Université de Lomé Année académique 2013-2014

Faculté Des Sciences Semestre Harmattan

Département de Biochimie

TRAVAUX PRATIQUE DE BIOCHIMIE

METABOLIQUE : BCH 221

TP N°1 : SEPARATION DES ACIDES AMINÉS ET DES ACIDES ORGANIQUES DE

FEUILLES D’EPINARD PAR CHROMATION SUR COLONNE ECHANGEUSE D’IONS

Membres du binôme :

Matricule Parcours Nom Prénoms

143636 BPA MISSINOU Anani Amégan
143195 BPA TOKOU LABITE Kpoti

Dirigé par Mr Bilabina

INTRODUCTION

La chromatographie est une méthode physico-chimique de séparation des espèces présentes dans un
échantillon en phase liquide ou gazeuse. Elle met en œuvre l’interaction entre les solutés de la phase
mobile et ceux de la phase stationnaire solide. Selon les interactions mises en œuvre entre les composés
d’intérêt qu’on cherche à déterminer et la nature du support solide, on distingue plusieurs types de
chromatographie, notamment la chromatographie sur colonne échangeuse d’ions. Notre manipulation
portera sur la séparation des acides aminés et les acides organiques de feuilles d’épinards par
chromatographie sur colonne échangeuse d’ions et la détermination de l’indice de saponification de ces
acides organiques.

I/-RESULTATS ET INTERPRETATIONS

Après avoir broyé 12,5g de feuilles d’épinards, on mélange le broyat obtenue avec 50 ml tampon
phosphaté dont le rôle est de provoquer une déshydration mécanique des cellules par éclatement libérant
ainsi leur contenu. Le tout est porté à l’ébullition pendant 3 mn pour dénaturer les protéines par
altération dans la conformation de la chaîne peptidique. Après avoir filtré pour éliminer les fragments
végétaux les plus volumineux, on ajoute 50 ml d’alcool pour précipiter les protéines contenues dans le
filtrat. Ensuite on fait une centrifugation à 2500 tours/mn pendant 5 mn pour diminuer les débris
cellulaires présents dans l’extrait végétal. On obtient un surnageant qu’on recueille et qu’on verse dans la
colonne de résine IR120. Cette dernière est une résine cationique forte de type sulfonique sur laquelle est
fixés des contres ions pouvant s’échangés avec les ions présents dans le surnageant. La phase de fixation
est basée sur cette propriété d’échange d’ions entre la résine et le surnageant ne s’applique qu’a des
solutés ionique ionisable présentant les mêmes charge que les contres ions liés à la résine IR120. Au
contact avec ces échangeurs les acides aminés présents dans le surnageant vont déplacer les contres ions
et se lier de façon réversible à la résine grâce au groupement NH2 suivant l’équation suivant.

Res-SO3- + R’-NH3 + + OH- Res-SO3--NH3-R’ +H2O

Ensuite on rince la colonne avec de l’eau distillée pour éliminer les impuretés et les molécules faiblement
liées à la résine. Le passage lent de la solution d’ammoniaque dans la colonne a pour but de décrocher les
acides aminés sur la résine : c’est la phase d’élution. L’ammoniaque (NH4 +) étant plus fort, provoque la
rupture de la liaison (résine-acides aminés) suivant l’équation suivante :

Res-SO3- NH3-R’ + (NH4+ ; OH- ) Res-SO3- NH4+ + R’-NH2 + H2O

On obtient une solution B qu’on chauffe pour éliminer l’excès d’ammoniaque. Ensuite on met en évidence
les acides aminés présents dans la solution obtenue en ajoutant quelques gouttes de Ninhydrine. Cette
dernière réagit avec les acides aminés à fonction carboxyle et amine libre en donnant une coloration
violette (Pourpre de Ruheman) sauf pour la proline et hydroxyproline avec lesquelles elle donne une
coloration jaune. L’obtention de coloration violette après ajout de la Ninhydrine à la solution B prouve la
présence d’acides aminés.
II/-EXTRACTION ET MISE EN EVIDENDE DES ACIDES ORGNIQUES

Le liquide obtenu après le passage du surnageant dans la colonne IR120 est mis dans une deuxième
colonne de résine contenant l’amberlite IR410 qui est une résine anionique ayant pour rôle de fixer les
anions. Lors de la phase de fixation cette résine se lie aux acides organiques suivant l’équation :

Res-CH2-N-(CH3)3-Cl- + RCOO- Res-CH2-N-(CH3)3-OOC-R + OH-

Le passage de la solution de carbonate d’ammonium [(NH4)CO2] permet de décrocher les acides
organiques à la résine IR120 : c’est la phase d’élution.

