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Chromat 0809 PDF
Chromat 0809 PDF
1 Gnralits
Cours TB
2008 - 2009
2008-2009 Chromatographie 1
Introduction
2008-2009
2008-2009 Chromatographie 2
Chromatographie (1/2)
1 3 - tude thorique et modlisation
1 Gnralits 1 3 1 - Modlisation intuitive
1 1 Dfinition de la 1 3 2 - Volumes de rtention
chromatographie : principes 1 3 3 - Efficacit de la colonne et rsolution
gnraux 1 4 Divers temps dune
1 1 1 - Dfinition chromatographie sur colonne
1 5 Divers temps dune
1 1 2 - Caractres gnraux chromatographie sur colonne
1 2 - Diffrents types de 2 Principe et utilisation des
chromatographies
mthodes de chromatographie
1 2 1 - Classification selon ltat des 2 1 Chromatographie dadsorption
phases 2 2 Chromatographie de partage
1 2 2 - Classification selon le principe
2 3 Chromatographie par
des interactions entre solut et phase change dions
stationnaire 2 4 Chromatographie par gel filtration
1 2 3 - Classification selon le mode 2 5 Chromatographie par interactions
dimmobilisation de la phase biospcifiques
2 6 Chromatographie par interactions
stationnaire hydrophobes
1 2 4 - Classification selon les 2 7 Chromatographie par
modalits de migration de la phase chlation (IMAC = Immobilised
metal affinity
mobile chromatography )
2008-2009 Chromatographie 3
Chromatographie (2/2)
3 Mthodologie et
applications
3 1 Mthodologies 3 2 Applications
3 1 1 Chromatographie sur colonne 3 2 1 Sparation des acides
A - Chromatographie en phase liquide amins
B - Chromatographie en phase gazeuse 3 2 2 Sparation de mdicaments par
HPLC
3 1 2 Chromatographie de surface
A Mthodologie gnrale 3 2 3 Sparation des protines par
B Diffrence
FPLC
3 2 4 Autres applications
2008-2009 Chromatographie 4
Chromatographie
1 Gnralits
Commentaires :
phase : toute partie homogne dun systme.
trois tats physiques dune phase : liquide, gazeux et solide.
2008-2009 Chromatographie 5
Chromatographie
1 Gnralits
1 1 Dfinition de la chromatographie : principes
gnraux
1 1 2 - Caractres gnraux
- la sparation de soluts se ralise entre deux phases :
* une phase stationnaire, par dfinition immobile ; choisie
pour sa grande affinit pour les divers soluts ;
affinit
quels mcanismes ?
cependant, affinit pas trop importante : les soluts doivent pouvoir tre
dtachs
* une phase mobile qui entrane les divers soluts
2008-2009 Chromatographie 6
Phase Phase Phase Phase
stationnaire mobile stationnaire mobile
Cmo
Cst
Cst
K = -------
Cmo
>1
Schmatisation
2008-2009 Chromatographie 7
Chromatographie
1 Gnralits
1 1 Dfinition de la chromatographie : principes
gnraux
1 1 2 - Caractres gnraux
1 1 2 - Caractres gnraux
- la mise en oeuvre est possible :
lchelle laboratoire
lchelle prparative
* lchelle industrielle.
2008-2009 Chromatographie 9
Chromatographie
1 Gnralits
2008-2009 Chromatographie 10
Chromatographie
1 Gnralits
2008-2009 Chromatographie 13
Chromatographie
1 Gnralits
1 2 - Diffrents types de chromatographies
1 2 4 - Classification selon les modalits de migration de la
phase mobile
A - Chromatographie par lution
Sortie des soluts de la phase stationnaire : c'est le cas de la chromatographie sur colonne.
ELUANTS : solvants (tampons ) (le plus souvent mlange) qui ralisent la rupture diffrentielle
des interactions entre phase stationnaire et soluts
lution en faisant varier la composition du solvant (tampon) utilis : force ionique, polarit par
exemple soit d'une manire brusque (gradient discontinu) soit d'une manire continue (gradient
continu).
caractrisation des soluts dans l'luat .
Maintien des soluts dans la phase stationnaire : ils se dplacent dans la phase
stationnaire
c'est le cas des chromatographies de surface (papier et couche mince) o on rvle les soluts
encore prsents dans la phase stationnaire.
2008-2009 Chromatographie 14
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 1 Modlisations
2008-2009 Chromatographie 15
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 1 Modlisations
A Modlisation intuitive
- srie de barques sans moteur sur une rivire.
- courant est suppos constant, cest dire quil est identique que lon soit au bord de
la rive ou au milieu.
- les barques transportent des passagers dune ligne marque dpart une ligne
marque arrive .
- les barques, au gr des passagers, sont susceptibles de sarrter sur la berge durant
des temps variables.
