Microbio Spe Ch1

INTRODUCTION [17, 24]
Les entrobactries sont des bacilles Gram ngatif dont la plupart sont
mobiles grce des flagelles disposs de manire pritriche. Leur culture est
facilement ralise sur les milieux usuels.
Leur abondance dans lintestin, leur mobilit, leur rapidit de
multiplication, leur frquente rsistance aux antibiotiques expliquent quelles
soient les bactries les plus impliques en pathologie infectieuse humaine
surtout en milieu hospitalier.
Parmi la gamme trs varie de bactries telles que les entrobactries,
dautres espces ont t identifies en particulier les bacilles Gram ngatifs
non fermentaires.
Ce sont des bactries immobiles ou mobiles par leur ciliature polaire.
Leur culture seffectue trs facilement sur les milieux usuels.
Ce groupe bactrien est trs riche en individualit, il est compos dune
vingtaine de genres et de plusieurs dizaines despces. Celles-ci sont souvent
opportunistes et responsables dinfections nosocomiales.
Limportance des entrobactries et des bacilles Gram ngatifs non
fermentaires, en pathologie humaine sexplique aussi bien par la varit des
espces qui le composent qu leur incidence au niveau de la sant des
populations.
Lidentification de ces espces est de plus en plus facilite au
laboratoire par lutilisation de nombreuses galeries didentification dont :
Les galeries classiques avec un nombre de caractres limits. Mais elles
ncessitent souvent le recours dautres tests biochimiques
complmentaires.
Les galeries API sont trs performantes mais leur cot est lev.
1
Cest dans cette lance que lunit de recherche et de biotechnologie

microbienne du laboratoire de bactriologie-virologie de lhpital Aristide Le
Dantec a labor une technique didentification reposant sur lutilisation de
mini galeries savoir les microplaques CSB.
De nombreuses tudes effectues dans ce laboratoire ont dmontr
lefficacit de ces micromthodes dans lidentification bactrienne. En effet
celles-ci sont simples, fiables, peu onreuses et surtout accessibles aux
structures de sant.
Seulement, lidentification ntait possible quaprs une incubation 24h
de ces microplaques ce qui a constitu un handicap dans ltablissement dun
traitement efficace et rapide.
Ainsi notre souci actuel est de pouvoir dlivrer des rsultats fiables
dans un dlai aussi court que possible pour une bonne prise en charge des
patients. Cest dans cette optique que nous nous sommes fixs les objectifs
suivants :
o Rechercher leffet de linoculum sur lidentification des bactries
o Etudier limpact de la taille de linoculum sur le temps
dincubation des galeries Micro-CSB.
Pour atteindre ces objectifs, nous allons dabord aprs un bref rappel
des gnralits, rechercher grce la technique de dnombrement sur bote de
ptri, linoculum adquat, nous permettant ensuite dobtenir un meilleur profil
didentification en un temps rduit.
I. LES ENTEROBACTERIES
1.1. Dfinition [9, 13, 26, 32]

La famille des entrobactries comprend plusieurs genres bactriens. Ce
sont des bacilles Gram ngatif, immobiles ou mobiles grce une ciliature
pritriche. Ils sont aro- anarobies facultatifs et se dveloppent sur milieu
ordinaire. Ils sont dpourvus doxydase et ont la facult de fermenter le
glucose, mais aussi de rduire les nitrates en nitrites.
Les diffrences entre les nombreux genres et espces viennent de critres
plus prcis, comme la fermentation des diffrents sucres, la production ou non
de sulfure, la prsence ou labsence denzymes du mtabolisme (dsaminases,
dcarboxylases).
1.2. Taxonomie
1.2.1. Historique [11, 12, 25]
La priode de naissance de la famille des Enterobacteriaceae se situe
entre 1937 lorsque 0tto RAHN proposa le genre Enterobacter pour regrouper
les
microorganismes
prsentant
des
proprits
biochimiques
et
morphologiques communes et parmi lesquels on trouvait dj des noms tels

que Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Serratia ou Shigella.
Deux annes aprs cette description qui concernait 112 espces, ce
nombre fut ramen 67.
Avec les travaux
de DON BRENNER et de PATRICK A.D.
GRIMONT, cette famille a connu un essor et beaucoup de nouveaux genres et

espces furent dcouverts.
En 1972, EDWARD et EWING intgraient 11 genres et 26 espces dans
la famille des Enterobacteriaceae.
3
En 1973, 31 genres et 139 espces taient caractriss.

En 1985, FARMER et COLL dcrivaient 22 genres comprenant 69
espces et 29 groupes entriques.
1.2.2. Habitat [3, 10]
Les Enterobactries sont des htes du tube digestif de lhomme et de
nombreux animaux o ils sont retrouvs soit ltat de pathogne, soit ltat
de commensaux. Mais cette localisation digestive nest pas exclusive.
On les retrouve galement dans lenvironnement (sols, eau) o ils
participent la dgradation des matires organiques, laltration des plantes
suite des ncroses, une dgnrescence ou un ramollissement.
1.2.3. Classification
La famille des Enterobacteriaceae comprend actuellement 100 espces
rpertories. Les espces les plus communment isoles en bactriologie
clinique appartiennent 12 genres : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,
Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serretia,
Shigella, Yersinia.
Cette classification est rsume dans le tableau I :
Tableau I : Classification des espces dentrobactries les plus

frquentes en clinique humaine [26]
Groupes
Familles
Edwardsielleae
Genre
Espces
Edwardsiella
Salmonella typhi
GROUPE I
Salmonnelleae
Salmonella
S. paratyphi
S. enteritidis
GROUPE II
Escherichia
Escherichia coli
Shigella
Shigella dysenteriae
Escherichieae
Shigella flexneri
Shigella boydii
Shigella sonnei
Levineae
Levinea
Klebsiella
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxymore
Enterobacter Enterobacter aerogenes

GROUPE III
Klebsielleae
Enterobacter cloaceae
Serratia
Serratia marcescens
Erwinia
Proteus
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
GROUPE IV
Proteae
Proteus rettgerii
Providencia
Yersinia
GROUPE V
Yersinieae
Yersinia enterolitica
Y. pseudotuberculosis
1.3 Les caractres bactriologiques

I.3.1 Les caractres morphologiques [5, 6, 10, 22, 24]
Toutes les entrobactries ont une morphologie habituellement typique,
sous forme de bacilles gram ngatif de 2 3 de long sur 0,6 de large
gnralement polymorphes. Les espces les plus nombreuses le sont grce
une ciliature pritriche. Les autres sont immobiles (Klebsiella, Shigella,
Yersinia pestis). La prsence dune capsule visible au microscope
est
habituelle chez Klebsiella. La plupart des espces pathognes chez lhomme

possdent des pili (ou fimbriae) qui constituent des facteurs dadhsion.
I.3.2. Les caractres culturaux [5, 10, 15, 27]
Les entrobactries arobie-anarobies facultatives se dveloppent
facilement sur milieux nutritifs simples.
Sur milieux gloss, les colonies dentrobactries sont habituellement
lisses, brillantes, de structure homogne (type smooth ou S). Cet aspect
peut voluer aprs cultures successives vers des colonies surface sche et
rugueuse (type rough ou R).
Les colonies de bactries capsules telles que Klebsiella sont mucodes,
plus grandes que les colonies S, avec une tendance la confluence.
I.3.3. Les caractres biochimiques [21]
Le diagnostic de genre et despce repose sur ltude des caractres
biochimiques, aprs que le diagnostic de famille ait t tabli avec certitude.
I.3.3.1. Production dHydrogne sulfur (SH2)
La production de SH2 par les microorganismes est mise en vidence par
incorporation du fer ou de plomb dans le milieu destin cette tude. Il se
forme un prcipit noir de sulfure de fer ou de plomb. Ce souffre rduit va se
combiner avec le fer ferreux Fe2+ qui vient du sulfate de fer.
6
I.3.3.2. Recherche de lurase

Les bactries possdant une urase active scinde lure en dioxyde de
carbone et en ammoniaque. Ceux-ci en se combinant donnent du carbonate
dammonium.
Le carbonate dammonium form alcalinise le milieu, ce qui ce traduit
par le virage de lindicateur color de lorange au rose framboise ou dans de
rares cas au rouge violac.
1.3.3.3. Production dindole
Certaines bactries dgradent le tryptophane grce une tryptophanase.
Il se forme de lindole, de lacide pyruvique et de lammoniac.
Lindole est apolaire et ragit fortement avec le paradimthylaminobenzaldhyde en milieu acide pour donner un anneau rouge qui remonte en
surface.
1.3.3.4. Recherche des dcarboxylases
Les dcarboxylases (LDC, ODC, ADH) scindent les acides amins,
entranant la formation de lamine correspondante et la libration de CO2.
Il sagit denzymes induites dont la synthse est favorise par un pH
acide (pH optimum : 3,5 5,5) et des conditions danarobiose.
Le milieu dtude contient du glucose, un indicateur color (le rouge
phnol) et bien entendu un acide amin.
Chez les bactries mtabolisme, la fermentation du glucose entrane
une baisse de pH suffisante pour favoriser la synthse de lenzyme ;
lalcalinit due lamine entrane ensuite le virage de lindicateur au violet
aprs une courte phase de jaunissement.
Si la bactrie tudie ne possde pas de dcarboxylases, le milieu restera
acide, donc jaune.
7
1.3.3.5. Recherche des dsaminases oxydatives

Les dsaminases, enzymes induites, agissent sur les acides amins en
entranant la formation des acides ctoniques correspondants.
Les acides ctoniques forms ont la proprit de donner des complexes
colors avec les ions Fe3+, raction utilise pour la lecture.
1.3.3.6. Utilisation du Citrate de Simmons (CS)
Lutilisation du citrate, comme seule source de carbone par les bactries,
se traduit par une alcalinisation du milieu (virage au bleu).
1.3.3.7. Utilisation du malonate
Le malonate inhibe le cycle de Krebs (inhibition de la succinate
dshydrognase).
Seules les bactries qui peuvent utiliser le cycle glyoxalique sont
capables de pousser sur un milieu au malonate.
Lutilisation du malonate saccompagne dune libration dions OHalcalinisant
1.3.3.8. Action de la Phnyl Alanine Dsaminase (PDA)
La PDA, enzyme induite, agit sur la phnyl alanine en entranant la
formation dacide ctonique correspondant.
Lacide ctonique form a la proprit de donner des complexes colors
avec les ions Fe3+ donnant une coloration bleue.
1.3.3.9. Milieu au Citrate de Christensen (CC)
A la diffrence du Citrate de Simmons, ce milieu contient une faible
quantit de glucose, dextrait de levure et une source dazote organique.
Dans ces conditions, certaines bactries citrate ngatif sur milieu de
Simmons sont capables dutiliser le citrate en milieu de Christensen.
La formation dions hydroxyles alcalinise le milieu (virage du jaune au
rose).
8
1.3.3.10. Recherche de lactone ou Raction de Voges-Proskauer (VP)

On tudie la formation de lactyl mthyl carbinol (A.M.C. ou actone)
soit partir de deux molcules dacide pyruvique, soit partir du glucose.
En prsence dune base forte, lactone donne une coloration rouge en
milieu trs oxygn (oxydation en diactal).
1.3.3.11. Test lONPG (Orthonitrophnyl -D-Galactopyranoside)
Le terme ONPG hydrolase est plus propos que celui de -galactosidase
dans la mesure o il prcise que le substrat utilis est lONPG et non le
lactose.
En effet, il existe des germes qui reconnaissent lONPG du ct du nitro2-phnol et non de celui du -galactoside. Ces germes ont donc une activit
ONPG hydrolase tout en ne fermentant pas les lactoses.
Le test lONPG est une technique base sur laction directe de lenzyme
sur une molcule chromogne pouvant tre lortho-nitrophnyl--Dgalactopyranoside ou le 2-naphtol--D-galactopyranoside. Ceux-ci sont
utiliss comme substrats et librent respectivement lorthonitrophnol (jaune)
et le -naphtol.
1.4. Etude des principaux genres

1.4.1. Escherichia [8, 17, 27]
Ce genre ne comporte quune seule espce Escherichia coli. Les souches
immobiles et agazognes anciennement dcrites comme Alkalescens dispar ne
sont plus quun biovar dEscherichia coli.
Escherichia coli
Hte normal de lintestin et des animaux, cest lespce arobie la plus
reprsente dans le tube digestif. La prsence de colibacilles ou espces
voisines dans leau est un tmoin de contamination fcale [1, 5]
Escherichia coli exprime les caractres gnraux des entrobactries. Il
est en outre :
- lactose +
- indole +
- citrate - actone - H2S - gaz +
- urase Il
existe diffrents
pathotypes
dEscherichia
coli
responsables
dinfections intestinales :
- ETEC : Enterotoxinogen Escherichia coli, responsable de la
diarrhe des voyageurs ou turista et des syndromes
pidmiques dans les pays du Tiers-monde ;
- EIEC : Enteroinvasive Escherichia coli, encore appel Escherichia
coli Shigella-like, responsable de syndromes dysentriques avec
invasion de la muqueuse intestinale ;
- EHEC : Enterohaemorragic Escherichia coli, responsable de
diarrhes sanglantes lies la production de toxines ;
- EPEC : Enteropathogen Escherichia coli, responsable de gastroentrites infantiles.
10
1.4.2. Klebsiella [12, 18, 21]

