UNIVERSITE DES SCIENCES ET CENTRE INTERNATIONAL DE

FACULTÉ DES SCIENCES

TECHNIQUES DE MASUKU RECHERCHES MEDICALES DE
  FRANCEVILLE

MEMOIR DE MASTER II
Parcours: Biochimie Biologie Moléculaire et Cellulaire
Option :Microbiologie

ÉVALUATION DE LA PROLIFÉRATION LYMPHOCYTAIRE ET DE LA

PRODUCTION DU GM-CSF SOUS STIMULATION DU PPD DANS UNE
POPULATION POLY PARASITÉE DU SUD-EST DU GABON

Présenté par :
POUNGOU Natacha
• Pr AKUE MEDZEGUE Jean Paul • Dr NDONG ATOME Guy Roger
Maître de Recherches CAMES, Maître-assistant CAMES,
CIRMF (Gabon) USTM(Gabon)
Année universitaire 2018-2019
 PLAN

 INTRODUCTION

 MATÉRIEL ET METHODES

 RÉSULTATS

 DISCUSSION

 CONCLUSION

 PERSEPTIVES

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 INTRODUCTION

 GM-CSF

 Fin des années 1960, découverte du CSF (Nicola, 2001).

 Glycoprotéine d’environ 23 kDa avec une structure à quatre

faisceaux hélicoïdaux

 Une bonne cible thérapeutique (Cavaillon and Singer,

2018). Glycoprotéine GM_CSF

 Plusieurs sources cellulaires (fibroblastes, les lymphocytes T et B activés etc.)

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 INTRODUCTION

 FONCTIONS DE GM-CSF

 Stimule la survie
Maintien des
 Médie la cytotoxicité des
fonction APC
éosinophiles et neutrophiles
 Développe l’auto-immunité et les
réactions pro-inflammatoires

La carence en GM-CSF
n’affecte pas le
Activation des
développement des
LT au repos
cellules Th1 ou Th2. Il
favorise Th17
Figure 1 : Production des GM-CSF par les APC: son rôle dans les réponses des lymphocytes T.
(Shi et al., 2006)
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 INTRODUCTION

 EFFETS THERAPEUTIQUE DU GM-CSF

 Améliore l’anémie macrocytaire

 Induit la récupération de l’ hématopoïèse après chimiothérapie et radiothérapie

 Augmentation de la reconstitution hématologique (maladie de Hodgkin)

 L’injection du GM-CSF diminue la charge bactérienne (Pseudomonas
aerginosa, Staphylococcus aureus ou Candida albicans (Dembic, 2015)

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 INTRODUCTION

Le polyparasitisme

 En clinique : Infections parasitaires simultanées chez les patients

individuels
 Actuellement, peu de données permettant d’évaluer les conséquences
réelles du polyparasitisme

 Quelques exemples de maladies parasitaires

 Filaires ( Loa loa )
 Paludisme ( Plasmodium falciparum )
 Helminthiases du sol (Parasites intestinaux

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 INTRODUCTION
 La filaire ( Loa loa )
 MTN affectent de nombreuses populations
négligées et marginalisées dans le monde
(Gyapong and Boatin, 2016).

 30% prévalence,13millions
de personnes infectées
 vecteur, chrysops, Chrysops
silacea et dimidiata
(Rozendaal, 1997)

Figure 2: Distribution géographiques des filaires ;cas de la loa loa

(Molyneux et al., 2014).
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 INTRODUCTION
 Dans le monde
 Paludisme ( plasmodium falciparum )
-80% d’accès à plasmodium
falciparum,228millions en 2018
-405 000 décès par an en 2018
contre 585 000 en 2010(OMS
2019)

 Au Gabon
-45% formes graves chez les
enfants fébriles hospitalisés
-71% des femmes enceintes
hospitalisées (KOUMBA 2018)

Problème de résistances :
(antiseptiques ,
traitement )

Figure 3 : Cycles biologiques de Plasmodium (Mouchet, 2004)

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 INTRODUCTION
 Helminthiases du sol (Parasites intestinaux)
Les œufs / larves se développent en stades
adultes, se multiplient dans l'hôte humain et
provoquent des maladies