2008-2009 Chromatographie 16
Chromatographie
1 Gnralits
Au temps 0,.. Elles
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 1 Modlisations
A Modlisation intuitive
1 Modle de barques sur une rivire :
Au temps zro
Courant
2008-2009 Chromatographie 17
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 1 Modlisations
A Modlisation intuitive
Dpart Arrive
- avance, dans le
courant, la mme
vitesse
2008-2009 Chromatographie 18
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 1 Modlisations
A Modlisation intuitive
Dpart Arrive
1 3 1 Modlisations
A Modlisation intuitive
2 Retour la chromatographie
chaque niveau,
partage du solut
- entre la phase liquide
et la phase gazeuse
(distillation)
- entre la phase
stationnaire et la phase
mobile
Colonne de chromatographie
2008-2009 Chromatographie 21
Colonne plateau
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 1 Modlisations
B Analogie chromatographie / distillation
Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941
Liquide appauvri Vapeur enrichie en
en solut volatil solut volatil
Plateaux thoriques
Colonne plateau
2008-2009 Chromatographie 22
2008-2009 Chromatographie 23
Chromatographie
1 Gnralits
tR
tR
0
2008-2009 Chromatographie 24
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 2 Le pic de chromatographie idal
2008-2009 Chromatographie 25
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 3 - Efficacit de la colonne et rsolution
A Efficacit de la colonne
1,2
sparation caractrise par le nombre effectif
de plateaux thoriques Neff .
Plus ce nombre est lev, meilleure est la
sparation. 11 Pic gaussien
On dmontre que :
tR2 L 0,6
Neff = ------- = --------- 0,5
= 1/2 / (8 Ln 2 )1/2
1/2
2 H
ou
H = L / N
tR
avec L, longueur de la colonne (en cm) tR
H, hauteur quivalente dun plateau
thorique (en cm) (HEPT)
t2, variance du pic (en units de temps)
2008-2009 Chromatographie 26
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 3 - Efficacit de la colonne et rsolution
A Efficacit de la colonne
1,2
2008-2009 Chromatographie 27
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 4 - Efficacit de la colonne et rsolution
A Efficacit de la colonne
Calculer de H partir de lquation de Van Deemter (CPG initialement).
H = A + B / u + C . U
8 . k . e2
H = 2 . dP . + 2 . . DM / u + --------------------------- . u
2 . (1 + k)2 . DS
: hauteur dun plateau thorique
: rgularit du remplissage
dp : diamtre des particules
: facteur de tortuosit
DM :: diffusivit de lchantillon dans la phase mobile
DS :: diffusivit de lchantillon dans la phase stationnaire
k : facteur de capacit
e : paisseur de la phase stationnaire (grains)
u : vitesse linaire de dplacement de la phase mobile
2008-2009 Chromatographie 28
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 4 - Efficacit de la colonne et rsolution
A Efficacit de la colonne
Calculer de H partir de lquation de Van Deemter (CPG initialement).
H = A + B / u + C . u
8 . k . e2
H = 2 . dP . + 2 . . DM / u + --------------------------- . u
2 . (1 + k)2 . DS
Hauteur dun plateau
thorique
2008-2009 Chromatographie 29
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 4 - Efficacit de la colonne et rsolution
A Efficacit de la colonne
Calculer de H partir de lquation de Van Deemter (CPG initialement).
H = A + B / u + C . u
: facteur correspondant B : facteur correspondant C : facteur correspondant la
aux chicanes, aux chemins la diffusion normale du diffusion dans la phase
diffrents entre les molcules liquide pendant lanalyse : stationnaire : rsistance au
: diffusion turbulente diffusion longitudinale transfert de masse
2008-2009 Chromatographie 30
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 4 - Efficacit de la colonne et rsolution
A Efficacit de la colonne
Calculer de H partir de lquation de Van Deemter (CPG initialement).
H = A + B / u + C . u
Hauteur dun plateau
thorique
B/u C.u
A
u
Conclusions :
- existence dun dbit optimum pour obtenir une hauteur minimale dun
plateau thorique (nombre maximal de plateaux thoriques)
- pour viter la diffusion (largissement des pics), il faut grains de faible
diamtre (mais pertes de charge)
- importance du remplissage Chromatographie
2008-2009 de la colonne. 31
Chromatographie
1 Gnralits
1 3 - tude thorique et modlisation
1 3 4 - Efficacit de la colonne et rsolution
B Rsolution
1 VR1 2 VR2 VR
2008-2009 Chromatographie 32
Chromatographie
1 Gnralits
1 4 Divers temps dune chromatographie sur
colonne
2008-2009 Chromatographie 33
2008-2009 Chromatographie 34
Chromatographie
1 Gnralits
1 5 Divers types de mise en uvre dune
chromatographie en phase liquide
- basse pression
- moyenne / haute pression ; actuellement
chromatographie haute performance (CLHP ou HPLC)
VR
2008-2009 Chromatographie 35
Chromatographie
Cours TB
2008 - 2009
2008-2009 Chromatographie 36
Chromatographie
2 1 Chromatographie dadsorption
2 1 1 Principe
Fixation, en gnral, par des liaisons lies la polarit
Support solide
Support solide + Adsorption Dsorption =
remplacement par
une autre molcule
2008-2009 Chromatographie 39
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 1 Chromatographie dadsorption
2 1 2 Phase stationnaire,
Solide insoluble, finement divis, "actif " (capable de fixer des
soluts)
- polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine : ces supports sont
activer .
