the presence of
neurons (co-culture). Measurements were performed on primary cultured microglia and
neurons from cortex and brainstem of postnatal day 3 and embryonic day 15–16 C57BL/6J
mice respectively. Microglial motility (µm traveled over 3 hours) and phagocytosis of
Dextran, Rhodamine B were monitored with or without triiodothyronine (T3; 1 µM).
Exposure to T3 increased brainstem microglial motility by 416% relative to controls, only in
the presence of neurons. On the other hand, single-cultured microglia from brainstem
responded to T3 by a 3-fold increase in phagocytosis as indicated by the fluorescence
intensity of Dextran Rhodamine B. We conclude that T3 facilitates multiple functional
responses of microglia, and some of them are specific to the surrounding environment. These
data support the notion that microglia are important effectors of thyroid hormones action in
the development of brainstem networks.

162
3.3 Introduction

Microglial cells are residents in the central nervous system (CNS) considered as the
main representatives of the innate immune system of the brain (Wolf et al., 2017). In addition
to their mobilization during pathological states of the brain, microglia are also constantly
monitoring and regulating their environment in the healthy CNS (Nimmerjahn et al., 2005).
They invade the CNS at early embryonic stages and have direct interactions with neurons,
synapses, and other glial cells in their environment, which make them potential effectors of
CNS plasticity over development (Ginhoux et al., 2010; Tremblay et al., 2011). Part of their
functions includes not only phagocytosis of neurons undergoing apoptosis during
programmed cell death and pruning of supernumerary weak synapses, but also support of
new synapses formation and neuronal survival (Elliott et al., 2009; Gude et al., 2008;
Kolodziejczak et al., 2015; Lim et al., 2013; Paolicelli et al., 2011; Parkhurst et al., 2013;
Schafer et al., 2012; Truman et al., 2008; Ueno et al., 2013). All these processes are necessary
for proper neuronal circuits’ formation and their resulting physiological functions. Microglial
phenotype and functions during development are extremely sensitive to their surrounding
micro-environment, including the interactions with neuronal and glial cells which produce
signaling factors (e.g. fractalkine, adenosine triphosphate (ATP), complement cascade, brain
derived neurotrophic factor; BDNF) to orchestrate the diverse neuronal processes mentioned
before (see (Harry and Kraft, 2012; Mosser et al., 2017; Paolicelli and Ferretti, 2017; Wolf
et al., 2017) for a complete review). Microglia are also influenced by the endocrine system,
but the precise actions have not yet been well explored (Gómez-González and Escobar, 2010;
Ock et al., 2006; Tanaka et al., 1997).

THs are essential for normal CNS development (Ahmed et al., 2008; Moog et al.,
2017; Morreale de Escobar et al., 2004; Schroeder and Privalsky, 2014). Thyroxine (T4;
3,5,3′,5′-tetraiodothyronine) and triiodothyronine (T3; 3,5,3′-triiodothyronine) are the most
important THs. They regulate many aspects of brain development, which do not only concern
neuronal growth and migration, but also glial cells development and differentiation (Lima et
al., 2001). THs can act through their nuclear receptors (TRs), modulating the cell’s
mechanisms by a slow genomic effect, or they can deploy their effects via a plasma-
membrane receptor inducing fast non-genomic signaling (Davis et al., 2016a; Kalyanaraman

163
et al., 2014). Microglia express TRs in vitro and they could also respond to the non-genomic
signalisation (Lima et al., 2001; Mori et al., 2015). The influence of THs on microglial
phenotype has been demonstrated on fixed brains from postnatal rodent. Perinatal anti-
thyroid treatment (4-methyl-2-thiouracil; MTU) delayed extension of cell processes and
decreased the density of cell bodies in cortical and subcortical forebrain regions during the
first three postnatal weeks of life (Lima et al., 2001). Recently, T3 exposure was shown to
increase microglial migration and phagocytosis and modify its morphology in postnatal
rodent primary cell culture from cortical regions (Mori et al., 2015). While these results
reveal a strong influence of THs on microglial activity, the studies were performed
exclusively on higher brain regions such as the cortex and hippocampus. Given that the
composition of the milieu surrounding microglia differs across the CNS, it is plausible that
microglial cells from more caudal brain regions behave differently but to the best of our
knowledge; this hypothesis is yet to be tested. This is an important issue considering that the
brainstem contains neural networks regulating vital homeostatic functions (e.g. respiratory
and cardiovascular control). Delayed or abnormal development of these neural networks is a
major cause of morbidity and hospitalization in newborn and has been associated with apnea
of prematurity (AoP) and sudden infant death syndrome (SIDS). With that in mind, the
objectives of this study are to 1) determine if microglia originating from the brainstem are
responsive to T3, and 2) evaluate if these effects differ in the presence of neurons, which can
release signalling molecules in the micro-environment surrounding microglia. With the help
of microglial cells culture from newborn mice, we measured microglial cell motility and
phagocytosis in the presence of T3. In addition, the influence of T3 on microglial functions
was compared between regions of the brain (cortex versus brainstem) and neuronal presence
(microglial single-culture versus co-culture of microglia and neurons).

164
3.4 Material and methods

3.4.1 Ethical approval of animal experiments

The study was approved by the Animal Research Committee of Kyushu University
and carried out in accordance with the National Institutes of Health Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals. Experimental procedures were based on the Guidelines of the
Committee for Animal Care and Use of Kyushu University. C57BL/6J mice (SLC,
Hamamatsu, Shizuoka, Japan) were maintained in standard laboratory conditions (23±1°C,
12:12-h dark-light cycle: lights on at 7:00 and off at 19:00); the access to food and water was
ad libitum during gestation.

3.4.2 Cell culture

Murine primary neurons cultured from the cortex and brainstem (pons + medulla
oblongata) were obtained at embryonic day 15–16 (F15-16) C57/BL6J mice brains. Cortex
and brainstem were isolated, meninges were withdrawn and tissue was minced with a scalpel
in neurobasal medium (Gibco, Tokyo, Japan). It was then exposed to 0.25 % Trypsin-
EDTA/DNase (0.06 mg/ml) for 10 minutes at 37°C. Fetal bovine serum (FBS, 100 µl/ml;
Hyclone Laboratories, UT, USA) was added to stop trypsin reaction and cells were
dissociated/filtered in neurobasal medium using a cell strainer (40 µm Nylon; BD Falcon,
Osaka, Japan). Average number of cells was counted and dissociated neuronal cells were
seeded into 6 wells plate (Thermo Fisher Scientific, Suzhou, China) at different
concentrations (2 x 105 or 106 cells/ml). Neuronal concentrations are referred in the text as
high neuronal density (HND; 106 cells/ml) and low neuronal density (LND; 2 x 105 cells/ml).
HND could not be performed with brainstem tissue as the volume of the cells was
insufficient. Neuronal cells were incubated in neurobasal medium with B-27 supplement
(Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan) and maintained at 37°C in 10% CO2/ 90% air with
humidity for 10 days. Medium was changed once a week.

165
 Murine microglial cells were isolated from the mixed glial cultures of brainstem (pons
+ medulla oblongata) and cortex from postnatal day 3 C57BL/6 mice brains, as described
previously (Mori et al., 2015). Briefly, mouse pups were anesthetized and cortex and
brainstem were isolated from the animal. Meninges were withdrawn and tissue was minced
with a scalpel in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Nissui, Tokyo, Japan).
Tissue was exposed to 0.25 % Trypsin-EDTA/DNase (0.1 mg/ml) for 3 minutes at 37°C.
FBS (100 µl/ml) was added to stop Trypsin reaction and cells were dissociated/filtered in
DMEM using a cell strainer (70 µm Nylon; BD Falcon, Osaka, Japan). Mixed glial cells were
seeded into 300 cm2 plastic flasks (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark) and
cultured for 13 days in DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.2% D-
glucose, 5 µg/ml insulin, 0.37% NaHCO3, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Medium was changed every 5 days and flasks were maintained at 37°C in 5% CO2/ 90% air
with humidity. Following incubation, microglial cells were separated from the underlying
astrocytic layer by gently shaking the flask (125 rpm) for 3 hours at 37°C in a shaker
incubator. Microglia were then isolated as strongly adhering cells after unattached cells were
removed. This technique as proven to create a culture of microglia with 98% purity (Mori et
al., 2015).

Following isolation of microglia, microglial cells were plated alone in 6 wells plates
(single-culture; 1-3x104 cells/ml) or with corresponding neuronal cells previously described
(co-culture; 2-10 x104 cells/ml). When microglial cells were co-cultured with neurons,
medium’s ratio was as followed: 10% microglial medium + 90% neurobasal medium. Single-
and co-cultures were pre-cultured for 2 days before the experiments were performed.
Microglia for single- and co-cultures resulted from 8-10 foetus/newborn mice each. Cerebral
and brainstem tissues from newborn mice were pooled together to increase cells density
considering the small amount of tissue collected on each animal. Males and females were not
differentiated for cell culture as sex specific effects were not considered in this study.

