L'etape pr#-analytique
CONSTANTES PRE -ANALYTIQU ES
EN HI MOCYTOM ETRI E-CYTO LOG IE
Franck Trimoreau *,% Patrice Perroud b, Jacques B o y e r c, Nathalie Gachard a
Resume
Cet article presente une revue des parametres affectant la phase
pre-analytique en hematologie cellulaire. Deux domaines distincts
sont consideres, rhematimetrie-cytologie et la cytometrie en flux, en
raison des specificites propres a c e s deux secteurs du laboratoire.
Les parametres sont presentes par ordre ,, chronologique ,,, en com-
mengant par les renseignements fournis par le prescripteur. Ceux-ci
doivent porter sur les facteurs personnels et environnementaux
ainsi que sur un etat pathologique eventuel et la prise de medica-
ments. Les conditions du prelevement sont ensuite exposees, sous
raspect du materiel (anticoagulant, type de tube) et de la methodo-
Iogie, en particulier pour les techniques propres & la pediatrie. Un
paragraphe est consacre a la conservation des echantillons ainsi
qu'a leur preparation (frottis sanguins). Pour chaque parametre pre-
analytique, les repercussions possibles des variations sur le resultat
biologique sont exposees. Une fiche de recommandations gene-
rales resume les principaux points discutes. Une demarche de
contrele de la qualite de la phase pre-analytique est egalement
proposee. Un plan similaire est repris pour le chapitre consacre
la cytometrie en flux, en insistant sur quelques points specifiques
comme les renseignements fournis pour orienter ranalyse,
la conservation et la preparation des echantillons.
Phase pre-analytique - hematim(~trie - cytometrie en flux.
Summary
This article reviews the pre-analytical parameters in cellular
haematology. Due to their specificity, the preanalytical phases of
blood ceil-counting and differential on blood smears on one hand,
and those for flow cytometry on the other hand are presented sep-
arately. The numerous steps belonging to the preanalytical phase
are presented in a "chronological "order, beginning with informa-
a Laboratoire d'hematologie
Centre hospitalier universitaire Dupuytren
2, av. Martin-Luther-King
87042 Limoges cedex
b Laboratoire d'hematologie et d'imrnunologie
Centre hospitalier general
39, av. de la Senatorerie
23011 Gueret cedex
c Laboratoire d'hematologie
Centre hospitalier
194, av. Rubillard
72037 Le Mans cedex
* Correspondance.
article requ le 22 fevrier, accepte le 10 rnai 1999.
~c' Elsevier,Paris.
RevueFrangaisedes Laboratoires,novembre1999, N° 317
tions provided by the physician that should accompany the sam-
ple. They concern the personnal and environemental factors, the
possible pathology and treatment of the patient. The harvesting
and sampling procedure (material and methodology), especially for
pediatric samples are detailed. Storage requirements and prepara-
tion of the samples (blood smears) are then analyzed. The poten-
tial consequences of modifications of each preanalytical parameter
on the final result provided by the laboratory are discussed. Finally,
a form of the general recommandations mandatory for a proper
development of this phase summarizes the major aspects previ-
ously discussed, and proposals for a rehable quality control pro-
cessing are presented. A similar presentation is used for the chap-
ter on flow cytometry, with a particular emphasl2is on some
specific points such as the clinical informations useful for an
appropriate guidance of the analysis, and the storage and prepara-
tion of the sample.
Preanalytical variables - cell counting - flow cytometry.
1 tntrodl.tCltion
a qualite de la phase pre-analytique en hematologie cellulaire est
h conditionnee par deux types de constantes : certaines ne sont pas
specifiques a c e domaine d'analyse et concernent les examens bio-
Iogiques en general. II s'agit des parametres relatifs & la tragabilite de
la phase pre-analytique, comme I'identification du prel¢vement, du pre-
leveur, du lieu et du mode de prelevement. D'autres sont propres au
domaine considere et se rapportent a la qualite de I'echantillon bio-
Iogique lui-meme, c'est-a-dire a son adequation avec les analyses qui
doivent 6tre pratiquees. Par souci de simplification, ces differentes
constantes seront presentees ici dans un ordre ,, chronologique ,,, des
renseignements fournis avec la demande d'analyse & la preparation
de I'echantillon biologique recueilli. Les parametres lies a I'hematimetrie
et ceux relatifs a la cytometrie en flux seront exposes successivement,
avec pour chacun d'eux les consequences possibles de leurs varia-
tions sur le resultat biologique.
2, H e m a t i m e t r i e et cytologie sanguine
', ~ a;li]:u S
] , ; ~:~,; : i, i r ! " O ! ,orhsd~qu(.nCeS
si , : >;4]:,
Les principales preoccupations de la phase pre-analytique en hema-
timetrie doivent 6tre :
- d'assurer une identification correcte du prelevement,
- de garantir la tragabilite de cette phase de I'analyse,
- de permettre la meilleure qualite possible de I'echantillon preleve en
71
L~LC~JLS~ fJl~ c~11c~lyu~u~
particulier en preservant I'integrite des cellules sur le plan qualitatif et
quantitatif,
- de recueillir les renseignements utiles & la validation des resultats.
2.1.1. Renseignements fournis
avec la prescription de I'analyse
II s'agit sans doute d'un des domaines de I'assurance qualite ou le tra-
vail & realiser est le plus important. Par ,, tradition ,, en effet, la demande
de numeration formule sanguine (N FS) voire de cytologie sanguine plus
specialisee est tres rarement accompagnee de renseignements cli-
niques. Le biologiste n'a souvent que les donnees relatives a I'etat civil
du patient pour valider son resultat. De nombreux facteurs sont pour-
tant susceptibles d'influencer le resultat biologique.
2.1.1.1. Facteurs personnels
•/~ge
La date de naissance du patient doit etre fournie avec la prescription.
La connaissance de I'&ge du patient est en effet indispensable, ne
serait ce que pour fournir des valeurs de reference adaptees Iors de
I'edition du resultat. Ce point est particulierement important chez I'en-
fant, de nombreux parametres se modifiant entre la naissance et I'ado-
lescence. Ainsi, & la naissance, les valeurs normales d'hemoglobine
(Hb), de volume globulaire moyen (VGM), de leucocytose sont supe-
rieures & celles de I'adulte. Des erythroblastes circulants sont frequents.
Ces elements etant comptes avec les leucocytes par les automates,
il convient Iorsque leur taux est superieur a 10 o/0 de corriger le compte
des leucocytes. Chez le nourrisson et jusqu'a 4 ans, les valeurs nor-
males d'Hb et de VGM sont inferieures & celles de I'adulte tandis que
celle de la leucocytose est superieure en raison de la lymphocytose
plus elevee. Des artefacts techniques peuvent exister Iors d'analyses
realisees sur du sang foetal ou de nouveau-ne, comme une resistance
anormale a la lyse des hematies riches en Hb fcetale. Ce phenomene
est responsable d'une surestimation de la leucocytose par les comp-
teurs automatiques (les erythrocytes non lyses etant comptabilises avec
les globules blancs). Certains automates proposent dans ce cas une
action prolongee de la lyse [6]. Enfin, comme nous le verrons plus has,
la date de naissance apporte un complement d'identification qui est
tres precieux dans les cas (frequents) d'homonymie.
• Sexe
Les valeurs normales des parametres erythrocytaires suivants: ery-
throcytes, taux d'Hb, hematocrite (Ht) etant differentes chez I'homme
et chez la femme, il est I& encore indispensable de connattre le sexe du
patient pour fournir des normes adaptees lots de I'edition du resultat.
/~ ce sujet, rappelons que le prenom n'est pas toujours indicatif du sexe.
• Ethnie
II n'est pas habituel de rendre des valeurs de reference en fonction
de I'ethnie du patient. Des variations physiologiques importantes doi-
vent toutefois etre connues : les taux de polynucleaires neutrophiles
et d'Hb sont habituellement plus bas chez les sujets de race noire que
chez ceux d'origine caucasienne [1] (jusqu'& - 3 0 °/0 pour les neu-
trophiles), le taux de plaquettes est inferieur chez les latins par rap-
port aux Europeens du herd (jusqu'& - 3 0 %).
• Grossesse
II est I& aussi difficile de donner des normes en fonction de ce para-
metre ; toutefois certaines variations sont bien connues : le taux d'Hb
et I'Ht diminuent & partir du deuxieme trimestre (jusqu'& - 2 0 %) ; la nume-
ration plaquettaire baisse pendant le troisieme trimestre et en particulier
au cours du dernier mois mais cette diminution reste tres moderee [1].