Les œufs sont passés dans le sol par

les excréments
Œufs embryonnés ingérés, à travers de
l'eau ou des mains contaminées, ou des
larves éclos à travers la peau Les œufs non fécondés ne
se développent pas

 Même bases du cycle de vie

Les œufs fécondés se transforment en embryons infectieux ou  Seul Stronglyoides stercoralis, qui est
éclosent en larves capable d’auto infection

Figure 4 : cycle générale de la transmission des STHs (El Bagi et al., 2007)
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 INTRODUCTION
 PPD (Protein purified derivated of tubercullin)

 Une caractéristique de la tuberculose est la prédisposition de M.

tuberculosis à se multiplier à l’intérieur des cellules du système
phagocytaire mononucléaires

 Le sérodiagnostic de la TB
 Sensibilité : 92%

 Le test DTH au dérivé de protéine purifiée (PPD) a été

utilisé pour déduire l’immunité protectrice à
mycobacterium tuberculosis et pour diagnostiquer la
tuberculose (Prasad et al., 2013).
Figure 5 :Protéine purifiée dérivé de la
Tuberculine

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 INTRODUCTION

 Contexte de l’étude
 les parasites peuvent générer un effet néfaste sur le vaccin BCG à travers
l’observation sur le PPD.

 Un parasite servirait de déclencheur de signe cliniques , en présence d’un

autres chez un même individu (M’bondoukué et al., 2018)

 Certains parasites seraient des co facteurs nécessaires à l’expression grave

de certains pathogène d’où intérêt de cette étude
 nombreuses variables confusionnelles impliquées, manque d’étude
prospectives.

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 OBJECTIFS

 Objectif principal

Evaluer l’impact du polyparasitisme sur la réponse immunitaire.

 Objectifs spécifiques

 Mesurer l’évolution de la prolifération des lymphocytes sous stimulation du PPD

 Mesurer la production du GM-CSF sous stimulation du PPD

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 MATÉRIEL ET MÉTHODES

 Site d’étude

 Période: saison des pluies

(mars- Avril 2020) .
 villages Venez-voire et
Mbouma-Ondama

5 Km de
HAUT-OGOOUE
Franceville
Figure 6 : Localisation géographique de la zone de
prélèvement (Logiciel Google Earth version 7.3.2.5776

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 MATÉRIEL ET MÉTHODES
 Echantillonnage

 Prélèvement sanguin

 Récolte des fèces Tubes de prélèvement (5mL à

10mL)

Figure 7: Prélèvement du sang au

pli du coude

Pot de prélèvement de selles 14

 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Examens parasitologiques du sang total

 Filaires

 Examen direct

Observation au MO de 10µl de sang

total entre lame et lamelle

 Examen indirecte:
Leucoconcentration

Figure 8: Microfilaires observés au MO après leucoconcentration

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 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Examen parasitologique du sang total

 Paludisme

 Test de diagnostic rapide

Kit de diagnostic rapide
malaria pf/pan Le test est
viable ,quand la
ligne apparait sur
le C (contrôle). Le
sang réagit avec
Figure 9 : Diagnostic du paludisme les anticorps anti
HRP-II

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 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Examen coprologique

 Parasites intestinaux 3.Identification

des œufs, larves
ou kystes de
 Examen direct : 1. 2mg de selles 2.Lecture au
parasite
+eau microscopes10X
physiologique

Identification plus
 Examen après concentration:  nette des kystes, ou
des œufs.
MIF (Merthiolate, Iode, Formol)

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 MATÉRIEL ET MÉTHODES

 Isolement des PBMC (Peripheral Blood Mononuclear cell)

 Technique du gradient de
concentration au Ficoll

 Test au Bleu de trypan Vérification

de la
viabilité des
cellules
 Mise en culture

Figure 10: Microscope inversé 18

 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Stimulation au PPD après 24H
 Test au MTT
Pour 1.106 cellules /ml sont été mises en culture dans des plaque de 96 puits
- Test avec 10µl de MTT (fournis dans le kit)
-mesurer la DO à la longueur d’onde de 570 nm avec un contrôle à 690nm.