- non polaire : carbone actif
- sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour
les protines
2 1 3 Phase mobile
Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG)
Ralise la rupture des liaisons solut - phase stationnaire
(phnomne de dsorption)
2008-2009 Chromatographie 40
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 1 Chromatographie dadsorption
2 1 4 Conditions de fixation et dlution
2008-2009 Chromatographie 41
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 1 Chromatographie dadsorption
2 1 5 Utilisation
- utilise pour la sparation des molcules organiques de masse molculaire
infrieure 1000 g.mol-1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire :
* fixation des colorants des vins et jus de fruits qui pourraient gner telle
ou telle mthode analytique. (phase liquide, chelle analytique)
* fixation de substances pyrognes existant dans une solution destine
lusage parentral. (phase liquide, chelle industrielle)
* sparation des acides gras (mthyls) (phase gazeuse, chelle
analytique).
2 1 Chromatographie dadsorption
Type Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'lution Mise en uvre et
d'interaction Applications
Fixation de soluts Solide insoluble, finement divis, Liquide (CPL) - Cas des liaisons polaires : - Sur colonne (CPL,
sur "actif " ou par ordre d'adsorption CPG)
un support solide capable de fixer des soluts) gazeuse (CPG) croissante, on a les - Sur couche mince
par - polaire : gel de silice (Kieselguhr), Ralise la esters, puis les ctones et (CCM)
ADSORPTION alumine rupture aldhydes, puis les alcools - Molcules
- Liaisons Ces supports sont activer des liaisons et les organiques
polaires - non polaire : carbone actif solut - amines et enfin les acides et (M < 1000 g.mol-1)
(le plus souvent) - sels de calcium : phosphate phase les comme
- Liaisons non tricalcique, stationnaire bases mtabolites,
polaires hydroxyapatite pour les protines (phnomne de Utilisation de gradients de mdicaments
(cas du carbone dsorption) solvants organiques - Sparation
actif) polaires d'hydrocarbures
- Cas des protines : gradient sur carbone actif
croissant de tampon - Protines :
phosphate recherche
(ancien)
2008-2009 Chromatographie 43
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 1 Principe
2 2 2 Supports
2 2 4 Utilisation
2008-2009 Chromatographie 44
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 1 Principe
Sol Sol
2008-2009 Chromatographie 45
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
Solubilisation dans Liquide polaire : eau, par exemple Solvants Gradient de polarit croissante - Sur colonne (CPL,
une organiques CPG)
n phase liquide peu polaires - Sur couche mince
o (adsorbe sur un (CCM)
r support - Petites molcules
m solide) polaires
a comme les acides amins
l
e
s
Solubilisation dans - Liquide apolaire plus ou moins visqueux Solvants Gradient de polarit dcroissante - Sur colonne (CPL,
une - Chanes hydrocarbones en C8, C16, C18, organiques CLHP)
i phase liquide adsorbe phnyl, fixes sur de billes de silice, plus polaires que la - Petites molcules
n sur un support ou agarose, rsine ou verre phase stationnaire apolaires, comme des
v radicaux hydrophobes drivs d'acides amins
e fixs sur un support
r solide
s
e
s
2008-2009 Chromatographie 46
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 2 Supports
- terme "support" prciser : matriau inerte qui sert de fixateur (inerte) la phase
stationnaire liquide. Il permet cette phase stationnaire dtre en un tat physique
liquide.
= support bien distinguer ici de la phase stationnaire.
- supports = solides finement diviss qui prsentent une trs grande surface, ceci afin
de retenir dans un petit volume une grande quantit de phase liquide ; rtention
nergique de phase stationnaire, sans interaction avec les soluts ; les proprits
dadsorption doivent tre totalement masques.
2008-2009 Chromatographie 47
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 2 Supports
2008-2009 Chromatographie 48
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 2 Supports
- billes de verres ; billes de silice ; peuvent faire lobjet de greffage de groupements
fonctionnels facilitant la fixation de la phase stationnaire : ralisation dune
silanation , cest dire traitement par des drivs permettant la fixation de
groupements hydrophobes (C6, C8, C16 et C18) = utilisation en phases inverses.
