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Biologie Moleculaire
Biologie Moleculaire
Chapitre. 3
Systèmes de mutation & de réparation de l’ADN in
vivo.
Chapitre. 4
Biologie moléculaire du cancer
(Proto-oncogènes, oncogènes, apoptose & agents
anti-cancer).
Chapitre. 5
Biologie moléculaire des virus, viroïdes & prions
(Analyse moléculaire & moyens génétique de
diagnostique & de traitement).
Chapitre. 6
Outils, techniques & applications de biologie
moléculaire.
OBJECTIFS DU COURS :
Partie Biologie Moléculaire
Transmettre à l’étudiant :
Objectifs:
•3 109 pb,
•100.000 gènes,
•46 chromosomes
(2 x 23)
La télomérase possède une matrice qui lui est propre et qui est
une matrice d’ARN, elle va se fixer à l’extrémité 3’:
(3’ brin parental + télomérase)
L’activité des télomérases est très réduite ou nulle dans les cellules
normales en culture. Après plusieurs réplications, les chromosomes
perdent leurs télomères et deviennent instables.
Par contre dans les cellules cancéreuses, l’activité des télomérases
est augmentée.
Les télomères ainsi que les gènes & les activités des télomérases
ont un intérêt primordial dans la recherche des phénomènes
moléculaires de vieillissement, de longévité & d’immortalité
cellulaire.
TERMES CLE EN BIOLOGIE
MOLECULAIRE
I.6. PSEUDOGENES
Les duplications:
se produisent en tandem, une séquence se trouvant répétée deux
fois dans le génome à la suite de la duplication.
Cette duplication permet à chacune des copies de la séquence
d’évoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de
produire des caractères nouveaux.
Les transpositions:
résultent de l’incorporation d’acides nucléiques synthétisés hors du
génome :
• soit par incorporation du DNA d’un virus,
• soit par transcription reverse d’un RNA de la cellule ou d’un virus,
au moyen d’une reverse-transcriptase qui produit un DNA
complémentaire (cDNA) et d’une transposase qui l’incorpore au
génome de la cellule.
Conversion de gène:
•Une seule chaîne nucléotidique (au lieu de deux dans les ADN).
Cette unique chaîne est plus courte que les chaînes d’ADN.
Les règles d’appariement entre les bases complémentaires
peuvent s’observer dans les ARN.
•Dans certains cas: une même chaîne d’ARN peut s’auto hybrider
où les portions bi caténaire ont un appariement suivant la règle:
A apparié avec U (deux liaisons hydrogène) et C apparié avec G
(trois liaisons hydrogène).
Ainsi les régions appariées donnent des tiges & les régions non
appariées donnent des boucles (structure en cruciforme) .
LES DIFFÉRENTS TYPES D’ARN.
Chez les eucaryotes, les ribosomes sont plus gros (80 S) avec
également une structure à deux sous-unités (40 S et 60 S).
.
LES ARN DE TRANSFERT (tARN).
•Les tARN sont les vecteurs qui vont transférer les acides aminés
jusqu’à l’usine ribosome où s’effectue la synthèse protéique.
•Structure des tARN.
Les tARN présentent bien entendu la structure générale des ARN.
Mais ils possèdent en plus quelques particularités propres.
Leur durée de vie est très courte à la différence des tARN par
exemple. Chez les bactéries, la durée de vie d’un mARN est de
quelques minutes environ.
Expression Génétique :
Transcription &Traduction
AGAGTCGTCTCGAGTCA...
...TCTCAGCAGAGCTCAGT
• Écrire à la suite les lettres A, C, G et T dans l’ordre où on rencontre les
nucléotides sur l’un des brins de l’ADN de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’
aboutit à un texte.
Transcription
antisens=transcrit.