Le MTT est réduit

en formazan ,il se
forme un précipité
violet.

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 MATÉRIEL ET MÉTHODES
 Dosage du GM-CSF

Pour 5.106 cellules ont été incubés sur plaque de 48.

- Après 5 jours d’incubation
-kit Quantikine ELISA human GM-CSF).

Analyse des données

  L’ensemble des données a été analysé sur le plan Biostatistique par le programme
Minitab 16 .
 Test non paramétrique de Mann-Whitney

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 RÉSULTATS
Tableau 1 : Parasitémie de la population

Parasites Infectés (%) Co-infectés(%) Non-infectés(%)

Loa loa 5,6% 1,012%(plasmodium) -

Plasmodium 31,46% 2,24%(amibes/ oxyure) -

Ascaris 1,012% 1,012%(plasmodium) -

Oxyures 2,24% - -

Tricocéphal 1,012% - -

Amibes E,coli 1,012% 1,012%(plasmodium) -

Total 42,34% 5,276% 57,66%

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 RÉSULTATS
Prolifération cellulaire
1.2
1.14027375

0.8
Indexe de prolifération

0.5991578
0.6

0.44115943
0.4

0.2

0
1 2 3 4 5 6 10 11 17 20 26 27 28 38 81 39 40 41 42 43 44 46 47 50 51 52 53 55 57 60 65 66 68 79 82 83 84 85 86 87 88 89

population étudiée

Indexe palu Indexe filaire Indexe non parasités

Figure 11 : Variation des indexes de prolifération cellulaires dans les populations parasité et non
parasités stimulés au MTT.
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 RÉSULTATS
Tableau 2 : variation des concentrations du GM-CSF chez les groupes parasités et
non parasités avec et sans stimulation

Groupes Concentrations(pg/mL)/ Stimulées au PPD Concentration(pg/mL)/Non stimulées au PPD

Parasitées Filaires 343,16±130 377,104±157

   

Parasitées Palu 424,2±158 339,5714±127

   

Non parasitées 243,975±107 410,66±124

   

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 DISCUSSION

Notion de polyparasitisme

 infections parasitaires multiples chez les

populations étudiées  Similaire à l’étude
-P.falciparum-Entemoeba coli (Migasena, 1982)
-P.falciparum-Loa loa
- loa loa-Enterobius vermicularis(oxyure).

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 DISCUSSION

Prolifération lymphocytaire

 L’estimation du test de prolifération des PBMC

sous stimulation du PPD ont montré que les
personnes non parasitées avaient un bon profil
prolifératif  ce qui contraste avec les
 Il en ressort des fluctuations visibles surtout au études antérieures (Akue
and Devaney, 2002)
niveau de la prolifération lymphocytaire

 Ces différences n’ont pas atteint le seuil de significativité,(p=0,9353); La

nature du parasite ne semble pas être liée avec la prolifération
lymphocytaire
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 DISCUSSION
Production de GM-CSF
 Il n’y a pas eu d’interactions significatives entre
parasites quel que soit le statut clinique des individus  corroborent avec
(p=0,372). l’étude d’Akue et
Devaney en 2002
 le PPD interfère dans les réactions du système
immunitaire.

 Influence négative des réponses immunitaires vis-à-vis

 Corrobore avec
de Mycobacterium tubrculosis; l’étude Shi et al.,
 Effet limitant exercé par chaque parasite sur la 2006)
parasitémie de l’autre  Similaire à l’étude de
M’bondoukwé et al.,
2018).
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 CONCLUSION

 Une multitude d’infections parasitaires chez un même individu est

une véritable atteinte au système immunitaire

 La nature du parasite ne semble pas être liée avec la prolifération

lymphocytaire, mais les filaires présentent un meilleur profil
comparer au paludisme;

 La cytokine GM-CSF induit la prolifération des macrophages et la

différenciation de DC en cas d’infection multiples, plusieurs
propriétés font de cette cytokine ,une véritable cible thérapeutique

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 PERSPECTIVES

 Un plus grand échantillonnage; d’autre villages ou d’autres provinces du

Gabon

 Une autre cytokine pro inflammatoire ;IL-17

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MERCI POUR VOTRE
ATTENTION

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