Au sein des entrobactries, les bactries du genre Klebsiella se
distinguent par leur immobilit constante, leur groupement en diplobacilles
gnralement encapsuls.
On distingue cependant plusieurs espces mais Klebsiella pneumoniae
est la plus frquemment retrouve en clinique humaine.
Connue autrefois sous le nom de pneumobacille de Friedlander,
Klebsiella pneumoniae est une bactrie commensale de lintestin, des voies
respiratoires et des animaux.
Chez lhomme, elle est lagent responsable des pneumopathies aigus,
dangines, dotites, de cystites et daffections rnales.
Ce sont des bactries Gram ngatif immobiles capsules, surtout au sortir
de lorganisme, trs polymorphes.
Sur glose : les colonies de type mucode ont un aspect caractristique ;
elles sont volumineuses (4 mm de diamtre), bombes, brillantes, opaques et
souvent confluentes.
En bouillon, on note la formation dun trouble dense avec colorette
visqueuse.
Klebsiella pneumoniae est en gnral :
- Gaz +++
- Lactose +
- ONPG +
- Ure +
- Indole - VP +
- ODC -.
11
1.4.3. Salmonella [7, 8, 27]

Prsents dans leau et dans diverses denres alimentaires, les
Salmonelles sont pathognes, soit exclusivement pour lhomme (Salmonella
typhi), soit exclusivement pour lanimal (Salmonella abortus ovis).
Chez lhomme, elles sont responsables de la fivre typhode et de gastroentrites.
Chez lanimal, les tableaux cliniques sont varis : avortements chez
diffrentes espces, septicmies du jeune ou entrites.
La morphologie est celle des entrobactries. Certaines souches
habituellement mobiles peuvent lisolement se prsenter sous forme
immobile.
Les colonies mesurent en gnral 1,5 3 mm aprs 24 heures
dincubation 37C et apparaissent lors de lisolement sous forme S.
Cependant on observe des colonies naines avec des srotypes pathognes
pour les animaux (Salmonella abortus ovis, Salmonella typhi suis) et
exceptionnellement avec des srotypes pathognes pour lhomme.
La plupart des salmonelles sont :
- H2S + (sauf paratyphi A)
- LDC +
- ONPG - Indole - CS variable
- Glatine - Urase et TDA -.
12
II. BACILLE A GRAM NEGATIF NON FERMENTAIRE :

ACINETOBACTER [4, 22]
2.1. Historique
En 1911 BEIJERINCK a dcrit un germe isol du sol, Micrococcus
calcoaceticus.
En 1939 DE BORD publie un travail prliminaire en mettant en place un
groupe de coccobacilles Gram ngatif proches des Neisseria quil classe
dans la tribu des Mimae (Mima polymorpha).
En 1940 AUDUREAU dcrit une espce quil rapproche des Moraxelles, sans
savoir leurs exigences nutritives, sous le nom de Moraxella lwoffi.
Le genre Acinetobacter a t dcrit par BRISOU et PREVOT en 1954.
BAUMANN, DOUDOROFF et STANIER en 1968 ont propos de runir
toutes ces varits dans une seule espce et un seul genre Acinetobacter
calcoaceticus.
2.2. Classification
Ds 1940, AUDUREAU avait not la ressemblance entre B. anitratum et les
Moraxella. En dcrivant M. glucidolytica, PIECHAUD proposa de scinder les
Moraxella en deux groupes :
Moraxella du groupe I : avec une oxydase
Moraxella du groupe II : sans oxydase
Le sous-comit a propos de sparer dfinitivement Acinetobacter de
Moraxella. Ainsi Acinetobacter correspond aux Moraxella du groupe II de
PIECHAUD.
Les Moraxelles constituent dsormais le genre III de la famille des
Neisseriaceae. Les Acinetobacter, proposs initialement en appendice de cette
famille, en constituent maintenant le genre IV.
13
Une seule espce est reconnue : Acinetobacter calcoaceticus.

Parmi les travaux qui ont permis de clarifier la position de Acinetobacter, il
faut citer limportante tude taxonomique que publia en 1967, MARGARET
THORNLEY.
2.3. Habitat
Acinetobacter est une bactrie tout fait ubiquitaire : elle existe sur le sol,
dans les eaux douces et marines. Chez les animaux, elle est prsente dans le
tube digestif et la surface des muqueuses ouvertes sur lextrieur ; de mme
que chez lhomme. Son isolement est assez habituel partir de lexpectoration
et des prlvements gnitaux, o sa prsence peut parfois poser des problmes
de diagnostic diffrentiel avec certaines espces de Neisseria.
Etant donn sa rpartition dans la nature, Acinetobacter est donc frquemment
un agent de contamination : aliments, produits biologiques, malades.
2.4. Caractres Bactriologiques
2.4.1. Les caractres morphologiques
Les espces du genre Acinetobacter se prsente sous forme de bacilles de
longueur variable de 1m (formes coccodes) 3m ou 5m (en moyenne)
jusqu des formes filamenteuses de plusieurs dizaines de m. Leur diamtre
est lgrement suprieur 1m.
Acinetobacter est Gram ngatif. Cette bactrie ne possde pas de flagelle
elle est immobile.
14
2.4.2. Les caractres culturaux

Acinetobacter est arobie strict. Il se dveloppe facilement sur milieux
nutritifs simples. En milieu liquide, le trouble est homogne, avec parfois une
lgre collerette en surface (souches muqueuses). Sur glose nutritive, les
colonies en 24h ont un diamtre de 2 3mm ; elles sont convexes, luisantes
et blanchtres. Sur glose au sang les colonies sont plus volumineuses.
Quelques souches se dveloppent sans difficult sur certains milieux slectifs
destins lisolement des entrobactries.
La temprature optimale de pousse est infrieure 37C. Acinetobacter
nest pas pigment et nlabore pas de toxine.
2.4.3. Les caractres biochimiques
Dans une batterie dpreuves didentification pour bacilles Gram ngatif,
Acinetobacter montre beaucoup de ractions constamment ngatives :
- indole (-)
- nitrate-rductase (-)
- H2S (-)
- VP (-)
- RM (-)
Un certain nombre de caractres varient suivant les souches :
Lacidification partir des sucres
Les souches qui attaquent le glucose, acidifient ainsi le milieu partir du
xylose, de larabinose et du galactose. Le lactose est aussi attaqu mais par
une voie ne produisant que peu dacide ; aussi est-il ncessaire pour mettre en
vidence cette attaque dutiliser une concentration de lactose 10% dans un
milieu. Lattaque des sucres se fait toujours par voie oxydative en arobiose.
Le saccharose, le fructose, le mannitol ne sont jamais attaqus.
15
Lhydrolyse de la glatine
Environ 10% des souches non glucidolytiques et 25% des souches
glucidolytiques hydrolysent la glatine (le rsultat est plus facilement observ
si la culture est faite en arobiose la surface dune glose la glatine).
Lhmolyse au sang frais
Certaines souches montrent une hmolyse intense, dautres ne modifient
pas le sang. La nature du sang ne semble pas avoir dimportance.
Lutilisation du citrate
La majorit des souches utilisent le citrate comme seule source de
carbone mais certaines se dveloppent sans alcaliniser le milieu de Simmons.
Les autres sources de carbone
On observe une utilisation trs variable suivant les souches. Leur source
dnergie est galement trs variable.
Lurase
Certaines souches possdent une urase trs active. Ce fut le cas de
toutes les souches isoles en 1952 par LEMOIGNE et partir dchantillon de
sol provenant de diverses rgions de France.
Dsaminase Dcarboxylase : Absentes
Enfin toutes les souches de Acinetobacter se dveloppent sur un milieu
minral simple.
16
III. NUTRITION ET CROISSANCE BACTERIENNES [2]

3.1. Conditions nutritionnelles et environnementales
La croissance bactrienne est dpendante de la composition de son
environnement, qui lui fournit toutes les substances indispensables et les
conditions convenables son dveloppement.
3.1.1. Besoins nutritifs de la cellule bactrienne
Les bactries ont toutes des besoins communs de base, comme eau,
sources dnergie, et nutriments (sources de carbone, dazote et autres
lments ncessaires aux biosynthses).
3.1.1.1. Les nutriments de base permettant de gnrer la biomasse
La premire indication des besoins est lie la constitution de la cellule
bactrienne. Lanalyse de la cellule bactrienne montre que 95% de son poids
sec correspond quelques lments majeurs. Ceux-ci sont appels les
macrolments ou macronutriments. Dautres lments sont ncessaires en
quantit faible : micro-lments ou micronutriments.
Leau
Leau reprsente 80 90% du poids cellulaire. Cest un lment
fondamental, solubilisant les nutriments, assurant leur transport et ralisant
des ractions dhydrolyse. Un paramtre, lAw (activit de leau), quantifie la
disponibilit de leau. Il est compris entre 0 et 1. Les micro-organismes
exigent un certain seuil dhumidit. Si lAw est trop faible, la croissance
diminue. Les formes de rsistance des bactries (endospores), peuvent se
maintenir dans un environnement sans eau libre .
17
Macro-lments
Six de ces lments reprsentent environ les 95% du poids sec de la
bactrie. Ce sont le carbone, lazote, loxygne, lhydrogne, le phosphore et
le souffre, mais aussi les constituants des acides nucliques, glucides, lipides
et protines.
Dautres ont une moindre importance quantitative, par ex : potassium,
magnsium, calcium et fer (certains participant lactivation denzymes).
Besoins en carbone
Deux groupes de bactries existent quand lassimilation du carbone :
Ceux qui utilisent comme source unique de carbone, un carbone minral
(comme le CO2) : ce sont les C-autotrophes. La rduction du carbone partir
de lanhydride carbonique demande beaucoup dnergie et de nombreuses
bactries ne peuvent effectuer cette transformation. Celles qui utilisent
comme sources de carbone, un compos organique, prform et rduit par
dautres organismes sont les C-htrotrophes. Souvent les substances sont en
mme temps des sources dnergie.
Certaines bactries peuvent utiliser le carbone minral et organique ( Cmixotrophes ). Certains substrats carbons ne sont pas assimils mais servent
de source dnergie.
Micro-lments
Pour les autres bio-lments, la cellule en demande de trs faibles
quantits. Ils sont souvent apports comme impurets du matriel, de leau,
des sels utiliss pour fabriquer le milieu de culture. Citons les plus
importants : Mn, Co, Cu, Mo, Zn, Ni.
18
3.1.1.2. Les aliments nergtiques

Les micro-organismes ont besoin dnergie pour synthtiser la biomasse,
pour raliser un travail (mobilit, transport de substrats). La source dnergie
peut tre la lumire ou souvent loxydation dun substrat oxydable dit
nergtique donneur dlectrons. La rcupration de lnergie sous forme
dATP est lie, soit un transfert dlectrons par des chanes de transport
partir dun donneur vers un accepteur, soit une phosphorylation au niveau
du substrat.
3.1.2. Autres facteurs intervenant dans la croissance des bactries
En dehors de leau, des nutriments et des sources nergtiques, le milieu
de croissance doit prsenter des paramtres physiques adapts aux
caractristiques des bactries prsentes.
3.1.2.1. Le pH
Il intervient dans lactivit mtabolique et la permabilit membranaire.
Les bactries maintiennent un pH interne relativement constant, mais elles
tolrent de large variation de pH. De nombreuses bactries se multiplient
prfrentiellement un pH neutre (6,5 - 7,5). Les acidophiles prfrent des
pH infrieurs 6, les basophiles ou alcalinophiles se dveloppent de faon
optimale pH suprieur 8.
Par consquent, il sera possible denrichir un prlvement en un type de
bactrie recherch par utilisation dun milieu un pH dtermin (ex : pH=9
pour Vibrio cholerae).
Le dveloppement de micro-organismes dans un milieu de culture peut
modifier fortement le pH. Il est donc ncessaire dintroduire des substances
tampons pour limiter ces variations.
19
3.1.2.2. La pression osmotique du milieu

La pression osmotique est fonction de la concentration du solut de part
et dautre dune membrane. Les bactries ont des systmes de transport qui
assurent des conditions osmotiques constantes lintrieur de la cellule. La
plupart des bactries ont une bonne tolrance aux variations de pression
osmotique, en raison de la prsence dune paroi rigide et maintiennent une
pression de turgescence, lexception des mycoplasmes (sans paroi).
Certaines bactries ne peuvent crotre que dans des milieux forte
concentration de NaCL (suprieure 0,2M), ce sont des halophiles. Il y en a
qui sont non halophiles et qui se dveloppent des taux de NaCL infrieurs
0,2M.
3.1.2.3. La temprature
Le domaine de temprature de croissance dune bactrie est dfini par les
tempratures cardinales : temprature optimale, minimale et maximale.
Les bactries msophiles peuvent se dvelopper environ 5 45 C
(optimum 30 37C).
Les bactries thermophiles peuvent crotre entre 25 et > 55C (optimum
vers 50C)
Les bactries psychrophiles peuvent se dvelopper environ -15C
20C (optimum vers 5 10C).
Les bactries psychrotrophes quand elles croissent des tempratures
comprises entre -5C et 35C (optimum souvent vers 20 - 25C).
20
3.1.2.4. Loxygne molculaire