166
3.4.3 Motility assay

Tracking of microglial cells movements was performed on brainstem single- and co-
cultures and cortex co-cultures at 15 days in vitro (DIV). Twenty minutes before recording,
cultures were incubated with T3 (1 µM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) or the same amount
of vehicle (PBS, control). Six-well plates were inserted in the incubator of the Keyence All-
in-One fluorescence microscope (BZ-X700; Keyence, Osaka, Japan), where the condition
was kept under 5% CO2/90% air with humidity at 37°C. Real-time recordings were then
performed for 3 hours in all 6 wells automatically. Multiple points containing microglia in
each well were set, the images were taken every 10 minutes, and combined into one video
each. Tracking of microglial cells movements was performed using the VW-9000 motion
analyzer (Keyence, Osaka, Japan). The sum of the movements was calculated by adding both
horizontal and vertical components over the full 3 hours period.

3.4.4 Phagocytosis assay

Analysis of phagocytosis was performed in brainstem single-cultured microglia at 15

DIV. Cultures were pre-incubated with 54 µg/ml Dextran Rhodamine B, 10 000 MW,
Neutral (red; Thermo Fisher Scientific, Yokohama, Japan) in DMEM for 1h followed by
incubation with or without T3 (1 µM) for 3h. The cells were then fixed by 4% PFA,
permeabilized with 0.1% Triton X-100 and treated with blocking solution (Block Ace;
Dainippon Pharmaceutical, Japan). Cells were subsequently labelled with a primary antibody
against microglia (rabbit anti-mouse Iba-1, 1: 2000 in 10% block ace; Wako Pure Chemical
Industries, Japan) overnight at 4°C, then with the Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit
IgG (green, 1:1000; Molecular Probes, OR, USA) for 3 hours at 18°C. DAPI (blue, 300 nM;
Molecular Probes, OR, USA) was applied finally for 5 minutes at 18°C. Images were
examined with a Keyence All-in-One fluorescence microscope (BIOREVO BZ-9000).
Analysis of each phagocytic cell was performed by evaluation of Dextran Rhodamine B
fluorescence intensity (average arbitrary units/area; R mean/µm2) using the BZ-X Analyzer
software (Keyence, Osaka Japan).

167
3.4.5 Statistical analysis

Number of experimental replicates represents the number of wells evaluated as each

cell movement or phagocytosis was evaluated individually and the sum of all cells was
averaged according to their respective well. Numbers of replicates ranges between 7 to 11
for the motility assay and 15 to 22 for the phagocytosis assay.

The data were first analyzed using a one way ANOVA for the effect of brain region,
neuronal density on microglial movements and the effect of T3 on phagocytosis. Two-way
ANOVA were then used for the effect of T3 on microglial movements, factors being brain
region or culture type. When ANOVA results indicated that a factor was significant (p <
0.05), a Fisher’s least significant difference test was performed for post hoc analysis.
Statistical analyses were performed using StatView 5.0 (SAS Institute, Toronto, ON,
Canada). Data are reported as mean ± standard deviation (SD). ANOVA results are mainly
reported in the text and results from post hoc tests are represented by symbols in the figures.

3.5 Results

3.5.1 Influence of T3 on microglial motility is dependent on the micro-

environment.

Co-cultures of microglia with neurons from cortex and brainstem used for real time
recordings of microglial motility are presented in figure 42A-C. Movements of microglia in
co-culture differ between the brain regions as they were increased in the cortex compared to
the brainstem (Brain region effect; P = 0.0002; F(1,14) = 24.44) (Figure 42D). This effect was
not related to the density of neuronal cells since an increase in neuronal density did not affect
cortex microglial motility (Neuronal density effect; P = 0.52; F(1,15) = 0.44) (Figure 42D).
Addition of T3 increased microglial movements compared to controls in co-cultures of cortex
with HND (156%) and cortex with LND (144%) (T3 effect; P = 0.0028; F(1,31) = 10.57)
(Figure 42E). In the brainstem, the presence of neurons in the culture augmented microglial

168
motility in response to T3 (416%) (T3 effect; P = 0.0041; F(1,16) = 11.17). T3 did not increase
microglial motility in the single-cultured microglia (Culture effect; P = 0.10; F(1,28) = 2.873)
(Factorial interaction T3 x culture effect; P = 0.0033; F(1,28) = 10.30) (Figure 42F). Brainstem
microglia show a strong response to T3 in co-culture, but this tendency is not significantly
bigger than the response from the cortex (Factorial interaction T3 x brain region effect; P =
0.21; F(1,31) = 1.634).

169
Figure 42. T3-induced motility in primary cultured microglia from cortex and
brainstem. Live imaging of microglial motility in co-culture (microglia + neurons) from A)
cortex with high neuronal density (HND), B) cortex with low neuronal density (LND) and
C) brainstem with LND, under control conditions (DMEM alone). D) Total microglial
movements in cortex and brainstem co-culture after 3h of exposure in control conditions.
Neuronal density was compared in cortex region only (HND versus LND). E) Total
microglial movements in cortex co-culture (HND and LND) after 3 hours of exposure to
DMEM with or without T3 (1 µM). F) Total brainstem microglial movements in single-
culture (microglia) and co-culture (microglia + neurons) after 3 hours of incubation with or
without T3 (1 µM). Data show means ± SD. * Significantly different from control group (P
< 0.05); # Significantly different from brainstem LND (P < 0.05).

170
3.5.2 T3 increases phagocytosis in the single-cultured microglia from
brainstem.

Fluorescence-images of single-cultured microglia isolated from brainstem after 3

hours incubation with or without T3 are presented in figure 43A-B. Exposure of brainstem
microglial single-culture to T3 for 3 hours did not affect the percentage of microglial cells
that engulfed foreign molecule Dextran Rhodamine B (T3 effect; P = 0.59; F(1,35) = 0.290)
(Figure 43C). The phagocytic activity of each microglial cell was, however, significantly
increased by T3 as depicted by the fluorescence intensity of Dextran Rhodamine B engulfed
(T3 effect; P = 0.032; F(1,35) = 4.98) (Figure 43D).

171
Figure 43. T3 increases phagocytosis of single-cultured microglia in the brainstem.
Fluorescence-images of single-cultured microglia isolated from brainstem after 3 hours
incubation without T3 (control) (A) or with T3 (1 µM) (B). Dextran-Rhodamine B (red), Iba-
1 (microglia, green), and DAPI (blue) are shown. C) No difference in the percentage of
phagocytic microglial cells after 3 hours of incubation with or without T3 (1 µM). D)
Fluorescence intensity of Dextran Rhodamine B engulfed by microglia after 3 hours of
incubation with or without T3 (1 µM). Data are shown as means ± SD. * Significantly
different from control group (P < 0.05).

172
3.6 Discussion

With the help of primary microglial cells culture, this study is the first documentation
of microglial functions in response to T3 in a lower region of the brain, the brainstem. Here,
we show that T3 exposure increases microglial motility in the brainstem and this effect
requires the presence of neurons, thereby indicating that the surrounding micro-environment
is the key to this mechanism. This contrasts with the microglial phagocytic activity which
can be potentiated despite the absence of the neurons. These data are consistent with the
notion that microglial cells are important effectors of T3’s actions on brain development; the
strong motility and phagocytic responses observed in the brainstem support a role in the
development of the vital networks contained within this area during the early life.

3.6.1 Microglial motility in the brain is region dependent.

Microglial motility in control conditions differed between the two brain regions used
in this study. This was once demonstrated previously (Gómez-González and Escobar, 2010),
where microglial density at postnatal day 1, potentially linked to microglial
migration/motility, was different between many regions of the CNS including cortex and
brainstem. This result is in line with the fact that spatio-temporal development differs
between each brain region and indicates that region-specific pattern of microglial activity
likely contributes to this process during gestation and following birth. In this study,
microglial motility in control conditions was lower in brainstem region compared to cortex.
Neuronal cells activity in each specific environment could explain this result, but this
hypothesis remains to be tested. Microglial motility can be guided by multiple
chemoattracting molecules, guiding cues or neuronal factors, which gradient is specific to
each CNS region (Arnò et al., 2014; Hoshiko et al., 2012; Lelli et al., 2013; Rezaie et al.,
2002).

173
3.6.2 Direct microglial response to T3: assessment of motility according to
the micro-environment.

Overall, in co-cultures of neurons and microglia, T3 supported microglial motility in

both brain regions regardless of neuronal density, with a great increase in the brainstem
region. This result is the same as the previous data from the literature showing a strong
sensitivity of microglial cells in the brainstem region to glucocorticoids, which are also
powerful modulators of CNS development (Gómez-González and Escobar, 2010). The signal
cascades of T3-induced microglial motility are numerous and include GABAergic signaling
which is highly dependent on THs modulation during CNS development (Mori et al., 2015;
Sawano et al., 2013). This high sensitivity of microglial functions to THs could be important
for the onset of several homeostatic processes. Amongst those, recent data pointing to a key
role of microglia in the postnatal development of the pre-Bötzinger complex, a notorious
respiratory rhythmogenic nucleus, is worth highlighting (Lorea-Hernández et al., 2016).

Using primary cultured microglia from brainstem, presence of neurons was necessary
for the T3-induced microglial motility. This is interesting as it differs from previous study
where cortical microglia responded to T3 in the absence of neuronal cells in the culture (Mori
et al., 2015). This once again shows the difference in the brain regions. Neuron-glial
communication could modify microglial activity in the brainstem. Interestingly, THs
influence interactions between microglia and neurons by a modulation of signaling factors
such as fractalkine (CX3CL1). T3 stimulates CX3CL1 expression by neurons, which in turn
attracts and activates microglia via the CX3CR1 receptor (Davis et al., 2016b).

