Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Délétroz Raphy
CHROMATOGRAPHIE
1. Introduction p. 2
4. Chromatographie d'adsorption
6. Conclusions générales p. 13
7. Bibliographie p. 14
2
1. Introduction
C'est totalement par hasard que, en 1906, le botaniste russe Tswett inventa la chromatographie en voulant filtrer
des pigments végétaux. Il s'aperçut que son tube de verre, rempli de carbonate de calcium, séparait différents
composants de ses pigments qu'il put alors récupérer séparément; la chromatographie était née.
Depuis, la chromatographie a fait de gigantesques progrès. Elle ne se limite plus à de la séparation liquide sur
colonne; elle se décline de toutes les manières : HPLC, CCM, GC, avec fluides surcritiques, sur capillaire, avec
toutes les variations de phases stationnaire et mobile que cela implique.
Et c'est pourquoi la chromatographie est à l'heure actuelle la meilleure technique de séparation et un des "must"
en chimie analytique.
Les 3 aspects de cette technique que nous nous proposons de mieux cerner sont :
La chromatographie est avant tout une méthode physique de séparation dans laquelle les composants à séparer
sont répartis entre deux phases; l'une d'entre elles est constituée par un lit de matériau stationnaire, au travers
duquel s'infiltre la deuxième phase mobile. Le processus chromatographique est le résultat d'adsorptions et de
désorptions répétées lors de la traversée de la phase mobile à travers la phase stationnaire; la séparation obtenue
est due aux différences de temps de passage entre les différents composés de la solution.
La phase stationnaire
- polaire : par exemple, gel de silice, alumine, résines échangeuses d'ions, etc...
- apolaire : par exemple, hydrocarbures, etc...
On la trouve généralement sous forme de "grains" (parfois de gel (ex. silice)). La taille et le
tassement des ces derniers dans une colonne (granulométrie) ont une très grande importance
sur le résultat final. En général, les particules ont une taille allant de cinq à une soixantaine de
microns; on observe que plus les particules sont petites et serrées dans la colonne, plus les
pics du chromatogramme sont étroits et distincts, alors que les grosses particules donnent des
pics avec une allure plus "gaussienne" et plus rapprochés.
La phase mobile
La phase mobile, dite éluant, peut elle aussi être polaire ou apolaire.
Dans la chromatographie d'adsorption, on utilise en général une phase stationnaire polaire (gel de silice) avec une
phase mobile apolaire (ex. n-hexane, THF,...). Quelquefois cependant, on fait appel à la chromatographie à polarité
de phases inversée : la phase stationnaire est apolaire, et l'éluant polaire (ex. eau, alcool,...).
La chromatographie par échange d'ions se fait avec une phase mobile constituée par un tampon aqueux dont le
pH et la polarité peuvent être réglés pour modifier les temps d'élution.
3
La chromatographie d'adsorption (on écarte les résines ioniques) repose sur une règle cruciale : il ne doit pas y
avoir de réactions chimiques entre soluté, phase mobile et phase stationnaire. Les produits d'arrivée sont les
produits de départ !
Par contre, le but même de la chromatographie est de jouer sur toutes les interactions possibles entre les trois
éléments (on remarquera que la chromatographie liquide se distingue de la chromatographie gazeuse qui n'inclut
pas d'interactions entre le soluté et la phase mobile (gaz vecteur inerte)).
Les interactions
Les interactions possibles sont extrêmement nombreuses et ne sont, à l'heure actuelle, pas totalement bien
comprises; les phénomènes de surface sèment décidément la discorde parmi les scientifiques !
Attardons-nous un peu sur les différents facteurs qui peuvent influencer les temps de rétention de différents
composés.
1) Le facteur le plus important est probablement l'existence dans la phase stationnaire de groupements polaires,
comme (par affinités d'adsorption croissantes) -CH3 , -F, -NO2 , -OH, -NH2 ,...
Citons le gel de silice Si-OH, qui permet de séparer des composés de différente polarité (séparation). On l'utilise
avec un éluant de polarité à peu près égale ou légèrement inférieure que celle du soluté.