Certaines bactries ont besoin doxygne libre pour leur mtabolisme.
Lors de leur mtabolisme nergtique, la rcupration de lnergie par des
chanes de transport dlectron est lie un accepteur final dlectrons qui est
loxygne molculaire. Cest la respiration des bactries arobies strictes.
Dautres bactries ne peuvent pas suivre en prsence doxygne libre : elles
sont anarobies strictes. Dautres par contre peuvent survivre en prsence ou
en labsence doxygne libre : ce sont les anarobie-arobies facultatives.
3.2. Croissance bactrienne
3.2.1. Dfinition [30]
La croissance bactrienne se dfinit comme laccroissement ordonn et
coordonn de tous les constituants du micro-organisme unicellulaire, jusqu
une dimension limite, qui normalement conduit la division cellulaire par
scission binaire. Il en rsulte une augmentation du nombre dindividus et une
augmentation de la masse cellulaire. Cette multiplication bactrienne conduit
la rplication du nuclode bactrien, suivi de la division cellulaire, rsultant
de lallongement concomitant de la membrane cytoplasmique et de la paroi,
avec formation dun septum transversal qui partage les composants
cytoplasmiques et spare les deux nuclodes bactriens. Deux cellules filles
identiques sont issues de la cellule mre.
3.2.2. La courbe et les phases de la croissance [17, 30]
Si un milieu liquide non renouvel est ensemenc avec des cellules
bactriennes prleves dune culture dj sature et le nombre de cellules
viables par millilitre dtermin rgulirement, une courbe du type de celle de
la figure ci-dessous, est habituellement obtenue. La courbe peut tre
segmente en 7 phases reprsentes par les chiffres 1 7.
21
Log N UFC/ml)
Temps
Figure 1 : Les 7 phases de la cintique de croissance dune population

bactrienne daprs Buchanan (1919) [17, 30].
La phase de latence (1) [30]
Elle reprsente la priode o les cellules ayant puises les mtabolites et
les enzymes de leur environnement initial, sadaptent leur nouvel
environnement. Les enzymes et les intermdiaires sont forms et
saccumulent jusqu ce quils soient prsents des concentrations permettant
une reprise de la croissance.
Elle peut tre supprime en incubant le milieu avec des bactries
prleves pendant la phase exponentielle de croissance.
La phase dacclration (2) [30, 31]
Au cours de laquelle, le taux de croissance saccrot rgulirement.
22
La phase exponentielle (3) [19, 30, 31]

Les cellules sont en quilibre. Le nouveau matriel de la cellule est
synthtis un taux constant, mais ce matriel est galement catalys, et la
masse augmente de faon exponentielle. Ceci continue jusqu ce que lun des
deux phnomnes suivants se produisent : un ou plusieurs des nutriments
spuisent dans le milieu, ou, que des produits mtaboliques toxiques
saccumulent et inhibent la croissance. Le taux de croissance devient constant
et atteint sa valeur maximale.
La phase de ralentissement (4) [16, 30, 31]
Elle est lie lpuisement du facteur limitant. La valeur de diminue
progressivement.
: taux de croissance
La phase stationnaire (5) [16, 30]
Elle est lie lpuisement de laliment, laccumulation de produits
toxiques ou la constitution dun quilibre ionique dfavorable.
La phase de dcroissance (6) [30, 31]
Au cours de laquelle la masse bactrienne dcrot et le taux de croissance
prend des valeurs ngatives. Cette phase de dcroissance correspond une
mort et une lyse progressive des bactries en prsence des dchets du
mtabolisme accumuls pendant la croissance.
La phase de mortalit logarithmique (7) [30]
Durant cette phase le taux de mortalit par organisme reste constant.
23
3.2.3. Techniques de mesure de la croissance bactrienne [19, 31]

La croissance bactrienne peut tre apprcie en estimant, en fonction du
temps, les variations de la masse bactrienne ou, plus souvent, du nombre de
cellules.
Des concentrations microbiennes peuvent tre mesures en termes de
concentration en cellules (le nombre de cellules viables par unit de volume
de culture) ou de la concentration de biomasse (poids sec de cellules par unit
de volume). Ces deux paramtres ne sont pas toujours quivalents, parce que
le poids sec moyen de la cellule change diffrentes tapes de lvolution
dune culture. Ils ne sont pas non plus dimportance gale.
Deux groupes de mthodes sont utiliss pour mesurer la croissance
bactrienne :
- les mthodes de numration,
- les mthodes quantitatives.
Mthode de numration [16, 19, 20, 31]
Deux mthodes principales peuvent tre utilises :
Numration totale : elle consiste dnombrer au microscope ou
avec des compteurs spciaux les individus viables ou non.
Les cellules mortes ne peuvent pas tre distingues de celles en vie.
Seules les suspensions denses peuvent tre comptes (>10 cellules par ml),
mais des chantillons peuvent tre concentrs par centrifugation ou filtration
pour augmenter la sensibilit ;
Numration des cellules viables : on compte les colonies
bactriennes apparues sur ou dans un milieu de culture glos
convenable, inocul par une aliquote dune suspension bactrienne
homogne et suffisamment dilue.
24
Sur un milieu appropri, chaque unit viable crot et forme une colonie.
Chaque colonie pouvant tre compte sappelle une unit formant colonies
(UFC), et le nombre dUFC est li au nombre de bactries viables dans le
milieu. Cette mthode est plus facile et de trs grande sensibilit, mais elle
ncessite beaucoup de dilutions et de botes.
Mthodes quantitatives [16, 19, 20, 31]
Plusieurs mthodes sont envisageables, parmi lesquelles :
La mesure directe de la masse bactrienne : en principe, la biomasse
peut tre mesure directement en dterminant le poids sec dune culture
microbienne. Les bactries sont laves, sches et peses. Cest une
mthode longue qui ncessite une grande quantit de cellules pour que
les peses soient assez prcises. Mais cest la mthode de rfrence
(1mg de poids sec correspond quelques milliards de corps bactriens).
La mesure de lactivit enzymatique : mesure du pH, mesure de la
consommation de loxygne. Ces mthodes sont peu prcises.
Le dosage de lazote bactrien : cette mthode a les mmes applications
que la mthode gravimtrique.
La mesure de la densit optique : ici on admet que labsorption
lumineuse est proportionnelle la masse des microbes. Elle est rapide
et prcise, mais sa sensibilit est modre, car il faut une teneur dau
moins 10 bactries/ml pour obtenir une densit optique mesurable. Elle
est fortement entache derreurs en cas de suspensions bactriennes non
homognes.
25
3.2.4. Conditions de croissance des familles bactriennes tudies [17, 28]

3.2.4.1. Les entrobactries
Elles se dveloppent entre 20 et 40C avec un optimum 37C.
Ces germes msophiles et neutrophiles (pH optimum voisin de 5,5-8) sont
assez
tolrants aux variations de la pression osmotique. Ils sont aro-
anarobies facultatifs avec un mtabolisme fermentatif.

3.2.4.2. Bacilles Gram ngatif non fermentaires
Bactries psychrophiles, cest--dire se dveloppant 0C, alcalinophiles et
qui supportent assez bien les variations de la pression osmotique.
Elles sont arobies strictes avec un mtabolisme oxydatif.
26
IV. QUELQUES PARAMETRES DE VALIDATION [34]

4.1. Corrlation et droite de rgression
4.1.1. Notion de corrlation
La corrlation consiste mesurer le degr dassociation existant entre deux
caractres. Pour calculer le coefficient de corrlation entre 2 variables, cela
revient rsumer la liaison qui existe entre les variables l'aide d'une droite.
On parle alors d'un ajustement linaire.
Pour calculer les caractristiques de cette droite, il faut faire en sorte que
l'erreur que l'on commette en reprsentant la liaison entre nos variables par
une droite, soit la plus petite possible. Le critre formel le plus souvent utilis,
mais pas le seul possible, est de minimiser la somme de toutes les erreurs
effectivement commises au carr. On parle alors d'ajustement selon la
mthode des moindres carrs ordinaires. La droite rsultant de cet ajustement
s'appelle une droite de rgression. Plus la qualit globale de reprsentation de
la liaison entre nos variables par cette droite est bonne, et plus le coefficient
de corrlation linaire associ l'est galement. Il existe une quivalence
formelle entre les deux concepts.
27
4.1.2. Droite de rgression

Dans les cas o le diagramme de dispersion montre l'existence d'une relation
linaire, on dsire dterminer la droite qui dcrira le mieux cette relation.
Cependant, le choix de cette droite dpend d'un critre qu'il faudra fixer.
Le critre mathmatique est celui des moindres carrs. Selon ce critre, on
cherche minimiser la somme des carres des carts entre les valeurs
estimes et les valeurs observes de la variable dpendante.
En formule la droite de rgression sera donne par :
Avec :
x = la valeur de la variable indpendante

y = la valeur estime de la variable indpendante
a = lordonne lorigine
b = la pente
4.2. Limite de dtection
Cest la plus petite quantit ou concentration qui peut tre distingue, avec
une probabilit connue, dun blanc de la raction ralis dans les mmes
conditions. Elle et gale k fois lcart type de prcision, mesur sur le blanc.
Si le nombre de valeur = 30, la valeur de 3 est retenue pour k.
28
LD = S x k
LD = limite de dtection
S = cart-type
K = facteur dpendant du nombre de mesures effectues
4.3. Prcisions
Cest le degr daccord entre les rsultats obtenus lors dessais diffrents. Elle
est mesure par la dispersion des rsultats individuels de part et dautre de la
moyenne et elle est gnralement reprsente par lcart-type ou par le
coefficient de variation calcul aprs avoir appliqu la mthode complte de
faon rpte un certain nombre dchantillons identiques sur le mme lot
homogne du produit analyser.
29
I. CADRE DETUDE
Ce travail a t effectu lunit de recherche et de biotechnologie
microbienne du laboratoire de bactriologie-virologie de lhpital Aristide Le
Dantec et au laboratoire de bactriologie-virologie fondamentale et applique
de lUCAD II.
II. MATERIELS ET REACTIFS

2.1. Matriels
2.1.1. Souches bactriennes
Une souche de rfrence et des souches de contrle ont t slectionnes, en
effet celles-ci ont dj t identifies et conserves -20C. Il sagissait pour
-La souche de rfrence de :
Escherichia coli : E.coli ATCC 25922
-Les souches de contrle d :
Une souche de Klebsiella pneumoniae
Une souche de Salmonella Paratyphi A
Une souche de Acinetobacter
2.1.2 Matriel pour lenrichissement et lisolement
- Bec bunsen
- Autoclave
- Anse de platine
- Boite de ptri
- Etuve
30
2.1.3. Matriel pour lidentification

- Autoclave
- Balance de prcision
- Bain marie
- Eprouvettes
- Erlenmeyer
- Filtres millipores
- Flacon en verre avec bouchon rod
- Tubes essai striles
- Bec bunsen
- Etuve
- Four micro-ondes
- Agitateur magntique
- Dessiccateur sous vide air renouvel
- -Microscope optique
- Micropipettes
- Embouts striles
- Plateau (inoxydable de prfrence)
- Anse de platine
- Becher rempli deau de javel
- Emballage en plastique
- Lames porte-objet
- Lamelles
- Papier buvard
- Microplaques
31
2.1.4 Matriel pour la conservation des souches

- Tubes nunc
- Tubes striles vis
- Gryotubes avec billes
- Portoirs
- Anse de platine
2.2. Ractifs
2.2.1. Ractifs pour lenrichissement et lisolement
- Bouillon au thioglycolate (BT)
- Bouillon trypticase soja (BTS)
- Glose Mller Hinton (MH)
- Glose Mac conkey
2.2.2. Ractifs pour lidentification
- Actate de plomb
- Alcool 95C
- Bleu de bromothymol
- Bromocresol pourpre
- Citrate de fer ammoniacal
- Citrate trisodique
- Disque ONPG
- Extrait de levure
- Extrait de viande
- Glucides: glu, lact, mannitol, sorbitol, saccharose,
inositol, rhamnose
-
Glatine
32
- Bouillon nutritif
- L-tryptophane, L-arginine , L-phenyl alanine , Llysine, ornithine
- NaCl
- NaOH
- Peptone triptyque
2.2.3. Ractifs de rvlation
- Acide sulfanilique 8g/l
- Acide alpha naphtylamine 5g/l
- Alpha naphtol
- FeCl 3
- KOH
- Ractif de kovacs
- Lugol
- Fuschine phnique
- Alcool 95C
- Eau distille
33
III. CONTROLE DE QUALITE DES TESTS EFFECTUES
Chaque lot de milieu a t prpar et soumis un contrle de strilit et

un contrle defficacit sur le plan bactriologique.
3.1. Contrle de qualit des milieux denrichissement et disolement
3.1.1. Contrle de strilit
3.1.1.1. Milieux liquides
Un millilitre de chaque milieu prpar a t mis dans un tube
hmolyse strile et incub ltuve 37C pendant 24 48 heures.
Les milieux ont t considrs striles en labsence de trouble et de
virage de lindicateur color
3.1.1.2. Milieux solides
Chaque bote contenant la glose prpare a t place ltuve 37C
pendant 24h 48h.
Les milieux ont t considrs striles en labsence dapparition de
colonies ou de virage de lindicateur color.
3.1.2. Contrle defficacit
Chaque lot de milieux prpars a t test avec une souche de rfrence de
lAmerican Type Culture Collection (ATCC).
Des souches de profil bien connu ont t choisies au hasard.
Lensemencement de ces souches effectu sur les milieux prpars a montr
que le profil des milieux pour les souches choisies tait identique.
34
3.2. Contrle de qualit des galeries didentification dshydrates

100l de milieu ont t distribus dans chaque puit. La dshydratation a
t faite en prsence dun dessiccateur ou dans un four micro-ondes.
3.2.1. Contrle de strilit
La strilit a t mise en vidence par labsence de souillures des milieux
pralablement dshydrats.
Pour les entrobactries, les cupules renfermant des milieux allant de
ADH URE ont t inoculs avec de leau physiologique strile et ceux de
GLU XYL avec le MEVAG Entrobactries.
Pour les bacilles Gram ngatif non fermentaires, les cupules renfermant
les substrats de ADH URE ont t inoculs avec de leau physiologique et
ceux allant de GLU XYL avec le MEVAG Entrobactries.
Aprs 24 48h dincubation et aprs rvlation de certains tests, le lot a
t considr strile en labsence de virage de lindicateur et de raction
positive pour les tests rvls.
35
Tableau II : Plan de contrle de strilit des microplaques CSB

