Méthodes de dosage de

l’hémoglobine glyquée et pièges

analytiques Dr .BELILITA .S
 Objectifs :
• L’hémoglobine glyquée et HbA1c
• Les fractions d’hémoglobine
• Définition et bases chimiques de la R°de glycation
• Intérêt du dosage de l’HbA1c
• Méthodes de dosage ;étape pré-analytique ; méthode
de référence;standardisation
• Variations physiopathologiques , ;anomalies d’Hb ,
variants d’Hb ; interférences et pièges
analytiques ,limitations du dosage
• Utilisation de l’Hb glyquée pour le diagnostic du diabète
• La place de la glycémie moyenne et démarches
d’interprétation.
• Recommandations
 Hémoglobine glyquée et HbA1c

• Hémoglobine glyquée :
• Désigne l'ensemble des molécules d'hémoglobine
modifiées par réaction de glycation (plusieurs
oses /plusieurs Hb /plusieurs sites de fixation).

• L’HbA1c:
• C’est une fraction d’hémoglobine glyquée formée
par fixation de glucose sur l’extrémité N terminale
de la chaine β de l’Hb A .
• Fractions d’Hb normales

• Les hémoglobines glyquées :

• Types d’oses
• Sites de glycation
 Les fractions d’hémoglobines normales :

Le sang contient également des traces d’hémoglobines

mineures (Hb A1, etc.)
Place de l’hémoglobine glyquée totale et de
l’HbA1c au sein de toutes les fractions
d’hémoglobine
GilleryP.Hémoglobine glyquéeLaboratoire de biologie et de recherche pédiatriques, American Memorial Hospital, Centre hospitalier
universitaire de Reims, 47, Rue Cognacq-Jay, 51092 Reims cedex, France
 Pourquoi l’HbA1c
• représentatif du taux de glycémie moyen sur une
période déterminée.

• l’HbA1c, représente 60 à 80% des hémoglobines

glyquées (4-6 % de l’Hb totale)
• pourcentage des autres fractions:

• le pyruvate pour l’HbA1b (0.5-0,8 % de l’Hb totale)

• et le fructose 1-6 diphosphate ou le glucose 6

Place de l’HbA1c au seins des fractions d’Hb.

Glycation sur
la chaine
alpha
 Sites de glycation
• Différence selon le site de glycation et de la
nature de l'ose fixé.

• Le site préférentiel de glycation est le résidu

de valine N-terminal des chaînes β de globine.
La fraction majeure d'Hb
 Les différents sites de glycation
• D’autres sites de glycation correspondent aux
lysines non terminales des chaînes α et ß et à la
valine N terminale de la chaîne α
Bases chimiques de la réaction de
glycation
 la réaction de Glycation
• La glycation est une réaction purement chimique
et spontanée .

• C’est une R° non enzymatique, (à ne pas

confondre avec la glycosylation, qui est une
réaction enzymatique) consistant à lier de façon
covalente un glucide à une protéine, à un lipide,
ou à une autre molécule.
 la réaction de Glycation
• Deux étapes

• Condensation

• Réarrangement (isomérisation)
la réaction de Glycation
 la réaction de Glycation
• La condensation:
• Le groupe carbonyle du sucre réagit avec le
groupe amine de l’acide aminé pour produire
des glycosylamines N-substituées et de l’eau.
 la réaction de Glycation
Le réarrangement (isomérisations) :
• Isomérisation de la glycosylamine pour
former des cétosamines, réaction catalysée
par un acide ou une base.
la réaction de Glycation
 la réaction de Glycation

• La glycation des protéines structurales de demi-vie

longue forme les produits avancés de la glycation,
ou AGE (pour Advanced Glycation End products),
• Les AGE sont impliqués dans le vieillissement
accéléré, l’athérogenèse, la pathogénie de
l’insuffisance rénale, et diverses complications du
diabète.

• Le taux de formation des AGE dépend de la durée

de l’hyperglycémie et du temps de renouvellement
des protéines.
 la réaction de Glycation

• La réaction dépend de :

• De la moyenne des concentration du glucose

• De la vitesse de glycation (attention aux

phénomène des glycateurs lents).