3.6.3 The effect of T3 on microglial phagocytosis involves specific

mechanisms

Microglial phagocytosis has a significant role in CNS homeostasis, development and

innate immunity. Engulfment of Dextran beads by microglia cultured alone was increased by
T3 exposure. Though the number of cells that take up dextran beads did not change with T3

174
treatment, each cell phagocytosis was increased with unknown mechanisms. Microglial cells
seem to react individually to T3 exposure, a response potentially linked to their mechanisms
of THs transport into the cell and binding to nuclear TRs or nongenomic receptors in the
plasma membrane, mitochondria or cytoplasm (Davis et al., 2016a).

Experiments were performed solely on brainstem single-cultured microglia as

motility and phagocytosis from cortex microglia had already been investigated (Mori et al.,
2015). Moreover, examination of microglial phagocytosis in co-culture with neuronal cells
in both brain regions was omitted in this study. It remains unclear how neurons would
interfere with microglial engulfment of Dextran molecule, which may be studied in the future
if necessary.

3.7 Conclusion

Physiologically, T3 facilitates microglial functions that are important for the fine
tuning of synaptic activity during development. THs are essential for proper brain
development and the high sensitivity of microglia could be beneficial for brainstem’s neural
circuits to ensure that vital homeostatic function are fully functional at birth. Understanding
the mechanisms by which these cells influence brainstem development is an important step
towards the development of new approaches to alleviate mortality and morbidity in
newborns, especially those born pre-term.

175
Acknowledgements: The authors thank Mr. Tomoya Matsumoto (Keyence Corporation,
Osaka, Japan) for technical advices with the All-in-one Fluorescence Microscope BZ-X700.
We also thank Mr. Kota Kitazono, Mr. Yusaku Yoshioka, Ms. Miki Yamamoto for helping
experiments, especially cell culture.

Funding: This work was supported by Grants-in Aid for Scientific Research of Japan Society
for Promotion of Science, and also partly supported by Research Support Center, Graduate
School of Medical Sciences, Kyushu University. JP Rousseau’s visit to Kyushu University
was supported by an award from the Respiratory Health Network of the Fonds de Recherche
en Santé du Québec. R. Kinkead and JP Rousseau were supported by Natural Sciences and
Engineering Research Council (NSERC) of Canada (RGPIN-2016-05848 and PGSD3-
490022-2016).

Conflicts of interest: The authors declare that they have no conflict of interest

176
 Partie 3

Discussion / conclusion générale

1. Principaux résultats

L’objectif général de cette thèse était de décrire le rôle des hormones thyroïdiennes
en période périnatale sur la régulation de la commande cardio-respiratoire du rongeur
nouveau-né et observer leurs effets sur les paramètres ventilatoires et cardiovasculaires.

Les résultats du chapitre 1 démontrent que la déficience en hormones thyroïdiennes

au cours de la période périnatale retarde le développement du réseau de contrôle respiratoire
et produit chez l’animal entier une hypoventilation par ses effets potentiellement centraux et
périphériques. Les effets se font remarquer dès les premiers jours de vies (P1-P4) et une
supplémentation en L-T4 suite à la naissance ne peut récupérer qu’une partie des fonctions
centrales de la commande respiratoire. Les traitements pharmacologiques utilisés dans cette
étude suggèrent qu’une sensibilité élevée du système respiratoire à l’activité GABAergique
pourrait être en cause des conséquences observées.

Le chapitre 2 révèle que les effets négatifs d’une déficience en hormones

thyroïdiennes sur le système cardio-respiratoire sont encore présents chez des animaux plus
âgés (15 jours de vie) si le traitement anti-thyroïdien est maintenu jusqu’à cet âge. Les
conséquences varient cependant avec l’âge puisque la ventilation de l’animal au repos n’était
pas affectée par le traitement de MMI. Les effets ont plutôt été représentés par des animaux
incapables de répondre adéquatement à une stimulation respiratoire (hypoxie ; FiO2=0.12).
De plus ces derniers présentent une importante inhibition du système cardio-respiratoire
lorsqu’ils sont anesthésiés, une condition où l’organisme est dépourvu de l’excitation fournie
par l’état d’éveil. Encore une fois, les études pharmacologiques dans ce chapitre portent à
croire que le système GABAergique est affecté par la déficience en hormones thyroïdiennes
et augmente l’inhibition respiratoire de l’animal traité au MMI.

177
 Finalement, avec l’aide de la culture primaire de microglies, le chapitre 3 révèle pour
la première fois l’activité microgliale en présence de l’hormone thyroïdienne T3 dans le tronc
cérébral. Cette région contrôle entre autres les fonctions cardiovasculaires et respiratoires.
De manière générale, la T3 augmente les fonctions des microglies (motilité et phagocytose)
et le tout dépend du micro-environnement qu’elles occupent.

2. Précisions méthodologiques et limites des études

2.1 L’hypothyroïdisme expérimental par exposition à l’agent anti-

thyroïdien méthimazole

Une critique de notre modèle d’hypothyroïdisme expérimental a déjà été initiée dans
les chapitres 1 et 2, mais cette dernière mérite d’être développée ici. L’utilisation d’un agent
anti-thyroïdien, dans ce cas-ci le méthimazole (MMI) est préférable aux autres procédures
utilisées dans le domaine. L’ablation de la glande thyroïde par chirurgie assure un coupure
décisive de la production d’hormones thyroïdiennes par la mère, mais cette technique est
invasive et entraîne des effets secondaires par l’absence des cellules para-folliculaires
(Argumedo et al., 2012). L’injection de molécule radioactive chez la femelle gestante afin de
d’endommager la glande thyroïde du fœtus peut aussi être utilisée, mais implique
d’importantes démarches pour acquérir et manipuler l’Iode 131 (I131) et entraîne les mêmes
effets secondaires que l’ablation chirurgicale (Argumedo et al., 2012). Enfin, la réduction
d’iode dans la diète de la femelle gestante permet d’obtenir des résultats fiables avec peu de
manipulation de la femelle ou du fœtus, mais la nourriture est très dispendieuse (Argumedo
et al., 2012). L’utilisation d’un agent anti-thyroïdien (PTU ou MMI) assure la coupure fiable
de production d’hormones thyroïdiennes de la mère et du fœtus tout en étant non invasive,
peu dispendieuse et très facile à effectuer. Leur utilisation présente un désavantage qui est
principalement technique. Le produit peut facilement traverser la peau et les muqueuses,
nécessitant des précautions lors de sa manipulation. Le PTU permet une réduction plus
modérée des niveaux d’hormones thyroïdiennes puisqu’il traverse la barrière du placenta et
du sein plus difficilement que le MMI (Hasebe et al., 2008). Le MMI est alors un excellent

178
traitement pour diminuer considérablement les niveaux d’hormones thyroïdiennes
disponibles au cours du développement, d’où l’utilisation de cette technique dans nos études.

Comme il est mentionné dans le chapitre 2, le traitement de MMI sur le statut

thyroïdien de la mère démontre des effets modérés alors que son impact semble bien plus
important lorsque nous évaluons les niveaux de T4 libre du raton nouveau-né. Pour le
moment, aucune étude n’a encore déterminé l’effet des hormones thyroïdiennes sur le
développement du réseau neuronal contrôlant la respiration. La majorité des études reliant
les hormones thyroïdiennes au contrôle de la respiration ont été effectuées sur des adultes
(Schlenker, 2012). Notre but ici était d’évaluer l’effet d’une indisponibilité presque totale
d’hormones thyroïdiennes pour le cerveau fœtal dans le développement et ainsi augmenter
les chances d’observer les conséquences sur l’organisme. Ceci explique aussi le protocole
d’hypothyroïdisme expérimental qui s’étend du premier jour de gestation jusqu’à l’utilisation
du raton suite à la naissance afin de s’assurer qu’il ait un minimum de contact avec les
hormones thyroïdiennes de toute source possible. Ce protocole peut sembler intense, mais il
n’est pas si distant d’une réalité observée en unité néonatale. L’hypothyroïdisme maternel
provoque une absence de transfert des hormones thyroïdiennes maternelles vers le fœtus
jusqu’à la mise en marche de la glande thyroïde de ce dernier (Moog et al., 2017). Ce manque
d’hormones thyroïdiennes maternelles crée un axe HPT dysfonctionnel chez le fœtus et
augmente les chances de naissances prématurées (Ozdemir et al., 2013). Finalement, les
enfants nés prématurément sont incapable d’engendrer la monté d’hormones thyroïdiennes
habituellement observée à la naissance (Biswas et al., 2002). Le tout résulte en une absence
marquée d’hormones thyroïdiennes pour le fœtus/nouveau-né en phase précoce du
développement, similaire à notre protocole expérimental.