N.B. On peut greffer différents groupes fonctionnels autres que OH sur le Si.
L'élution
- l'O nucléophile du groupement hydroxyle fixe assez volontiers un site électrophile du soluté (adsorption)
- le courant de la phase mobile finit par décrocher le soluté (désorption) qui "vogue" jusqu'au prochain
groupemement hydroxyle, qu'il occupe s'il est libre (front inférieur) ou déloge s'il est déjà occupé (milieu de
bande).
4
2) Outre l'activité des groupements hydroxyles, il faut aussi compter sur la participation de forces de Van der
Waals (forces de Keesom, forces de Debey et forces de London, sur lesquelles nous ne nous attardons pas). Ce
sont des forces de type électrostatique entre les différents dipôles (permanents (Keesom) ou induits (Debey,
London)).
Ces forces peuvent jouer un grand rôle : on peut remarquer, comme exemple, l'O du groupement hydroxyle : doté
d'une charge partielle négative (δ-), il peut facilement interagir avec la partie δ+ éventuelle du soluté. Nous
étudierons un peu plus en détail ce phénomène dans le chapitre 4.
3) Les résines échangeuses d'ions poussent en quelque sorte ces interactions au maximum, puisqu'elles n'hésitent
pas à échanger certains de leurs ions contre d'autres. Nous nous y attarderons au chapitre 5.
Ainsi donc, on voit comment ces différentes interactions peuvent modifier le temps de passage des différents
composés du soluté (les composés les plus retenus sortent en dernier).
Ces adsorptions-désorptions répétées sont régies en général par des lois d'équilibre : les composés du soluté se
séparent entre la phase mobile et la phase stationnaire selon un équilibre :
A mobile ⇔ A stationnaire
On définit ainsi un "coefficient de partage" k = [A stationnaire] / [A mobile]; plus k est grand, plus le composé a
d'affinité avec la phase stationnaire et plus son temps de rétention est grand.
Ces équilibres répétés tout le long de la colonne peuvent être modélisés par la notion de "plateaux théoriques"
(on imagine la colonne constituée par de nombreuses "tranches" (plateaux) où s'établit chaque fois un équilibre).
Le nombre de ces derniers varie de quelques centaines pour les colonnes simples, à quelques milliers pour la
chromatographie gazeuse, et jusqu'à des centaines de milliers avec des capillaires ! Les séparations, à ce niveau,
sont fabuleuses !
Ces notions établies, nous pouvons revenir à des considérations un peu plus "macroscopiques" !
Allure du chromatogramme
Les composés qui sortent les uns après les autres peuvent être récupérés sur un détecteur qui peut tracer le
chromatogramme. La hauteur des pics (ou mieux, leur aire) est proportionnelle à la concentration du composé.
5
- tR est le temps de rétention d'un composé, càd le temps total depuis l'injection pour qu'il sorte en bas de colonne
- tM est le temps d'élution de la phase mobile, càd le temps "minimal" qu'il faut à l'éluant pour traverser la colonne
- tR' est le temps de rétention réduit du composé, càd le temps qu'il passe réellement adsorbé (= t R - tM)
De nombreuses autres variables peuvent être définies (volume de rétention, largeur de pic,...); nous ne nous
étalerons pas ici.
On établit alors de nombreuses formules mathématiques à partir de ces chromatogrammes. La théorie devient vite
compliquée, et il est totalement inutile d'en parler ici, puisqu'elle ne nous servira à rien pour les manipulations à
suivre.
On rajoutera enfin que de nos jours les chromatographes sont toujours (sauf à l'UNI !) accompagnés
d'intégrateurs qui intègrent immédiatement l'aire sous les pics.
Nous développons ici un type particulier de chromatographie : les résines échangeuses d'ions.
On rappellera succinctement le principe d'une telle résine (pour des détails, se référer aux ouvrages spécialisés : la
littérature ne manque pas !).
Ces résines ont la particularité de posséder des groupements fonctionnels (en général fixés sur une structure
organique, comme des polystyrènes) capables d'échanger des ions contre d'autres selon leur affinité pour la
résine.