Entrobactries
ADH
Eau
ONPG
physiologique Eau
strile
GEL
physiologique Eau
strile
ODC
physiologique Eau
strile
Eau
physiologique
strile
strile
H2S / IND
MAL / PDA
Eau
physiologique
physiologique
strile
strile
URE
GLU
physiologique Eau
strile
CS
physiologique
physiologique Eau
strile
LDC
Eau
physiologique Eau
strile
VP
Eau
CC
MEVAG
physiologique
strile
LAC
MAN
SOR
XYL
MEVAG
MEVAG
MEVAG
MEVAG
36
Tableau III : Plan de contrle de strilit des microplaques CSB

Bacilles Gram ngatif non fermentaires (BGN NF)
ADH
ONPG
Eau
physiologique Eau
strile
CC
physiologique Eau
strile
ESC
GEL
Eau
physiologique Eau
strile
NIT
TDC
Eau
physiologique Eau
strile
physiologique
strile
strile
H2S / IND
MAL / PDA
Eau
physiologique
physiologique
strile
strile
URE
GLU
physiologique Eau
strile
Eau
physiologique
physiologique Eau
strile
CS
MEVAG
physiologique
strile
LAC
MAN
SOR
XYL
MEVAG
MEVAG
MEVAG
MEVAG
3.2.2. Contrle defficacit
Ce contrle a t ralis avec des souches de rfrence et de contrle

dont le profil biochimique prsente une stabilit bien connue.
Ainsi le milieu considr strile a pu faire lobjet dune tude en ce qui
concerne sa capacit donner un rsultat positif avec une souche dont le
caractre correspondant est positif et donner un rsultat ngatif si ce
caractre est ngatif pour une autre souche donne.
37
Technique
Deux plaques ont t prvues pour chaque galerie (contrle positif et
ngatif)
Une suspension bactrienne a t prpare partir dune culture de 24h
sur milieu solide.
Tableau IV : Contrle defficacit des substrats des microplaques
CSB entrobactries et bacilles Gram ngatif non Fermentaires
Substrats
Tmoins positifs
Tmoins ngatifs
LDC
Escherichia coli
Enterobacter
ODC
Klebsiella
ADH
Escherichia coli
UREE
Klebsiella Pneumoniae
Escherichia coli
VP
Klebsiella Pneumoniae
Escherichia coli
GEL
Proteus mirabilis
Escherichia coli
CS
Klebsiella
Escherichia coli
CC
Escherichia coli
H2S
Salmonella Typhi
IND
Escherichia coli
MAL
Escherichia coli
PDA
Proteus vulgaris
Escherichia coli
ONPG
Escherichia coli
Shigelli flexneri
LAC
Escherichia coli
Escherichia coli
Pseudomonas
aeroginosa
GLU
Escherichia coli
Proteus mirabilis
MAN
Escherichia coli
Shigella flexneri
SOR
Escherichia coli
Shigella flexneri
XYL
Staphylococcus xylosus
38
Staphylococcus aureus
3.2.3. Contrle des appareils

Ltuve
La temprature tait toujours maintenue 37C
Le densitomtre
3.2.4. Contrle des paramtres dynamiques
La temprature, paramtre trs slectif, a t maintenue 37C. Celle-ci
a t favorable la croissance des bactries utilises lors de notre tude.
Le pH tolr par les bactries se situe entre 6 et 9, donc avant chaque
manipulation nous avons effectu un ajustement du pH de tous les milieux
liquides utiliss. Nous avons pu avoir
une bonne identification de nos
bactries en utilisant les galeries Micro-CSB.

Les bactries ont une certaine tolrance vis--vis des variations ioniques,
en effet notre tude na pas t influence par leur prsence.
IV. METHODES
4.1. Isolement et identification
4.1.1. Isolement
En vue dobtenir des colonies des germes identifier, les souches
conserves -20C ont t rgnres dans un bouillon denrichissement puis
ensemences sur la glose CLED. Lincubation a t faite ltuve 37C
pendant 24 heures.
4.1.2. Identification
4.1.2.1. Examen macroscopique
Les souches de E.coli ont donn sur le milieu CLED de grosses colonies
sches, lactose positif et contours irrguliers.
39
Les souches de K.pneumoniae ont donn sur le milieu CLED de grosses

colonies muqueuses, lactose positif, ayant un aspect de goutte de miel avec
une tendance la confluence.
Les souches de Salmonella quant elles ont montr des colonies lisses
de type S bord rgulier.
Les souches de Acinetobacter ont dvelopp sur le milieu MH des
colonies lisses bordures nettes.
4.1.2.2. Examen microscopique
Coloration de Gram
Principe
La coloration de Gram est la coloration de base de la bactriologie ; elle
consiste mettre en vidence les caractres morphologiques propres une
bactrie. Elle permet ainsi de distinguer les bactries gram ngatif des
bactries Gram positif.
Technique
La coloration de Gram se droule en plusieurs tapes qui se succdent.
Il sagit de :
- Fixer le frottis la flamme dun bec bunsen,
- Recouvrir le frottis de la solution de violet de gentiane,
laisser agir une minute,
- Laver la lame au lugol puis de la recouvrir de lugol, laisser
agir 30 secondes,
- Rejeter le lugol puis laver leau,
40
- Dcolorer lalcool 95C ,

- Rincer la lame leau courante et la recouvrir de solution de
fuchsine avant de laver abondamment,
- Egoutter et lire au microscope optique lobjectif 100 avec
une goutte dhuile immersion.
Rsultat
Des bacilles colors en rose ont t observs.
4.1.2.3. La raction loxydase
Principe
Cette raction est recherche sur des cultures en milieux gloss exempts
de sucres ferments cibles ou de sang. Les bactries possdant des oxydases
donnent en prsence de sucre, des mtabolites qui se combinent avec le ractif
utilis pour donner une coloration variable selon la bactrie.
Technique
Le test a t ralis laide dun disque de commerce prt lemploi,
imprgn deau distille sur lequel a t dpose une colonie.
Rsultat
La raction positive sest traduite par lapparition dune coloration
violette lendroit o la colonie a t dpose. Les rsultats obtenus taient
les suivants :
Les entrobactries comme Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, et
Salmonella paratyphi A taient dpourvues doxydase ngative, c'est--dire
quil ny a pas eu de coloration.
La souche dAcinetobacter sest galement rvl oxydase ngative
41
4.1.2.4. Mini galerie didentification

Milieu mannitol-mobilit
Cest une glose molle conditionne en tubes qui permet dtudier la
fermentation du mannitol ainsi que la mobilit des germes.
La bactrie est ensemence par piqre centrale jusquau fond du tube
laide dune anse de platine.
Rsultat
La fermentation du mannitol a t matrialise par un virage du milieu
au jaune.
Les bacilles mobiles ont diffus partir de la ligne densemencement,
crant un trouble du milieu ; nous avons lexemple des bacilles comme E. coli
ou encore S. paratyphi A.
Les bacilles immobiles ont uniquement pouss le long de la strie
densemencement ; nous avons pris comme exemple K. pneumoniae.
Milieu kliger hajna
Cest un milieu solide coul en pente et contenant du thiosulfate, des
ions ferreux, de la lysine, du glucose, du lactose et galement des lments
nutritifs permettant la multiplication et la croissance des bactries.
Sur ce milieu on peut rechercher les 6 caractres suivants :
- La fermentation du lactose : le milieu vire du rouge au jaune,
- La fermentation du glucose,
- La production de gaz,
- La production dhydrogne sulfur,
- La prsence de lysine dcarboxylase.
42
Rsultat
Les souches de E. coli fermentaient le glucose ainsi que le lactose, elles
produisent du gaz mais pas du sulfure dhydrogne H2S.
Les souches de K. pneumoniae ont ferment le glucose mais pas le
lactose, par contre elles ont produit du gaz et du H2S.
Les souches de S. typhi A fermentaient le glucose ainsi que le lactose,
mais nont produit ni du gaz ni du H2S.
Quant la souche dAcinetobacter, elle na rien ferment et na pas
produit de gaz ni de H2S.
Milieu du citrate de simmons
Ce milieu est coul en tube pour ltude de lutilisation du citrate comme
seule source de carbone par les germes.
Il contient un indicateur de pH qui est le bleu de bromothymol, ce qui
confre au milieu une coloration verte ltat acide.
Les germes qui utilisent le citrate comme seule source de carbone
entranent une alcalinisation du milieu, do le virage du vert au bleu.
Rsultat
Les souches de E.coli nutilisent pas le citrate comme seule source de
carbone, de mme que la souche de S. paratyphi A. Les souches de
K.pneumoniae et de Acinetobacter utilisent le citrate comme seule source de
carbone.
Le milieu Ure-Indole
Cest un milieu liquide dans lequel on recherche trois caractres :
-
la production durase qui se matrialise par le changement de la

coloration jaune en rose, du fait de lalcalinisation du milieu ;
43
- la prsence dindole qui se matrialise par un anneau rouge, aprs

addition du ractif de Kovacs ;
- la prsence de TDA qui se matrialise par un changement de la
coloration du jaune au rouge, aprs addition de perchlorure de fer
(FeCL3).
4.2. Recherche de leffet inoculum et de leffet du temps
dincubation des galeries Micro-CSB sur lidentification des
bactries Gram ngatif
4.2.1. Recherche de leffet inoculum sur lidentification
Aprs identification des bactries sur lesquelles a port notre tude, une
colonie isole sur le milieu CLED a t prleve laide dune anse de platine
puis ensemence dans 10ml de bouillon thioglycolate.
Aprs homognisation, une suspension a t obtenue et celle-ci a t
considre comme un chantillon de volume V0 =10ml et de concentration C0
linstant t=0 min (T0)
A partir de ce moment, un prlvement a t effectu toutes les 20 30
min et ceci pendant 2 3heures. Durant les deux premires demi-heures
100l ont t prlevs uniquement pour le dnombrement bactrien. Alors
que pour les demi heures restantes 1,5ml de la suspension ont t prlevs
servant aussi bien pour lensemencement des galeries
Micro-CSB
Entrobactrie que pour le dnombrement bactrien.

4.2.1.1. Le dnombrement bactrien
Principe
La technique de mesure de la croissance dune population bactrienne
par dnombrement sur botes de ptri consiste ensemencer des intervalles
de temps rguliers des botes de ptri par des dilutions appropries dun
chantillon de la suspension bactrienne : la dilution est calcule pour obtenir
44
entre 30 et 300 colonies sur chaque bote, ces deux bornes tant considres
comme donnant le moins derreurs sur le dnombrement final. Cette tape est
suivie dune culture de 24 48h 37C au terme de laquelle les colonies sont
dnombres.
Technique
Une dilution en srie a t effectue chaque espace de temps, ainsi
donc 100l de suspension ont t prlevs et dilus une concentration
convenable dans 900l deau physiologique. Les derniers 100l ont t
dposs sur une glose MH, puis disperss grce un taleur strile. Les
botes ont t places ltuve pendant 24h 37C.
Dans un souci de minimiser les erreurs de dnombrement, nous avons
dcid densemencer chaque point de prlvement deux boites.
Aprs incubation nous avons pu dnombrer les colonies viables obtenues
au niveau des deux boites.
Expression des rsultats
Les rsultats ont t obtenus en faisant la moyenne du dnombrement
des deux botes de ptri. Ils sont exprims en UFC/ml.
4.2.1.2. Recherche de leffet du temps dincubation des galeries
Micro-CSB sur lidentification des bactries
Principe
Il sagit dune mthode miniaturise permettant la mise en vidence
dactivit enzymatique, de la fermentation des sucres et de la croissance en
milieu hostile.
45
Les galeries Micro-CSB des entrobactries et les bacilles Gram ngatif

non fermentaires permettent de raliser respectivement 16 tests biochimiques
et de faire le diagnostic despce de la plupart des entrobactries ainsi que
des bacilles Gram ngatif non fermentaires.
Technique
Les inocula qui ont t obtenus aux diffrents intervalles de temps ont
ensuite t ensemencs dans les galeries Micro-CSB Entrobactrie et
BGNNF.
Inoculation des microplaques Entrobactries
Il fallait :
- distribuer 100l dinoculum bactrien par micro cupule de ADH
URE,
- mlanger 100l de la suspension bactrienne 1ml de
- MEVAG Entrobactries,
- ensemencer les cupules de GLU XYL avec 100l de MEVAG
ainsi inocul,
- recouvrir les puits destins la recherche des dcarboxylases,
dADH, durase et des sucres avec 2 gouttes de paraffine afin
de maintenir lanarobiose ncessaire ces ractions,
- incuber les galeries 37C sur un plateau recouvert de papier
buvard imbib deau,
- faire la lecture toutes les 4 heures pendant 12 heures,
- faire une dernire lecture 24 heures et sil y a lieu ajouter des
ractifs de rvlation,
- noter toutes les modifications observes lors de ces lectures.
46
Les bacilles Gram ngatif non fermentaires