2008-2009 Chromatographie 49
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles
A - Les phases stationnaires
1 - Chromatographie en phases normales
2008-2009 Chromatographie 50
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles
A - Les phases stationnaires
2 - Chromatographie en phases inverses
- dune manire gnrale, phases stationnaires prpares par imprgnation (par exemple, en prsence
de solvant volatil) ou par greffage (utilisation des drivs halogns du silane).
2008-2009 Chromatographie 51
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles
B - Les phases mobiles
2008-2009 Chromatographie 52
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles
B - Les phases mobiles
2008-2009 Chromatographie 53
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 2 Chromatographie de partage
2 2 4 Utilisation
- utilise sur colonne, sur papier, sur couche mince et en phase gazeuse.
- sert la sparation de molcules organiques de masse molculaire infrieure
1000 g.mol-1
- sparation dantibiotiques, des substances anticancreuses, des mtabolites, de
substances prohibes (drogues, substances dopantes , ..)
- Phases normales (composs polaires)ou phases inverses (composs plus
hydrophobes)
- Remarque : une variante, la chromatographie par (de) paires dions (voir plus loin)
R1 + R3 R1 + R3
+
R2 R4 R2 R4
chantillon moins Complexe hydrophobe
hydrophobe
2008-2009 Chromatographie 54
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 3 1 Principe
2 3 2 Supports
2 3 4 Utilisation
2008-2009 Chromatographie 55
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2008-2009 Chromatographie 56
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 3 Chromatographie par change dions
2 3 1 Principe
()
+
+++ + + + + + +
++
++ + + + + +++
+
++ +++ +
+
( ) ()
par augmentation du pH
Extraction - purification des enzymes 58
2005 - 2006
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 3 Chromatographie par change dions
2 3 2 La phase stationnaire : les changeurs dions
A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'changeurs
Selon le type de charge de lion chang, et la charge de lchangeur,
on distingue :
- changeurs danions
- changeurs de cations.
2008-2009 Chromatographie 59
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 3 Chromatographie par change dions
2 3 2 La phase stationnaire : les changeurs dions
A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'changeurs
1 - les changeurs d'anions, changeurs sous forme cationique
Exemples de groupements fonctionnels porteurs de charge positive :
en gnral damines I, II, III, IV
groupements les plus classiques pour les protines : groupements DEAE et TEAE.
- CH2 - CH3
DEAE, Su O- CH2 - CH2 - N
- CH2 - CH3
(changeur faible, non ionis certains pH, pH acides)
- CH2 - CH3 pKA = 9,5 - CH2 - CH3
Su O- CH2 - CH2 - N + H+ <=====> S O- CH2 - CH2 - N+ - H
- CH2 - CH3 - CH2 - CH3
- CH2 - CH3
TEAE, +
Su O- CH2 - CH2 - N - CH2 - CH3
- CH2 - CH3
(changeur fort, ionis tous les pH)
2008-2009 Chromatographie 60
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2008-2009 Chromatographie 61
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
ECH Fixation de soluts par Billes de composs organiques naturels Liquide : tampons Gradient de pH (discontinu) et / ou - Sur colonne (CPL,
ANG des liaisons ioniques (dextrane, cellulose, ), synthtiques (Tris, phosphate, de force ionique croissante CLHP)
E entre charges (polyacrylamide, rsines, ) ou minraux citrate, ) de pH (discontinu ou continu) - Sparation d'ions (acides
D'IO opposes (faiblement (verre, silice, ) avec greffage de et de donns amins, ) et de
NS nergtique) groupements ioniss ou ionisables variant lors de macroions (protines,
changeant des anions ou des cations l'lution acides nucliques, )
- Anions : DEAE, AE,
- Cations : CM, SP,
2008-2009 Chromatographie 62
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2008-2009 Chromatographie 63
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2008-2009 Chromatographie 64
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
B - Elution
2008-2009 Chromatographie 65
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2008-2009 Chromatographie 66
Extraction - purification des enzymes 67
2005 - 2006
Charge + des protines
(cations) : sparation sur
changeur - (sur changeur de
cations)
CM
2 4 1 Principe
2 1 2 Supports
2 1 4 Utilisation
2008-2009 Chromatographie 69
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
- origine :
mise sur le march d'un gel hydrophile de dextrane artificiellement
rticul, le SEPHADEXTR, suite aux travaux en 1959 par PORATH et
FLORKIN.