Ces résines peuvent échanger des cations (ex. -SO3 -, -COO-,...) ou des anions (ex. -CH2 -NR3 +, -CH2 -NR2 ).
Citons la résine très utilisée que nous avons d'ailleurs utilisée pour notre manipulation : la résine sulfonate qui,
initialement, est sous forme d'acide sulfonique, et qui échange très volontiers ses protons contre des cations
métalliques.
6
L'affinité pour la résine varie donc d'un cation à l'autre : ainsi K+ < Ca 2+ < Al3+ (densité de charges -), et H+
+
< Na < K . +
L'éluant est un acide qui, par la règle d'équilibre, déplace peu à peu les cations dans la colonne et permet leur
séparation.
Souvent, les ions ont des affinités trop semblables pour pouvoir les séparer sur des colonnes de grandeur
raisonnable (on ne veut pas une colonne de 2 km !). On utilise alors des réactions de complexation pour faire la
différence.
L'éluant est une solution de glycinate d'ammonium H2 N-CH2 -COO-NH4 +. On citera le "zwitterion" possible (selon
le pH) avec ce composé :
Le pH est ajusté de façon suffisamment basique pour être en présence de l'anion glycinate (aminoacétate) H2 N-
CH2 -COO- : G-).
- au front supérieur, il y a désorption des cations M2+ emprisonnés dans la résine par formation d'anions
complexes qui peuvent alors circuler librement (la résine ne capte pas les anions) :
- dans la zone contenant les ions M 2+ des différents métaux, il s'établit un équilibre entre les différents complexes
(qui peuvent alors circuler librement) :
- au front inférieur de la zone, le complexe anionique [MG3 ]- est décomposé au contact de la résine acide :
Ainsi, le composé qui forme les complexes les plus stables passe le plus clair de son temps sous forme anionique,
et traverse donc le plus facilement la résine.
En plus de la séparation, on peut mettre en rapport la longeur de la bande avec la concentration du ion, et donc
déterminer cette dernière d'une solution inconnue en comparaison d'une solution étalon connue; inutile de
préciser que ceci est une approximation "sans scrupule" !
- Co 2+ 0.008 M
- Ni2+ 0.008 M
- Cu 2+ 0.008 M
La "traversée" de la colonne est très lente, même sous légère pression; les colonnes ont été abandonnées
pendant toute la nuit; lors du contrôle matinal, elles étaient toutes "vides", sauf la nôtre, qui nous avait
cependant causé des problèmes lors de la mise en place et l'introduction de la prise (donc, mise en garde contre
les résultats...).
Les 3 bandes se suivent dans l'ordre suivant : bleue (Cu), verte (Ni), puis rouge(Co). C'est donc le Cu 2+ qui forme
les complexes les plus stables.
On met donc en rapport la longeur de chaque bande avec la concentration de l'élément. Grâce à la solution étalon,
on peut établir le tableau suivant :
On fera tout d'abord remarquer que les concentrations calculées sont totalement approximatives : comment en
effet distinguer clairement le début et la fin de chaque bande ?
De plus,
- on a supposé les deux colonnes de même diamètre; le sont-elles exactement ?...
- le tassement de la résine n'est pas exactement le même dans les deux colonnes;
- nous avons eu des problèmes au début de notre expérience...
Bref, de très nombreuses sources potentielles d'erreurs; donc méfiance envers les résultats !
8
Comme dernière remarque, on rappellera l'utilité des résines échangeuses d'ions; en plus des nombreuses qualités
de séparation qu'elles offrent, c'est aussi elles qui fournissent la plupart du temps l'eau désionisée de nos
laboratoires (traitement sur une résine cationique/anionique mixte).
4. Chromatographie d'adsorption
Quittons un moment les résines échangeuses d'ions pour revenir à une phase stationnaire non réactive. On utilise
ainsi souvent le gel de silice (cf chapitre 2), ou l'alumine : c'est cette dernière que nous utiliserons pour séparer un
mélange de permanganate (MnO4 -) et de dichromate (Cr2 O7 2-).
