1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont

on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) :

tr
MM
(min)

Aldolase 145000 10,4

Lactate déshydrogénase 135000 11,4
Phosphatase alcaline 80000 18,4
Ovalbumine 45000 26,2
Lactoglobuline 37100 28,6

1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous ?

2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique précédent. Existe t'il une autre
méthode pour déterminer la MM ?
Correction

Correction exercice 1 :

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire, gel
filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents temps de
rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau), selon la relation :

Ve (volume d'élution) = d (débit) x tr (temps de rétention)

La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer préalablement (voir
tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite :

Log tr
MM Ve (ml)
MM (min)

Aldolase 145000 5,16 10,4 52

Lactate déshydrogénase 135000 5,13 11,4 57
Phosphatase alcaline 80000 4,9 18,4 92
Ovalbumine 45000 4,65 26,2 131
Lactoglobuline 37100 4,57 28,6 143
Le fait de visualiser une droite signifie qu'aucune protéine n'est exclue du gel.

2 - La glucokinase, avec un temps de rétention de 21 min, est éluée à un volume d'élution de 5 x 21 = 105
ml. Il suffit de se reporter au graphe pour déterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse
moléculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ.

Ici, on a tracé le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution : log MM = f (V e).

L'autre représentation serait de porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le

coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV).

KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm)

Mais pour cela, il faudrait connaître le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt).
Exercice 2

Exercice 2 : On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par

-
chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3 ). Les pH
isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ;
9,74, à 25 °C.

On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à
7.

Question :

1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminé-
résine sont uniquement d'ordre électrostatiques).
Correction 2
 Correction exercice 2 :

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions. Une résine polystyrénique
-
substituée par des groupements sulfonate (-SO3 ) est chargée négativement et est donc une résine
échangeuse de cations.

Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique).

Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique).

Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids aminés, à pH = 2 et à pH = 7.

acide aminé : pHi : charge à pH = 2 : charge à pH = 7 :

Acide L-Glutamique (Glu) 3,22 + -

L-Leucine (Leu) 5,98 + -
L-Lysine (Lys) 9,74 + +

Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur
la colonne.

A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne.

Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).
Exercice 3

Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue
en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH).

Questions :

1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76
; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76).

2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi =
11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions
protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre électrostatiques).
CORRECTION 3

Correction exercice 3 :

1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9.

Le pH est donné par la relation suivante :

 -4
À pH = 1 : = pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76 donc : = 1,74 10

-4 -4
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10 .(A), on en déduit que (A) + 1,74 10 .(A) = 100
-4
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 1,74 10 )

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 %

À pH = 4,76 : = pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0 donc : =1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), on en déduit que (A) + (A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

À pH = 7 : = pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24 donc : = 173,78

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), on en déduit que (A) + 173,78(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(174,78)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %

À pH = 9 : = pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24 donc : = 13378

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), on en déduit que (A) + 13378(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(13379)

-3
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10 % et (B) = 99,994 %

Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements carboxyméthyls
se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH).

À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements carboxyméthyls se présenteront

 -
majoritairement sous forme basique (-CH2-COO )

2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée négativement (-CH2-
-
COO ).

Protéine : pHi : Charge à ph = 7 :

Ovalbumine 4,6 négative

Cytochrome c 10,65 positive
Lysozyme 11 positive

Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le
cytochrome c et le lysosyme seront retenus.
Exercice 4

Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d'anions, obtenu en

substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls :

CH2-CH3
/
-CH2-CH2- NH+
\
CH2-CH3

Questions :

1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On
considérera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).

2 - Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi =
9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions
protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques).
Correction 4

Correction exercice 4 :

1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux pH : 2,
7, 9,4 et 12.

Le pH est donné par la relation suivante :

 -6
À pH = 2 : = pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4 donc : = 3,98 10

-6 -6
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), on en déduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100
-6
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10 )

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %

-3
À pH = 7 : = pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4 donc : = 3,98 10

-3 -3
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), on en déduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100
-3
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10 )

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %

À pH = 9,4 : = pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0 donc : =1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), on en déduit que (A) + (A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

À pH = 12 : = pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6 donc : = 398,1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), on en déduit que (A) + 398,1(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 398,1)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %

Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements
+
diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH ).

À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront

 majoritairement sous forme basique (-N)

2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,996 % sous forme acide, chargée positivement.

Protéine : pHi : Charge à ph = 7 :

Sérumalbumine 4,9 négative

Uréase 5 négative
Chymotrypsinogène 9,5 positive

Ainsi, à pH = 7 la sérumalbumine et l'uréase sont chargées négativement, et seront donc retenues sur la
colone. Le chymotrypsinogène ne sera pas retenus.
Exercice 5

Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane
et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de
tétrachlorométhane (CCl4).

Donnée : I2 est plus soluble dans le tétrachlorométhane que dans l'eau.

Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l'eau, après agitation et
décantation.
Correction 5

Correction exercice 5 :

Coefficient de partage de l'iode dans le tétrachlorométhane et l'eau.

D'après les données de l'exercice, on peut écrire les deux égalités suivantes :

On peut en déduire que :

 Concentration dans le tétrachlorométhane (solvant organique) = 9,9 g/l

Concentration dans l'eau (solvant aqueux) = 0,099 g/l

Exercice 6

Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie
d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.

L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes
d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :

MM (Da) Ve (ml)

Dextran 2000000 45
Fibrinogène 340000 60
Catalase 230000 75
Lactoglobuline 19000 132

Questions :

1 - Rappeler à quoi correspond le Dalton.