2.1.1.2. Facteurs environnementaux
• Criteres de jel3ne
Le prelevement a. jeun (depuis 12 heures) est conseille. En effet, en
situation post prandiale, il existe souvent une phase d'augmentation
moderee des leucocytes. Surtout, la lactescence du plasma peut
?2
perturber la determination spectrophotometrique de I'Hb, qui se trouve
surestimee, alors que le decompte des globules rouges, la mesure de
I'Ht et le VGM sont corrects (le calcul des constantes erythrocytaires :
TCMH, teneur corpusculaire moyenne en Hb et C C M H (concentra-
tion corpusculaire moyenne en Hb) est faussee avec des valeurs de
C C M H superieures & 36). Ce phenomene s'observe particulierement
en milieu hospitalier chez les patients provenant d'unites de soins inten-
sifs sous nutrition parenterale. Deux solutions sont alors possibles :
- rendre les seuls parametres : erythrocytes, Ht, VGM et non I'Hb et
les constantes C C M H et TCMH ;
- remplacer le plasma par un volume exactement equivalent de diluant
isotonique puis realiser des lavages cellulaires avant de repasser la
suspension sur le compteur.
Chez ces patients, par ailleurs, des interferences sont possibles avec
les numerations plaquettaire et leucocytaire.
• Vie en altitude
Ce parametre ne concerne bien st3r que les laboratoires dont la clien-
tele comporte une population d'altitude (au-del& de 3 000 metres),
auquel cas I'adresse du patient devient un renseignement interessant
connaTtre. Chez ce type de sujets, les valeurs habituelles d'Hb et d'Ht
sont superieures aux normes traditionnelles.
• Stress et exercice physique recent
IIs elevent le taux de polynucleaires neutrophiles. II est donc conseille
de realiser le prelevement chez un sujet au repos et dans la mesure
du possible relaxe (il peut etre utile de faire figurer sur la demande
d'examen un eventuel antecedent de prelevement difficile, chez un
patient particulierement emotif par exemple).
• Exercice
II est parfois utilise pour provoquer une demargination des polynu-
cleaires dans le cadre de I'exploration d'une neutropenie. La deter-
mination de la polynucleose est realisee avant et apres I'effort (le retour
& la valeur de base ,, awes effort ,, s'effectue dans les 20 minutes). Dans
ce cas, chaque prelevement devra 6tre identifie clairement par la men-
tion ,, avant ,, ou ,, apres ,, effort (de meme pour les epreuves & I'adre-
naline et aux corticoi'des).
• Heure de prelevement
Certains parametres ont une variation circadienne en particulier la leu-
cocytose et la lymphocytose (plus elevees jusqu'& +150/o le soir). II
est ainsi souhaitable que I'heure du prelevement figure sur le tube ou
sur la feuille d'accompagnement. Par convention, I'usage recommande
de prelever dans la mesure du possible le matin, horaire oQ la condi-
tion de jet3ne sera plus facilement respectee. I] s'agit par ailleurs des
conditions les plus favorables pour un grand nombre d'analyses bio-
Iogiques. La mention de I'heure de prelevement revet d'autre part une
importance pour la prise en charge de I'echantillon (delais pour I'ana-
lyse et la conservation), nous le reverrons plus loin.
2.1.1.3. Donn~es relatives a I'~tat clinique du patient
• Caractere urgent eventuel de I'analyse
II dolt figurer clairement sur la demande. Cette notion conditionne la
prise en charge du prelevement au laboratoire et la transmission des
resultats.
• Pathologie hematologique connue ou suspectee
Des renseignements precis dans ce domaine foumis par le prescrip-
teur (orientation clinique, hemopathie connue, traitement en cours) ou
des donnees issues des anteriorites du laboratoire sont tres souhai-
tables voire indispensables s'ils conduisent & une etude cytologique
specialisee (etude de la morphologie erythrocytaire, lymphocytaire, pla-
quettaire, recherche de parasites,...).
• Presence d'une agglutinine froide
,/k temperature ambiante in vitro, la formation d'agglutinats erythrocy-
taires induite par I'anticorps entra;ne une sous-estimation des ery-
throcytes et une surestimation du VGM alors que la determination de
Revue Franeaise des Laboratoires, novembre 1999, N° 31 ?
 I'Hb est juste. La solution est de placer le tube & 37°0 pendant 30
minutes puis de le passer sur I'automate sans delai. Les constantes ery-
throcytaires se normalisent dans la majorite des cas. La presence d'une
agglutinine froide ou d'une cryoglobuline peut s'accompagner egalement
parfois d'une pseudo-hyperleucocytose, des particules cryoprecipitantes
pouvant etre confondues avec des leucocytes par les automates [3].
• Intoxication ethylique
Parfois difficile & formaliser, cette information est cependant utile pour
I'interpretation de VGM augmentes.
• Intoxication tabagique
Elle est responsable d'une polynucleose neutrophile souvent mode-
tee (pouvant toutefois atteindre jusqu'& 3 fois la normale chez certains
patients) ainsi que d'une augmentation du taux d'Hb.
• Insuffisance hepatocellulaire
Des phenomenes de resistance augmentee & la lyse des hematies sont
possibles.
• Diabete
Les fortes hyperglycemies sont susceptibles d'augmenter le VGM ainsi
que I'Ht [12], par un mecanisme osmotique (concentration elevee en
glucose int ra-eryt h rocytaire).
2. 1.1.4. Prise de medicaments
Meme si la connaissance des traitements suivis par le patient ne revet
pas la meme importance en cytologie qu'en hemostase, certains ren-
seignements peuvent etre utiles. II n'est pas possible d'etre exhaus-
tif dans le cadre de cet expose (il existe un fichier du Centre national
de pharmacovigilance repertoriant les drogues hematotoxiques). On
peut citer la liste suivante.
• Chimiotherapies anti-neoplasiques
Elles sont & I'origine de cytopenies, puis Iors de la reconstitution hema-
topd~'etique de monocytoses et de myelemies. Certaines drogues
(Hydrea "~) sont & I'origine de macrocytoses.
• Drogues interferant sur le metabolisme des folates
Certains antibiotiques (Bactrim ~ )ou antiviraux sont generateurs de
macrocytoses et de cytopenies.
• Drogues & effets secondaires hematologiques
De tres nombreux medicaments sent susceptibles de generer des effets
secondaires & type de cytopenies (neutropenies, thrombopenies, ane-
mies hemolytiques). II s'agit en pratique de donnees rarement dispo-
nibles au moment de I'analyse, et plus souvent obtenues a posteriori.
2.1.2. Conditions du pr~l~vement
2.1.2.1. Materiel
• Anticoagulant : nature et concentration
Utilise depuis plus de 40 ans en hematologie, I'acide ethylene diamine
tetra acetique (EDTA) reste aujourd'hui malgre plusieurs inconvenients
I'anticoagulant de reference pour le comptage et la mesure des cel-
lules sanguines. II n'est toutefois pas depourvu d'effets sur les elements
des trois lignees circulantes [16] :
- effets sur les globules rouges : I'EDTA existe sous trois formes : sel
disodique (Na2EDTA) , sel dipotassique (K2EDTA) et sel tripotassique
(K3EDTA). Les sels potassiques etant les plus solubles, ce sont les
plus largement utilises. II n'existe pas en revanche de consensus quant
& I'utilisation du K2EDTA, recommande par I'lnternational council for
standardization in hematology (ICSH) [11], ou du K3EDTA, recom-
mande par le National commitee for clinical laboratory standards
(NCCLS) aux Etats-Unis [13]. En conditions optimales de concen-
tration en EDTA (4,55 +_ 0.85 mmol par litre de sang, [11]) et de fraf-
cheur de prelevement (moins de 4 heures), il n'existe pas de difference
significative entre les deux sels potassiques [8]. En presence d'une
concentration elevee en EDTA (tube insuffisamment rempli), le sel K 3
est responsable d'une diminution plus marquee de la taille des hema-
ties [11 ]. Cet effet n'est cependant retrouve que Iorsque I'hematocrite
RevueFrangaisedes Laboratoires,novembre1999, N° 31'7
est determine par centrifugation [8]. Les parametres mesure (VGM)
et calcule (Ht) sur les compteurs automatiques ne sont pas modifies,
m¢me & des concentrations tres elevees de K3EDTA [8]. Lorsque le
prelsvement est conserve plus de 24 heures & temperature ambiante,
les deux sels induisent de fagon similaire une augmentation du VGM.