Il nous faut rappeler qu'on obtient l'alumine (Al2 O3 ) par déshydratation des hydroxydes d'Al à basse température
(~450°C). Cette alumine a plusieurs formes d'hydratation allant de AlO-OH à Al(OH)3 .
Toutes ces formes ont de nombreuses opportunités d'interactions avec des molécules polaires comme MnO4 - et
Cr2 O7 2-.
L'élution se fait d'abord avec HNO3 0.5 M : elle permet d'éluer le permanganate, mais ne parvient pas à déplacer le
dichromate; il faut alors avoir recours à H2 SO4 2 M pour éluer ce dernier; nous tenterons d'expliquer pourquoi
dans le paragraphe "discussion des résultats".
Faisons tout de même remarquer que ce procédé de changement d'éluant est très courant en chromatographie de
séparation (très souvent aussi, on augmente graduellement la concentration de l'éluant, ce qui déplace différents
composés).
Le permanganate et le dichromate sont ensuite titrés par Na 2 S2 O3 0.01 M, après adjonction de KI en excès. Les
deux titrages se résument dans le tableau suivant :
MnO4 - Cr2 O7 2-
Réaction du MnO4 -
Réaction du Cr2 O7 2-
Quand on titre directement les deux produits, on trouve en gros les mêmes chiffres légèrement supérieurs, dû
assurément aux pertes pendant la chromatographie, particulièrement pour le Cr (colonne encore jaune).
! A voir ces chiffres, vraiment ridiculement petit, on se dit quand même que la molarité de Na 2 S2 O3 ne devait pas
être 0.01 M, mais beaucoup plus; malheureusement, mon collègue titreur ne sait plus quelle solution il a utilisée.
Donc, prière de ne pas regarder les concentrations et les mg; heureusement, le rapport Cr/Mn reste inchangé.
Avant toute chose, on dira que le titrage du dichromate est un vrai exercice d'équilibriste : y'a pas intérêt à être
daltonien pour espérer voir le virage bleu/vert - vert/bleu !
A part le titrage, pas très important, nous allons maintenant essayer de trouver pourquoi HNO3 n'arrive pas à
éluer le dichromate et pourquoi il faut recourir à H2 SO4 pour le faire.
Ce qui suit n'est bien qu'une tentative d'explication; elle est peut-être totalement fausse, mais comme on dit, c'est
la participation qui compte ! Elle a du moins le mérite de faire voir certaines interactions possibles entre la phase
mobile, la phase stationnaire et le soluté.
Examinons tout d'abord les interactions possibles entre l'alumine et les solutés.
On peut voir dans l'alumine deux "sites d'attache" pour un composé polaire.
1) le plus évident est donné par l'interaction des O δ- des groupes hydroxyles de l'alumine (sous sa forme
hydratée, AlO-OH...Al(OH)3 ). Cet O, ayant une forte densité de charges négatives, peut attirer des cations très δ+
comme Mn ou Cr, dont on rappelle ici la structure :
10
On voit déjà le gros avantage pour le Cr : il peut "s'attacher" à deux groupes hydroxyles, et donc on peut se dire
qu'il sera plus difficile de l'y déloger.
2) On peut aussi voir une réactivité chez Al2 O3 déshydratée; en effet, les deux Al n'ont pas une configuration
fermée (à 8 électrons de valence) : ils prennent donc un caractère électrophile, qui pourrait bien être satisfait par
les O nucléophiles de MnO4 - et Cr2 O7 2-.
De même pour le Cr; de nouveau, on remarque qu'une molécule de dichromate peut s'attacher sur deux Al en
même temps (avec 2 O).
et pour le dichromate :
On remarquera cependant que certaines molécules de dichromates restent attachées définitivement; il est vrai que
si toutes les interactions ci-dessus agissent simultanément, le dichromate s'incruste définitivement dans la résine
!
Voilà donc une belle tentative d'explication : quel que soit le verdict, elle a au moins le mérite de tenir debout. Elle
démontre en tout cas la finesse et la difficulté des phénomènes de surface.