Il fallait :
- distribuer 100l dinoculum bactrien par micro cupule de ADH URE,
- verser le reste de la suspension bactrienne dans 1ml de MEVAG
Entrobactries,
- ensemencer les cupules de GLU XYL avec 100l de MEVAG
ainsi inocul,
- recouvrir les puits destins la recherche des dcarboxylases,
durase et des sucres avec 2 gouttes de paraffine afin de maintenir
lanarobiose ncessaire ces ractifs,
- incuber les galeries 37C sur un plateau recouvert de papier
buvard imbib deau,
- faire la lecture toutes les 4 heures pendant 12 heures, puis 24 h
- noter toutes les modifications observes lors de ces lectures.
Lecture et interprtation
La lecture a repos sur le changement de la coloration initiale des
diffrents milieux. Pour la plupart des milieux, la lecture a t faite
directement, alors que pour dautres elle a ncessit laddition de ractifs de
rvlation.
La lecture des caractres tait effectue grce une fiche de lecture (cf.
tableau IV et V)
47
Tableau V : Tableau de lecture de lentrobactrie
Tests
substrats
Ractions / Enzymes
LDC
ODC
Lysine
Ornithine
ADH
Arginine
URE
Ure
Lysine dcarboxylase
Ornithine
dcarboxylase
Arginine
dcarboxylase
Urase
VP
Glucose
pyruvate
Glatine
Production dactone VP1+

VP3
Glatine
Citrate de
simmons
Citrate de
chistensen
Sulfate
Sodium
Tryptophane
GEL
CS
CC
H2S
IND
MAL
Ractifs de Rsultats
rvlation
positifs
Rsultats
ngatifs
Rouge
Rouge
Jaune
Jaune
Rouge
Jaune
Rose
framboise
Rose rouge
Orange
Inchang
Utilisation du citrate
Diffusion
du charbon
Bleu
Utilisation du citrate
Rose
Jaune claire
Production dH2S
Noir
Incolore
Tryptophane
Malonate
Sodium
Utilisation du
malonate
Phnylalanine Phnylamine
PDA
dsaminase
ONPG ONPG
-galactosidase
GLU
Glucose
Fermentation
ARA Arabinose
48
Incolore
Vert
1 goutte de Anneau
kovacs
rouge
Bleu
Anneau
incolore
Jaune vert
1 goutte de Vert
perchlorure
Jaune
Jaune
Jaune
Incolore
Bleu
Tableau VI : Tableau de lecture des bacilles Gram ngatif non fermentaire
Tests
NIT
Ractifs ajouter
1 goutte dacide
Interprtation
Positif
Ngatif
Rose
Incolore
sulfanilique
1goutte d-naphtylamine
poudre de zinc
UREE
Rouge violac
MAL
Bleu
PDA
1 goutte de FeCL3
Jaune
Jaune vert
Vert
Jaune
ADH
Violet
Jaune
CS
Bleu
Vert
CC
Rose
Jaune clair
ESC
Nuage noir
GEL
Diffusion du pigment
H2S
IND
1 goutte de Kovacs
Jaune
Pas de diffusion
Prcipit noir
Incolore
Anneau rouge
Anneau jaune
ONPG
Jaune
Incolore
GLU
Jaune
Bleu vert
LAC
Jaune
Bleu vert
SOR
Jaune
Bleu vert
MAN
Jaune
Bleu vert
XYL
Jaune
Bleu vert
49
I. EFFET DE LINOCULUM SUR LIDENTIFICATION

BACTERIENNE EN FONCTION DU TEMPS DINCUBATION
1.1. Escherichia coli
1.1.1. Rsultats du dnombrement
Le tableau ci-dessous montre les rsultats du dnombrement de Escherichia coli
Tableau VII : Dnombrement de Escherichia coli
Temps
T0 = 0
T1 = 30
T2 = 50 T3 = 70
T4 = 90
T5 =110
T6=130
6,3 105
7,5 105
5,5 106
7,65 106
1,75 107
1,4 108
(min)
Inoculum
6,85 106
(UFC/ml)
Linoculum a t prpar avec du bouillon thioglycolate, ensuite incub

ltuve 37C. Pour un dbut de croissance, seule la premire phase
dincubation na dur que 30 minutes. Les autres phases dincubation ont dur
20 minutes, suffisant pour un bon suivi de la croissance de cette souche. Un
accroissement de la concentration bactrienne est observ tout au long de ces
2h10min de manipulation. Lequel accroissement sest effectu de manire
timide jusquau bout de 80 minutes.
1.1.2. Conditions dinterprtation
Lidentification dune bactrie est rgie par un certain nombre de critres
qui permettent de catgoriser leur interprtation en cinq groupes selon le
pourcentage de positivit des galeries testes.
50
Ainsi nous avons :

99,9% : excellente identification,
99% : trs bonne identification,
90% : bonne identification,
80% : identification acceptable,
< 80% : identification inacceptable.
1.1.3. Rsultats des galeries Micro-CSB
Les plaques ont t incubes ltuve 37C aprs les avoir
ensemences
avec
linoculum
obtenu.
Les
deux
premiers
inocula
correspondant respectivement aux temps T0 = 0min et T1 = 30min nont pas

t utiliss pour lensemencement des plaques du fait de leur faible
concentration. Les rsultats obtenus ont t inscrits dans les tableaux
suivants :
Rsultats des galeries Micro-CSB obtenus la 4me, la 8me, la
12me et 24heures dincubation en fonction de linoculum
51
Tableau VIII : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Escherichia coli)
5,5 10
6,85 10
7,65 10
Inocula(UFC/ml)
Temps
dincubation
en heures
12 24
12 24
Caractres
didentification
de E.coli
[4,14, 23]
12 24
Tests
biochimiques
ADH
ONPG
+
+
+
CC
CS
VP
i
i
i
i
i
i
i
i
i
GEL
H2 S
IND
i
i
+ i
i
i
+ i
i
i
+
MAL
PDA
i
i
i
i
i
i
i
i
i
LDC
ODC
- + +
+
- + +
+
- + +
+
URE
GLU
- + +
+
- + +
+
+ + +
+
LAC
- + +
+
- + +
+
- + +
+
MAN
- + +
+
- + +
+
- + +
+
SOR
+
+
- +
+
XYL
- +
+
- + +
+
- + +
+
Concordance des 60 80 86 100 60 86 86 100 66 86 93 100
caractres (%)
Lgende : (+) = caractre positif,

(-) = caractre ngatif,
(d) = caractre variable,
(i) = caractre indtermin.
52
d
+
+
d
d
+
+
+
d
d
100
Tableau IX : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Escherichia coli)
1,75 107
Caractres
didentification
de E.coli
[4,14, 23]
1,4 108
Inocula (UFC/ml)
Temps
dincubation
en heures
12
24
12
24
Tests
biochimiques
ADH
ONPG
CC
CS
VP
GEL
H2 S
IND
MAL
PDA
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
Concordance des
caractres (%)
i
-
i
-
i
-
+
66
+
+
+
+
+
86
+
+
+
+
+
+
93
+
+
+
+
+
+
+
+
100

53
i
-
i
-
i
-
+
+
73
+
+
+
+
+
86
+
+
+
+
+
+
93
+
+
+
+
+
+
+
+
100
d
+
+
d
d
+
+
+
d
d
100
Les rsultats des tests pour la mise en vidence de lindole, de la raction

de Voges-Proskauer et de la phnyl alanine dsaminase nont pu tre
dtermins quau bout de 24h pour cause, leur rvlation a ncessit
laddition de ractifs.
Les pourcentages de concordance des caractres biochimiques
en
fonction du temps dincubation des microplaques CSB pour chaque inoculum

ont t illustrs sur les figures suivantes :
Figure 2 : Concordance des caractres de E.coli en fonction du temps

dincubation de la microplaque CSB avec un inoculum
de 5,5 106 UFC/ml
Lidentification de la souche a t demble acceptable la 8me heure
dincubation de la microplaque. Dans ce cas, il sagit dune bonne
reprsentativit de linoculum. Les concordances ont cr dans le mme sens
que les temps dincubation des plaques Micro-CSB.
54
Figure 3 : Concordance des caractres de E.coli en fonction du

temps dincubation de la microplaque CSB avec un inoculum
de 6,85 106 UFC/ml
Il est important de noter que la progression de cette concordance est

fonction de lallongement du temps dincubation mais galement de
laccroissement de la taille de linoculum. En effet la concordance observe
la 8me heure dincubation pour linoculum de 6,5 106 UFC/ml est passe de
80% 86% pour linoculum de 6,85 106 UFC/ml.
55

de 7,65 106 UFC/ml
Il y a une bonne corrlation entre la concordance des caractres tudis

et le temps dincubation.
56

de 1,75 107 UFC/ml
Le paralllisme entre ces deux paramtres sest prcis au fur et
mesure que la concentration de linoculum augmentait. Les rsultats sont
superposables pour les inocula de 7,65 106 UFC/ml et de 1,75 107 UFC/ml
bien que la population ait augment dune puissance de 10.
57

de 1,4 108 UFC/ml
Nous avons constat une volution de la concordance des caractres la
4me heure de lecture avec un pourcentage qui est pass de 66 % UFC/ml
73 % UFC/ml.
Rsultats des galeries Micro-CSB obtenus la 12me heure
dincubation en fonction de linoculum
Les rsultats obtenus aprs 24 heures ont t analyss et valids par des
tudes antrieures. Seuls les rsultats obtenus durant la priode
dincubation, comprises entre 4 heures et 12 heures ont t retenus pour
cette tude. Les meilleurs de ceux-ci ont t obtenus la 12me heure
mais dj aprs 8h dincubation nous pouvions observer une bonne
identification de la souche. Nous avons donc fait une tude comparative
de nos rsultats cette heure en fonction des diffrents inocula.
58
Tableau X : Etude comparative des rsultats obtenus la 12me heure

dincubation en fonction des inocula
I2
I3
I4
I5
I6
5,5 106
6,85 106
7,65 106
1,75 107
1,4 108
ADH
ONPG
CC
CS
VP
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
% de concordance des
86
86
93
93
93
Inocula (UFC/ml)
Caractres
Biochimiques
caractres
Lgende : (I) = inoculum

(i) = caractre indtermin
59
Lvolution de la
concordance des caractres biochimiques la
douzime heure en fonction de linoculum est reprsente par la figure
Figure 7 : Identification de E. coli au bout de 12h dincubation des

Plaques en fonction des diffrents inocula
Sur les 18 tests biochimiques tudis, les trois tests savoir lindole, le
VP et le PDA nont pu tre dtermins qu la 24me heure car leur rvlation
a ncessit laddition de ractifs.
Pour les deux premiers inocula, seuls deux caractres ont donn des
ractions ngatives. Il sagit de lONPG et du sorbitol.
Pour les trois derniers inocula, seul lONPG sest prsent comme tant
un caractre discordant.
60
1.2. Klebsiella pneumoniae

Le tableau ci-dessous montre les rsultats du dnombrement de
Tableau XI : Dnombrement de Klebsiella pneumoniae
Temps
T0 = 0
T1 = 30
T2 = 60
T3 = 90
T4 = 120 T5 =150
T6=180
2,32 106
7,45 106
2 107
1,35 108
1,5 108
1,75 109
(min)
Inoculum
3,45 108
(UFC/ml)
Le bouillon thioglycolate, aprs inoculation, a t incub ltuve

pendant 3h. En effet la souche de K. pneumoniae prsente un temps de
gnration de 30min. Toutes les 30min durant donc, une plaque a t
ensemence avec linoculum ainsi obtenu. Cette souche a prsent une
croissance assez significative.
Lidentification dune bactrie est rgie par un certain nombre de critres
qui permettent de la catgoriser (cf. 1.1.2).
1.2.3. Rsultats des plaques Micro-CSB
Les conditions dtude de Klebsiella pneumoniae ont t les mmes que
celles de E.coli (cf. I.1.1.3).
Rsultats des galeries Micro-CSB obtenus la 4me, la 8me, la 12me
et aprs 24heures dincubation en fonction de linoculum
61
Tableau XII : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Klebsiella pneumoniae)
Caractres
didentification
de K.
pneumoniae
Inocula (UFC/ml)
2 107
1,35 108
1,5 108
[4,14, 23]
Temps
dincubation
en heures
12
24
12
24
12
24
ADH
ONPG
CC
CS
Tests
biochimiques
VP
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
i
-
i
-
i
-
i
-
i
-
i
-
i
-
i
-
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
73
83
53
53
73
83
53
66
80
83
100
Concordance des
53 53
caractres (%)

(i) = Indtermin.
62
Tableau XIII : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Klebsiella pneumoniae)
3,45 108
Inocula(UFC/ml)
Caractres
didentification
de K.
pneumoniae
1,75 109
[4,14, 23]
Temps
dincubation
en heures
12
24
12
24
i
i
i
+
+
+
+
53
+
i
i
i
+
+
+
+
66
+
+
i
i
i
+
+
+
+
+
+
+
80
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
83
i
i
i
+
+
+
+
53
+
i
i
i
+
+
+
+
73
+
+
i
i
i
+
+
+
+
+
+
+
80
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
83
Tests
biochimiques
ADH
ONPG
CC
CS
VP
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
Concordance des
caractres (%)

(i) = Indtermin.
63
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
d
d
100

dtermins quau bout de 24h pour cause, leur rvlation a ncessit
en

Figure 8 : Concordance des caractres de K. pneumoniae en

fonction du temps dincubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 2 107 UFC/ml
Une bonne identification de la souche na pu tre possible qu la 24me
heure ce qui montre que les inocula ntaient pas tant significatifs pour donner
de bons rsultats. Le pourcentage des caractres a volu dans le temps
jusqu donner un bon rsultat la 24me heure dincubation des
microplaques.
64

un inoculum de 1,35 108 UFC/ml
Les rsultats sont superposables pour les inocula de 1,35 108 UFC/ml et
2 107 UFC/ml. Bien que la diffrence entre les inocula soit grande, les
caractres biochimiques nont pas volu.
65
Figure 10 : Concordance des caractres de K. pneumoniae en fonction

du temps dincubation de la microplaque CSB avec un inoculum de
1,5 108 UFC/ml
Par contre pour linoculum de 1,5 108 UFC/ml, le pourcentage des
caractres a bien progress en passant 66% la 8me heure 80% aprs
12heures dincubation ; permettant ainsi une bonne identification de la
souche. A cet inoculum nous avons pu avoir une identification de la souche
12 heures.
66

Les rsultats pour linoculum de 3,45 108 UFC/ml sont superposables
ceux de 1,5 108UFC/ml. Ceci est comprhensible parce que la diffrence de la
population nest pas grande.
67

Mme pour linoculum le plus lev, lidentification de la souche na pu
se faire qu 12 et 24 heures dincubation des plaques Micro-CSB. Les
caractres la 24me heure sont rests constants pour pratiquement tous les
inocula.
Rsultats des galeries Micro-CSB obtenus la 12me heure dincubation
en fonction de linoculum
Dune manire gnrale, les rsultats obtenus pour cette souche nont
pas t fameux. Mme la 12me heure, avec certains inocula, nous
navons pas pu bien identifier la souche de Klebsiella pneumoniae.
Mais en moyenne lidentification est assez bonne. Ltude comparative
des rsultats de cette souche sest faite quand mme la 12me heure,
car avant 24 heures, les concordances taient acceptables cette heure.
68
Tableau XIV : Etude comparative des rsultats obtenus la 12me heure

I2
I3
I4
I5
I6
2 107
1,35 108
1,5 108
3,45 108
1,75 109
ADH
ONPG
CC
CS
VP
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
73
73
80
80
80
Inocula (UFC/ml)
Caractres
Biochimiques
caractres
(I) = inoculum
Lvolution de la
concordance des caractres biochimiques la
douzime heure en fonction de linoculum est reprsente la figure 13.