• du taux de renouvellement des protéines

« l’hémoglobine », subordonné à la durée de vie
du globule rouge qui la contient.
la réaction de Glycation
Historique & Intérêt du dosage de l’HbA1c
 Historique :
1958
Séparation des autres formes
d’hémoglobine Par chromatographie

1968
caractérisée comme une glycoprotéine

1970

son augmentation dans

le diabète a été décrite de façon fortuite
Études des hémoglobinopathies;
découverte d’un variant chez les
diabétiques
 Intérêt du dosage de l’HbA1c
1976

2010:

Utilisation de l’HBA1c pour le

diagnostic du diabète
 Intérêt du dosage
• la mesure de l’HbA1c permet :
• D’obtenir facilement une mesure de la glycémie
moyenne ;

• De prédire le risque de complications

• (macrovasculaires et surtout microvasculaires)
• Une évaluation de l’efficacité thérapeutique et de
fixer des objectifs thérapeutiques.
Intérêt du dosage
 METHODES DE DOSAGE DE
L’HEMOGLBINE GLYQUEE ET DE
L’HbA1c
 Méthodes de dosage
• Utilisation de principes variés

• Différentes formes glyquées de

l'hémoglobine

• Difficultés de standardisation
Méthodes de dosage
 Techniques de dosage de l’hémoglobine glyquée.
Paramètre évalué Principe de dosage
Propriétés physico-
HbA1c chimiques (charge)
Propriétés antigéniques
(peptide β-N-terminal)
Hb glyquée totale Affinité
acide boronique et dérivés)
Technique
*Chromatographie
d'échang cationique
(minicolonnes*, CLBP,
CLHP)
*Electrophorèse
Immunochimie
Méthodes
enzymatiques
Chromatographie
(minicolonnes*, CLHP)
Dosage automatisé
Méthodes de dosage de l’HbA1c
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• Méthodes basées sur la modification de la charge

• La fixation du glucose sur l’extrémité N-terminale

de la valine de la chaîne de la globine entraîne
 une augmentation de la charge négative par
diminution de la charge positive du groupement
amine
• Les méthodes basées sur la modification de la
charge sont très sensibles aux conditions
opératoires comme le pH et la température.
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques chromatographiques:
• Chromatographie liquide avec résine
échangeuse de cations séparent les diverses
fractions de l’hémoglobine donnant des pics
correspondant à chaque fraction sur le
chromatogramme .

• Ces techniques ont l’avantage de mettre en

évidence les variants de l’hémoglobine
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• Techniques chromatographiques
mini-colonnes qui sont en voie de
disparition car elles ne sont pas
certifiées

chromatographie
basse pression (CLBP)

Automates de
chromatographie
haute performance (CLHP)

très résolutifs
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
Techniques chromatographiques:
Dosage de l’HbA1c par HPLC:
Principe:
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
Techniques chromatographiques:
Dosage de l’HbA1c par HPLC:
Principe:

Les fractions rapides sont appelées

HbA1 et ont été désignées, en
fonction de leur ordre d’élution,
par une lettre minuscule
(HbA1a , A1b et HbA1c ).
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
Techniques chromatographiques:
Dosage de l’HbA1c par HPLC:
Avantage:
Bonne résolution
Détection de variants d’Hb
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
L’électrophorèse:
• la seule technique électrophorétique retenue
est l’électrophorèse capillaire

• L’électrophorèse sur gel d’agarose et ne répond

pas aux exigences des dernières
recommandations.
• Il existe une forte cohérence entre les résultats
EC et HPLC
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
L’électrophorèse:
• Avantage de l’EC

• la résolution EC est supérieure à EC-HPLC en

raison de la séparation de nombreuses
variantes Hb communes et rares de la fraction
HbA0.
Méthodes de dosage de l’HbA1c
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :

• Immunoturbidimétrie en phase homogène

• Immuno-inhibition sur latex

• ELISA
 Causes pathologiques et limitations analytiques
• Présence de variants d’Hb:

Techniques immunologiques :