Selon les normes du domaine d’endocrinologie pédiatrique (Société Européenne

d’Endocrinologie Pédiatrique; ESPE), l’hypothyroïdisme expérimental induit chez nos
rongeurs nouveau-nés serait très profond. Les études cliniques sur nouveau-nés humains
affirment qu’un hypothyroïdisme est jugé sévère lorsque les niveaux de T4 libre sont
inférieurs à 5 pmol/L et modéré avec des niveaux inférieurs à 10 pmol/L (Zwaveling-
Soonawala et al., 2015). La comparaison des niveaux de T4 libre chez le rat avec ceux des
humains provenant d’études cliniques sur l’hypothyroïdisme doit cependant être faite avec

179
précaution. Les niveaux de T4 libre enregistrés chez les ratons nés de femelles témoins et
âgés de 1 et 4 jours de vie sont inférieurs à 10 pmol/L. Les niveaux de T4 libre observés chez
des animaux provenant de mères traités au MMI peuvent alors sembler très faibles selon les
normes de l’ESPE, mais la différence est potentiellement plus modérée. Malgré tout, les très
faibles niveaux de T4 libre enregistrés chez les ratons suite au traitement MMI ainsi que les
effets physiologiques observés dans les chapitres 1 et 2 démontrent une action significative
du traitement sur l’organisme du rongeur nouveau-né. Les données d’études cliniques sur des
humains ne peuvent bien sûr être ignorées dans l’interprétation des résultats de cette thèse.
L’objectif principal reste cependant de tester si le principe théorique de déficience périnatale
en hormones thyroïdiennes a des conséquences réelles sur le développement et la
fonctionnalité du système respiratoire. Ultimement, ces données fondamentales seront la base
d’études visant à déterminer l’applicabilité de ce principe en clinique.

2.2 L’utilisation de la pléthysmographie sur l’animal entier

La pléthysmographie sur animal entier permet d’évaluer la ventilation (𝑉̇ E) de

l’animal de façon non invasive par l’enregistrement de ses paramètres respiratoires
(fréquence respiratoire : fR et volume courant : VT). La technique a été utilisée dans les
chapitres 1 et 2. Le principe général de cette technique d’enregistrement veut que l’animal
placé dans une chambre fermée hermétiquement produise des mouvements ventilatoires à un
rythme donné, qui provoquent des variations de pression dans la chambre. À l’inspiration,
un volume d’air entre dans les poumons pour être chauffé et saturé en vapeur d’eau, passant
ainsi des conditions de la chambre aux conditions du corps. Lors de l’expiration, l’air se
refroidit et une partie de la vapeur d’eau est condensée. Ces changements de température et
de vapeur d’eau engendrent une variation de pression qui est mesurable par un capteur de
pression (Drorbaugh and Fenn, 1955). Dans notre cas, le système utilisé n’est pas fermé
hermétiquement. Plutôt que d’enregistrer un changement de volume, la méthode permet de
déterminer le débit d’air sortant de la chambre. Ce signal est intégré pour déterminer le
volume. La mesure du volume courant par cette approche est souvent considérée comme une
valeur qualitative plutôt que quantitative de la respiration. Malgré cette limitation, il est

180
déterminé que la technique de pléthysmographie demeure la meilleure façon de mesurer
l’activité respiratoire sur un animal non restreint et non anesthésié (Niane and Bairam, 2011).
D’autres procédures pour l’enregistrement de l’activité respiratoire demandent que l’animal
soit anesthésié, ce qui ne reflète pas l’état naturel de l’animal (Lim et al., 2014). Certaines
vont aussi restreindre l’animal dans la chambre et créer ainsi des conditions stressantes qui
peuvent influencer la respiration.

2.3 Le modèle expérimental d’enregistrements électrophysiologiques sur

préparations de tronc cérébral-moelle épinière isolés

La préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés a tout d’abord été développée

sur un modèle de poisson rouge en 1931 pour ensuite être adaptée vers le modèle mammifère,
plus précisément le rongeur, dans les années 1980 (Adrian and Buytendijk, 1931; Suzue,
1984). Ce modèle expérimental est utilisé dans le cadre de l’étude qui constitue le chapitre
1. Brièvement, la méthode permet d’observer une respiration dite «fictive» qui est en fait le
signal correspondant à l’activité inspiratoire neuronale, produite par le réseau respiratoire.
Cette activité est captée grâce à l’enregistrement des influx nerveux provenant entre autres
du nerf cervical C4 (nerf phrénique) représentant le signal dirigé vers le diaphragme pour
enclencher sa contraction. Cette activité peut aussi être mesurée en utilisant la racine de
l’hypoglosse (XII) et/ou le nerf cervical C1 relié à l’hypoglosse, qui innerve les muscles de
la langue (Suzue, 1984). La technique peut aussi être effectuée de façon simultanée avec un
enregistrement sur cellule entière sur la face rostrale de la préparation afin de visualiser le
signal du réseau respiratoire ainsi que l’activité d’une cellule particulière (Arata, 2009).

181
Figure 44. Représentation schématique du système d’enregistrement in-vitro sur
préparation de tronc cérébral-moelle épinière isolés. Le liquide céphalorachidien artificiel
est oxygéné (95% O2 / 5% CO2) et réchauffé tout en étant envoyé par un pompe dans la
chambre d’enregistrement. Le liquide céphalorachidien en excès est aspiré par la pompe et
éliminé. La chambre d’enregistrement est reliée au sol et au contrôleur de température. La
sortie de l’électrode est directement reliée à l’amplificateur et l’intégrateur, puis au système
d’acquisition de données et finalement à l’ordinateur. Tiré de (Rousseau and Caravagna,
2015)

Ce type de préparation peut être utilisé pour répondre à un nombre important de

questions ciblant les variations respiratoires face à l’environnement qui change ou en réponse
à la modification pharmacologique du milieu (Caravagna et al., 2014; Fournier et al., 2013).
La technique fournit aussi un accès direct aux éléments du réseau respiratoire du tronc
cérébral, difficilement atteignables en condition in-vivo. Elle permet d’enregistrer un signal
respiratoire qui n’est pas influencé par les afférences périphériques des poumons et des corps
carotidiens (Ballanyi et al., 1999). La préparation utilisée dans l’étude constituant le chapitre
1 de cette thèse est dépourvue des régions rostrales à la moelle allongée. Le pont ainsi que
les régions mésencéphaliques et diencéphaliques peuvent être conservées afin de déterminer
leur influence sur la commande respiratoire (Hilaire et al., 2004; Voituron et al., 2005). Il
peut être bénéfique dans le cadre d’une étude, de comparer l’activité du réseau respiratoire
en présence ou non des noyaux pontiques puisqu’ils possèdent une influence inhibitrice sur
la génération du rythme respiratoire (Caravagna et al., 2014). Afin d’éviter le retrait

182
chirurgical complet d’une région d’intérêt, il est aussi possible de compartimenter la
préparation dans la chambre d’enregistrement et ainsi pourvoir observer l’effet de différentes
température, pH ou drogues sur l’activité de noyaux respiratoires isolés (Onimaru et al.,
1997; Suzue, 1984).

Certains inconvénients accompagnent cependant l’utilisation du tronc cérébral-

moelle épinière isolés. Les expériences sont effectuées à température inférieure à celle du
corps (26°C comparativement à 34°C), avec des concentrations plus élevées de glucose et
d’O2 dans le liquide céphalorachidien artificiel (Suzue, 1984). De plus, la technique ne peut
être utilisée sur des animaux plus vieux que 4 jours de vie, limitant l’observation de la
respiration fictive à des jeunes stades développementaux. Finalement, l’enregistrement ne
peut s’étendre sur plus de 7 heures avant la perte de vitalité de la préparation, ce qui empêche
l’utilisation de cette technique pour des protocoles à long terme (Suzue, 1984). Le tout
soulève ainsi des inquiétudes sur la pertinence du signal enregistré (Rousseau and Caravagna,
2015). La fréquence du rythme inspiratoire est effectivement différente entre les conditions
in-vitro et in-vivo, mais le fait reste que nous enregistrons sur cette préparation un rythme
respiratoire robuste, provenant des noyaux respiratoires reliés à des fonctions homéostatiques
vitales (Ballanyi et al., 1999). Il est souvent préférable d’effectuer l’enregistrement du rythme
respiratoire généré in-vitro de façon complémentaire à la respiration in-vivo par
pléthysmographie sur animal entier afin d’avoir un vue d’ensemble de l’activité du réseau
respiratoire.

2.4 Évaluation des niveaux de protéines du système GABAergique sur

moelle allongée entière

L’évaluation des niveaux de protéines reliées à l’activité du système GABAergique

dans le chapitre 1 a été effectuée sur des moelles allongées entières. Ces résultats sont
pertinents puisqu’ils démontrent comment la réponse du réseau neuronal à l’activité
GABAergique dans notre modèle d’hypothyroïdisme expérimental peut être expliquée par
une modification du phénotype des récepteurs GABAA dans l’environnement de la moelle

183
allongée. Cependant, ils ne nous permettent pas de déterminer si cette modification des
récepteurs GABAA est spécifique à certains noyaux respiratoires ou si elle est distribuée
aléatoirement dans la moelle allongée. De plus, la technique reste qualitative. Une
quantification de l’ARNm par hybridation in-situ de la sous-unité α1 du récepteur GABAA
sur des tranches fixées de tronc cérébral permettrait d’élucider cette question. Cette
quantification pourrait aussi être fait pour l’expression des co-transporteurs NKCC1 et KCC2
afin de s’assurer que l’absence de différence entre nos groupes témoins et traités au MMI ne
soit pas due à l’expression diffuse à travers la moelle allongée.