Enfin, bien que les echantillons de calibration et de contrele aient des
valeurs d'Ht determinees par centrifugation [19], ces effets sont sans
consequence sur la calibration des compteurs puisque ces sangs de
reference (recueillis en general sur K3EDTA) sont laves et depourvus
de plasma et d'anticoagulant. Au total, le choix entre K2et K3 EDTA
semble indifferent en pratique biologique quotidienne, notamment pour
les automates utilisant I'impedance [15] ;
- effets sur les leucocytes : les polynucleaires neutrophiles et les mono-
cytes sont les elements les plus sensibles & la presence de I'EDTA.
Les modifications morphologiques apparaissent des 2 heures apres
le prelevement (vacuolisation des cellules) et s'accentuent avec la
duree de conservation (perte des ponts entre les lobes des polynu-
cleaires, perte des contours cytoplasmiques). Les effets sont d'autant
plus marques et rapides que la concentration en EDTA est elevee. IIs
affectent aussi bien la determination automatique que manuelle de la
formule sanguine. Enfin, des cas d'agglutination leucocytaire induites
par I'EDTA et responsables de ,, fausses ,, leucopenies ont et6 rap-
portes [20] ;
- effets sur les plaquettes : il s'agit en pratique du principal inconve-
nient lie a. I'utilisation de I'EDTA en hematimetrie. L'EDTA induit tout
d'abord un changement de forme des thrombocytes, de discoTde &
spherique, introduisant une erreur dans la determination du volume pla-
quettaire moyen (VMP). Surtout, pour certains patients, il peut se pro-
duire in vitro, apres le prelevement, un phenomene d'agregation des
plaquettes en presence d'EDTA. II s'agit d'un phenomene purement
artefactuel lie b. la presence de I'anticoagulant et ne traduisant aucune
pathologie chez le sujet preleve. Les compteurs electroniques basant
leur reconnaissance des elements figures sur le volume, seules les pla-
quettes non agregees sent decomptees. Le nombre de plaquettes
rendu par I'automate est donc sous estime dans une proportion variable
selon I'importance du phenomene d'agregation, lui-meme dependant
du delai avant analyse (il s'amplifie avec la duree de conservation du
tube). Les amas sont parfois assimiles & des leucocytes et plus gene-
ralement & des debris et ne sont pas responsables en pratique d'une
surestimation significative de la leucocytose. La recherche d'amas pla-
quettaires, declenchee systematiquement devant toute valeur basse
de plaquettes chez un sujet sans anteriorite, peut etre realisee de dif-
ferentes fagons. Un moyen rapide consiste & regarder une goutte de
sang entre lame et lamelle, en contraste de phase (cette methode per-
met aussi de voir d'eventuels amas de fibrine). On peut egalement pre-
ceder & une recherche sur cellule de Malassez ou sur frottis sanguin
colore au May GrLJnwald Giemsa. Sur ce point precis de I'agregation
plaquettaire induite par I'EDTA, faisons une remarque & la limite du
cadre de cet expose puisque concernant plutet la post-analyse et la
transmission du resultat : il faut encourager I'abandon des termes
,, fausse thrombopenie ,, et ,, pseudo-thrombopenie ,,, expressions qui
favorisent les erreurs de transmission et d'interpretation. La throm-
bopenie, ni ,, vraie ,, ni ,, fausse ,,, n'existe & aucun moment Iors d'une
agregation plaquettaire induite par I'EDTA. Aucune valeur basse ne
devrait d'ailleurs sortir du laboratoire ni parvenir & I'oreille du clinicien.
Le resultat de la NFS ne dolt pas comporter de valeur pour les pla-
quettes mais seulement la mention claire de la presence d'amas ren-
dant le decompte impossible (eventuellement completee par la sug-
gestion d'un prelevement sur citrate de sodium). En effet, dans cette
situation et cette situation seulement, un autre anticoagulant que I'EDTA
est recommande : le citrate de sodium, utilise couramment pour I'etude
de I'hemostase ou bien encore le CTAD (acide citrique, theophylline,
adenosine, dipyridamole) ce dernier permettant une inhibition de I'ac-
tivation plaquettaire. Le CTAD est tres sensible & la lumiere et les tubes
doivent etre stockes b. I'obscurite jusqu'& leur utilisation. Dans les deux
73
 L'etape pr#-analytique
cas, il s'agit d'un anticoagulant liquide, le rapport anticoagulant/sang
etant de t/9. II est donc indispensable que le tube soit parfaitement
rempli; d'effectuer une correction du nombre de plaquettes obtenu
sur le compteur (ajouter 10 %). Malgre le changement de tube, il est
possible que I'agregation plaquettaire continue & se produire in vitro
pour certains patients. Dans ce cas on preconise la determination sur
prelevement capillaire de la numeration plaquettaire : le sang capillaire
est recueilli au bout du doigt apres piq0re et dilue dans une solution
de lyse des hematies (cet examen peut etre realise en ambulatoire).
Les plaquettes sont alors numerees au microscope en cellule de
Malassez. Le mode ,, pre-dilue,, sur certains automates peut consti-
tuer une autre alternative. Enfin, il faut citer au chapitre des effets poten-
tiels de I'EDTA sur les plaquettes le rare phenomene de satellitisme
plaquettaire o0 les plaquettes adherent in vitro aux polynucleaires et
aux monocytes, formant des images de ,, rosettes,,. Ce processus,
observe uniquement en presence d'EDTA, est & I'origine de sous esti-
mations du taux de plaquettes par les compteurs.
• Type de tube
Differents types de tubes a prelevement sont utilisables :
- les tubes en verre silicone sont d'usage le plus courant. II existe des
tubes en matiere plastique, qui presentent un avantage de praticabi-
lite, mais restent tres peu utilises en France. Par consequent, I'usage
et les etudes manquent pour valider totalement ce type de tube, en
particulier pour les utilisations proches de la date de peremption ;
- les tubes & prelevement peuvent etre sous vide ou non, I'usage des
premiers s'etant considerablement generalise en raison des nombreux
avantages d'un tel systeme : continuite totale depuis la veine du patient
jusqu'au tube (reduction du risque d'accident par exposition au sang),
garantie de la sterilite du sang depuis le patient jusqu'au tube, rem-
plissage rapide permettant un ben melange du sang avec I'anticoa-
gulant, volume de remplissage optimum permettant I'homogeneisation
et respectant la concentration recommandee en EDTA. En contre par-
tie, il importe de s'assurer de la qualite des tubes sous vide utilises
au moment du prelevement, en particulier en verifiant la date de
peremption du lot ainsi que les conditions de stockage (temperature
ambiante autour de 20°C, absence d'exposition & la lumiere). De ces
parametres depend la qualite du vide et de I'anticoagulant ;
- le vide peut etre ajuste pour un volume de prelevement de 4 mL ou
de 2 mL (,, demi methodes ,,). Ces derniers tubes permettent de rea-
liser d'importantes economies de sang chez les patients soumis & des
prelevements repetes, comme en hematologie clinique par exemple.
Dans la grande majorite des cas un volume de 2 mL de sang est suf-
fisant pour les analyses de routine et specialisees en hemocytometrie.
Comme ces tubes restent de plus adaptes aux passeurs automatiques
des compteurs, on ne peut qu'encourager la generalisation de leur uti-
lisation b. condition de rester vigilant sur le volume reel de remplissage.
II n'existe pas de recommandation propre b, I'utilisation des demi
methodes s i c e n'est qu'une attention particuliere est requise pour le
melange sang / EDTA apres le prelevement : le vide et les volumes etant
plus faibles, celui-ci est moins spontane Iors de I'ecoulement dans le tube.
II dolt etre facilite par des retournements realises avec application ;
-le prelevement de sang capillaire par ,, micromethodes,, en pedia-
trie represente un cas de figure tres particulier. Nous verrons plus loin
les problemes specifiques poses par ces methodes (voir paragraphe
,, realisation du prelevement ,,).
2. 1.2.2. Methodologie
• Lieu de prelevement
Ce parametre est une variable pre-analytique importante mais n'est pas
specifique & I'hemocytometrie. On passera donc rapidement sur ce
point en rappelant que le cas de figure ideal est realise Iorsque le pre-
levement est effectue au laboratoire meme ou en dehors mais par un
membre du laboratoire. Lorsque la phase de prelevement est totale-
ment deleguee & un tiers (centres hospitaliers, ramassages des exa-
mens en exercice prive), la ma;trise de la phase preanalytique sera
74
forcement moins complete. I_'ideal est de fournir & ses interlocuteurs
un protocole indiquant clairernent la necessite de renseigner en par-
ticulier I'identite du preleveur, I'heure du prelevement ainsi que d'autres
conditions et de s'y tenir. Cette conduite suppose une certaine fer-
mete (rejet de prelevements non conformes) pas toujours compatible
avec I'exercice pratique de la biologie.