5’….AGCUUAACGCGUA…. 3’ mRNA
1.A. La transcription
• Les nucléotides qui précèdent l’exon contiennent de nombreuses
séquences reconnues par des protéines nucléaires qui permettent
le début (initiation) & la régulation de la transcription. C’est le
promoteur
• On distingue en particulier :
— vers -20 -30 (20 à 30 nucléotides en amont de l’exon 1 en
direction de l’extrémité 5’ du brin sens) une séquence TATATA
appelée « boîte TATA », qui est spécifiquement reconnue par la
protéine TFIID, cofacteur de la RNA-polymérase II ;
— vers -80 une séquence GGCCCATCCAT à la fois « boîte CAT ou
CAAT » et « boîte GC », sur laquelle viennent se fixer d’autres
protéines de la transcription (CTF et Sp-1) ;
— de nombreuses autres séquences sont des sites de fixation des
protéines régulatrices de la transcription. Par exemple, une
séquence TRE (TGACTCA) au début de la troisième ligne de la
sequence, sur laquelle vont se fixer des protéines de la famille AP-1
pour activer la transcription.
Cis- et trans-régulateurs
• Les séquences de nucléotides du promoteur=(facteurs cis-
régulateurs), sont reconnues par une classe de protéines
spécifiques=(facteurs trans-régulateurs) dont la structure permet
une liaison avec l’ADN (DNA binding proteins).
• Les exons, parties codantes, sont ensuite liés entre eux bout
à bout (épissage), pour établir la séquence primaire de l’ARN
messager.
• L’intron, libéré sous forme de lasso, est détruit par des nucléases. Le
transcrit perd successivement tous ses introns et les exons épissés
constituent la séquence codante du messager.
RNA Messager
• L’ARN messager comprend plusieurs séquences :
— une séquence 5’ non-codante, qui ne sera pas traduite, qui correspond
à l’exon 1 et à une partie de l’exon 2 dans le gène de l’apoA-II ;
• Un ARNt chargé vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au fond
du site A va se lier complémentairement avec l’anticodon de l’ARNt du nouvel
acide aminé ce qui va permettre l’incorporation de cet acide aminé dans le
peptide en cours de synthèse.
Transfert du peptide
Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situé sur l’ARNt du site P sur
la fonction amine de l’acide aminé de l’ARNt du site A. Il utilise pour cela,
l’énergie de l’hydrolyse de la liaison ester riche en énergie entre le peptide et
l’ARNt du site P.
Translocation des codons
• L’ARNt libre du site peptidique quitte le ribosome.
• Le messager, l’ARNt restant et le peptide en cours de synthèse sont alors
déplacés (translocation) du site A vers le site P, sans qu’il y ait fusion de
l’hybride entre le codon et l’anticodon
Terminaison de la traduction
Caractéristiques générales.
réplication dite semi-conservatrice. Ceci signifie que sur les deux brins
d’ADN, on a toujours un brin d’ADN qui provient d’un des deux brins de
l’ADN parental et un brin nouvellement formé. A chaque réplication, les deux
brins d’ADN parental se séparent, chacun de ces deux brins sert de matrice
pour la synthèse d’un brin complémentaire.
Terminaison de la réplication.
IL existe au moins 6 sites de terminaison ou sites (ter) de terminaison dans le
génome bactérien. Une protéine spécifique appelée Tus peut se lier aux sites de
terminaison.
Cette liaison arrête la protéine dnaB (hélicase).
LA RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES EUCARYOTES
•Caractéristiques générales.
La réplication de l’ADN chez les eucaryotes est tout à fait
comparable à la réplication de l’ADN chez les procaryotes.
Elle est généralement bidirectionnelle, elle est discontinue entre les
deux brins d’ADN. Des amorces d’ARN sont nécessaires. Cette
réplication est également complémentaire, antiparallèle et dans le
sens 5’à 3’.
•Caractéristiques particulières.
La réplication se fait en de nombreux points d’initiation. Elle fait
intervenir un nombre d’ADN polymérases plus important que chez
les procaryotes. De nombreuses protéines interviennent comme
facteurs de réplication.
Les changements subis par les nucléosomes au cours de la
réplication de l’ADN eucaryote & la réplication de l’ADN des
extrémités chromosomiques (ou télomères) ont un rôle primordial
dans la régulation du cycle & de la division cellulaire.
Mutations génétiques & systèmes de réparations
LES TYPES DE MUTATION DE L’ADN.
- Les duplications.