3. Les hormones thyroïdiennes et le réseau neuronal de contrôle

respiratoire

3.1 Les hormones thyroïdiennes ont-elles un effet sur le développement

des noyaux respiratoires du tronc cérébral?

Il existe à ce jour très peu d’études qui ont évaluées les niveaux d’hormones
thyroïdiennes T4 et T3 dans le tronc cérébral et aucune ne s’est attardée sur leur présence
dans les différents noyaux respiratoires. Il a été démontré à partir de cerveau fœtaux humains
que la T4 et T3 sont toutes deux présentes dans le tronc cérébral (Kester et al., 2004).
L’iodothyronine déiodinase D2 est aussi retrouvée dans le tronc cérébral, ce qui démontre la
conversion locale de la T4 en T3 dans cette région (Kester et al., 2004). Une étude sur
cerveaux de rats adultes a permis d’observer la présence de sites de liaison de la T3 dans le
tronc cérébral, ce qui renforce l’hypothèse d’une action spécifique des hormones
thyroïdiennes dans cette région (Puymirat, 1992). Dans le cadre de cette thèse, la détection
dans le tronc cérébral des niveaux d’hormones thyroïdiennes et des enzymes ou récepteurs
participant à leur activité aurait bien sûr été bénéfique pour concrétiser les résultats présentés.
Une étude neuroanatomique détaillée de la localisation des différents types de récepteurs
serait aussi souhaitable et permettrait de mieux cibler les régions potentiellement affectées
par la carence en hormones thyroïdiennes. Cette étude pourrait aussi permettre d’identifier si

184
les effets ont lieu sur les neurones ou cellules gliales. Cependant, savoir que les hormones
thyroïdiennes ainsi que leur site de liaison sont présents dans le tronc cérébral était assez pour
nous convaincre d’un potentiel effet de ces dernières dans le développement du réseau de
contrôle respiratoire. Leur impact sur le développement de la commande respiratoire avait
déjà été démontré à partir d’un modèle amphibien par notre équipe et les procédés de
régulation par les hormones thyroïdiennes sont amplement conservés à travers l’évolution
(Moog et al., 2017; Rousseau et al., 2016a).

Le traitement anti-thyroïdien utilisé ici affecte le développement de l’animal entier au

cours de la gestation. Les répercussions sur le système respiratoire peuvent autant être
périphériques (e.g. effet sur les muscles respiratoires, les poumons et les corps carotidiens)
que centrale (e.g. effet sur les générateurs de rythme respiratoire). Les résultats provenant
des études présentées dans cette thèse confirment cependant le rôle potentiel des hormones
thyroïdiennes dans le développement du réseau respiratoire. L’utilisation de la préparation
de tronc cérébral-moelle épinière isolés démontre que la commande centrale dans la
génération du rythme respiratoire est réduite par l’absence d’hormones thyroïdiennes et
augmentée suite à la supplémentation en L-T4. La modification de ce rythme respiratoire
fictif représente l’effet potentiel sur le préBötC, principal générateur de rythme, mais aussi
sur les noyaux qui influencent son activité (PiCo, pFL, BötC, Raphé) (Ballanyi et al., 1999;
Del Negro et al., 2018). La situation est similaire pour les effets du traitement anti-thyroïdien
sur les fonctions du système cardio-respiratoire. Ce dernier est amplement inhibé suite à la
déficience en hormones thyroïdiennes avec un rythme cardiaque et une saturation en O2 plus
faibles ainsi que des apnées plus profondes suite à la stimulation du CRL. La région caudale
du NTS, le DMNV et le noyau ambigu sont des potentiels noyaux influencés par les
hormones thyroïdiennes tel que discuté dans le chapitre 2. La forte réaction à l’activité
GABAergique dans la génération du rythme respiratoire et sur les fonctions cardio-
respiratoires laisse aussi deviner un effet des hormones thyroïdiennes sur le système
GABAergiques des noyaux respiratoires.

185
3.2 Effets dépressifs du rythme respiratoire par la déficience en hormones
thyroïdiennes : la balance excitation/inhibition en cause ?

La ventilation de base des ratons exposés au MMI pendant la gestation est réduite
comparativement aux ratons témoins dans leurs premiers jours de vie (P4). Ce résultat peut
être produit par une modification périphérique du système respiratoire de l’animal (e.g. force
des muscles respiratoire moindre, transmission neuromusculaire perturbée), mais elle peut
aussi être de source centrale. Les enregistrements sur préparation de tronc cérébral-moelle
épinière isolés supportent cette hypothèse puisque la fréquence de décharge du nerf
phrénique est aussi diminuée chez les ratons traités au MMI. La génération d’un rythme
respiratoire dépend de l’équilibre parfait entre l’activité des neurones excitateurs et
inhibiteurs. Tout déséquilibre de la balance excitation/inhibition pourrait expliquer la
réduction du rythme respiratoire observée ici. Bien que le sujet ait été abordé brièvement
dans le chapitre 1, il gagne à être détaillé dans cette section.

Excitation : Le préBötC nécessaire à la génération d’un rythme respiratoire adéquat

repose sur des interneurones excitateurs (interactions glutamatergiques) pour synchroniser
ses neurones et produire l’activité inspiratoire de l’animal (Baertsch et al., 2018). Malgré
tout, il est composé à 50% de neurones inhibiteurs qui maintiennent l’équilibre du système
respiratoire en empêchant une surexcitation du préBötC (Kuwana et al., 2006). Les neurones
glutamatergiques du préBötC exprimant le facteur DbX1 sont primordiaux pour la génération
du rythme inspiratoire. Ils sont cependant incapables de produire une décharge
immédiatement après une décharge antérieur de la population neuronale, ce qui les empêche
de produire une activité à haute fréquence (Baertsch et al., 2018; Kottick and Del Negro,
2015). Ce phénomène se nomme période réfractaire et il est présenté dans la section 2.3.3.1
de l’introduction. Brièvement, plus les neurones seront excités, plus ils auront une période
réfractaire longue. Ils seront hyperpolarisés dans la période réfractaire, ce qui augmente le
temps avant la seconde décharge. Il a été démontré qu’un rythme ponctué de périodes
réfractaires plus longues résulte en une fréquence respiratoire plus lente (Baertsch et al.,
2018). La question à poser ici est : est-ce que la déficience périnatale en hormones
thyroïdiennes augmente l’excitabilité du réseau neuronal respiratoire ? Si oui, la déficience
en hormones thyroïdiennes devrait, entre autre, augmenter les taux ou l’activité des

186
neurotransmetteurs excitateurs du SNC. Les résultats concernant l’effet des hormones
thyroïdiennes sur le glutamate divergent à travers les études sur le rat nouveau-né. Une
injection d’I131, 2 heures suite à la naissance, réduit les niveaux de glutamate dans le cerveau
entier (Ramírez de Guglielmone and Gómez, 1966). D’autre part, la supplémentation en T4
de la femelle pendant la gestation réduit les niveaux de glutamate chez le nouveau-né dans
le cervelet (Messer et al., 1989). Chez l’adulte, l’hypothyroïdisme par injection d’I131
augmente aussi les niveaux de glutamate dans le cortex (Chapa et al., 1995). La déficience
en hormones thyroïdiennes modifie aussi le système dopaminergique. Elle stimule les
récepteurs pré-synaptiques D2, ce qui augmente le relâchement du glutamate dans la fente
synaptique (Oh-Nishi et al., 2005).

Un deuxième phénomène lié à l’excitation pourrait être en cause : une incapacité de

la neurotransmission excitatrice à contrer l’inhibition. Il a été mentionné précédemment que
l’hypothyroïdisme néonatal peut réduire les niveaux de glutamate dans le cerveau. De plus,
l’effet pourrait passer par les neurones sérotoninergiques. La libération de 5-HT produit un
effet excitateur sur les CPGs du tronc cérébral et augmente le rythme respiratoire (Morin et
al., 1990). La déficience en hormones thyroïdiennes réduit la sensibilité du SNC au
neurotransmetteur 5-HT et augmente le taux de recyclage de 5-HT dans le tronc cérébral
(Cleare et al., 1995; Henley and Koehnle, 1997). Inversement, l’injection d’hormones
thyroïdiennes augmente le relâchement de 5-HT dans le cortex et l’hippocampe (Bauer and
Whybrow, 2001). Une diminution des taux de 5-HT dans le noyau du raphé par exemple
pourrait expliquer la dépression du rythme respiratoire observée dans notre modèle.