• Realisation du prelevement
Pour le site, il faut choisir une veine de calibre suffisant (pli du coude)
permettant une ponction franche et un ecoulement facile et rapide du
sang dans le tube. Si le malade est perfuse, il est imperatif de choi-
sir le bras oppose a la perfusion en raison du risque de dilution du pre-
levement se traduisant par un effondrement artefactuel de tousles para-
metres de la NFS. Lors d'un prelevement de sang capillaire en pediatrie
il faut choisir des tubes adaptes & ces techniques dites de ,, micro-
prelevement,,. Plusieurs systemes sont disponibles. Certains utilisent un
capillaire pour recueillir la goutte de sang avant le transfert dans le tube,
d'autres proposent de recueillir le sang directement dans le tube &
I'aide d'une petite gouttiere presente & I'ouverture du tube. Certains
tubes disposent de billes pre-incluses pour faciliter le melange avec
I'anticoagulant, d'autres ont des parois coatees par de I'EDTA. Dans
tousles cas le niveau de remplissage theorique est indique et com-
pris entre deux traits sur la paroi du tube (entre 250 et 500 tJI). Du fait
meme des conditions de recueil du sang avec ce type de prelevement
(ainsi que de I'hypercoagulabilite du nouveau-ne), il existe un risque
important de formation d'amas plaquettaires et de coagulation du pre-
levement. II convient donc d'etre particulierement vigilant Iors de I'ana-
lyse de tels echantillons pour d6pister ces artefacts meme si la detec-
tion de ,, microcaillots ,, est en pratique quasiment impossible. La notion
de microprelevement dolt ainsi apparaftre sur le rendu du resultat, afin
d'attirer I'attention du clinicien sur les reserves A prendre pour inter-
preter certains parametres (la numeration plaquettaire en particulier)
et sur la valeur relative des normes fournies (les valeurs de reference
pour les parametres de la NFS mesures sur sang capillaire n'etant pas
clairement ¢tablies, la valeur de I'Hb, notamment, etant plus elevee du
fait de la stase circulante). Pour assurer une bonne qualite de prele-
vement avec ces methodes, on peut conseiller quelques precautions :
masser vigoureusement le talon pour obtenir rapidement une goutte
de sang, operer rapidement pour transferer le sang dans le tube, melan-
ger consciencieusement I'echantillon, ne p a s s e contenter de trop
faibles volumes de sang (meme s'ils sont suffisants a priori pour I'ana-
lyse). Ce dernier point est en pratique difficile & respecter, en parti-
culler en neonatalogie ou les personnels soignants ont en charge de
grands prematures de petit poids necessitant des prelevements fre-
quents et multiples. En milieu obstetrical, le prelevement de sang foetal
pose le probleme specifique de la recherche d'une contamination par
le sang maternel ou par le liquide amniotique (dilution). Ce contr61e
de qualite repose sur des techniques qui depassent le cadre de cet
expose mais dans tousles cas la mention ,, sang foetal ,, est & preci-
ser avec le resultat. Les principaux parametres d'interet de la NFS dans
cette situation sont I'Hb et la numeration plaquettaire, dans un contexte
d'alloimmunisation materno-foetale erythrocytaire ou plaquettaire. La
determination de ces deux parametres est susceptible d'etre faussee
par une coagulation du sang. Au niveau du prelevement, le risque peut
etre reduit par I'utilisation d'aiguilles plus grosses (de gauge 22 au lieu
des aiguilles de gauge 20 utilisees pour le dosage des proteines de
la coagulation) ou specifiques (siliconees sur la face interne permet-
tant d'augmenter la vitesse du flux [9]). Au niveau de I'analyse, I'at-
tention des techniciens et des biologistes sera particulierement atti-
ree par ce type de prelevement : delai d'analyse le plus court possible,
recherche de caillot et d'amas plaquettaires. On peut rappeler enfin
qu'un phenomene de resistance & la lyse des erythrocytes foetaux peut
s'observer darts ce contexte (voir plus haut). Le prelevement sur cathe-
ter installe ou Iors de la pose est possible pour la determination de la
NFS. La situation est frequente en reanimation et en pediatrie, o0 de
tels prelevements Iorsqu'ils sont possibles sont sans doute preferables
RevueFrangaisedes Laboratoires,novembre1999, N° 317
L'~tape pre-analytique
& ceux obtenus par micromethodes. La purge du catheter avant le rem-
plissage des tubes est imperative sur des catheters installes. II est fre-
quent d'observer dans cette situation une hemolyse, parfois importante,
en particulier Iorsque I'on utilise des tubes sous depression. Elle semble
due aux turbulences liees aux diam~tres differents des tubulures adap-
tees sur le catheter. Le prelevement arteriel avec ou sans catheter est
convenable, il est en general associe aux demandes de gazometries.
La contamination par I'heparine est frequente sur ce type de prele-
vement mais elle perturbe peu les parametres hemocytometriques.
• Duree de maintien du garrot
Une mise en place prolongee du garrot est connue pour generer une
hemolyse et une hemoconcentration. Toutefois le parametre hemoly-
tique ne revet pas la meme importance en hemocytometrie qu'en bio-
chimie ou en hemostase (activation de la fibrinolyse). Le retentisse-
merit de I'hemolyse sur la NFS n'est sensible que Iorsqu'elle est intense
(sous estimation des erythrocytes et de I'hematocrite avec une valeur
d'Hb juste et des constantes fausses). II est recommande de laisser
le garrot moins d'une minute et de I'enlever ou de le desserrer Iorsque
le sang commence & arriver dans le tube.
• Ordre des prelevements
II n'y a pas d'exigences particulieres concernant la place du tube de
NFS Iorsque plusieurs tubes doivent 6tre preleves. En raison d'inter-
ferences possibles de I'EDTA avec les prelevements destines & ]'etude
de I'hemostase on conseille toutefois de remplir le tube EDTA apres
celui d'hemostase. Lorsque seul le tube EDTA dolt 6tre preleve, I'uti-
lisation des premiers millilitres est possible.
• Remplissage du tube
Le remplissage doit permettre d'atteindre la concentration recom-
mandee en anticoagulant. Dans rintention legitime d'economiser le
capital sanguin des patients, il est preferable d'utiliser des demi
methodes (vide prevu pour 2 mL de sang) plutet que de remplir & demi
des tubes prevus pour contenir 4 mL de sang. Dans ce dernier cas
en effet, la concentration trop elevee en EDTA accelere et accentue
les modifications morphologiques des leucocytes induites par I'anti-
coagulant. Le tube ne dolt pas etre trop rempli : il dolt rester apres rem-
plissage un volume d'air representant au moins 200/0 du volume du
tube [11]. Ceci facilite & la fois le melange sang / EDTA au moment
du prelevement (bonne anticoagulation) et I'homogeneisation du pre-
levement avant le passage sur le compteur. Un remplissage excessif
peut gener I'homogeneisation du sang & ce stade et induire de
,, fausses polyglobulies ,, [14]. Ces deux conditions sont faciles & res-
pecter avec le systeme de prelevement sous vide, & condition bien s0r
que le tube reste bouche pendant toute la duree du prelevement.
• Melange anticoagulant - sang
II faut insister sur le fait qu'un prelevement coagule, meme partielle-
ment, est totalement impropre a. la realisation de la NFS : les taux de
plaquettes, de globules rouges et de leucocytes sont sous evalues,
de fagon plus ou moins dissociee et plus ou moins intense selon I'im-
portance de la coagulation du prelevement. Ce point est important car
il s'agit d'une erreur pre-analytique frequente et souvent difficile & depis-
ter par la suite en cours d'analyse : les tubes ne sont plus debouches
au laboratoire gr&ce aux passeurs d'echantillons, ce qui constitue un
progres en matiere de securite mais qui en contre partie gene le depis-
tage des caillots. II est donc essentiel de bien realiser le melange sang-
anticoagulant immediatement apres le prelevement par retournements
successifs du tube. Celui-ci ne dolt pas etre agite mais retourne plu-
sieurs fois doucement. Enfin soulignons que seuls les caillots suffi-
samment volumineux sont visibles ; les microcaillots, ecueils des micro-
prelevements en particulier, sont indetectables.