2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM.
Correction 6

Correction exercice 6 :
-27
1 - Le Dalton est une unité de masse atomique et correspond à 1,66 . 10 kg. La masse moléculaire d'un
composé s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter que l'abréviation de dalton
s'écrit avec un Dmajuscule : Da et que le kilodalton s'écrit kDa.

2 - Afin de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer la
représentation du log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous représente le tracé de log (MM) =
f(Ve) pour les composés suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline.
 Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la masse moléculaire :

MM (Da) Ve (ml) log MM

Dextran 2000000 45 6,3

Fibrinogène 340000 60 5,53
Catalase 230000 75 5,36
Lactoglobuline 19000 132 4,28

Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un log MM = 4,93, soit
une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protéine p.

Il est très important de noter que :

- 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire le volume d'élution des substances exclues (ici, le
dextran).

- 132 ml représente le volume d'exclusion des protéines totalement incluses.

- la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogène et à la catalase, car
le dextran est un composé totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une protéine totalement incluse
dans le gel. Ainsi, il aurait été totalement faux de tracer une droite à partir des points correspondant à la
catalase et la lactoglobuline (qui sont les protéines dont les volumes d'élution encadrent celui de la protéine p).
Exercice 7
 Exercice 7 : Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au
total 20000 unités de cette enzyme.

Questions :

1 - Compléter le tableau ci-dessous :

protéine (g) : activité (UE) : taux de purification : rendement :

Extrait brut 1000 20000

Chromato. d'exclusion 200 14000
Chromato. d'échange d'ions 15 4500
Chromato. d'affinité 0,5 3500

2 - Quelles conclusions peut on tirer de cette étude ?

Correction7

Correction exercice 7 :

Afin de remplir le tableau, il faut connaître quelques définitions :

- L'activité spécifique (AS) représente un nombre d'unités enzymatiques (UE) par gramme de protéines (g) :

AS = (UE / g)

- Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesurée après une étape de purification, sur l'AS
mesurée à l'étape précédente :

Taux de purification = AS après une étape / AS avant cette même étape

- Le rendement correspond à un nombre d'UE mesuré après une étape de purification, sur un nombre d'UE
mesuré à l'étape précédente :

Rendement = UE après une étape / UE avant cette même étape

Connaissant ces définitions, on peut remplir le tableau. Il faudra rajouter une colonne supplémentaire "AS" qui
nous permettra de calculer le taux de purification :

protéine (g) : activité (UE) : AS : taux de purification : rendement :

Extrait brut 1000 20000 20 - -

Chromato. d'exclusion 200 14000 70 3,5 fois 70 %

Chromato. d'échange d'ions 15 4500 300 4,28 fois 32 %

Chromato. d'affinité 0,5 3500 7000 23,3 fois 77,7 %

On pourra utilement calculer :

 - Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les étapes, divisée par celle de
départ. Ici, le taux global de purification est égal à 7000 / 20 = 350.

- Le rendement global qui est égal à 3500 / 20000 = 17,5 %,

Conclusion : Suite aux différentes étapes de purification, on a pu récupérer 3500 unités, sur les 20000 que
l'on avait au départ, soit 17,5 %. L'enzyme a été purifiée 350 fois.
Exercice 8

Exercice 8 : Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est
soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon
à pH = 6.

Question :

1 - Dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?

Correction 8

Correction exercice 8 :

Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une
chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6.

Question : dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?

Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un
pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous
une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée
négativement.

Acide aminé : pHi Charge à pH < 2,87 Charge à pH 6

Asp 2,87 + -
Leu 6 + neutre (50%/50%)
Arg 10,76 + +

À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée.
L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas éluée.
Exercice 9

Exercice 9 : Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000
Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da).

Rappel : MM = masse moléculaire.

Question :

1 - Tracer un diagramme d'élution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort.
CORRECTION 9
 Correction exercice 9 :

Voici un diagramme d'élution vraisemblable pour une chromatographie d'exclusion séphadex G-100 (limite
d'exclusion = 100000 Da), sur laquelle on aurait déposé un un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000
Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da).

Ici on a représenté la mesure de la densité optique (DO) de l'éluat en fonction du volume d'élution (Ve).:

Les IgG présentent une masse moléculaire supérieure à la valeur de la limite d'exclusion de la colonne (100000
Da). Elles seront donc éluées en premier, et donneront la valeur du volume mort de la colonne (V m = Ve IgG)

L'albumine de masse moléculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et éluée plus tard, avec
un Ve albumine qui est égal à Vm + Ve' albumine.

EXERCICE 10

Exercice 10 : On veut réaliser la séparation de 5 acides aminés (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5
g de résine sèche de polystyrène sulfoné que l'on dispose dans une colonne ouverte. La résine est lavée par
une solution d'HCl (1 M) en excès. Après ce traitement, la résine est lavée à l'eau distillée. On fait alors passer
une solution de NaCl (2 M) en excès. Le filtrat correspondant est recueillit dans sa totalité et est dosé par 11,5
ml de NaOH (1 M).
 Questions :

1 - Commenter les opérations effectuées (écrire sommairement les équations mises en jeu) et en déduire la
capacité de rétention de la résine.

2 - Les 5 acides aminés à séparer sont solubilisés dans un tampon à pH = 3,8. A ce pH, quels sont les
composés qui seront retenus sur la résine ?

3 - Après avoir chargé la colonne par les 5 acides aminés préalablement solubilisés dans le tampon à pH 3,8,
l'élution est réalisée en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides aminés vont-ils être
élués ?

On se servira des données ci-après :

acide aminé : pK - COOH pK - NH2 pK -R

Glu 2,19 9,67 4,25
Met 2,28 9,21 -
Tyr 2,20 9,11 10,07
Lys 2,18 8,95 10,53
Ser 2,21 9,15 -

Correction 10