•Pas de détection des variants

•on peut considérer qu’il n’existe pas

d’interférence significative avec l’HbE et l’HbD
car les substitutions se trouvent loin de
l’extrémité N-terminale
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
• elles font appel à des anticorps spécifiques de la
liaison glucose- valine N-terminale de la chaîne de
la globine.
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
• L’immunoturbidimétrie en phase homogène :
adaptée à divers analyseurs automatiques de
biochimie clinique.
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
• L’immunoturbidimétrie en phase homogène :
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
• ELISA:
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
• Immuno-inhibition sur latex
• Requiert l’utilisation d’un analyseur spécialisé

• Reproductibilité interlaboratoire très

performante CV=3.2%
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
• Immuno-inhibition sur latex
• Requiert l’utilisation d’un analyseur spécialisé

• Reproductibilité interlaboratoire très

performante CV=3.2%
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques technologie
BAYER :
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les techniques immunologiques :
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les méthodes enzymatiques :
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les méthodes enzymatiques :
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les méthodes enzymatiques :
 Méthodes de dosage de l’HbA1c
• les méthodes enzymatiques :
• Adaptation sur automates
 Techniques de dosage de l’hémoglobine glyquée.
Paramètre évalué Principe de dosage
Propriétés physico-
HbA1c chimiques (charge)
Propriétés antigéniques
(peptide β-N-terminal)
Hb glyquée totale Affinité
acide boronique et dérivés)
Technique
*Chromatographie
d'échang cationique
(minicolonnes*, CLBP,
CLHP)
*Electrophorèse
Immunochimie
Méthodes
enzymatiques
Chromatographie
(minicolonnes*, CLHP)
Dosage automatisé
 Dosage de l’Hb glyquée totale
Affinité de l’Hb glyquée pour le boronate
 Dosage de l’Hb glyquée totale
Affinité de l’Hb glyquée pour le boronate
 Valeurs usuelles
• Elles varient en fonction de la technique
utilisée et de la forme d’Hb glyquée dosée.
1976

2010:

Utilisation de l’HBA1c pour le

diagnostic du diabète
 Interprétation des résultats d’HbA1c
valeurs de référence
standardisation

• Deux grandes études 1980 :

• DCCT : «Diabetes Control and Complications Trial»
société savante américaine  éudes concernant les
patients diabétiques de type 1.
• UKPDS «United Kingdom Prospective Diabetes
Study», concernant les patients diabétiques de type 2,
• Les deux études qui ont toutes deux établi la relation
existant entre la glycémie moyenne, le taux d’HbA1c
et le risque de complications chroniques associées à
la maladie
 Interprétation des résultats d’HbA1c
valeurs de référence
standardisation

• DCCT : sur 1441 diabétiques de type 1 sur une

période de 10 ans a montré qu’une baisse de 1 %
d’HbA1cs’accompagne d’une diminution de 43 %
du risque de rétinopathie.
•
• Les résultats de l’UKPDS montrent qu’une
diminution ou augmentation de 1 % s’accompagne
respectivement d’une diminution ou augmentation
de 10 à 20 % du risque de complications
 Interprétation des résultats d’HbA1c
valeurs de référence
standardisation

• Un processus de standardisation des dosages de

l’hémoglobine glyquée a été mis en place fin des
années 90.
• Un premier groupe de travail est le NGSP
(National Glycohemoglobin Standardization
Program).
• Le deuxième est le groupe de l’IFCC
(International Federation of Clinical Chemistry).
• Nécessité de standardisation : méthodes de
dosage variées ,non équivalentes en matière
d’exactitude et de précision.
Interprétation des résultats d’HbA1c
valeurs de référence
standardisation
 NGSP
• Le premier groupe ;un groupe américain du NGSP
(National Glycohemoglobin Standardization
Program), Université de Columbia

• Ce groupe s'appuie sur les travaux menés depuis

plusieurs années par le DCCT (Diabetes Control
and Complications Trial)

• Définition d’un intervalle de référence pour

l'HbA1c (de 4 à 6 % de l'hémoglobine totale)
 Interprétation des résultats d’HbA1c
valeurs de référence
standardisation

• La NGSP:
• Méthode utilisée :chromatographie liquide à haute
pression (HPLC)échangeuse de cations.