• Precautions avant I'envoi du tube au laboratoire
Uetiquetage des tubes ou & defaut leur identification manuelle est une
etape pre-analytique essentielle commune & routes les analyses de bio-
Iogie (le preleveur dolt faire confirmer son identite au patient person-
nellement). Une procedure particuliere dolt etre prevue pour I'identi-
RevueFrangaisedes Laborato[res,novembre1999. N° 317
fication des prelevements issus de patients non identifiables & I'origine
(urgences ou anonymat) et reidentifies ulterieurement. Nous verrons
qu'il existe dans la NFS un parametre, le VGM, permettant parfois de
depister des erreurs d'identification. Le reperage des sangs poten-
tiellement contaminants (VlH, hepatites,...) ne semble plus essentiel
puisque tout prel~vement dolt ~tre considere comme potentiellement
contaminant et manipule comme tel. Le delai de traitement des echan-
tillons ayant une importance en cytologie, la date et I'heure du prele-
vement doivent figurer sur le tube et/ou la demande d'accompagne-
ment. Le prelevement dolt ~tre achemine le plus rapidement possible
au laboratoire. Si la transmission est differee (voir plus loin les delais
acceptables), les tubes seront conserves & temperature ambiante. Les
chocs thermiques ou mecaniques, susceptibles de provoquer une
hemolyse, doivent 6tre evites pendant le transport.
2,1. 3, Conservation des echantillons
2.1.3.1. Stabi/it# des parametres
Elle est variable en fonction du parametre considere et de la tempe-
rature de conservation. Les concentrations en erythrocytes, en leu-
cocytes et en hemoglobine, ainsi que la TCMH sont stables 6 jours
& temperature ambiante e t a + 4 ° 0 . La concentration en plaquettes est
stable 6 jours a + 4 ° C mais seulement 24 heures a temperature
ambiante (diminution du nombre au-delA). Les parametres dependants
du volume des hematies : VGM, Ht et C C M H sent stables 6 jours &
+ 4 ° C et seulement 24 heures A temperature ambiante. La reticulo-
cytose a une stabilite limitee a 48 heures A + 4 ° C ainsi qu'b. tempe-
rature ambiante. La stabilite des parametres de la formule leucocytaire
est moins bien definie car elle depend, en plus de la temperature de
conservation, de la concentration en EDTA (alterations plus rapides
& forte concentration) et de I'automate utilise. Ceci explique proba-
blement les donnees contradictoires de la litterature : I'ICSH avance
une stabilite de 12 heures & + 4°C [11 ] alors que d'autres auteurs
rapportent une meilleure conservation a temperature ambiante [10].
Un consensus existe cependant pour reconnaTtre qu'& temperature
ambiante, les modifications morphologiques apparaissent des la
deuxieme heure apres le prelevement et deviennent importantes
apres 4 heures, que la formule soit realisee manuellement ou sur un
automate.
2.1.3.2. Recommandations relatives aux d~lais
avant I'analyse et ~ la conservation des 6chantillons
En pratique les comites internationaux recommandent que le comp-
tage automatique des elements du sang preleve sur EDTA et main-
tenu & temperature ambiante soit effectue dans les 6 heures apres le
prelevement [11,13]. Nous avons vu que pour certains prelevements
(sang foetal ou de nouveau-ne) les delais doivent etre les plus brefs
possibles. ,&, I'inverse, il importe de ne pas realiser trop tet le comp-
tage sur certains automates (attendre 20 minutes apres le prelevement
pour realiser I'analyse). La conservation des tubes au-del& de 24 heures
n'est pas recommandee [11 ] (sauf dans un but de verification de I'iden-
tite). En cas de realisation manuelle de la formule, le frottis sanguin
dolt 6tre realise dans les 3 heures qui suivent le prelevement. Une fois
fixe et colore le frottis sanguin est parfaitement stable dans le temps
(le degraissage favorise la conservation). Sans fixation ni coloration,
le frottis peut etre congele dans du papier d'aluminium pour servir &
des etudes cytochimiques ulterieures.
2.1.4. R#alisation des frottis sanguins
II s'agit d'une etape & la frontiere des phases pre-analytique et ana-
lytique. II peut 6tre envisage dans la pre-analyse en tant qu'equivalent
du ,, tube secondaire ,, des biochimistes et comme etape de preparation
de I'echantillon. II est certain que sa qualite conditionne totalement celle
de I'analyse proprement dite qui est la determination de la formule leu-
cocytaire au microscope.
75
L'#tape pr#-analytique
2,1.4.1. Etalement
Nous avons vu qu'il devait etre realise a partir de sang frais (dans les
2 a 3 heures suivant le prelevement). Les lames doivent etre en verre,
degraissees, a bords rodes (a 45 degres), a pans coupes (pour que
le frottis n'atteigne pas les bords de la lame et puisse 6tre parcouru
darts son ensemble). Une fois ces conditions imperatives respectees,
la qualite du frottis depend ensuite beaucoup de I'entratnement de
I'operateur. II ne s'agit pas d'un ,, geste biologique ,, facile, il dolt s'ac-
querir au travers d'un apprentissage applique. Le frottis ne dolt pas
6tre trop epais pour secher rapidement permettant ainsi un etalement
optimum des cellules. II ne dolt pas non plus etre trop fin. Le sang doit
s'epuiser progressivement tout au long du frottis dent la Iongueur dolt
representer environ les deux tiers de la lame. On considere genera-
lement comme crit~re de qualite la presence d'une zone (pres de I'ex-
tremite du frottis) oo les hematies sont etalees de fa0on a c e que leur
centre clair soit visible
2.1.4.2. Identification des lames
Les procedures d'identification des frottis doivent respecter les regles
generales de bonnes pratiques deja citees pour I'identification des pre-
levements, en minimisant le plus possible la possibilite d'une erreur
d'identification. Le numero informatique interne du laboratoire
(numero de ,,travail ,,) propre & I'echantillon est le plus utilise et peut
6tre consider6 en pratique comme suffisant. II dolt #tre ecrit lisiblement
et avec une encre resistant aux reactifs de fixation et de coloration (ou
au crayon a papier) ainsi qu'& I'huile d'immersion. Si la lame dolt 6tre
archivee ou adressee a un laboratoire exterieur, I'identification doit 6tre
aussi complete que celle du tube initial avec les nom, prenom et date
de naissance du patient, ainsi que la date du prelevement.
2.1.4.3. S~chage des frottis
Les frottis doivent secher librement a Fair. Aucun artifice pour acce-
lerer le sechage (agitation, sechoir) ne dolt ~tre utilis& Ces
methodes peuvent en effet induire des changements morphologiques
artefactuels sur les leucocytes, notamment au niveau des contours
cytoplasmiques.
2.1.4.4. Coloration
La coloration de reference (en Europe) est celle de May GriJnwald
Giemsa. Le critere de qualite est I'obtention d'une couleur ,, chamois ,,
des hematies. Trois points sont essentiels.
• L'eau utilisee pour les dilutions des colorants et pour les ringages
EIle dolt etre tamponnee a. pH 7.
• Les lames
Elles doivent #tre immergees dans les bains de colorant et non recou-
vertes par le colorant sur un portoir.
• Les bains de colorant
IIs doivent ~tre renouveles regulierement, la stabilite du Giemsa en par-
ticulier etant breve et dependante de la temperature ainsi que du
nombre de lames colorees. Le bain de Giemsa devra ainsi ~tre renou-
vele plus souvent en ete. La pratique repandue qui consiste a ,, rajou-
ter de temps en temps,, de la solution de Giemsa pure dans le
deuxieme bain est a proscrire.
2.1.4.5 Num#risation
Avec le developpement actuel des reseaux de teletransmission
d'images en cytologie, il devient indispensable de standardiser la qua-
lite des frottis sanguins & tousles niveaux de leur realisation : etale-
ment, coloration, numerisation (choix des images et definition des cou-
leurs). Les promoteurs de ces reseaux, comme le Groupe frangais
d'hematologie cellulaire, travaillent actuellement a la definition de cri-
teres de qualite des images numerisees avec pour but I'etablissement
d'une ,,fiche de conformite ,, des images permettant d'accepter ou de
refuser les dossiers transmis, selon un protocole identique a celui suivi
pour des tubes non conformes [4]. On peut attendre de I'arrivee sur
76
le marche d'automates integrant des modules d'etalement et de colo-
ration des frottis sanguins un progres certain en matiere de standar-
disation de qualite des etalements ainsi que de s6curite de manipu-
lation et d'identification. Le probleme de la coloration et de la
numerisation restera en revanche entier.