Inhibition : La majorité des résultats présentés dans les chapitres 1 et 2 de cette thèse
supportent l’hypothèse que le rythme respiratoire réduit chez les ratons traités au MMI soit
dû à une trop forte inhibition du réseau neuronal. La sensibilité de la commande respiratoire
centrale à l’activation du système GABAergique est augmentée par l’absence d’hormones
thyroïdiennes en phase périnatale. Aussi, l’inhibition cardio-respiratoire causée par le
traitement périnatal de MMI est fortement influencée par une modification de l’activité
GABAergique. L’hypothèse générale veut que l’importante sensibilité du réseau neuronal
respiratoire soit due au système GABAergique immature. Il est discuté en détails dans le
chapitre 1 que ce serait potentiellement relié à la composition du récepteur GABAA. Une

187
surexpression de la sous-unité α1 du récepteur GABAA, qui engendre une plus forte
inhibition par sa cinétique et temps de décroissance bien plus rapides, pourrait être en cause
dans notre modèle. L’effet non-génomique des hormones thyroïdiennes sur l’activité
inhibitrice du système GABAergique a été mentionné dans la section 3.6.2 de l’introduction.
Ce dernier pourrait participer à la réaction du système respiratoire en réponse au muscimol.
En effet, l’application de T3 sur des synaptoneurosomes de cortex de rat réduit le passage
intracellulaire du chlore en présence de muscimol par un mécanisme de blocage (Martin et
al., 2004). La T3 présente une forte préférence pour la sous-unité α1 du récepteur GABAA
(Chapell et al., 1998). La diminution de T3 disponible dans le cerveau provoquée par le
traitement de MMI pourrait empêcher cette action non-génomique sur le récepteur GABAA
et ainsi permettre un fort passage d’ions Cl- lorsque le système respiratoire est exposé au
muscimol. Les résultats de supplémentation en L-T4 à la naissance supportent aussi cette
théorie. La demi-vie de la T4 est d’environ 7 jours et celle de la T3, 1 jour (Jahnke et al.,
2004). Les taux de T3 dans le tronc cérébral peuvent être augmentés par la conversion locale
de T4 dans la période des enregistrements (4e jour de vie). Ils vont ainsi effectuer leur effet
non-génomique sur le canal du récepteur GABAA afin de réduire la réponse du système
neuronal de contrôle respiratoire au muscimol.

3.3 La chémoréception centrale est affectée par la déficience en hormones

thyroïdiennes

La réponse normale à l’hypoxie par la préparation de tronc cérébral-moelle épinière

isolés du nouveau-né est représentée par une diminution du rythme respiratoire. En effet, plus
de 60% des neurones respiratoires du tronc cérébral répondent par une hyperpolarisation en
hypoxie (Ballanyi et al., 1999). Cette inactivation n’est cependant pas une perturbation
pathologique de la transmission synaptique puisque les potentiels d’action et décharges du
groupe de neurones inspiratoires peuvent toujours être suscités dans ces conditions. Celle-ci
démontre plutôt un mécanisme adaptatif pour réduire la consommation d’énergie de la part
du système (Ballanyi et al., 1999). La réponse centrale à l’hypoxie est réduite chez les ratons
âgés de 4 jours et traités au MMI. Ceci suggère que l’effet inhibiteur de l’hypoxie est masqué

188
par le traitement MMI, potentiellement par son action sur le développement des régions
chémosensibles du tronc cérébral. Ces dernières se situeraient plus précisément au niveau
dorsal du pont proche du locus coeruleus et au niveau ventral proche du noyau Kölliker-Fuse
(Breen et al., 1997; Moore et al., 1996). Le canal K+ sensible à l'ATP (KATP) pourrait
participer à la dépression respiratoire observée, mais l’effet des hormones thyroïdiennes sur
ce canal reste méconnu (Mironov et al., 1998).

Il peut être surprenant de parler de chémoréception centrale sans mentionner la

réponse au CO2. En effet, l’élévation du CO2 est un stimulus majeur qui augmente
généralement la ventilation. Des neurones spécialisés, nommés chémorécepteurs centraux,
sont localisés dans certaines régions du tronc cérébral ( NTS, LC, région ventro-latérale de
la moelle allongée) (Stunden et al., 2001). Une diminution du pH intracellulaire engendrée
par le haut taux de CO2 viendrait créer l’augmentation de décharges des neurones spécialisés.
Cette notion n’a cependant pas été abordée dans le cadre de cette thèse, notion qui aurait
éclairée de façon substantielle les effets de la carence périnatale en hormones thyroïdiennes
sur les réflexes respiratoires du rongeur. Malgré tout, alors que la réponse centrale au CO2
/H+ et les réponses périphériques à O2 et CO2 sont en développement tôt après la naissance,
le préBötC peut aussi changer son rythme de décharge selon l’oxygénation centrale (Pawar
et al., 2008; Pepper et al., 1995; Stunden et al., 2001). Son influence dans la modification de
la respiration du nouveau-né selon les déviations des gaz sanguins serait plus importante que
convenu précédemment. La réponse à l’hypoxie est un bon indicateur de la maturité du
réflexe respiratoire du rongeur dont la dysfonction est reliée à certains désordres respiratoires
(e.g. SIDS).

4. L’effet d’une déficience en hormones thyroïdiennes varie

selon l’âge

À travers les études des chapitres 1 et 2 de cette thèse, certains effets âge dépendent
de la déficience en hormones thyroïdiennes ont été révélés. La ventilation de base était
affectée par la déficience en hormones thyroïdiennes dans les premiers jours de vie (P1-P4)

189
alors que l’effet disparait avec l’avancée en âge (P14-P15). Il est possible que le système
respiratoire plus mature et mieux excité puisse combler l’effet du retrait des hormones
thyroïdiennes, ce qui n’est pas le cas du système des animaux plus jeunes qui est en
développement. En effet, leur neurotransmission excitatrice est immature et serait
potentiellement incapable de combler l’inhibition profonde produite par le traitement MMI;
d’où la dépression ventilatoire en conditions de base observée aux jeunes âges (Greer et al.,
2006). Chez les animaux âgés de deux semaines, les conséquences de l’hypothyroïdisme
expérimental sont principalement observées lorsque l’animal est anesthésié. L’anesthésie
retire principalement les influences excitatrices fournies par le stade d’éveil de l’animal. Elle
peut donc déclencher les effets dépressifs du système cardio-respiratoire qui accompagnent
la déficience en hormones thyroïdiennes.

En plus des effets sur la ventilation en condition de base, la réponse à l’hypoxie de

l’animal entier change à travers le développement et l’effet des hormones thyroïdiennes sur
cette dernière aussi. Chez les nouveau-nés, l’activation de la ventilation dans les premières
minutes d’hypoxie est très subtile et la réponse se traduit principalement par une dépression
de la respiration à travers la période d’hypoxie subséquente (Hilaire and Duron, 1999). Cette
dépression ventilatoire n’est cependant pas observée tant dans les ratons témoins que les
ratons traités au MMI à leurs premiers jours de vie. Ici, le traitement au MMI n’affecte pas
la réponse ventilatoire dans les 5 dernières minutes de l’hypoxie. Nous pouvons supposer ici
que l’intensité de l’hypoxie (FiO2=0.12, 20 min) n’était pas assez importante pour provoquer
une dépression respiratoire chez les jeunes ratons. Si c’est le cas, il est possible de croire que
la faible réponse à l’hypoxie des animaux crée une absence de différence dans la réponse lors
du traitement avec le MMI. Ceci reste cependant des spéculations qui doivent être
approfondies ; le tout pourrait être effectué tout d’abord en utilisant un niveau plus sévère
d’hypoxie (FiO2=0.10 ou 0.06, 20 min). Malgré tout, la présence d’une réponse ventilatoire
à l’hypoxie de 12% chez des ratons de 1 et 4 jours de vie a déjà été démontrée par des
collègues (Niane and Bairam, 2011).

Aux âges plus avancés (P14-P15), la réponse ventilatoire à l’hypoxie (FiO2=0.12, 20

min) est présente et est modifiée par le traitement de MMI. Les rats traités au MMI présentent
un patron de réponse à l’hypoxie bi-phasique et plus immature que les rats témoins. La

190
réponse dans les premières minutes d’hypoxie est inchangée entre les groupes alors que la
dépression ventilatoire dans les dernières minutes est intensifiée par le traitement MMI.
Comme il a été mentionné en introduction dans la section 2.5.5, la phase d’augmentation
initiale est engendrée par l’action des corps carotidiens et la dépression en phase ultérieure
est produite par une dépression du réseau de contrôle respiratoire (Gourine and Funk, 2017).
Il est surprenant de ne pas voir de différences dans la phase hypoxique initiale puisque
l’hypothyroïdisme par exposition au PTU réduit l’activité du nerf du sinus carotidien en
hypoxie (Olea et al., 2007). L’incapacité de maintenir une ventilation dans la phase finale de
l’hypoxie par les rats traités au MMI suggère un réseau de contrôle respiratoire immature. La
plus forte dépression en fin d’hypoxie chez ces animaux peut être causée par des
changements dans la neurotransmission GABAergique (amplement démontré dans nos
études). Cette hypothèse pourrait être confirmée par l’injection de l’antagoniste des
récepteurs GABAA chez l’animal avant d’effectuer l’exposition à l’hypoxie. La forte
dépression peut cependant aussi être causée par les fonctions déficientes d’un senseur central
d’O2. L’astrocyte, cellule gliale du SNC, a été introduit comme un senseur central d’O2 dans
la section 2.5.4.2. En réponse à la diminution de la Po2, les astrocytes augmentent la
libération d’ATP et activent la respiration (Angelova et al., 2015). Les astrocytes expriment
les récepteurs TRs; ces cellules gliales sont donc des cibles des hormones thyroïdiennes dans
le développement (Patel et al., 1989). L’absence d’hormones thyroïdiennes ralentie la
maturation des astrocytes en culture cellulaire alors que leur présence augmente la
prolifération de ces cellules gliales (Dezonne et al., 2009; Trentin and Moura Neto, 1995).
L’hypothyroïdisme causé par une thyroïdectomie réduit la synthèse de l’ATP dans le cortex,
mais perturbe aussi l’homéostasie du Ca2+ réduisant ainsi les niveaux de calcium
intracellulaires (Katyare and Rajan, 2005; Katyare et al., 1977; Wrutniak-Cabello et al.,
2001). Ensembles, ces résultats démontrent que les hormones thyroïdiennes influencent
grandement les astrocytes et suggèrent un potentiel effet dans la capacité des astrocytes à
détecter les niveaux d’O2 et d’activer le réseau de contrôle respiratoire. Une perturbation de
ce mécanisme pourrait expliquer la dépression ventilatoire plus importante chez les animaux
traités au MMI en fin d’hypoxie.