GÉNÉRALITÉS.
Intervient, la proteine du gène uvrD, qui est une hélicase II, elle déplace
l’oligonucléotide endommagé
juxtapositions aberrantes
une translocation chromosomique interessant le
chromosome 8 et le chromosome 14.
Il a été démontré que la translocation entraine un échange
de matériel entre la région du proto-oncogène c- myc située
sur le chromosome 8 et une région codant pour des gènes
d'immunoglobulines (Ig). L'activation de c-myc se traduit par
son expression anormale en quantité ou en durée dans le
cycle cellulaire. La translocation survient à l'occasion d'une
erreur de recombinaison génétique au cours des
réarrangements des gènes des Ig.
fusions de 2 gènes
Elle se caractérise par la présence dans 90 % des cellules
tumorales d'une translocation entre les chromosomes 9
et 22 au cours de laquelle le proto-oncogène c-abl du
chromosome 9 est fusionné avec une séquence du
chromosome 22 toujours retrouvée au niveau du point de
cassure et appelée pour cette raison "breakpoint cluster
region" (bcr); le produit qui résulte de cette fusion est
une protéine anormale qui présente l'intérêt diagnostique
de pouvoir être détectée en l'absence d'anomalie.
Délétions chromosomiques
Elles ont été mises en évidence dans le cadre de l'étude des cancers
héréditaires où elles ont conduit à la notion d’anti-oncogènes".
La constatation de la perte de la tumorigénicité d'une cellule hybride
obtenue par fusion entre une cellule maligne et une cellule normale,
a conduit à la notion de "gènes suppresseurs" dont l'inactivation
pourrait tout aussi bien être responsable de la croissance tumorale
que l'activation des oncogènes.
gène P53:
localisé sur chromosome 17
Code pour une protéine de 53 kD
« DNA-binding nuclear protein »
« Transcription factor »
Facteur clef de la régulation du cycle
cellulaire
Perte de fonction de P53
Cause des types multiples de cancer
Thérapie Conventionnel du Cancer
Traitements disponibles du cancer :
Radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie & Chirurgie,
Médicaments anticancers
•Médicaments alkylants (Endoxan): perturbent la réplication
& empechent les deux brins d’ADN de s’écarter.
Thérapie Génique du Cancer .
Utilisation des gènes suppresseurs des tumeurs qui
existent Naturellement dans la cellule ou des gènes
d’antitopoisomerases,
Lipofection
Complexes Liposome-DNA.
Essays de Thérapie géniques du cancer
& des maladies génétiques, infectieuses et métaboliques
Premier transferts de gènes ont été approuvés en 1989 « marker
gene »,
Premier protocole fédéral de thérapie génique a été approuvé en 1990
pour le traitement de l’ (ADA ): Adenosine DeAminase deficiency
(Une déficience héréditaire, recessive qui cause la « Severe Combined
Immunodeficiency Syndrome SCID ».
Types: A, B, C, D, E;
différents structures, modes de contamination & pouvoir pathogène
HBV
•Virus à ADN, génome < 5 kb,
•Génome double brin partiel:
•Brin long (-) antisens = 3,2 kb
•Brin court (+) sens =longeur variable
•Génome circulaire, complémentarité partielle (200nt) à l’extrémité 5’des
deux brins.