69
Figure 13 : Identification de K. pneumoniae au bout de 12h

dincubation des Plaques en fonction des diffrents
inocula
Sur les 18 tests biochimiques, les trois nont pu tre rvls qu la 24me
heure dincubation des microplaques car leur identification a ncessit lajout
de ractifs de rvlation.
Pour les inocula de 2 107 UFC/ml et de 1,35 108 UFC/ml, lidentification
de la souche na pas pu tre possible car sur les 15 tests, les quatre ont donn
des rsultats ngatifs. Parmi ces tests discordants il y a le lactose, lure, le
malonate, lONPG. Le malonate est rest ngatif pendant toute la dure de
lopration alors quil devait tre positif.
Pour les inocula de 1,5 108 UFC/ml, de 3,45 108 UFC/ml, et de 1,75 109
UFC/ml, lidentification de la souche a t acceptable, et le pourcentage a
diminu avec deux caractres discordants. Cest le malonate qui a persist
dans sa ngativit ; lONPG, mais aussi le test lure ne sont rests ngatifs
que pour linoculum de 1,5 108 UFC/ml. Il y a lODC qui est pass dun
caractre ngatif un caractre positif alors que ce caractre devait rester
ngatif pour pouvoir rpondre aux normes didentification de cette souche.
70
1.3. Salmonella paratyphi A

Le tableau ci-dessous montre les rsultats du dnombrement de
Salmonella paratyphi A
Tableau XV : Dnombrement de Salmonella paratyphi A
Temps
T0 = 0
T1 = 30 T2 = 60
T3 = 90
T4 = 120
T5 =150 T6=180
3,5 105
4 105
1,2 106
1,42 106
3,5 106
(min)
Inoculum
4 105
1,2 107
(UFC/ml)
Linoculum de dpart a t mis ltuve 37C pendant 3h. Durant ces

3h le tube qui contenait la suspension dinoculum est sorti toutes les 30min.
Ceci nous a permis dobtenir les rsultats inscrits dans le tableau ci-dessus. Il
faut signaler que cette croissance est assez lente.
Lidentification dune bactrie est rgie par un certain nombre de critres qui
permettent de la catgoriser (cf. 1.1.2).
71

Comme pour les autres souches, les plaques ensemences avec la souche
de Salmonella paratyphi A ont t incubes ltuve 37C. Les phases
dincubation ont dur 30min. Les rsultats obtenus ont t inscris dans les
tableaux ci-aprs :
et 24 heures dincubation en fonction de linoculum
72
Tableau XVI : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Salmonella paratyphi A)
Caractres
didentification
de S. paratyphi
A
Inocula (UFC/ml)
4 105
1,2 106
1,42 106
[4,14, 23]
Temps
dincubation
en heures 4
12
24
12
24
12
24
Tests
biochimiques
ADH
ONPG
CC
CS
VP
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
Concordance des 86 86 93
100
86 86 93
caractres (%)

73
100
86 86 100 100
100
Tableau XVII : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Salmonella paratyphi A)
Caractres
didentification
3,5 10
Inocula(UFC/ml)
1,2 10
de S.
paratyphi A
[22, 11, 17]

Temps
dincubation
en heures
12
24
12
24
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
86
93
100 100 93
Tests
biochimiques
ADH
ONPG
CC
CS
VP
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
Concordance des
caractres (%)

(d) = caractre variable.
74
100 100 100
d
d
+
d
+
+
d
d
100

dtermins quau bout de 24h, pour cause leur rvlation a ncessit
en

Figure 14 : Concordance des caractres de S. paratyphi A en

Lidentification a t demble acceptable la 4me heure dincubation,
elle est trs bonne la 24me heure. Il suffit donc dun faible inoculum pour
avoir une bonne identification. Le pourcentage des caractres a volu en
fonction du temps.
75

Les inocula de 4 105 UFC/ml et de 1,2 106 UFC/ml ont prsent des
rsultats superposables. Les concordances nont pas vari malgr la diffrence
des inocula aprs 4 heures, 8 heures et 12 heures dincubation.
76

Nous avons constat que la concordance des caractres la 12me heure
de lecture a progress de 14% par rapport la 8me heures.
77

Une autre volution a t observe la 8me de lecture, le pourcentage est
pass de 86% 93%. Plus la population devenait importante, plus le dlai
pour lobtention de bons rsultats tait rduit.
78

Pour linoculum de 1,2 107 UFC/ml lidentification de la souche tait
excellente lexception de la lecture 4h.
Rsultats des galeries Micro-CSB obtenus la 12me heure dincubation
en fonction de linoculum
Nous avons obtenus de trs bons rsultats tous les inocula.
79
Tableau XVIII : Etude comparative des rsultats obtenus la 12me heure

Inocula (UFC/ml)
I2
I3
I4
I5
I6
4 105
1,2 106
1,42 106
3,5 106
1,2 107
ADH
ONPG
CC
CS
VP
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
LDC
ODC
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
93
93
100
100
100
Caractres
Biochimiques
caractres
(I) = inoculum
80
Figure 19 : Identification de S. paratyphi A au bout de 12h

inocula
Les concordances ont vari dans le mme sens que les diffrents inocula.
Il y avait 18 tests biochimiques dont les 3 ncessitaient lajout de ractifs pour
leur identification.
Pour les inocula de 4,5 105 UFC/ml et 1,2 106 UFC/ml sur les 15 tests
restant, il y a eu deux caractres discordants qui taient le lactose et le
glucose.
Lensemble des caractres a pu tre dtermin avec les inocula de 1,42
106 UFC/ml, de 3,5 106 UFC/ ml et de 1,2 107 UFC/ml.
81
1.4. Acinetobacter
Le tableau ci-dessous montre les rsultats du dnombrement de Acinetobacter
Tableau XIX : Dnombrement de Acinetobacter
Temps
T0 = 0
T1 = 30
T2 = 60
T3 = 90
T4 = 120 T5 =150
T6=180
6,95 105
9,1 105
2,35 106
3 106
2,7 107
8 107
(min)
Inoculum
3,85 107
(UFC/ml)

Lidentification dune bactrie est rgie par un certain nombre de critres qui
permettent de les catgoriser (cf. 1.1.2).
Les conditions dtude de Acinetobacter ont t les mmes que celles de
E.coli (cf. 1.1.3).
et 24 heures dincubation en fonction de linoculum
82
Tableau XX : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Acinetobacter)
Inocula
(UFC/ml)
2,35 106
3 106
2,7 107
Caractres
didentification
de
Acinetobacter
[4, 14, 23]

Temps
dincubation 4
en heures
12 24
12 24
12 24
Tests
biochimiques
ADH
ONPG
CC
CS
ESC
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
NIT
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
Concordance
des caractres
(%)
+
+
+
+
+
+
+
+
- +
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
85 85 85 100 85 85 92 100 85 85 92 100

83
+
+
d
d
d
d
100
Tableau XXI : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

linoculum et du temps dincubation des plaques (Acinetobacter)
Caractres
didentification
de
Acinetobacter
Inocula (UFC/ml)
3,85 107
8 107
[4, 14, 23]

Temps
dincubation
en heures
12
24
+
+
i
i
i
100
+
+
100
i
i
i
85
12
24
+
+
i
i
i
100
+
+
100
Tests
biochimiques
ADH
ONPG
CC
CS
ESC
GEL
H2S
IND
MAL
PDA
NIT
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
Concordance des
caractres (%)
i
i
i
85
+
i
i
i
92

84
+
i
i
i
92
+
+
d
d
d
d
d
100
Figure 21 : Concordance des caractres de Acinetobacter en

Ds la 4me heure, nous avons pu obtenir de bons rsultats, cela veut dire
que cet inoculum est adquat pour permettre une bonne identification.
85
Figure 22 : Concordance des caractres tudis de Acinetobacter en

Les donnes observes pour linoculum de 3 106 UFC/ml sont
superposables celles de linoculum de 2,35 106 UFC/ml pour les heures de
lecture suivantes : 4 heures, 8 heures et 24 heures. Alors quune volution a
t observe la 12me heure, le pourcentage de concordance cette heure est
pass de 85 % 92 %.
86

Les rsultats observs pour linoculum de 2,7 107 UFC/ml sont les
mmes que ceux de linoculum de 3 106 UFC/ml.
87

Lvolution des concordances sest faite en fonction du temps. En

passant de linoculum de 2,7 107 UFC/ml 3,85 107 UFC/ml, les
pourcentages ont bien volu. A la 4me heure de lecture le pourcentage des
caractres est pass de 85 % 92 %, la 8me heure de lecture celui-ci est
pass de 92 % 100 %, signe dune bonne volution dans lidentification de
la souche.
88

Pour les inocula 3,85 107 UFC/ml et 8 107 UFC/ml, les concordances
taient constantes.
Rsultats des galeries Micro-CSB obtenus la 12me heure
dincubation en fonction de linoculum
Les rsultats obtenus la 12me heure taient acceptables.
89
Tableau XXII : Etude comparative des rsultats obtenus la 12me heure

dincubation en fonction des diffrents inocula.
I2
I3
I4
I5
I6
2,35 106
3 106
2,7 107
3,85 107
8 107
ONPG
CC
CS
ESC
GEL
H2S
URE
GLU
LAC
MAN
SOR
XYL
85
92
92
100
100
Inocula (UFC/ml)
Caractres
Biochimiques
ADH
IND
MAL
PDA
NIT
caractres
(I) = inoculum
90
Figure 26 : Identification de Acinetobacter au bout de 12h

inocula
Il y a 17 tests biochimiques qui permettent didentifier Acinetobacter,

mais parmi ces 17 tests, les trois nont pu tre dtermins qu la 24me heure
de lecture aprs ajout de ractifs de rvlation.
Pour le premier inoculum, deux caractres taient discordants ; ctaient
le CS et le CC. Pour les inocula 3 106 UFC/ml et 2,7 107 UFC/ml, seul le CC
est rest ngatif. Ils se sont tous rvls aux deux derniers inocula.
91
II. VALIDATION DE LA METHODE

2.1 Dtermination de la droite de rgression
2.1.1 Paramtres de dtermination
La droite de rgression fournit une ide schmatique de la relation entre deux
variables.
Pour faire la prdiction, il s'agira simplement de substituer la valeur donne x
dans l'quation de rgression et de calculer la valeur de y.
Pour cela nous avons trac la droite la plus reprsentative de lensemble qui
est donne par lquation :
o a et b sont des constantes dtermines par les formules suivantes :
x et y sont des variables
92
Ce qui nous a permis de calculer un coefficient de corrlation entre les deux

variables, r de formule :
r = coefficient de corrlation;
b = pente de la droite;
n = concentration inocula;
xi = donnes observes
a = ordonne lorigine
C = concordance des caractres
Y = donnes lordonne de droite de corrlation

N = nombre de paires (x ; y) utilises pour calculer la droite de concordance.
Critres dinterprtation de r et de a
r = 0,2 0,4 : Corrlation faible ou quasi absence de corrlation.
r = 0,4 0,6 : Corrlation moyenne.
r = 0,6 0,8 : Bonne corrlation.
r = 0,8 : Corrlation leve.
r = 1 o -1 : Corrlation parfaite
a = 0 : pas de corrlation
a < 0 : corrlation ngative
a > 0 : corrlation positive
93
2.1.2. Escherichia coli

Tableau XXIII : Rsultats de E.coli la douzime heure dincubation des
microplaques
Concentrations
inocula
(UFC/ml)
Concordance
des caractres
(%)
x = log [n]
y=C
a
b
Y
r
5,5 106
6,85 106
7,65 106
1,75
107
1,4 108
86
86
93
93
93
6,7
0,86
6,83
0,86
7,24
0,93
8,14
0,93
0,881
0,886
0,90
0,94
6,88
0,93
0,040
0,613
0,888
0,614
La corrlation entre la taille de linoculum et la concordance des caractres est

bonne. Lquation de la droite obtenue par la mthode des moindres carrs est
sous la forme de y = 0,040x + 0,613, avec r = 0,614. La valeur de a, pente de
la droite est suprieure zro donc la corrlation est positive.
94
2.1.3. Klebsiella pneumoniae