191
5. Retour sur la technique de culture primaire de microglie du
tronc cérébral

5.1 Utiliser la culture cellulaire sur tronc cérébral entier pour répondre
aux questions

L’utilisation de culture primaire de microglie dans le chapitre 3 est justifiée en partie

par l’obtention d’une bourse de déplacement pour un stage à l’étranger de la part du Réseau
en Santé Respiratoire du Québec. Le but principal du stage était d’apprendre une nouvelle
technique et de greffer les résultats au projet de doctorat. L’équipe du Dr. Noda se spécialise
dans l’observation de la microglie provenant de culture primaire de souris (modèle rongeur
expliqué ci-dessous). La technique permet l’évaluation directe de plusieurs fonctions des
cellules microgliales incluant la motilité, la phagocytose, la migration et la modification de
leur phénotype. L’utilisation de cette technique a permis d’observer la motilité divergente
des microglies entres les régions du cerveau et la nécessité d’une présence de neurones dans
le milieu pour que les microglies du tronc cérébral répondent à la T3. Ce type d’analyse ne
pourrait être fait dans un modèle d’animal ou de cerveau entier, ce qui démontre les avantages
de la technique. L’observation des fonctions microgliales sur animal entier peut être effectuée
par microscopie à deux photons (microglies fluorescentes sur souris CX3CR1-GFP ou Iba1–
EGFP) (Kato et al., 2019). La technique ne peut se faire que sur les couches supérieures du
cerveau, demandant l’amincissement de la boîte crânienne. Cette contrainte rend donc
délicate la tâche d’analyser les microglies du tronc cérébral situé sous le cervelet. L’étude du
chapitre 3 est une première étape pour non seulement découvrir les fonctions des microglies
dans le tronc cérébral, mais aussi leur réponse aux hormones thyroïdiennes. Ces résultats
pourraient être comparés avec une étude de l’effet du traitement MMI en période périnatale
sur les mêmes fonctions des microglies du tronc cérébral en culture cellulaire. Aussi, il
pourrait être intéressant d’injecter la femelle gestante avec la minocycline (inhibiteur de
l’activité microgliale) et comparer les conséquences sur les fonctions des microglies avec
celles observées suites à la déficience périnatale en hormones thyroïdiennes. Parallèlement,
avec l’utilisation de l’animal entier, une évaluation entres les différents noyaux cardio-
respiratoires du tronc cérébral pourrait être effectuée pour déterminer l’effet du traitement

192
périnatale de MMI sur la densité des microglies, leur phénotype et l’expression de
chimiokines relatives à leur activité (e.g. CX3CL1). La comparaison simultanée des
fonctions microgliales sur tissu entier et en culture cellulaire est selon moi bénéfique pour
mieux comprendre leur implication dans le développement du réseau neuronal de contrôle
respiratoire, mais aussi du système cardio-respiratoire.

5.3 Critique du modèle

La culture primaire de microglie produite pour l’étude du chapitre 3 provient de

souris. Alors que les chapitres précédents (1 et 2) comportent des études sur le rat,
l’utilisation de la souris peut sembler incohérente. Ce modèle animal était au moment du
stage celui dont l’équipe du Dr. Noda se sentait le plus confortable d’utiliser pour les cultures.
L’isolation de microglie peut aussi être effectuée sur le rat, mais des différences dans les
réponses moléculaires et fonctionnelles des microglies à certains agents activateurs (pro- ou
anti-inflammatoire) peuvent être présentes (Lam et al., 2017; Tamashiro et al., 2012). Les
résultats provenant du chapitre 3 sont significatif pour cette thèse, mais leur généralisation
entre les deux espèces de rongeurs (souris vs rat) doivent être faite avec précaution. Une
étude similaire sur des cultures primaires de microglies de rat aiderait à clarifier les
différences si elles existent.

L’utilisation de la culture de microglies dans le cadre de notre étude comporte un lot

d’avantages : nombre élevé de données collectées rapidement, faibles coûts, évaluation des
fonctions d’une cellule précise sans les afférences du système, observation de l’effet
cellulaire d’une substance (Murphy, 1991). La technique nécessite une quantité raisonnable
de tissu pour produire la culture cellulaire. Elle est cependant effectuée sur des animaux de
très jeune âge (P3 pour les microglies et GD16 pour les neurones) avec un faible volume de
tissu nerveux, ce qui demande une quantité importante d’animaux (~9) pour faire une culture
viable. La culture cellulaire sur tronc cérébral du chapitre 3 présentait une faible densité de
neurones comparativement au cortex. Les résultats de motilité des microglies en conditions
contrôles dans le cortex ont cependant confirmé que la motilité n’est pas affectée par la

193
densité neuronale. Malgré tout, puisque la présence de neurones est importante pour avoir
une réponse des microglies du tronc cérébral à la T3, il serait intéressant de tester différentes
densités neuronales dans la culture de cette région. De plus, l’isolation et la préparation de
culture peut amener un stress mécanique qui maintient la microglie en mode alerte. Les
microglies en mono culture ne sont pas exposées aux signaux inhibiteurs produits par les
cellules nerveuses et gliales. La co-culture avec des neurones permet de contrer cet
inconvénient. La culture peut aussi être effectuée sur une tranche de cerveau qui offre un
environnement plus normal aux microglies. Enfin, le protocole d’internalisation du Dextran
Rhodamine B par les microglies représente de façon adéquate d’observer l’activité de
pinocytose des cellules en réponse à l’hormone T3. Il serait néanmoins intéressant d’effectuer
un protocole similaire avec des billes fluorescentes à plus fort volume que le Dextran afin
d’avoir une idée plus claire du processus de phagocytose par les microglies en réponse à la
T3. Il est démontré que ce dernier est influencé par la T3 dans la région du cortex (Mori et
al., 2015). L’internalisation de billes à plus haut volume représenterait de façon plus fiable
l’élagage par la phagocytose des boutons terminaux par exemple (Mosser et al., 2017).

6. Retombées dans la recherche clinique

À travers le texte de cette thèse, il a été introduit et discuté que l’hypothyroïdisme

maternel peut provoquer la naissance prématurée du bébé et que les conséquences sur le
développement du SNC sont nombreuses. D’un point de vue physiologique, le SNC et plus
précisément le système respiratoire du rongeur est sous-développé à la naissance et
s’apparente au système d’un nouveau-né prématuré (Clancy et al., 2001). Le patron
respiratoire du raton est instable, ponctué d’apnées et la réponse ventilatoire à l’hypoxie est
immature (Bissonnette, 2000). Ces caractéristiques font du rat un excellent modèle pour
étudier le développement du réseau de contrôle respiratoire et déterminer comment la
modification de l’environnement fœtal peut interférer dans sa mise en place.

Les conséquences développementales de la déficience périnatale en hormones

thyroïdiennes observées dans les études de cette thèse sont similaires à celles retrouvées dans

194
certains désordres respiratoires du nouveau-né. Les troubles endocriniens peuvent être reliés
à l’apnée du prématuré. Un enfant hypothyroïdien présentera parfois une ventilation
hypotonique ponctuée d’apnées. Les ratons âgés de 1 à 4 jours de vie sont très représentatifs
des nouveau-nés affectés par l’apnée du prématuré. Tout comme les ratons ayant subi le
traitement de MMI, les nouveau-nés affectés par l’apnée du prématuré présentent les
symptômes suivants : une forte neurotransmission GABAergique, une instabilité respiratoire
plus importante avec une augmentation des apnées, une chémosensibilité centrale réduite
(Abu-Shaweesh and Martin, 2008; Rousseau et al., 2017). Un second désordre respiratoire,
le syndrome de mort subite du nourrisson (SIDS), peut être relié à notre modèle expérimental.
Il se résume en la mort inattendue d’un enfant âgé de 1 an et moins, principalement pendant
le sommeil (Krous et al., 2004). Il est étroitement relié à une défaillance centrale de la
commande cardio-respiratoire (Rousseau et al., 2017). Pour le moment, peu d’études ont relié
les hormones thyroïdiennes aux cas cliniques de SIDS. Des taux élevés d’hormones
thyroïdiennes, plus précisément de T3, ont déjà été retrouvés chez des victimes du SIDS
(Chacon and Tildon, 1981). Cependant, il a par la suite été conclu que cette élévation soit
principalement due à la conversion périphérique post-mortem de T4 en T3 (Wellby et al.,
1987). Puisque le désordre se produit principalement entre 1 mois et 1 an de vie, les ratons
âgés de 15 jours postnataux traités au MMI sont plus représentatifs. Les conséquences
similaires entre les deux modèles sont : un CRL anormal causé par une inhibition cardio-
respiratoire excessive, une immaturité du réseau neuronal de contrôle respiratoire et une
réponse ventilatoire à l’hypoxie réduite (Kinney and Thach, 2009; Kinney et al., 2009).
Finalement, le syndrome de détresse respiratoire est retrouvé chez les enfants né
prématurément (Sürmeli-Onay et al., 2012). Il se résume par une immaturité des poumons
ainsi qu’une production de surfactant insuffisante. Le surfactant est vital pour une respiration
adéquate puisqu’il empêche l’effondrement des alvéoles en réduisant la tension de surface à
l’interface air-liquide (Redding and Pereira, 1974). Les hormones thyroïdiennes augmentent
la production de surfactant dans les poumons. Il est incertain si ce procédé pourrait prendre
part à la ventilation réduite chez nos ratons traités au MMI à bas âge (P1-P4), mais la faible
consommation d’O2 dans ce groupe pourrait être due en partie à la mauvaise production de
surfactant.