Res-CH2-N-(CH3)3-OOC-R + (2NH4 ; CO32-) 2Res-CH2-N-(CH3)3- CO32- + R-COO- + 2NH4+

On recueille une solution C qui contient les acides organiques et un excès de carbonate d’ammonium. On
verse ensuite la solution IR120 la solution C dans un bécher contenant préalablement la résine IR120. Pour
fixer l’excès d’ammonium et on observe un dégagement de bulle due à la libération du CO2. On sépare
ensuite la solution C de IR120 par décantation et on porte la porte à l’ébullition pour éliminer le CO2
restant. On identifie ensuite les acides organiques (OA) par saponification avec la solution de potasse
alcoolique puis l’on passe au dosage.

III/- DOSAGE ET CALCUL DE L’INDICE DE SAPONIFICATION

Après addition de la potasse alcoolique, on porte à ébullition pour que la saponification soit effective selon
la réaction suivante :

2Res-SO3-H+ + R-COO- + (2NH4 ; CO32-) 2ResSO3--NH4+ + CO2 + H2O

 Tableau de dosage

Volume de KOH Volume des AO Volume tampon Volume de H2SO4

(ml) utilisé versé (ml)
Témoin 25 0 10 17,3
Essai 1 25 10 - 16,10
Essai 2 25 10 - 16,20
Le titrage par l’H2SO4 en présence de la phénolphtaléine nous a permis de déterminer la quantité de KOH
ayant servi à la neutralisation des acides organiques.

 Calcul des concentrations

[H2SO4] = 1 N or N = z × M M = N/z, pour H2SO4 z = 2 M = 1/2 = 0,5 mol/l

[H2SO4] = 1/2 = 0,5 mol/l

A l’équivalence : H2SO4 + 2H2O K2SO4 + 2H2

2 nH2SO4 = nKOH 2[H2SO4] × V H2SO4 = [KOH] × VKOH

[KOH] = (2[H2SO4] × VH2SO4)/ VKOH

 Pour le témoin : [KOH] T = (2 × 0,5 × 17,30.10-3) / 25.10-3 = 0,692 mol/l

 Pour les essais : on fait la moyenne du volume de H2SO4 versé qui est Vmoyen 16,15 ml
[KOH]E = (2 ×0,5 × 16,15)/ 25 = 0,646 mol/l
 Calcul quantité de matière : n = C.V

On a : pour le témoin nT = [KOH] T × VT et pour les essais nE = [KOH]E × VE

La quantité de KOH neutralisant les acides organiques est : n’ = nT-nE = ([KOH] T ×VT) - ([KOH]E ×VE).

Or VE = VT = VKOH donc n’KOH = VKOH × ( [KOH] T - [KOH]E ).

AN : n’ = 25.10-3(0,692-0,646) n’ = 1,15.10-3 mol.

n’ est la quantité de matière de KOH nécessaire pour saponifier 10ml de la solution C.
 Masse de KOH saponifiant les acides organiques contenus dans la solution C (VC = 32 ml)

10 ml de solution C n’KOH = 1,15.10-3 mol.

32 ml de solution C n’’KOH = ?
n’’KOH = m’’KOH/M’’KOH m’’KOH = n’’KOH × M’’KOH = (32 × n’KOH/10) × M’’KOH
M’’KOH = 56 g/mol, AN: m’’KOH = (32 × 1,15.10-3/10) × 56 = 0,20608 g = 206,08 mg.
La masse de KOH nécessaire pour saponifier tout les acides organiques contenus dans la solution C est
m’’KOH = 206,08 mg.

 Détermination de l’indice de saponification

L'indice de saponification (Is) d’un lipide est la masse de potasse (exprimée en mg) nécessaire
pour neutraliser les acides gras libres et saponifiés les acides gras estérifiés contenus dans 1 g de matière
grasse.
Is = m’’KOH / m , avec m égale à la masse initiale de feuilles d’épinards broyées (12,5 g).
Is = 206,08/12,5 = 0,0164 mg. L’indice de saponification est de 0,0164 mg de KOH.
CONCLUSION
A la fin de notre travail pratique nous avons eu à nous familiariser avec les techniques utilisées lors de la
chromatographie sur colonne échangeuse d’ions. Ainsi, nous avons eu à séparer les acides aminés et les
acides organiques a partir d’un extrait végétal, puis à déterminer l’indice de saponification de ces acides
organiques.