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Microscopie électronique en biologie

Objectif de la microscopie en biologie

Imager des structures,

Co-localiser les protéines ou certaines molécules

Acquisition In vivo

A haute résolution
Microscopie électronique
R

R= 0.61 l /nsinm

R = Limite de
résolution
Avantages et limites de la MO

M Photonique
Signal Photons

Résolution 0.2 µm

Fixé ou Fixé ou
in vivo in vivo
Epaisseur 1 à 50 µm 0.2 mm
l’échantillon Coupe ou culture
Durée de Quelques sec à qlq heures Cheveu en MO
préparation
Temps Quelques ms
d’acquisition en 2D

Immunomar Marquage et colocalisation


quages
Milieu Air, liquide

Support Lame, boite de pétri 60 µm

Microsphère en MO En fluorescence on ne voit


que ce qui est marqué
En Microscopie optique

Muscle cardiaque en coupe longitudinale

Gross . x300
En Microscopie électronique

En Microscopie photonique

X 1000
X 10000
Principe de la ME : Interaction électron-matière
LE Microscope Electronique à Transmission
MET
Microscope Electronique en Transmission JEOL 100 Kv
La Microscopie Electronique en Transmission

MO
Immunofluorescence d’une protéine de
jonction sur culture cellulaire

L’image MET la même culture


Applications du MET
Ultrastructure sur coupe de tissu vivant ou matériaux

Immunomarquage des protéines par billes d’or

Diffraction électronique
Coupe MET dans une feuille d’arabidopsis
Effet de peptides microbienne sur cellules cancéreuse
Phagocytose
Bacteries dans cellules
Coloration négative •

Virus, proteines, molecules
Pas de coupes
• Résultats rapides

Phages

APT ou AcU à
saturation dans
l’eau ou alcool

100 nm
Immunomarquage, Echantillons

Système révélateur
billes or (1 à 15 nm)

Anticorps primaire

Epitope
Antigène
Echantillon
(tissus, cellules,
virus, bactéries…)‫‏‬

Stage d'immunomarquage en M E, Toulouse le 15 mai 2010


Marquage post synaptique d’une protéine sur coupe de cellules nerveuse
LE Microscope Electronique à Balayage
MEB
Interaction électron-matière
Microscope électronique à Balayage 840A de JEOL
MO

MET
L’image MEB correspondante
Application du MEB

Image de surface cellulaire ou de matériau

Immunomarquage des protéines de surface par billes d’or

Imagerie en mode électrons rétrodiffusés

Spectrométrie X
La différence entre la peau humaine et la peau de souris

La surface d’un cheveu


humain. Notez les
plaques de kératine
qui se chevauchent comme
des écailles

20µm

Couchedes cellules
Poil desquamentes Poil
Chez la souris
Epiderme les plaques
s’emboitent
entre elles.

Derme

20µm
Images de vaisseaux sanguins en
MEB et MET

MEB MET

Pl
N

Gr N
Gr

2µm
Culture cellulaire
Fibrocytes Osteoblastes

Osteocyte Osteoclaste
200µm 500µm

200µm 500µm

Œufs et larves(chenilles) du papillon blanc Charançon perçant le grain de blé


Legionella pneumophila
traité aux peptides antimicrobienne
Les différents types de grain de pollen

20µm

20µm
Pomme de terre
Crue

Pomme de terre
cuite

200µm
Un poil de barbe coupé par Un autre poil qui a été déchiqueté
la lame d’un rasoir mécanique par un rasoir électrique

50µm
Cardiomyocite sur lame
de culture
Cellule sanguine de Wolbachia
Col de chemise propre Col de chemise sale

200µm
200µm
Contraintes liées à
l’échantillon

Le plus proche du vivant (Fixé) MET et MEB

Ultrafin Epaisseur de coupe comprise entre 60 et 70 nm MET

Déshydraté MET et MEB

Surface conductrice MEB


Etapes de préparations des échantillons pour la MET
1 jour
3 jours MET MEB au mini

Fixation des protéines Fixation des protéines


minimum

Fixation des Lipides


Culture
cellulaire Déshydratation Déshydratation
Acétone ou Ethanol Acétone ou Ethanol
Tissu ou
Inclusion dans la résine Appareil par contournement
Suspensions du pt critique du CO2
(virus, bactéries, …)
Polymérisation CO2 liq par purges à 10°C
60 à 70° C dans étuve
(obtention de blocs) CO2 liq /gaz 31°C
(pt critique)
Coupes au microtome
Semi-fines ~ 1 µm Ultrafines CO2 gaz 40°C
~ 60 à 70 nm Dessiccation totale

Contraste Métallisation

Observation Observation
Prise de contact : 35 36

Compétence et savoir faire : Préparation d’échantillons biologiques


pour l’observation au MET et MEB

 Techniques classiques de fixation, déshydratation, inclusion et de coupes pour l’analyse


ultrastructurale,
 Techniques immunocytochimiques avec immunomarquage à l’or colloïdal en pré ou
post enrobage avec amplification à l’argent si nécessaire.
 Coloration négative de macromolécules et de fractions cellulaires
 Réalisation de coupes fines suivi du contraste

 Métallisation et dessiccation par contournement du point critique.


 Observation aux microscopes MEB et MET.
 Collecte des résultats sous forme fichiers numériques

 Enseignements et formations
Nouvelles techniques microscopie
Electronique

AMW (Automatic Microwave Tissue Processor)

Techniques à froid : cryofixation-cryocoupe-

Cryo-MET –cryo-transfert pour le MEB

Tomographie électronique

MEB 3 view

Microscopie à balayage environnementale