195
 L’hypothyroïdisme maternel est habituellement surveillé pendant la grossesse, mais
le diagnostic est difficile à effectuer (Biondi and Wartofsky, 2014). Si la supplémentation en
hormones thyroïdiennes est inadéquate pendant la grossesse ou si elle est effectuée trop tard,
des conséquences sur le nouveau-né peuvent apparaître. Il est reconnu que les conséquences
d’un hypothyroïdisme maternel ne peuvent être complètement renversées par le traitement
en hormones thyroïdiennes dans les premiers jours de vie (Gilbert et al., 2012; Morreale de
Escobar et al., 2004). Le test de Guthrie permet de détecter les taux de T4 et TSH du nouveau-
né et est effectué de façon assidue au troisième jour de vie (Roussey et al., 2015). Ce test est
bénéfique pour contrer une majeure partie des conséquences d’un hypothyroïdisme
congénital. Cependant, si l’hypothyroïdisme maternel n’a pas été diagnostiqué, le test de
Guthrie ne pourra aider qu’à effectuer un traitement postnatal. Il est aussi encore incertain si
le test peut échouer dans la détection d’un hypothyroïdisme congénital lorsqu’il est effectué
sur des enfants nés prématurément. Les résultats présentés dans cette thèse confirment que
certains effets du traitement MMI dans la période périnatale, principalement ceux au niveau
de l’animal entier (hypoventilation, instabilité respiratoire) ne peuvent être corrigés par une
supplémentation en L-T4 dans les premiers jours de vie. Malgré tout, la supplémentation
semble rétablir une partie des fonctions centrales du réseau neuronal de contrôle respiratoire.
Bien sûr, l’objectif de cette thèse ne consiste pas à trouver la supplémentation adéquate en
hormones thyroïdiennes pour contrer les désordres respiratoires des nouveau-nés. Il est
cependant intéressant de remarquer que l’hypothyroïdisme maternel peut causer de profondes
perturbations dans le développement du réseau neuronal respiratoire, un facteur oublié dans
le traitement de l’hypothyroïdisme qui pourrait être diagnostiqué à l’avenir.

7. Conclusion générale

Nous pouvons conclure de cette thèse que les hormones thyroïdiennes exercent une
importante influence sur le développement du système cardio-respiratoire du rongeur. Le
réseau neuronal de contrôle respiratoire ainsi que le réflexe respiratoire à l’hypoxie sont
particulièrement touchés, mais de façon âge-dépendante. L’inhibition trop profonde du
système cardio-respiratoire (en partie causée par l’activité du système GABAergique) est au

196
cœur de la pathophysiologie observée chez les ratons suite à la déficience périnatale en
hormones thyroïdiennes. Une certaine cellule gliale, la microglie, est présente dans les
régions de contrôle du système cardio-respiratoire et ses fonctions sont modifiées par la
présence d’hormones thyroïdiennes. Elle pourrait influencer le développement des noyaux
du tronc cérébral et expliquer une partie des effets rencontrés dans cette thèse. L’étude des
effets des hormones thyroïdiennes sur le système cardio-respiratoire est effectuée en
considérant les composantes centrales ainsi que périphériques. L’intégration de ces données
est nécessaire pour établir un effet physiologique sur l’ensemble de l’animal et la diversité
des approches utilisées pour évaluer ces aspects représente la force de cette thèse. Les
hormones thyroïdiennes sont essentielles au bon développement du SNC et
l’hypothyroïdisme maternel peut provoquer de graves conséquences dans la mise en place
des fonctions centrales. Le système nerveux immature qui en découle affecte potentiellement
les fonctions cardio-respiratoires du nouveau-né. L’immaturité du système de contrôle
respiratoire est souvent reliée aux désordres respiratoires impliquant un rythme de ventilation
réduit chez ces enfants, particulièrement ceux nés prématurément. La supplémentation en
hormones thyroïdiennes à la naissance est une des solutions pour rétablir une partie des
fonctions respiratoires normales chez les nouveau-nés. Puisque les résultats obtenus au cours
de cette thèse appuient ceux obtenus chez d’autres vertébrés, cela nous amène à proposer
qu’il s’agit d’un principe biologique fondamental. Ultimement, il sera intéressant de voir
comment celui-ci pourrait s’appliquer chez l’humain et permettre le développement de
nouvelles approches visant à traiter les problèmes respiratoires causés par une immaturité
neurologique.

197
 Partie 4
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of congenital hypothyroidism of central origin should not be underestimated. J. Clin.
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245
 Partie 5
Annexe A : Liste des conférences nationales et
internationales

1. Rousseau JP., Kinkead R. (2015) Delays in respiratory control development: Is thyroid

hormone insufficiency the culprit? Experimental Biology 2015, Boston, USA, 28 Mars au
1er Avril 2015 (Présentation orale)

2. Rousseau JP., Kinkead R. (2015) L'hormone thyroïdienne, un nouveau joueur dans le

développement périnatal des circuits respiratoires chez le rongeur. 9e Journée de recherche
en neuroscience et santé mentale, Université Laval, Québec, QC, Canada, 9 Novembre 2015
(Présentation orale et affiche)

3. Rousseau JP., Kinkead R. (2016) Delays in respiratory control development: Is thyroid

hormone the culprit? 12e colloque scientifique de la Société Legallois pour l'Étude du
Contrôle Respiratoire, Orford, QC, Canada, 19 au 21 Février 2016 (Présentation orale)

4. Rousseau JP., Kinkead R. (2016) Thyroid hormone deficiency disrupts respiratory control
development and responses to hypoxia in newborn rat. Experimental Biology 2016, San
Diego, USA, 2 au 6 Avril 2016 (Présentation orale et affiche)

5. Rousseau JP., Kinkead R. (2016) Thyroid hormone deficiency disrupts respiratory

control development and responses to hypoxia in newborn rat. 16e Journée de recherche en
santé, Université Laval, Québec, QC, Canada, 25 au 26 Mai 2016 (Présentation orale)

6. Rousseau JP., Tenorio L., Kinkead R. (2017) Disruption of the GABAergic system by
thyroid hormone deficiency. A link with respiratory network development in newborn rat?
13e colloque scientifique de la Société Legallois pour l'Étude du Contrôle Respiratoire,
Orford, QC, Canada, 10 au 12 Février 2017 (Présentation orale)

246
7. Rousseau JP., Tenorio L., Kinkead R. (2017) Thyroid hormone deficiency potentiates
GABAergic inhibition of the brainstem respiratory network in newborn rat. Experimental
Biology 2017, Chicago, USA, 22 au 26 Avril 2017 (Présentation orale et affiche)

8. Rousseau JP., Laouafa S., Tremblay M., Joseph V., Kinkead R. (2017) Defective microglia
alters respiratory control and mitochondrial function in mice. Experimental Biology 2017,
Chicago, USA, 22 au 26 Avril 2017 (Présentation orale et affiche)

9. Rousseau JP., Tenorio L., Kinkead R. (2017) Nouvelles pistes sur la modulation
neuroendocrinienne dans le développement des centres de contrôle respiratoire. La demi-
journée des résidents en pédiatrie 2017, Université Laval, Québec, QC, Canada, 15 Juin 2017
(Présentation orale)

10. Rousseau JP., Kitazono K., Yoshioka Y, Noda M, Kinkead R. (2018) Is regulation of
microglial functions by T3 dependent on the micro-environment?: Insights from the
brainstem respiratory control network of newborn mice. Experimental Biology 2018, San
Diego, CA, USA, 22 Avril 2018 (Présentation orale et affiche)

11. Rousseau JP., Kitazono K., Yoshioka Y, Noda M, Kinkead R. (2018) Is regulation of
microglial functions by T3 dependent on the micro-environment?: Insights from the
brainstem respiratory control network of newborn mice. Research day in health, Université
laval, Quebec, Canada, 24 Avril 2018 (Présentation orale et affiche)

12. Rousseau JP., Kinkead R. (2019) Thyroid hormone supplementation dampens

GABAergic inhibition of the brainstem respiratory network in newborn rat. Experimental
Biology 2019, Orlando, FL, USA, 8 Avril 2019 (Présentation orale et affiche)

247