2008-2009 Chromatographie 70
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'lution Mise en uvre et
Applications
GEL ABSENCE Liquide contenu dans les billes poreuses Liquide : tampons Simple percolation de la colonne - Sur colonne (CPL,
FILT d'interactions au sens dont la matire constitue le support (Tris, phosphate, par un tampon adquat, sans CLHP)
RAT strict Les supports sont des composs organiques citrate, ) de pH modification au cours de l'lution - Sparation de
ION Diffusion plus ou naturels (dextrane, agarose, ), et donns (lution isocratique) macromolcules (ADN,
moins grande dans un synthtiques (polyacrylamide, rsines, ) protines, ) selon leur
support poreux : les ou des composs minraux (verre ou silice) taille
molcules les plus - Dtermination de M par
grosses sont lues les la reprsentation :
premires Kav = - log M + b
2008-2009 Chromatographie 71
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 1 Principe
- pas de liaison entre solut et phase stationnaire = pas, ici, de "rtention
Remarques : .
- sparation selon la taille des molcules dun type de forme dtermin (en gnral
forme globulaire)
- possibilit de dterminer les masses molculaires.
2008-2009 Chromatographie 72
2008-2009 Chromatographie 73
vo
ve
vt
2008-2009 Chromatographie 74
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 1 Principe
A - La phase stationnaire
- constitue de grains de gel pourvus de pores de diamtres variables, ceci dans une
gamme permettant la diffusion des soluts de masses molculaires dtermines.
- pores de plus faible diamtre (diamtre minimal)
- pores de plus grand diamtre (diamtre maximal)
- ensemble de pores de diamtres intermdiaires
2008-2009 Chromatographie 75
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 1 Principe
B -La phase mobile :
- ne fait pas cesser des interactions entre soluts et phase stationnaire qui
nexistent pas
Copie
2008-2009 Chromatographie 76
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
Documents
2008-2009 Chromatographie 77
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2008-2009 Chromatographie 80
Mlange initial
CONSTITUANTS
NON SEPARES
CONSTITUANTS
NON SEPARES
2008-2009 Chromatographie 81
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 3 Conditions de fixation et dlution
B - Quantification ; dtermination des masses
molculaires
1 - Les divers volumes
a Description : dfinition des divers volumes
- Vo : volume mort
Aucune substance ne peut sortir avant ce volume : Vo, volume mort de la colonne
Il correspond au volume de phase mobile entre les grains du gel
- Vt : volume total de la colonne
Vt = volume du solut correspondant la percolation totale de la
colonne (extrieur et intrieur des billes)
- Ve : volume d'lution ; valeur intermdiaire entre vo et vt
2008-2009 Chromatographie 82
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 3 Conditions de fixation et dlution
B - Quantification ; dtermination des masses
molculaires
1 - Les divers volumes
b Interprtation de ces divers volumes
2008-2009 Chromatographie 83
Approche de la valeur de Vs
partir de lexpression du volume total de la colonne
Vt = Vo + Vs + Vg
Vs Vg
Vo
2008-2009 Chromatographie 84
CONSTITUANTS
NON SEPARES
CONSTITUANTS
NON SEPARES
vo
ve
vt
1 - Les grosses molcules
2 - Les petites molcules
3 - Les molcules de taille intermdiaire
Conclusion :
Sparation
2008-2009 Chromatographie 85
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 3 Conditions de fixation et dlution
B - Quantification ; dtermination des masses
molculaires
2 - Le coefficient de diffusion KD, le coefficient de diffusion accessible : Kav
a - Le coefficient de diffusion KD
2008-2009 Chromatographie 86
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 3 Conditions de fixation et dlution
B - Quantification ; dtermination des masses
molculaires
a - Le coefficient de diffusion KD
- Proprits du coefficient de diffusion
KD
1
0
Log MM
2008-2009 Chromatographie 87
KD
1
0 Log MM
Or, pour dterminer KD, il faut connatre Vs. ce qui nest pas
le cas ..
2008-2009 Chromatographie 88
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 3 Conditions de fixation et dlution
B - Quantification ; dtermination des masses
molculaires
b - Le coefficient de diffusion accessible KAV
Vt = Vo + Vs + Vg
do Vs = Vt - Vo - Vg
Or Vg est ngligeable. On peut donc admettre que
Vs = Vt - Vo
dtermination du coefficient de diffusion; alors appel
coefficient de diffusion accessible ... Kav (available = accessible)
Ve - Vo
Kav = ---------------
Vt - Vo
2008-2009 Chromatographie 89
vo v
ve vt
Log kDa
Kav
2008-2009
Copie Chromatographie 90
Courbes thoriques
Courbes exprimentales
KAV log MM
log MM 0 1 KAV
et Log MM = - c . Ve + d
2008-2009 Chromatographie 91
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 4 3 Conditions de fixation et dlution
B - Quantification ; dtermination des masses
molculaires
c - Dtermination de masse molculaire par chromatographie
de gel filtration
diverses oprations raliser :
2008-2009 Chromatographie 92
Dtermination de masse molculaire par chromatographie
de gel filtration 1/2
1 - Dtermination de vo et vt avec des substances appropries
Log kDa
Copie2008-2009 Chromatographie 93
Dtermination de masse molculaire par chromatographie
de gel filtration 2 / 2
Kav
Log kDa
Log kDaX
Copie2008-2009 Chromatographie 94
Exprience de dessalage
2008-2009 Chromatographie 98
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 5 Chromatographie par interactions biospcifiques
(chromatographie daffinit)
2 5 1 Principe
A - Gnralits
- condition sine qua non : solut sparer (protine) capable de se fixer rversiblement
un ligand spcifique qui est attach une matrice insoluble.