2.2. [ ;m~d'.,s~: c o m m e c ( , n t r 0 i e d e la q u a i i t e
d e ;a i~- ~:, ~:,re analytic:F~e
Nous avons vu que la situation etait frequente ou une grande partie,
si ce n'est la totalite de la phase pre-analytique, etait confiee a un tiers,
echappant par la meme pour une grande part au biologiste (qui en est
pourtant responsable d'apres les textes). Celui-ci a donc besoin d'ef-
fectuer des contr61es et de disposer de temoins de qualite relatifs
cette phase du processus analytique. Un certain nombre de
constantes pre-analytiques peuvent faire I'objet d'un contr61e Iors de
la reception du prelevement : identification, renseignements fournis,
remplissage des tubes. D'autres, potentiellement responsables d'ar-
tefacts pouvant influer sur le resultat, sont totalement ,, masquees ,,
ce stade du processus. Une interpretation attentive des resultats peut
cependant contr61er plusieurs variables.
2.2.1. La nature de certains p r e l e v e m e n t s
La nature de certains prelevements ainsi que certaines circonstances
de prelevement (& condition qu'elles soient correctement signalees)
doivent attirer I'attention. On sera plus vigilant sur la recherche d'amas
plaquettaires et de prelevements coagules avec des echantillons de
sang foetal ou des microprelevements, ou encore si une notion de pre-
levement difficile apparatt sur la demande d'analyse.
2.2.2. La C C M H
La CCMH, param~tre de validation technique de la NFS, est tres infor-
mative dans ce domaine. La C C M H est le rapport entre I'Hb (deter-
minee par spectrometrie) et I'Ht (produit du nombre des hematies et
du VGM determines par variation d'impedance). Elle exprime ainsi la
coherence entre deux mesures differentes d'un meme param~tre, les
globules rouges. Mesurant de plus la concentration en Hb de I'hematie,
la C C M H ne peut 6tre physiologiquement superieure & 36 (marne en
pathologie, spherocytose hereditaire mise a. part). De telles valeurs tra-
duisent donc presque toujours la presence d'une interference dans
la mesure provenant soit de I'automate lui-meme, soit du prelevement.
En cela I'interpretation de la C C M H peut constituer un temoin de la
qualite de certaines variables pre-analytiques. Les valeurs de C C M H
superieures & 36 doivent faire rechercher en pratique (le ben fonc-
tionnement du compteur etant par ailleurs verifi¢) :
- la presence d'une agglutinine froide (sous estimation du nombre de
globules rouges);
- ia presence d'une hemolyse (sous estimation du nombre de globules
rouges);
- la presence d'un plasma lactescent (sur estimation de I'Hb).
2.2.3. Les a u t o m a t e s m o d e r n e s
IIs signalent le plus souvent par des alarmes fiables la presence d'amas
plaquettaires. La regle est de toute fagon de toujours rechercher (entre
lame et lamelle en contraste de phase, en cellule de Malassez ou sur
frottis) la presence d'amas devant un nombre de plaquettes inferieur
& la normale obtenu chez un patient sans anteriorite. Rappelons que
le mot ,,thrombopenie ,, ne pourra ~tre utilise qu'apres avoir etabli I'ab-
sence de tels amas plaquettaires.
2.2.4. La connaissance des resultats ant~rieurs
Enfin, concernant a la fois I'analyse et la post analyse, la connaissance
de resultats anterieurs est d'une grande importance. Une variation
franche de la valeur du VGM entre deux analyses rapprochees dans
le temps et en dehors de toute transfusion evoque une erreur
Revue Fran0aise des Laboratoires, novembre 1999, N ° 317
L'~tape pre analytique

d'etiquetage. Une variation importante sur t o u s l e s parametres de la ~ "~; cytometrie en flux

NFS suggere quant & elle I'existence d'une dilution ou d'une coagula-
tion du prelevement. L& encore la regle est de rechercher systemati-
quement la presence d'un caillot Iorsqu'une ou surtout plusieurs Ngnees
sont abaissees. Uobservation du tube pendant les retournements n'est
pas suffisante : il faut deboucher ie tube et transvaser la totalite de son
contenu dans un tube propre. On peut ainsi <<voir passer >> le caillot ou
le detecter au fond du tube ou encore parfois & I'interieur du bouchon.
2.3. R e c o m m a n d a t i o n s generaies
/~ partir de cette revue des conditions de la phase pre-analytique, on
peut etablir une liste de recommandations generales sous la forme
d'une fiche de conformite des prelevements (tableau I). Celle ci ser-
vira a I'etablissement du protocole destine aux personnes assurant les
prel¢vements dans le laboratoire et surtout aux tiers A qui est deleguee
cette phase essentielle du processus analytique. Elle servira egalement
etablir les criteres d'acceptation et de rejet des tubes Iors de la recep-
tion au laboratoire.
{ 10ot 4r te !Die in~iyiiqLieS
Le schema general expose au chapitre precedent, s'applique dans ses
grandes lignes aux analyses realisees en cytometrie en flux Nous insis
terons donc plus particulierement dans ce chapitre sur quelques points
specifiques, sachant que les principales preoccupations de la phase
pre analytique en cytometrie doivent 6tre de preserver la m o r p h o l o
gie cellulaire de preserver I'integrite des antigenes cellulaires, et dans
le cas particulier des applications au diagnostic des hemopathies, de
permettre la meilleure approche possible de la population tumorale
3.1.1. Renseignements fournis
avec la prescription de I'analyse
Les exigences relatives A I'identification du patient sont les memes que
precedemment.

I R e ~ a n d ~ Acceptable Non co~orme

Identification - Nom, prenom, date de naissance,
sexe, heure de prelevement
- Identite du preleveur
Je0ne Patient & jeun
depuis plus de 12 heures
Anticoagulant K2 ou K3 EDTA
Tube Verre silicone ou plastique
sous vide,
Microtubes pour les pretevements
capillaires
Melange sang / anticoagulant
Remplissage - Adapte au vide (2 ou 4 mL)
- Permettant I'homogeneisation
- Microprelevements
entre 250 et 500 pl
Site Veineux : bras oppose & ta peffusion
Sur catheter : apres fin?age
Garrot Moins d'une minute
Place du tube Demier tube
Temperature de transport Temperature ambiante
Delai avant analyse - Numeration : < 6 heures
- Formule : > 30 min et < 4 heures
- Reticulocytes : < 24 heures
Temperature de conservation Temperature ambiante
Frottis sanguin - Identification des lames
- Etalement dans les 3 heures
- Sechage des frottis & Pair
- Colorant de Giemsa fra~chement
prepare, eau & pH ?
- Criteres de qualite des images
Nom, prenom (le non renseignement de la date
de naissance devra etre signale sur le resultat
rendu sans normes)
Pas de precision
Non & jeun en circonstance d'urgence
(mentionner sur le resultat : patient non & jeun
ou renseignement non fourni)
Citrate ou CTAD pour la numeration
plaquettaire (avec correction)
Tube non & vide
- Inferieur au volume prevu
(realiser les frottis dans I'heure suivante)
- Trop rempli (rechercher un caillot)
- Microprelevements : moins de 250 pl
(faire apparaffre cette donnee sur le resultat)
Plus d'une minute
Autres positions (influence sur le tube
d'hemostase si celui-ci est preleve apres)
+4°C
Numeration : > 6 heures et < 24 heures
- Formule : > 4 heures et < 6 heures
- Reticulocytes : > 24 heures et < 48 heures
+4°C
- Etalement dans I'heure si tube
insuffisamment rempli
Absence d'identification
Plasma lactescent en situation
post prandiale
(prelevement non conforme pour
la determination de I'Hb et des
constantes erythrocytaires)
Autres anticoagulants
ou tube sec
Lots de tubes perimes
Prelevement coagule
(quelle que soit la taille du caillot)
Du c6te et en amont de la peffusion
Numeration > 24 heures
- Formule > 6 heures
- Reticulocytes : > 48 heures
Inferieure & +4°C et superieure & 40°C
- Mauvaise identification des frottis
- Etalement apres 3 heures
- Sechage accelere
- Colorant de Giemsa perime,
eau non tamponnee

numerisees ?

Revue Fran0aisedes Laboratoires,novembre1999, N° 317 77

L'~tape pr#-analytique
3.1.1.1. La connaissance de la date et de I'heure du pr~l#vement
Elle est indispensable pour au moins deux raisons.
• Darts le cadre du suivi des patients VlH positifs
Les variations nycthemerales des populations lymphocytaires circu-
lantes obligent & realiser le prelevement destine & la numeration des
lymphocytes T C D 4 + toujours au meme moment de la journee. En pra-
tique la prise de sang est realisee de preference le matin & 9 heures
(l'heure dolt apparaTtre sur le resultat biologique).
• Cette donnee renseigne sur le delai possible avant I'analyse, qui
depend egalement du type d'anticoagulant utilise (cf. 3.1.2.1 .).