•Génome particulier: Gènes chevauchants permettent à un petit génome
3,2 kb de coder pour plusieurs protéines
•Une sequence à 3 cadres ouvert de lecture (ORF): transcrit 3 RNA &
traduit 3 protéines
Gènes codant & protéines de HBV
P DNA polymerase
Virus à ADN
Prevention de HBV:
Vaccins:
Protéine Ag = HBs
Péptide synthétique = oligopeptide antigénique de HBs
3 gènes de structure:
•Gag (prot: interieur de env, majeur de capside & nucléocapside)
•pol (région code pour retrotranscriptase, integrase & protéase)
•Env (Glycoprotéine de l’enveloppe)
6 gènes régulateurs:
•nef ( Negative regulatory factor = latence)
•Tat (Transcription trans activator)
•Rev (Regulatior of expression of virion protéines)
•Vif ( virion infectivity factor = augmente pouvoir infectieux)
•Vpr
•& Vpu ou Vpx
•Reconnaissance & affinité pour les protéines de surface la c hôte
•Injection du RNA viral dans c hôte
•RNA viral donne DNA viral par reverse transcriptase
•Intégration de HIV dans DNA de C Hôte par les bouts LTR
•Latence virale séronégatif
•Test ELISA (Enzyme Linked Immuno essay) detecte présence d’Ac anti HIV
•Test de confirmation: Western blot
•Tests tardifs
•Tests precoces : Rt PCR détection RNA viral,
PCR détection DNA viral
Ciblage Moléculaire HIV
Gène sur Chromosome 20, avec 2 exons dont un seul (ex: 2) est codant,
Transmission de maladie:
10% à 15% hérédité
Contamination: Hormones de croissance (cadavres)
Greffes de cornée
Instruments neurochirurgicaux
Consommation d’abats ou de viandes contaminéés
Hypothèse Prusiner:
Accumulation de PrPsc dans les lysosymes qui éclatent & les enzymes
Lysosomales endommagent les cellules nerveuses.
Nomenclature:
Exemples:
Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC
Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG
Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G
Type de coupure:
« Cohesive ends » = cos ends
•CLONAGE
•EXTRACTION ADN, ARN
•DIGESTION DE L’ADN PAR LES ENZYMES DE RESRTICTION
•SEPARATION DE L’ADN & L’ARN SUR GEL D’AGAROSE
•SEPARATION DES PROTEINES SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE
•VISUALISATION DE L’ADN: COLORATION AU BROMURE
D’ETHIDIUM
•TRANSFERT DE L’ADN, L’ARN & LES PROTEINES SUR
MEMBRANES DE NITROCELLULOSE « SOUTHERN, NORTHERN &
WESTERN BLOTS »
•MARQUAGE DES SONDES, HYBRIDATION & AUTORADIOGRAPHIE
•SEQUENÇAGE D’ADN.
•PCR
•ORGANISMES TRANSGENIQUES
•EMPREINTES D’ADN
•RFLPS
•HYBRIDATION IN SITU.
LA PCR EN TEMPS RÉEL
FDA-approved kit for HER-2 testing by FISH and follow the scoring and interpretation
recommended by the manufacturer. In this procedure, the chromosome 17 centromere
is marked with a green florescent signal and HER-2 gene with an orange florescent
signal. A tumor is designated as “positive” for gene amplification if gene-to-
chromosome (17) ratio is >2.0
Microarrays: Biopuces
La biopuce à ADN est une plaque de verre ou de silicium sur laquelle sont gravées un
grand nombre de microcuvettes.
Sur chacune d’entre elles, on accroche une séquence de bases d’ADN, qui joue le rôle
de sonde et qui est caractéristique d’un gène, d’une mutation ou d’une maladie.
On prélève alors de l’ADN sur le patient et on le verse dans les microcuvettes.
L’ADN-sonde se liera avec l’ADN du prélèvement si et seulement si les séquences sont
complémentaires. On lave ensuite la biopuce.
Pour permettre la lecture du résultat, on a préalablement accroché à l’extrémité de
l’ADN du prélèvement une molécule fluorescente.
Ainsi, dans les microcuvettes où il y a eu appariement, l’ADN du prélèvement est resté
accroché à l’ADN-sonde et est visible à la lumière ultraviolette grâce à la molécule
fluorescente.
Dans les microcuvettes où il n’y a pas eu d’appariement, l’ADN du prélèvement a été
enlevé par le lavage et il n’y a pas de signal lumineux.
Techniques de diagnostique génétique du cancer
FISH
PCR en temp réel
microarrays ou Biopuces
Permettent
• La détection des mutation de marqueurs génétiques de
cancer
• La détection de l'amplification génique de marqueurs de
métastase
• Orientent vers un pronostic plus précis
• Des choix thérapeutiques mieux ciblés
• Une meilleure prise en charge des patients cancereux
• Un diagnostic précoce ou préventif (PCR en temps réel
& microarrays)