M + L <===== ML
Macro- Ligand Complexe
molcule attach
la matrice
2008-2009 Chromatographie 99
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 5 Chromatographie par interactions biospcifiques
(chromatographie daffinit)
( RL)/(L)
2 5 1 Principe
KA n (P)
A - Gnralits
M + L <===== ML
(M L)
KA = -----------------
(M) . (L)
n (P) (RL)
- valeurs de KA comprises ici entre 105 et 108 M-1
- dtermination de KA la mthodologie de Scatchard
- ( RL)/(L) = KA n (P) - KA (RL)
101
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 5 Chromatographie par interactions biospcifiques
(chromatographie daffinit)
Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'lution Mise en uvre et
Applications
- Fixation des soluts - Billes de composs organiques naturels Liquide : tampons - Gradient de pH (discontinu) et / ou - Sur colonne (CPL, CLHP)
par des interactions (dextrane, cellulose, ), synthtiques (Tris, phosphate, de force ionique croissante - Exemples d'application :
spcifiques avec un (polyacrylamide, rsines, ) ou minraux citrate, ) de pH et (discontinu ou continu) interaction enzyme -
ligand fix par (verre, silice, ) avec greffage d'un ligand donns. - Gradient de ligand de meilleure substrat, antigne -
covalence sur un par covalence Variation au cours affinit anticorps, hormone -
support solide - Exemples de ligands (classiquement de de l'lution et / ou rcepteur,
- Interactions protine - petites molcules) : 2',5'-ADP, 5'-AMP, tampon contenant Trs efficace lors de la
ligand caractrise par arginine, bleu Cibacron, calmoduline, une substance plus purification des enzymes
la constante de polyU, protine A, protine G, forte affinit pour le
dissociation "KD" ligand
C La phase mobile
- Tampon faisant diminuer les interactions entre soluts et phase stationnaire (ligand) ou
contenant un ligand ayant davantage daffinit pour le solut macromolculaire.
c - Ractions de fixation
Copie
2008-2009 Chromatographie 110
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 5 Chromatographie par interactions biospcifiques
2 5 3 Conditions de fixation et dlution
A Fixation des soluts
Copie
2008-2009 Chromatographie 119
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 5 Chromatographie par interactions biospcifiques
2 5 3 Conditions de fixation et dlution
B - Elution
1 - Sortie des substances non fixes (luat 1)
Passage d'un tampon faisant sortir de la colonne ce qui n'est pas fix.
3 - Elution spcifique
utilisation de substances ayant une plus grande affinit pour le ligand ou
pour la macromolcule :
- substrats ou inhibiteurs rversibles de la macromolcule s'il s'agit d'un enzyme
- autre ligand ayant plus grande affinit pour la macromolcule : NADP+ dans le
cas de l'AMP 5'
Remarque :
ncessit dliminer (par exemple par gel filtration) les produits utiliss pour l'lution :
sels,
lautre ligand, ....
Copie
2008-2009 Chromatographie 123
Ligand Substances spares
Copie
2008-2009 Chromatographie 124
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 5 Chromatographie par interactions biospcifiques
2 5 4 Utilisation
A Sparation dune molcule prsente dans un
mlange
1 - Spcificit absolue
Sparation spcifique dacides nucliques :
Introduction : historique :
expriences de "contrle" effectues lors du dveloppement des supports de
chromatographie d'affinit
tude du comportement de matrices contenant des bras espaceurs en l'absence de
ligands
dans la plupart des cas, aucune fixation notable = comportement espr
dans certains cas (bras hxamthylne), forte liaison des enzymes mme en
l'absence de groupements chargs (amine ou carboxylique ) aux extrmits qui
auraient pu fonctionner comme des changeurs d'ions
utilisation pour la sparation de protines dune chromatographie d'interactions
hydrophobes , c'est--dire dune chromatographie fonde sur les interactions entre
des chanes aliphatiques d'un support et les rgions hydrophobes la surface de
protines.