3.1.1.2. Le prescripteur
II dolt s'assurer que le laboratoire peut prendre en charge le preleve-
ment dans des delais compatibles avec la bonne conservation de
I'echantillon (cf. 3.1.4.). En dehors bien sQr des situations d'urgence
(leucemies aigues), la prise de rendez-vous est souhaitable.
3.1.1.3. Le biologiste
II dolt 6tre beaucoup plus exigeant sur les donnees cliniques fournies
par le prescripteur. L'immunophenotypage est en effet un outil puissant
mais complementaire des donnees cliniques et cytologiques auxquelles
il dolt toujours ¢tre rapporte. Les renseignements obtenus (& partir du
clinicien ou du cytologiste) doivent permettre de connattre :
- la nature du prelevement (sang, moelle, liquide d'epanchement, liquide
cephalo-rachidien, liquide bronchio-alveolaire, biopsie ganglionnaire) ;
- la nature ,, suspectee ,, de la population & etudier (cellules lymphdldes
matures normales ou leucemiques, cellules immatures, progeniteurs
normaux circulants,...). Cette donnee oriente la recherche de la popu-
lation d'inter~t d'apres ses caracteristiques de diffraction ou d'ex-
pression de certains antigenes (intensite d'expression de I'antigene
panleucocytaire CD45), et la composition des panels d'anticorps
monoclonaux b. utiliser ;
- pour les populations anormales, la proportion estimee de cette popu-
lation dans I'echantillon. Cette derniere evaluation peut 6tre approxi-
mative mais il est en revanche essentiel qu'elle soit effectuee directe-
ment sur la suspension cellulaire utilisee pour le marquage (cf. 3.1.2.2.).
3,1,2. Conditions de prdl~vernent
3.1.2.1. Materiel
• Anticoagulant
Deux types d'anticoagulants sont couramment utilises pour les immu-
nophenotypages, I'EDTA potassique (K2 ou K3 EDTA) et I'heparine (& une
concentration de 50 U/mL) [1 ?]. Presque tousles types de prelevements
doivent faire I'objet d'un recueil sur anticoagulant : sang et moelle osseuse
mais aussi liquides d'epanchements. Seul le liquide cephalo-rachidien peut
~tre preleve sur tube sec. Uanticoagulant est susceptible d'alterer la mor-
phologie, la viabilite et I'expression antigenique des cellules. Ces effets
dependent du type d'anticoagulant, du temps de conservation de I'echan-
tillon, et de la nature des cellules (les lymphocytes B sont ainsi plus fra-
giles que les lymphocytes T dans le sang normal [2]).
Uheparine permet la plus Iongue conservation de I'echantillon, jusqu'a 3
jours selon certains auteurs [17]. Les proprietes de diffraction lumineuse
des cellules, dont depend I'etude" morphologique " en cytometrie, sont
en effet preservees plus Iongtemps qu'en presence d'EDTA ou des modi-
fications sont observees des les premieres 24 heures. De meme, si une
separation des cellules mononucleees est realisee, des echantillons pre-
leves depuis plus de 6 heures sur EDTA peuvent generer des suspen-
sions contaminees par des polynucleaires neutrophiles et des hematies
(l'heparine est conseillee si une telle separation dolt 6tre realisee, [17]).
Inversement I'EDTA reste I'anticoagulant alterant le moins la morpholo-
gie des cellules dans un delai court (6 heures). Uetude cytologique, nume-
ration des leucocytes et determination de la formule, qui dolt toujours 6tre
realisee en parallele de I'etude en cytometrie, sera au mieux pratiquee sur
78
un prelevement recueilli sur EDTA. L'EDTA est egalement I'anticoagulant
qui favorise le moins I'agregation des plaquettes in vitro, agregats qui peu-
vent gener I'etude morphologique en cytometrie (les areas plaquettaires
peuvent en effet ,, contaminer,, un nuage de population anormale sur I'his-
togramme de diffraction, [17]).
En resume, on peut donner les recommandations simples suivantes
pour les prelevements de sang et de moelle osseuse :
- si I'analyse peut etre realisee dans les 6 heures suivant le preleve-
ment, les deux types d'anticoagulants peuvent 6tre utilises indiffe-
remment. On preferera I'heparine si un Ficoll est realise et I'EDTA si
le marquage est pratique par une technique avec lyse ;
- si I'analyse dolt 6tre differee jusqu'a 24 heures apres le prelevement,
I'heparine dolt 6tre choisie ;
- si le prelevement dolt etre envoye a un laboratoire exterieur il sera
realise sur heparine et devra parvenir a ce laboratoire dans les 24
heures ;
- si I'analyse dolt ~tre differee de plus de 24 heures, la simple conser-
vation de I'echantillon preleve sur heparine peut ne plus ~tre suffisante.
II est possible d'ameliorer un peu la conservation en ajoutant du milieu
de survie directement dans le tube de sang ou de moelle osseuse [5].
Au-dela de 48 heures de delai, il devient necessaire de recourir aux
techniques de cryopreservation, plus Iourdes et non sans consequence
sur la viabilite cellulaire et I'expression des antigenes [5] ;
le maintien des cellules dans le tube heparin6 d'origine est toujours
-
preferable a une separation des cellules mononucleees suivie d'une
remise en suspension des cellules dans un tampon phosphate ou
meme un milieu de survie ;
un contrele de la viabilite cellulaire est souhaitable pour s'assurer
-
de la qualite de cette etape pre-analytique. II peut ~tre realise par une
numeration en cellule de Malassez des cellules colorees au bleu try-
pan ou par un marquage b, I'iodure de propidium en cytometrie, voire
simplement par une analyse de I'histogramme de diffraction. L'interet
de ce contrele est admis pour les techniques de cytometrie destinees
la numeration d'une population cellulaire (sous populations lym-
phocytaires, progeniteurs circulants). II est plus discute pour le typage
des cellules anormales. Certains auteurs considerent ainsi que le pour-
centage de cellules vivantes dans I'echantillon analyse n'est pas impor-
tant s'il existe ,, suffisamment de cellules neoplasiques viables pour per-
mettre une interpretation claire des resultats ,, [18]. Ce point ne fait
pas I'objet d'un consensus.
• Type de tubes
Les tubes en verre silicone sont d'usage le plus courant. Les remarques
relatives aux tubes en matiere plastique sont les memes que celles
faites pour la numeration.
3.1.2.2. Modalit~s du pr~16vement
• Choix de la nature du prelevement
Ce probleme est propre & I'etude des hemopathies. Le choix doit 6tre
adapte & chaque cas, guide par les donnees cliniques et cytologiques.
Le prel¢vement dolt 6tre oriente ,, I& oQ la population tumorale est le
mieux represente ,, [1 8]. Par definition, il s'agit de la moelle osseuse
dans le cas des leucemies aigues. Toutefois, I'existence d'un enva-
hissement sanguin ou mening#, peut rendre un echantillon de sang ou
de LCR propre & la caracterisation de la leucemie, et de fagon par-
fois tres precieuse Iorsque le prelevement medullaire est difficile. Dans
un lymphome en phase leucemique avec une Iocalisation pleurale, le
liquide d'epanchement pleural, le sang ou une suspension obtenue &
partir d'une adenopathie biopsiee constituent trois types possibles de
prelevements adaptes au typage de I'hemopathie (sous reserve des
contr61es cytologiques). Quelle que soit la nature du prelevement choisi
en effet, I'evaluation cytologique du degre d'envahissement par la popu-
lation anormale dolt toujours 6tre realisee et correlee avec les resul-
tats obtenus en cytometrie. Elle repose sur des techniques de cyto-
Iogie courantes et dolt donc au mieux #tre menee sur des
echantillons preleves sur EDTA depuis moins de 6 heures.
RevueFrangaisedes Laboretoires,novembre1999, N° 317
L'etape pre-analytique
Le point le plus important toutefois est que cette etude porte reellement
sur la suspension cellulaire directement utilisee pour les marquages :
- pour les marquages sur sang ,,total ,, avec lyse, un frottis sanguin rea-
lise a partir du tube initial (le sang etant un milieu biologique homogene) ;
- pour les marquages sur moelle osseuse -totale* avec lyse, un frottis
medullaire realise a partir de la suspension prelevee pour le typage et non
les frottis realises Iors du prelevement avec les premiers mm 3 de moelle
obtenus. La moelle osseuse, en tout cas Iorsqu'elle est aspiree au trocart
ou a I'aiguille n'est pas en effet un echantillon homogene, la contamina-
tion par le sang etant en general proportionnelle a la quantite aspiree ;
- pour les echantillons ayant fait I'objet d'une separation par Ficoll, une
lame de cytocentrifugation preparee a. partir de la suspension separee
et lavee, ajustee a une concentration de 50 000 cellules pour 100 pI;
- si un delai important a du 6tre observe avant la realisation de I'ana-
lyse, on conseille de realiser le contrele cytologique a deux
moments : a la reception (reference indispensable) puis Iors de la prise
en charge effective, la proportion des populations cellulaires ayant pu
evoluer par lyse de certains elements fragiles.