• Cette technique ne définissant l’étalon que par des

critères chromatographiques, elle est sujette à de
nombreuses interférences
 Interprétation des résultats d’HbA1c
valeurs de référence
standardisation

• L’IFCC: Un groupe de travail qui a décrit en 2002 une

méthode de référence qui repose sur une HPLC en
phase inverse couplée à la spectrométrie de masse
ou à l’électrophorèse capillaire.
• Ici, l’étalon est défini chimiquement :
l’hexapeptideN-terminal glyqué de la chaîne beta .
Cette technique est plus spécifique et donne des
résultats 1 à 2 % plus bas que ceux dela NGSP/DCCT.
• Une équation directrice permet la conversion entre
les deux systèmes .
 NGSP/IFCC
• NGSP = [0, 09148 × IFCC] + 2, 152

Les résultats de la NGSP sont exprimés en

% et ceux de l’IFCC en mmol/mol

Les valeurs usuelles sont de 4 à 6 % (NGSP)

et 20 à 42 mmol/mol (IFCC)
 Méthode de référence

• La méthode de référence, validée par IFCC

• Elle associe une chromatographie liquide

haute performance (CLHP) en phase inverse
couplée à une électrophorese capillaire ou
couplée à une spectrométrie de masse

• Le paramètre mesuré est l'hexapeptide N-

terminal glyqué de la chaîne β de
l'hémoglobine, caractéristique de l'HbA1c,
libéré après hydrolyse enzymatique
 Méthode de référence

• La méthode utilisée par défaut comme

référence « la méthode NGSP »

• Chromatographie d’échange ionique

• Méthode qui a servi de base aux travaux

du DCCT et de l’UKPDS
1976

2010:

Utilisation de l’HBA1c pour le

diagnostic du diabète
HbA1c pour le diagnostic du diabète sucré
?! 2010
HbA1c pour le diagnostic du diabète sucré
?!
• Une validation par les autorités sanitaires
américaines (Food and Drug Administration
[FDA]) de l’HbA1c en tant qu’outil
diagnostique du diabète.
• Cette décision a été argumentée par la
moindre variabilité de l’HbA1c.
Dans la directive de 2010 de l’American Diabetes Association
(ADA), l’HbA1c a été recommandée comme critère pour la
détection et le diagnostic du diabète en utilisant une valeur
seuil de 6,5% (48 mmol / mol)3.
 HbA1c pour le diagnostic du diabète sucré
?!

E. Sepulchre(1), L. Lutteri (2), E. Cavalier (3), B. Guerci (4), R.P. Radermecker (5)
 Variations physiologiques
• Le taux d’HbA1c est indépendant:
• du régime alimentaire et de l’exercice
physique, ainsi que de l’état de jeûne.
• du sexe et de l’âge chez le sujet sain .
• Variation légère au cours de la grossesse
(diminution au cours du premier trimestre )
• Les variations physiologiques
interindividuelles de l’HbA1c sont faibles
• Phénomène de glycateurs lents
 HbA1c

Variations pathologiques
Limites du dosage de l’HbA1c
Interférences
& Pièges analytiques
 Causes pathologiques et limitations analytiques

• Difficultés d’interprétation des résultats devant :

• métabolisme anormal d’Hb ou des GR

• Présence de variants d’Hb

• Présence d’autres Hb modifiée (Hb carbamylée et Hb

acétylée)

• Une limite pour le dosage de l’HbA1c  indication de la

fructosamine
 Causes pathologiques et limitations
analytiques
• L’HbA1c est conditionnée par la durée de vie des
GR et une synthèse normale de l’Hb avec 97 à
99 % d’HbA:
• La glycation est un processus cumulatif
dès les stades érythropoïétiques, puis tout au long
de la présence des GR dans le courant circulatoire.
• Le taux d’HbA1c augmente avec l’âge des globules
rouges
• Toute modification de la durée de vie des hématies
affecte les valeurs d’HbA1c .
 Causes pathologiques et limitations analytiques
Changement de la durée de vie des GR:
 Causes pathologiques et limitations
analytiques