2 6 1 Principe
- prsence de rsidus superficiels non polaires chez beaucoup de protines
2 6 1 Principe
2 6 1 Principe
- possibilit dutiliser ces interactions entre ces groupements et des groupements non
polaires fixs un support fixe.
A - Phase stationnaire
- supports classiques possdant des groupements hydrophobes
B - Phase mobile
- diminution de la temprature
- utilisation de solvants organiques
- diminution de la force ionique (remplacer le sulfate d'ammonium par du
chlorure mercurique)
- diminuer la polarit de l'luant (thylne glycol - SDS)
- diminuer le pH : rduction des effets d'change d'ions dus aux charges
positives associes au couplage de l'isoure dans la matrice.
R3 R3
R1 + R1 +
+
R2 R4 R2 R4
Agent de la ralisation de la
paire dions chantillon moins Complexe hydrophobe
hydrophobe
- des sels dammonium quaternaires tels que les ttrathyl ou
ttrabutylammonium (+Nbu4) pour les composs ioniques
- des alkylsulfonates pour la sparation des cations forms par protonation des
amines
- favorise leur rtention sur les silices greffes n-octyle : C8 ou n-octadcyle : C18 =
sparation possible de composs ioniss ou ionisables.
2008-2009 Chromatographie
Phases rverses
145
R3 R3
R1 + R1 +
+
R2 R4 R2 R4
Bu
Bu - N+ - Bu Bu - = CH3 CH2 CH2 CH2
butyl
Bu
2008-2009
Copie Chromatographie 147
- technique utilise pour la sparation du fibrinogne, de la superoxyde
dismutase et des protines nuclaires diffrentes des histones
- Utilisation pour des protines recombinantes (de fusion) dans
lesquelles
2+ sont inclus des tags (poly His) qui fixent des ions
(Ni )
- protines de fusion : protines obtenues par gnie gntique (expression
dans une cellule hte E. coli) comprenant :
- la protine dintrt
- un morceau ( domaine ) dune protine servant de marqueur (tag) :
ici poly His
(mieux accepte par la cellule hte + facilit de sparation)
Fixation des protines
2+ 2+(azote de His) par
2+
lintermdiaire
2+ 2+
dions
2+ 2+
minraux
2+ (Me = Ni par exemple (Zn , Cu , Cd , Co Hg et
Ni )).
- lution par EDTA, par exemple
Extraction - purification des enzymes 148
2005 - 2006
Protines de fusion
Squence tag gne dintrt ADN recombinant = obtenu
par gnie gntique
Expression
3 Mthodologie et applications
Cours TB
2003 - 2004
1 Gnralits
1 1 Dfinition de la 1 3 - tude thorique et modlisation
chromatographie : principes
gnraux
1 1 1 - Dfinition 1 3 1 - Modlisation intuitive
1 1 2 - Caractres gnraux 1 3 2 - Volumes de rtention
1 2 - Diffrents types de 1 3 3 - Coefficient de partition,
chromatographies constante de distribution
1 3 4 -Facteur de capacit, facteur de
1 2 1 - Classification selon ltat des partition
phases
1 3 5 - Facteur de slectivit
1 2 2 - Classification selon le principe
des interactions entre solut et phase
1 3 6 - Efficacit de la colonne et rsolution
stationnaire
1 2 3 - Classification selon le mode 1 3 7 - Reprsentation schmatique
dimmobilisation de la phase dune chromatographie
stationnaire
1 2 4 - Classification selon les
modalits de migration de la phase
2008-2009
mobile Chromatographie 153
Chromatographie
3 1 2 Chromatographie de surface
A Mthodologie gnrale
B Diffrences
convexe
concave
Volume de Volume de
phase mobile Existence de gradients phase mobile
2008-2009 Chromatographie 162
dcroissants
Appareil gradient
Intensit de P
C1 C2
Volume de
V1 V2 phase mobile
Vers colonne
d'o le
Concept de
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) ou
Chromatographie Liquide Haute Pression(CLHP)
Conclusion :
On distinguera :
- chromatographie basse pression
- chromatographie moyenne et haute pression
(chromatographie haute performance)
- Colonne
1 - Taille
Conclusion :
- basse pression : technique souvent manuelle ; mise en uvre prparative
- moyenne et haute pression : grand degr d'automatisation et d'informatisation :
toutes parties performantes : appareillage sophistiqu, utilisation aide par l'informatique ;
mise en uvre analytique et industrielle
2008-2009 Chromatographie 174
Chromatographie
3 Mthodologie et applications
3 1 Mthodologies
3 1 1 Chromatographie sur colonne
A - Chromatographie en phase liquide
2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit.
a Appareillage schma d'une systme basse pression
Rservoir dluant
Robinet Injection
Sortie de colonne
Robinet Injection
Sortie de colonne
a1 - colonne
taille de l'ordre de 30 cm de haut,
diamtre 1,6 cm (en moyenne)
support en fonction du type de
chromatographie choisi, c'est--dire en fonction
du mlange de soluts : exemple PHARMACIA :
gel filtration, change d'ions, affinit, interactions
hydrophobes ...
a2 Phase mobile
rservoir : un ou deux
pompe pour pression constante
(suprieure la pression atm), gradient (?)