Tableau XXIV : Rsultats de K. pneumoniae la douzime heure
dincubation des Microplaques
Concentrations
inocula (UFC/ml)
2 107
1,35
1,5 108
108
3,45
1,75
108
109
Concordance des
73
73
80
80
80
x = log [n]
7,3
8,13
8,17
8,53
9,24
y=C
0,73
0,73
0,8
0,8
0,8
0,77
0,80
caractres
(%)
0,039
0,444
0,73
0,761
0,763
0,725
La corrlation entre la taille de linoculum et la concordance des

caractres est bonne. Lquation de la droite obtenue par la mthode des
moindres carrs est sous la forme de y = 0,039x + 0,444, avec r = 0,725. La
valeur de a, pente de la droite est suprieure zro donc la corrlation est
positive.
95
2.1.4. Salmonella paratyphi A

Tableau XXV : Rsultats de S. paratyphi A la douzime heure dincubation
des microplaques
Concentrations
4 105
1,2 106
1,42 106
3,5 106
1,2 107
93
93
100
100
100
x = log [n]
5,6
6,08
6,15
6,54
7,08
y=C
0,93
0,93
0,98
inocula
(UFC/ml)
Concordance
des caractres
(%)
0,051
0,648
0,93
0,95
0,96
0,74
Lquation de la droite obtenue par la mthode des moindres carrs est

suivante : y = 0,051x + 0,648 avec r = 0,74. Une bonne corrlation a t
obtenue entre la taille de linoculum et la concordance des caractres. La
valeur de a, pente de la droite est suprieure zro donc la corrlation est
positive.
96
2.1.5. Acinetobacter
Tableau XXVI : Rsultats de Acinetobacter la douzime heure dincubation
des Microplaques
Concentrations
inocula (UFC/ml)
2,35 106
3 106
2,7 107
3,85
8 107
107
Concordance des
caractres
(%)
85
92
92
100
100
x = log [n]
6,37
6,47
7,43
7,58
7,90
y=C
0,85
0,92
0,92
0,97
0,99
0,078
0,376
0,87
0,88
0,95
0,85
Une corrlation leve a t observe entre la taille de linoculum et la

concordance des caractres. Lquation de la droite obtenu par la mthode des
moindres carrs est sous la forme de y = 0,078x + 0,376, avec r = 0,85. La
pente de la droite est suprieure zro donc la corrlation est positive.
97
Notre tude tournait au tour de deux objectifs majeurs savoir :

La recherche de leffet de linoculum sur lidentification des
bactries
Ltude de limpact de la taille de linoculum sur le temps
dincubation des galeries Micro-CSB.
Une analyse pratique ralise de faon minutieuse au laboratoire a donn
des rsultats fiables et utilisables.
I. LES SOUCHES BACTERIENNES

Pour atteindre nos objectifs nous avons choisi de travailler avec quatre
espces. Ces souches ont t identifies avant chaque manipulation pour
confirmer leur authenticit. Il sagit de trois bacilles Gram ngatif qui
taient E. coli, K. pneumoniae et S. paratyphi A et dun bacille Gram ngatif
non fermentaire : Acinetobacter. Ces souches ont t isoles sur de la glose
CLED (cysteine lactose electrolyte deficient). Celle-ci avec son composant
lactos permettait une meilleure caractrisation de lONPG. Les souches qui
fermentent le lactose, prsentaient sur la glose des colonies jaunes alors que
celles qui ne le fermentent pas prsentaient des colonies transparentes ou
bleues. Pour les identifier nous avons utilis la mini galerie classique
didentification pour avoir une assurance de la qualit de la souche tudie.
II. ETUDE DE LA CROISSANCE PAR LA METHODE

DU DENOMBREMENT SUR BOITE DE PETRI
Quelques difficults ont t rencontres au cours de notre tude. Trouver
la dilution adquate pour obtenir un inoculum convenable tait le problme
majeur. Cette technique est trs fastidieuse, il fallait effectuer plusieurs
98
dilutions. A chaque point de prlvement nous devions faire des dilutions

progressives et ensemencer cet inoculum par talement sur des botes de ptri
contenant de la glose MH. Pour obtenir cet inoculum convenable, nous
avons rencontr quelques difficults mais cela sest amlior aprs quelques
manipulations. Lautre difficult tait dviter la prsence de souillures au
cours de nos oprations, car celles-ci pouvaient modifier considrablement
nos rsultats.
III. EFFET DE LINOCULUM ET DU TEMPS DINCUBATION SUR

LIDENTIFICATION DES BACILLES GRAM NEGATIFS
Les galeries didentification Micro-CSB Entrobactries et Micro-CSB
BGNNF ont t valides par les tudes de stabilit, defficacit, et de
reproductibilit avant leur utilisation.
Le nouvel objectif quil fallait atteindre avec ces plaques tait la
rduction de leur dlai de lecture. Il fallait tout dabord inoculer les plaques
avec diffrentes concentrations obtenues au cours des 3h ou 2h10min de
manipulation. Ensuite les plaques taient incubes ltuve 37C, elles
devaient rester 4h dans cette environnement ce qui correspondait la
premire phase de lecture. A cet instant les caractres dfinissant la souche
ntaient pas trs significatifs. La plaque tait r-incube pour quatre autres
heures ce qui correspondait 8h dincubation. A cette heure de lecture nous
avons constat une amlioration de la positivit des caractres. La plaque est
remise ltuve pendant 4h ce qui revenait un total de 12h dincubation. La
majorit des caractres pouvaient correctement tre identifis cette heure de
lecture. Certains des caractres nont pu tre dtermins quaprs 24h
dincubation car ceux-ci ncessitaient lajout de ractifs pour leur rvlation.
99
Toute cette opration avait pour objectif
la rduction du temps
dincubation. Et cette rduction pouvait permettre ces plaques davoir une

comptitivit sur le march par rapport aux autres mthodes didentification
des bacilles Gram ngatif.
3.1. Escherichia coli
Cette espce appartient la famille des Enterobacteriaceae, cette famille
comporte un caractre indispensable qui est la fermentation du glucose et
comme E. coli est capable de fermenter le glucose il est donc un membre de
cette famille. Le genre auquel il appartient prsente des caractres
dterminants que sont lONPG et le lactose, E. coli respecte lappartenance
ce groupe. Il est le seul rpondre aux caractres suivants : Ure (-), Indole
(+), ce sont ses caractres despces. [13]
Tous ces caractres ont pu tre identifis dj la 8me heure, lIndole
fait partie des caractres qui ncessitaient lajout de ractif de rvlation la
24me heure. Seul lONPG na pu tre identifi cela sexplique par la lenteur
de la raction, il na pu tre rvl quaprs 24h. Le test lONPG est encore
appel test la galactosidase, ce test est indispensable lorsque le lactose ne
peut tre rvl. Le retard dans lidentification de lONPG sexplique par le
fait que : la Gal est une enzyme inductible et le test se ralise en deux
temps. Il faut dabord une induction de lenzyme par du lactose, ce qui va
permettre lenzyme dagir sur le substrat pour donner lortho-nitro-phnol.
Des tudes antrieures ont montr que pour favoriser llution des disques, il
fallait les immerger dans une solution de lactose de 10% [4]. Nous avons pu
le rvler, 24 heures aprs parce que notre milieu disolement le CLED
contient 10% de lactose.
100
Nous avons pu avoir jusqu' 93% de caractres concordants au profil de

rfrence avec des inocula de 7,65 106 UFC/ml, de 1,75 107 UFC/ml et 1,4
108 UFC/ml.
3.2. Klebsiella pneumoniae
Cette espce appartient galement la famille des Enterobacteriaceae
car comme E. coli elle est capable de fermenter le glucose. Comme espce
elle
prsente des caractres
indispensables
qui
sont le
VP (+),
lODC (-), lIndole (-). Le VP et lIndole nont pu tre identifis quaprs 24h
car leur rvlation ncessitait lajout de ractifs, ils ont rpondu positivement
aux normes didentification de lespce. Seul lODC a prsent des caractres
discordants. Ce caractre est ngatif pendant les 12h dincubation ce qui sest
avr correct, cest la lecture de 24h que ce caractre est devenu positif ce
qui est anormal. En effet lODC est une enzyme qui scinde lacide amin
prsent dans le milieu, ce milieu contient du glucose et un indicateur color.
La souche aprs avoir t ensemenc dans le milieu et que celle-ci soit
capable de fermenter le glucose, il va y avoir une acidification du milieu cela
va permettre lenzyme de la souche de scinder lacide amin prsent dans le
milieu pour donner une amine. Ainsi la prsence de lamine va alcaliniser le
milieu et entrainer le virage de lindicateur color [13].
Lexplication quon pourrait avancer sur la positivit de ce caractre
serait une mutation de la souche car la souche de Klebsiella pneumoniae ne
possde pas cette dcarboxylase et donc naurait pu scinder lacide amin
prsent dans le milieu.
Les lectures qui ont t faites 4h et 8h aux diffrents inocula nont
pas donn de bons rsultats, nous navons pas pu bien identifier la souche de
K. pneumoniae. Lidentification na t possible qu la 12me et la 24me
heure, nous avons obtenu des pourcentages variant entre 80% 83%.
101
3.3. Salmonella paratyphi A [13, 32]

Contrairement aux deux autres souches celle-ci appartient la famille
des Enterobacteriaceae mais ne fermente pas le lactose. Elle prsente des
caractres despce qui sont ngatifs ce qui permet de la distinguer des autres
espces de Salmonella, il y a le LDC, le CS et le H2S. [10] Le seul caractre
discordant que nous ayons rencontr cest la fermentation du lactose, il sest
avr tre positif pour les inocula de 4 105 UFC/ml et de 1,2 106 UFC/ml aux
heures de lecture de 4h, 8h et 12h ; pour linoculum de 1,42 106 UFC/ml aux
heures de lecture de 4h et 8h enfin pour les inocula de 3,5 106 UFC/ml et de
1,2 107 UFC/ml pour la premire lecture.
Selon Robert FASQUELLE nous pouvons avancer des explications
1plausibles. Il faudrait tout dabord que nous parlions de lisolement de la
souche, en effet celle-ci a t ensemence dans la glose CLED qui contient
10% de lactose. Les bactries qui fermentent le lactose possdent dune part
lenzyme ncessaire la pntration du lactose dans la bactrie, il sagit de la
-galactoside permase et dautre part lenzyme scindant la molcule de
lactose en glucose et en galactose, il sagit de la -galactosidase qui est une
enzyme induite par le lactose. Si toutefois la souche avait subi plusieurs
isolements et par consquent avait acquis un mutant permase (+), cette
dernire pourrait faire pntrer le lactose dans la cellule bactrienne. Ainsi la
fermentation pourrait avoir lieu et le milieu lactos serait acidifi avec virage
du milieu. Lidentification de la souche a t excellente avec des pourcentages
de lordre de 86% 100%.
3.4. Acinetobacter [13]
Acinetobacter appartient aux bacilles Gram ngatifs non fermentaires.
Ce genre bactrien fait parti dun groupe qui ne possde pas doxydase ce qui
les diffrencie des autres BGNNF comme les Pseudomonas. Il a des
102
caractres indispensables mais ceux-ci varient en fonction de lespce. Nous

navons pas observ de discordance dans les caractres de Acinetobacter.
Pour les diffrents inocula les concordances montrent que Acinetobacter a pu
tre trs bien identifi avec des pourcentages variant entre 85% et 100%.
IV. LA VALIDATION
Toute mthode danalyse doit tre valide pour prouver quelle
correspond bien lusage pour lequel, elle est prvue. Pour cela nous avons
utilis la droite de rgression qui est un diagramme de dispersion qui montre
lexistence dune relation linaire en vue dune prdiction. Nous avons tent
dtablir une relation entre les concordances des caractres et les inocula qui
ont servi leur obtention. Pour les quatre souches tudies nous avons obtenu
les rsultats suivants :
E. coli :
y = 0,040x + 0,613
K. pneumoniae :
y = 0,039x + 0,444
S. para typhi A :
y = 0,051x + 0,648
Acinetobacter :
y = 0,078x + 0,376
Nous pouvons constater que les valeurs de a obtenu sont suprieurs

zro, la corrlation est donc positive. A partir de ces droites une corrlation a
t tabli avec comme coefficient de corrlation des deux variables tudies :
E. coli :
K. pneumoniae :
S. paratyphi A :
Acinetobacter :
r = 0,614
r = 0,725
r = 0,74
r = 0,85
103
La valeur des coefficients de corrlation trouve permet de dire que nos

droites sont plutt fiables. Elle permet galement de conclure que la relation
entre les deux variables tend vers la linarit dans la mesure o la plupart des
coefficients de corrlation r sont bons. Nanmoins il faudrait prciser quune
trs bonne corrlation devrait avoir un coefficient de corrlation gale 1 ou
proche de 1.
104
Les infections humaines entrobactries et bacilles Gram ngatif non