La chromatographie ionique sur colonne (HPLC : High Performance Liquid Chromatography) est un peu
l'aboutissement de la chromatographie liquide : en remplaçant la gravité et la pression atmosphérique par de
hautes pressions (facilement autour de 100 bars; jusqu'à 450 bars !), elle permet des analyses très fines en des
temps remarquablement courts.
Notre manipulation consistera à séparer les chlorures (Cl-), nitrates (NO3 -) et sulfates (SO4 2-) de différentes eaux
et d'en analyser les concentrations.
On utilise pour cela le chromatographe ionique décrit dans le polycopié "Chromatographie ionique sur colonne"
et une colonne remplie d'une résine fixeuse d'anions de forme ammonium-quaternaire. Nous ne reviendrons pas
sur la théorie des résines échangeuses d'ions (cf chapitre 3). Les équilibres sont :
NB : les premiers pics "fous" du chromatogramme sont dits les pics d'injection : ce sont tous les ions (partic.
cations) qui n'ont pas été retenus dans la colonne (et arrivent tous en même temps sur le détecteur).
Le dernier pic est dit "pic système" : on suppose que c'est comme si la colonne "crachait" tout ce qui restait (à
vérifier...).
- Cl- 5 ppm
- NO3 - 10 ppm
- SO4 2- 10 ppm
Puis, on passe toutes les solutions à analyser (nettoyage à l'eau désionisée avant chaque analyse). On suppose
ensuite que la concentration est proportionnelle à la hauteur du pic (vrai si le pic est symétrique), ce qui permet de
déterminer les différentes concentrations. Les résultats sont résumés dans le tableau suivant (graphes en
dernière page) :
Eaux hteur Cl- conc Cl- hteur NO3 - conc NO3 - hteur SO4 2- conc SO4 2-
standard 12.1 cm 5.0000 ppm 7.7 cm 10.0000 ppm 1.7 cm 10.0000 ppm
robinet 16.8 cm 6.9628 ppm 1.9 cm 2.4675 ppm 1.8 cm 10.8824 ppm
de la Sorge dépassé ? 6.0 cm 7.7922 ppm 2.0 cm 11.7647 ppm
du Lac dépassé ? 1.7 cm 2.2078 ppm 1.8 cm 10.5882 ppm
Evian 16.4 cm 6.7769 ppm 2.4 cm 3.1169 ppm 1.9 cm 11.1765 ppm
Pour l'eau de la Sorge et celle du Lac, les chlorures étaient trop importants; il a fallu donc faire un nouveau
standard avec une sensibilité moindre.
On remarque que :
- l'eau de la Sorge contient beaucoup de chlorures et passablement de nitrates; ces derniers sont en effet produits
principalement par les engrais.
- l'eau du Lac contient relativement pas mal aussi de chlorures (heureusement, c'est pas encore la mer morte !)
14
- les sulfates sont partout à la concentration ~10 ppm; est-ce une valeur due à un produit de solubilité particulier
des sulfates dans toutes les eaux naturelles ?
En dehors de ces analyses, nous pouvons rajouter, pour avoir nous-mêmes eu le privilège d'utiliser cet appareil,
qu'il est très aisé d'utilisation; enfin de la chimie facile et agréable !
C'est actuellement la meilleure méthode de séparation connue; la chromatographie gazeuse en particulier permet
d'analyser des composés extrêmement compliqués (très nombreuses substances), avec des quantités d'analyse
infimes, et de donner des résultats spectaculaires.
Il n'empêche qu'on peut parfois émettre des réserves quant à la rapidité et l'aspect quantitatif limité de la
chromatographie. On ajoutera que la mise en place d'une colonne est assez délicate, et que la mesure visuelle des
longeurs des bandes est assez hasardeuse.
Ces désagréments disparaissent heureusement avec un appareillage moderne. La chromatographie prend alors
tout son intéret, d'autant plus que son coût par analyse reste modéré (l'appareil est tout de même assez cher à
l'achat...), comparé par exemple à celui d'une distillation fractionnée; cette dernière ne permet d'ailleurs pas de
séparer des produits thermosensibles.
La chromatographie est donc une méthode fiable, propre, qui a encore une longue vie devant elle.
7. Bibliographie