2008-2009 Chromatographie 180
2008-2009 Chromatographie 181
2008-2009 Chromatographie 182
2008-2009 Chromatographie 183
Chromatographie
3 Mthodologie et applications
3 1 Mthodologies
3 1 1 Chromatographie sur colonne
A - Chromatographie en phase liquide
2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit.
a Appareillage
a3 Dispositif dinjection
simple par une seringue
ou robinet plusieurs voies (voir schmas
appareillage PHARMACIA)
a4 - Dtection
manuelle (discontinue) ou spectrophotomtre
280 nm ou autre longueur d'onde (254 nm)
a5 - Recueil des fractions
- manuel : discontinu
- collecteur de fractions
a6 - Rsultats ; leur traitement
Abs A B C
Diagramme dlution
dun standard
(solution des divers soluts
de concentration connue et
traite dans les mmes
conditions )
Dtermination de
talon externe
= SstA / CstA
tr
Conclusion :
mg de produit.
a3 - Injecteur
boucle d'injection de FPLC : systmes boucles : voir document
PHARMACIA
systmes en HPLC
2008-2009 Chromatographie 190
2008-2009 Chromatographie 191
2008-2009 Chromatographie 192
Schma dun appareillage FPLC
b3 - lution
gradient continu de phase mobile : 2 3 (ou plus phases mobiles)
mlanges selon un gradient programm ; recueil des fractions
Diagramme dlution
dun chantillon
tr
talon externe talon interne
Abs Abs
tr tr
Diagramme dlution Diagramme dlution
dun standard dun chantillon
(solution des divers soluts de avec talon interne
concentration connue et traite dans les
mmes conditions )
2008-2009 Chromatographie 202
Dtermination des concentrations
des diffrents soluts dun chantillon
A B C
Abs
Diagramme dlution
dun chantillon
Dtermination de
la surface SdA
Cd = Sd /
Cd = Sd . SstA / CstA tr
Abs A B C
Diagramme dlution
dun standard
(solution des divers soluts
de concentration connue et
traite dans les mmes
conditions )
Dtermination de
talon externe
= SstA / CstA
tr
- grande puret,
- inertie par rapport aux substances chromatographier,
- trs faible viscosit (la viscosit des gaz augmentant avec la temprature, il y
aurait d'importantes diminutions de dbit) ;
-conductibilit thermique compatible avec le systme de dtection
- les plus employs : azote, argon, hlium et hydrogne.
- conserv dans des bouteilles mtalliques sous forte pression ; introduit aprs
passage dans des dtendeurs dans le systme chromatographique sous des pressions
allant de 1 4 bars
a3 Dbit ; sa rgulation
e - Le dtecteur
e2 - Catharomtre
e - Le dtecteur
e3 Capture dlectrons
e4 Spectromtrie de masse
b2 - Raction d'alcoylation
- remplacement d'un H mobile par une radical R alcoyl (chane hydrocarbone)
b3 - Raction d'acylation
- remplacement d'un H mobile par une radical R acyl (chane hydrocarbone d'un
acide organique)
Remarque : Utilisable pour de petites molcules, pas d'application aux
macromolcules ; utilisation pour les alcools, ce qui sort d'un fermenteur
- technique la
plus simple : maintien de la pression et la temprature
constantes dans la colonne : chromatographie isotherme et isobare.
- pour viter de trop long temps de migration d'augmenter progressivement
la temprature de la colonne selon un programme prtabli (gradient de
temprature) : chromatographie temprature programme ; l'augmentation
de temprature modifie le dbit gazeux ce qui conduit l'emploi d' un
systme de rgulation automatique de dbit en fonction de la temprature.
Les tempratures les plus utilises : 80 300 C
A Mthodologie gnrale
B Diffrences
3 Dpts
- quidistants
5 Rvlation
raction colore permettant de mettre en vidence les soluts sous
forme de taches = spots
nature chimique des ractifs utiliss (corrosivit)
Dpt
Rf = d / D
Dref d
Dpt
Rf = d / DRef
Dref d
Dpt
Rf = d / DRef
- 80 cm : chromatographie
descendante
Phase organique
Phase aqueuse
- plaques 20 X 20 cm maximum :
souvent plus petites
- Ascendante
puis
soit soit
3 2 4 Autres applications
Charge - des
protines (anions) : DEAE
sparation sur
changeur + (sur
changeur danions)