• La valeur sémiologique de l’hémoglobine

A1c (HbA1c) en tant que marqueur
rétrospectif cumulatif de l’équilibre
glycémique chez le patient diabétique est
prise en défaut en cas d’hémoglobinopathie.
• Certaines de ces pathologies (HbSS, HbCC,
HbSC, thalassémies sévères) rendent
impossible l’utilisation de l’HbA1c quelle que
soit la méthode utilisée (hémolyse associée
réduisant la durée de vie des globules rouges,
augmentation secondaire de l’HbF
Causes pathologiques et limitations analytiques
 Causes pathologiques et limitations analytiques
• Présence de variants d’Hb:

Techniques chromatographiques :

Les résultats d’HbA1c mesurée par chromatographie

seront inexacts lorsque le variant de l’Hb ou son dérivé
glyqué ne pourront être séparés de l’HbA ou de HbA1c
 Causes pathologiques et limitations analytiques
• Présence de variants d’Hb:
Techniques chromatographiques :
 Causes pathologiques et limitations analytiques
• Présence de variants d’Hb:
Techniques chromatographiques :

Attention ; une hémolyse chronique générée par l’anomalie

 Causes pathologiques et limitations analytiques
• Présence de variants d’Hb:
Techniques chromatographiques :

Exp Hb Hope

Les résultats d’HbA1c obtenus dans

ces
cas ne doivent pas être rendus car
ils sont ininterprétables

 Dosage des fructosamines

 Causes pathologiques et limitations analytiques
• Présence de variants d’Hb:
Techniques chromatographiques :

En pratique, des valeurs d’HbA1c

supérieures à 15 % ou inférieures à
3.5 % conduisent à la recherche
plus approfondie
d’un variant de l’Hb
Présence de variants d’Hb:
 Interférences analytiques des anomalies quantitatives
de l’Hb

• Les taux d’Hb A sont réduits dans plusieurs

conditions dont les thalassémies (défaut de
production des chaînes alpha ou bêta).
• Dans ces cas, les formes mineures d’Hb comme
l’Hb A1, l’Hb A2 et l’Hb F ou encore des formes
anormales comme:
• l’Hb H remplacent avec plus ou moins l’Hb A
normale.
• une augmentation des taux d’HbF et d’HbA2
circulantes dans les ß-thalassémies
• l’hémolyse
Causes pathologiques et limitations analytiques
 Hb carbamylée et insuffisance rénale

cyanate

l’acide isocyanique se fixe sur

les groupements aminés
des protéines
« R°de carbamylation »
 Hb carbamylée et insuffisance rénale
• La valine N-terminale des chaînes ß de l’Hb est
particulièrement réactive avec l’acid isocyanique,
conduisant à la formation d’Hb carbamylée
• Les patients atteints d’insuffisance rénale sévère peuvent
avoir des taux d’Hb carbamylée de l’ordre de 3 %.
• Le point isoélectrique de l’HbA carbamylée est identique
à celui de l’HbA1c et peut potentiellement interférer dans
les méthodes basées sur la différence de charge.
• L’Hb carbamylée n’interfère pas avec les méthodes
immunologiques ou de chromatographie d’affinité
• En IRC une anémie chronique se rajoute rendant
l’interprétation encore plus délicate
• Intérêt de dosage de fructosamines
Pièges d’interprétation :
interférence des médicaments et toxiques
 Corrélation Glycémies moyennes & taux
d’HbA1c
• Glycémie moyenne (mmol/l)=2xHbA1c (%) – 6,0
Interpréation selon les valeurs de glycémies
moyennes et le taux d’HbA1c

• cahier d’autocontrôle ou le fichier extrait du

lecteur de glycémie capillaire d’un patient
doit faire suspecter un variant de l’Hb.
 Recommandations

• les résultats d’HbA1c doivent être

exprimés à la fois en mmol/mol (IFCC)
et en pourcentage (NGSP).
• Lesvaleurs usuelles sont de 4 à 6 %
(NGSP) et 20 à 42 mmol/mol(IFCC)
Recommandations
Recommandations
Recommandations
 Objectifs :
• hémoglobine glyquée et HbA1c
• fractions d’hémoglobine
• Définition et déroulement de la glycation
• Méthodes de dosage ; méthode de référence
comparaison de méthodes ;standardisation
• Variations physiopathologiques ,interférences
pièges analytiques limitations du dosage
• Utilisation de l’Hb glyquée pour le diagnostic du
diabète
• La place de la glycémie moyenne et démarches
d’interprétation.