fermentaires occupent une place importante en pathologie infectieuse en
raison de leur frquence et de leur gravit, tant au niveau de lhpital quau
sein des populations.
Le diagnostic microbiologique et le traitement de ces infections imposent
lidentification correcte de lagent tiologique en cause pour une bonne prise
en charge thrapeutique.
Cest dans cette perspective que lunit de recherche et de
biotechnologie microbienne du laboratoire de bactriologie-virologie de
lhpital Aristide Le Dantec a labor une technique didentification reposant
sur lutilisation de mini galeries savoir les microplaques CSB. Lefficacit,
la fiabilit et la spcificit de celles-ci ont t prouves et amliores par des
tudes antrieures. De plus, leur moindre cot a permis leur accessibilit au
niveau certaines couches sociales. Leur seule contrainte se situe au niveau de
leur comptitivit par rapport dautres mthodes didentification telles que
les galeries API qui ont russi rduire leur temps dincubation.
Cest dans cette optique que nous avons cherch identifier des bacilles
Gram ngatifs avec un inoculum adquat et en un temps rduit.
Cette tude a eu lieu au laboratoire de recherche de lUCAD II du
Professeur BOYE entre Janvier et Juin 2008. Elle a port sur quatre souches
savoir :
Escherichia coli ATCC 25922,
Klebsiella pneumoniae,
Salmonella Paratyphi A
Acinetobacter
105
Escherichia coli
Ds la 8me heure, lanalyse a rvl une identification acceptable de E.
coli avec des pourcentages de lordre de 80%. Cependant la meilleure
identification, tout en restant bien entendu dans lide de la rduction du
temps dincubation, a t obtenue la 12me heure de lecture de la plaque
Micro-CSB Entrobactries. Le pourcentage des caractres obtenu cette
heure de lecture ont varis entre 86% et 93% pour diffrents inocula savoir :
5,5 106 UFC/ml, 6,85 106 UFC/ml, 7,65 106 UFC/ml, 1,75 107 UFC/ml et 1,4
108 UFC/ml.
Avec lespce K. pneumoniae, lidentification na t acceptable qu la
12me heure de lecture pour les inocula de 1,5 108 UFC/ml, de 3,45 108
UFC/ml et de 1,75 109 UFC/ml avec une concordance de 80%.
Salmonella Paratyphi A
Avec la souche de S. paratyphi A lidentification a t excellente. Ainsi
ds la 4me heure la concordance tait 86% avec un maximum de 100% la
12me heure de lecture des plaques pour les inocula de 1,42 106 UFC/ml, de
3,5 106 UFC/ml et de 1,2 107 UFC/ml.
Acinetobacter
Acinetobacter a trs tt pu tre identifi, avec la 4me heure un
pourcentage de 85% et un maximum de 100% la 12me heure pour des
inocula de 3,85 107 UFC/ml et de 8 107 UFC/ml.
106
Dans le cas gnral nous avons pu tablir une identification acceptable

des souches tudies avant 24 heures.
En plus dtre une exigence rglementaire, la validation doit galement
tre une exigence de la part du laboratoire lui-mme, dans un souci de qualit,
de scurit et de meilleure matrise des procds. Cest dans ce cadre quune
relation linaire acceptable a pu tre tablie entre les deux variables (x et y)
savoir la concordances et les inocula. Les quations de droite de rgression
ont permis de faire des estimations acceptables.
Par ailleurs, dans une perspective de rendre la recherche plus exhaustive,
il serait intressant dapprcier la rptabilit ainsi que la reproductibilit de
la mthode; mais galement dexplorer leffet du changement de certains
paramtres (pH, temprature, activit enzymatique) sur lidentification.
107
1. API 20 E
Systme didentification des entrobactries
Bio Mrieux S. A. France, 2002.
2. Association des Enseignants de Microbiologie et dImmunologie

des Facults de Pharmacie Franaises (AEMIP)
Microbiologie gnrale et sant
Editions ESKA 2003 :155 162
3. AVRIL. J. MONTEIL. H, DOBERNAT.H, DENIS. F.

Bactriologie clinique.
Edition ELLIPSE: 171, 172, 175, 208, 294, 295
4. AVRIL. J.L., DABERNAT H., DENIS F., MONTEIL H.

Bactriologie Clinique
Ellipses, 3 edition, France, 2000: 114.
5. BAKHOUM I.
Contrle qualit et validation de diffrentes micromthodes
didentification bactrienne.
Thse Pharm., 2004.N8
6. BOSSERT I. D., YOUNG L.Y.

Anaerobic oxidation of paracresol by a denitrifying bacterium.
Applied and environmental Microbiology 1986, 52 (5) : 1117-1122.
108
7. BRENNER D.J.
Introduction to the family Enterobacteriaceae
In: Starr M.P., Stolp H.G.
Eds the prokaryotes Spinger- Verlag K.L. Berlin, 1981: 1105 - 1127
8. CARBONNELLE B., DENIS F., MARMONIER E., PINON G.,

VARGUES R.,
Bactriologie mdicale : Techniques usuelles.
SIMEP SA, Paris, 1987 : 121-137, 146-155.
9. DENIS F., DABERNATH, MONTEIL H. AVRIL J. L.

Bactriologie clinique
Edition marketing, Paris, 1998; 144-145.
10. DRAME B.
Micromthode didentification et dtude de la sensibilit des
entrobactries : Intrts thrapeutiques.
Thse Pharm., Dakar, 2001 ; n 86.
11. EDWARDS P.R., EWING W.H.

Identification of the Enterobacteriaceae
Ed Burgess, Minneapolis, 3rd ed, 1977
12. FARMER
Biochemical identification of new species and biogroup of
Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens
J. clin. Microbiol 1985, 21 : 46-76
109
13. FARMER
Enterobacteriaceae: Introduction and identification
In : Manual of clinical Microbiology, P.R. Murray, E.J. Baron, M.A.
Pfatter, Tenoven F.C. and R.H. Yolken (eds)
7th ed. American Society for Microbiology, Washington DC, 1999:
442-458.
14. FASQUELLE R.
Elments de bactriologie mdicale.
7 Editions Mdicales Flammarion, Paris 1968 : 160.
15. FERRON A.
Bactriologie mdicale
Editions C. et R. 1984;(3, 14, 15):3-2- 15-6.
16. FERRON A.
BACTERIOLOGIE MEDICALE lusage des tudiants en mdecine
EDITION C et R, 12 dition 1984 :122.
17.GUEYE O.
Utilisation des mthodes biomtriques dans lidentification de
quelques bacilles Gram ngatif.
Thse de pharm., 2007 ; n 36.
18. JANDA J. M. and ABBOTT S. L.

Historical perspectives on the family Enterobacteriaceae
Lippin Cott Raven Publishers, Philadelphia 1998, 1-7.
110
19. JAWETZ E., Melnick J. L., Adelberg E. A.

The Growth, Survival, & Death of Micro-organisms.
Review of Medical Microbiology, 1987;5:66-70.
20. Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison

Department of Bacteriology
Growth of Bacterial Populations, Rev. 2002:1-7.
21. LE MINOR L., VERON M.

Bactriologie Mdicale
Flam. Md. Science, Paris, 1984 : 392 394.
22. LE MINOR L., VERON N.

Bactriologie Mdicale
Flam Med. Science, Paris, 1989 : 318-333 ; 773-823.
23. MOUSTARDIER G.
Bactriologie Mdicale.
4 Edition, LIBRAIRIE MALOINE S. A. EDITEUR, Paris 1972 : 805.
24. NDOYE R.
Algorithme didentification des Entrobactries et des bacilles gram
ngatifs non fermentaires.
Thse Pharm., 2004 ; n 83.
25. NIANG O.
Validation dune micromthode didentification des bacilles Gram
ngatif non fermentaires.
Thse Pharm., Dakar 2003, n 60
111
26. PERRIERE G.
Application dune prsentation par objet des connaissances de
modlisation certains aspects de lexpression des gnes chez E. coli
UCBL.
Thse Universit de Lyon I, France. (1992) : 14, 77.
27. PILET C., BOURDON J. L., TOMA B., MARCHAL N.,

BALBASTRE C.
Les entrobactries
Bactriologie mdicale et vtrinaire : Systmatique bactrienne.
Doins Paris 2 dition 1979 : 109-187.
28. SANAA. M.
Microbiologie prvisionnelle : principaux modles de croissance
utilise en apprciation quantitative des risques.
Epidemiol et Sant Anim, 2002, 41, 169 177: 2, 4.
29. SMAI : 4e rencontres Math- Industrie.

Microbiologie prvisionnelle : Un outil pour estimer la dure de vie
des Aliments. (DLC) et Assurer la qualit jusqu la consommation.
Article Adria Dveloppement, 4 Avril, 2006 : 2, 3, 20.
30. SOW M. F.
Utilisation des mthodes biomtriques pour la validation de
lidentification des cocci Gram positif.
Thse de pharm., 2007
31. VERON M.
Croissance et nutrition bactriennes
Bactriologie mdicale, 1984 ; 2:22-28.
112
32. Article de Wikipedia

Entrobacteriaceae :
http : //fr.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae.
33. Article de Wikipedia

Droite de corrlation :
http://fr.Wikipedia.org/Wiki/R%C3%A9gression_lin%C3%A9aire.
113
SERMENT DE GALIEN
Je jure, en prsence des matres de la facult, des
conseillers de lordre des pharmaciens et de mes
condisciples :
Dhonorer ceux qui mont instruit dans les prceptes de
mon art et de leur tmoigner ma reconnaissance en
restant fidle leur enseignement ;
Dexercer, dans lintrt de la sant publique, ma
profession avec conscience et de respecter non seulement
la lgislation en vigueur, mais aussi les rgles de lhonneur,
de la probit et du dsintressement ;
De ne jamais oublier ma responsabilit et mes devoirs
envers le malade et sa dignit humaine.
En aucun cas, je ne consentirai utiliser mes
connaissances et mon tat pour corrompre les murs et
favoriser des actes criminels.
Que les hommes maccordent leur estime si je suis fidle
mes promesses.
Que je sois couvert dopprobre et mpris de mes
confrres si jy manque.
114
VU
VU
LE PRESIDENT DU JURY
LE DOYEN
VU ET PERMIS DIMPRIMER
LE RECTEUR DE LUNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR
115

Microbio Spe Ch1

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Microbio Spe Ch1

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

INTRODUCTION [17, 24]

Cest dans cette lance que lunit de recherche et de biotechnologie

1.1. Dfinition [9, 13, 26, 32]

morphologiques communes et parmi lesquels on trouvait dj des noms tels

de DON BRENNER et de PATRICK A.D.

GRIMONT, cette famille a connu un essor et beaucoup de nouveaux genres et

En 1973, 31 genres et 139 espces taient caractriss.

Tableau I : Classification des espces dentrobactries les plus

Enterobacter Enterobacter aerogenes

1.3 Les caractres bactriologiques

habituelle chez Klebsiella. La plupart des espces pathognes chez lhomme

I.3.3.2. Recherche de lurase

1.3.3.5. Recherche des dsaminases oxydatives

1.3.3.10. Recherche de lactone ou Raction de Voges-Proskauer (VP)

1.4. Etude des principaux genres

1.4.2. Klebsiella [12, 18, 21]

1.4.3. Salmonella [7, 8, 27]

II. BACILLE A GRAM NEGATIF NON FERMENTAIRE :

Une seule espce est reconnue : Acinetobacter calcoaceticus.

2.4.2. Les caractres culturaux

III. NUTRITION ET CROISSANCE BACTERIENNES [2]

3.1.1.2. Les aliments nergtiques

3.1.2.2. La pression osmotique du milieu

3.1.2.4. Loxygne molculaire

Figure 1 : Les 7 phases de la cintique de croissance dune population

La phase exponentielle (3) [19, 30, 31]

3.2.3. Techniques de mesure de la croissance bactrienne [19, 31]

3.2.4. Conditions de croissance des familles bactriennes tudies [17, 28]

tolrants aux variations de la pression osmotique. Ils sont aro-

anarobies facultatifs avec un mtabolisme fermentatif.

IV. QUELQUES PARAMETRES DE VALIDATION [34]

4.1.2. Droite de rgression

x = la valeur de la variable indpendante

II. MATERIELS ET REACTIFS

2.1.3. Matriel pour lidentification

2.1.4 Matriel pour la conservation des souches

III. CONTROLE DE QUALITE DES TESTS EFFECTUES

Chaque lot de milieu a t prpar et soumis un contrle de strilit et

3.2. Contrle de qualit des galeries didentification dshydrates

Tableau II : Plan de contrle de strilit des microplaques CSB

Tableau III : Plan de contrle de strilit des microplaques CSB

3.2.2. Contrle defficacit

Ce contrle a t ralis avec des souches de rfrence et de contrle

3.2.3. Contrle des appareils

une bonne identification de nos

bactries en utilisant les galeries Micro-CSB.

Les souches de K.pneumoniae ont donn sur le milieu CLED de grosses

- Dcolorer lalcool 95C ,

4.1.2.4. Mini galerie didentification

la production durase qui se matrialise par le changement de la

- la prsence dindole qui se matrialise par un anneau rouge, aprs

Entrobactrie que pour le dnombrement bactrien.

Les galeries Micro-CSB des entrobactries et les bacilles Gram ngatif

Les bacilles Gram ngatif non fermentaires

Tableau V : Tableau de lecture de lentrobactrie

Production dactone VP1+

Tableau VI : Tableau de lecture des bacilles Gram ngatif non fermentaire

I. EFFET DE LINOCULUM SUR LIDENTIFICATION

Linoculum a t prpar avec du bouillon thioglycolate, ensuite incub

Ainsi nous avons :

correspondant respectivement aux temps T0 = 0min et T1 = 30min nont pas

Tableau VIII : Concordance des caractres biochimiques en fonction de

Lgende : (+) = caractre positif,

Tableau IX : Concordance des caractres biochimiques en fonction de