• Remplissage et homogeneisation
Pour le sang, les criteres sont les memes que ceux vus pour la NFS.
Les tubes EDTA a vide de 2 ou 4 mL en particulier sont utilisables. Si
la population a typer est reduite et qu'une separation est envisagee
(population leucemique circulante peu abondante) il peut etre neces-
saire de prelever plusieurs tubes. Pour la moelle osseuse, le remplissage
est bien sOr plus aleatoire. En pratique 1 a 2 mL de moelle osseuse suf-
fisent le plus souvent. De plus, il faut savoir que le volume de moelle pre-
leve est en general proportionnel a son degre de dilution par le sang.
La principale precaution a ce niveau est d'eviter la coagulation du pre-
levement. Le probleme n'est pas ici comme pour la NFS la modification
des concentrations mais la perle en cellules. La moelle prelevee sur
seringue dolt etre placee rapidement dans le tube contenant I'anticoa-
gulant et melangee consciencieusement avec celui-ci. La seringue peut
etre rincee au prealable (et simplement rincee) avec de I'heparine si celle-
ci est I'anticoagulant utilise. Un tube de recueil contenant un milieu de
survie, lui-meme anticoagule, peut etre utilise Iorsque le prelevement
medullaire est particulierement difficile : le milieu de survie permet de
diluer directement le faible volume de moelle dans la seringue et de rea-
liser plusieurs rin0ages, afin de faciliter la recuperation de I'echantillon
aspire. Darts tousles cas, la presence d'une personne assistant le pre-
leveur pour ces gestes est souhaitable.
3.1.3. D~lai avant analyse,
temperature de conservation, transport
Nous avons detaille plus haut ce point crucial dependant de I'anti-
coagulant utilise. Uautre parametre a prendre en compte est la tem-
perature de conservation. Un consensus existe pour recommander le
maintien des echantillons a temperature ambiante (20-25°C) et evi-
ter tout sejour du prelevement a des temperatures plus basses jus-
qu'& I'analyse. Dans tousles cas, les prelevements seront bien sQr ache-
mines le plus rapidement possible au laboratoire de cytometrie. Pour les
prelevements de liquides (liquides d'epanchements et surtout LCR) la
conservation des cellules est en general plus mauvaise que dans le sang
et la moelle. Les echantillons de LCR en particulier doivent etre analy-
ses dans les plus courts delais (moins de deux heures).
3.1.4. Preparation de I'echantillon
Ce point se situe & la frontiere entre les phases pre-analytique et ana-
lytique. La preparation de I'echantillon designe ici la realisation d'une
separation des cellules mononucleees par gradient de densite (Ficoll).
Celle-ci dolt etre realisee dans des tubes & fond rond (et non a fond
conique) dans les conditions suivantes : densite du milieu de sepa-
ration 1.077, temperature de centrifugation t 5°C, vitesse de rotation
& I'anneau 400 g. Cette technique de separation s'oppose a. la tech-
nique dite ,, avec lyse ,, ou les marquages sont effectues directement
RevueFrangaisedes Laboratoires,novembre1999, N° 317
sur I'echantillon ,, total ,,, I'elimination des hematies, indispensable pour
la lecture au cytometre, etant realisee par lyse et non par separation.
Dans les deux cas, le risque d'alterer les antigenes cellulaires voire les
cellules elles-m~mes Iors de la separation ou Iors de I'exposition a.
I'agent de lyse dolt etre mis en balance avec les avantages respec-
tifs des deux methodes : obtention d'une population theoriquement
enrichie en cellules anormales pour la separation, rapidite et
meilleure viabilite cellulaire pour les techniques avec lyse. Plusieurs pro-
gres recents ont favorise la generalisation des techniques avec lyse
dans de nombreux laboratoires : commercialisation de reactifs de lyse
et de permeabilisation performants et de qualite constante, possibi-
lite de marquage des antigenes intra-cytoplasmiques et des immu-
noglobulines de surface (apres lavages) sur les echantillons non sepa-
res, possibilite de selection des populations anormales par marqueurs
de -fenetrage ,, (CD45, avec des limites) en double et triple marquages.
Par ailleurs, les conditions standard de temperature (15°C), de vitesse
de rotation (400 g a I'anneau) et de densite du milieu de separation
(1.077) du ,, Ficoll ,, ne sont pas forcement adaptees a tousles types de
populations anormales etudiees (ces conditions standard ont ete deft-
nies pour I'isolement des lymphocytes). II reste cependant conseille de
proceder, darts chaque site, a I'evaluation du reactif de lyse utilise et de
ses effets eventuels sur I'expression des antigenes cellulaires [5].
3.1.5. Conservation a long terme :
modalites de congelation et de decong~lation
Nous avons vu plus haut qu'il etait possible Iorsque le marquage devait
6tre differe de plus de 48 heures de congeler des cellules dans des condi-
tions adequates pour une utilisation en cytometrie. II s'agit toutefois d'une
solution de secours, tant la realisation du typage d'une hemopathie sur
cellules fratches est preferable. La cryopreservation induit en effet des alte-
rations des cellules et des antigenes variables selon les populations, avec
des repercussions sur la qualite de I'analyse : certains types de cellules
comme les cellules de Burkitt ou de leucemie aigue myeloblastique M3
de la classification FAB se pretent mal & la congelation [7]. II est donc pre-
ferable de concevoir la congelation des cellules comme un complement
du marquage realise sur cellules fra;ches ; dans le but de constituer une
cellulotheque dont I'interet scientifique a ete, et est toujours, majeur. Les
exigences relatives a la cryopreservation sont les suivantes :
- une separation des cellules mononucleees est indispensable ;
la congelation dolt 6tre realisee en presence de serum de veau foetal
-
decomplemente et d'un cryoprotecteur (le dimethyl sulfoxide, DMSO, le
plus souvent). Le melange cellules / DMSO dolt ¢tre tres progressif et
realise & froid (tubes places dans de la glace fondante) ;
- d a n s un premier temps les tubes sent places, entoures de coton carde,
dans un congelateur ~t -80°C. IIs sont ensuite transferes b. - 1 9 6 ° 0 en
azote liquide. Cette derniere modalite de conservation est preferable en
raison de la temperature inferieure, du maintien constant de cette tem-
perature et de la securite optimale qu'elle assure a condition de veiller au
remplissage de la cuve. Les congelateurs & - 8 0 ° C sont, eux, soumis au
risque de panne et de coupure electrique ;
I'echantillon dolt etre fractionne en ampoules contenant chacune un
-
nombre limite de cellules. Cette pratique facilite la gestion de la cellulo-
theque ;
- la decongelation est une etape critique ou il importe de preserver
au maximum la viabilite cellulaire. Elle dolt etre realisee aux environs
de 40°C pour etre rapide et suivie aussitet par plusieurs lavages dans
de grands volumes de milieu de survie additionne de serum de veau
foetal. Ces lavages sont destines & eliminer le DMSO qui est toxique ;
- les etapes de congelation et de decongelation doivent etre realisees
par des techniciens entraTnes ;
il est necessaire de proceder & un contrele de la viabilite cellulaire
-
apres decongelation. Les techniques de numeration en cellule de
Malassez en presence de bleu trypan ou de marquage & I'iodure de
propidium en cytometrie peuvent etre utilisees. Nous avons vu que I'in-
terpretation & donner & ce test de viabilite est discutee ;
79
 ii i INI!!! !!i
L'~tape pr6-analytique

Recommande Acceptable Non conforme

Identification - Nom, prenom, date de naissance - Absence d'identification

du patient
- Date et heure du prel¢vement - Date et heure non mentionnees
(8-9 h le matin pour les numerations
des lymphocytes T CD4+)
- Identite du pr61eveur
Renseignements fournis - Permettant d'orienter ?analyse : - Absence de rendezvous en cas d'urgence - Absence d'orientation de I'analyse
nature du prelevement, type suppose
de la population & typer, suspicion
de diagnostic, traitement eventuel
- Prise de rendezvous
Nature du prelevement Pour les hemopathies : representant Inadapte & la caracterisation
au mieux le processus neoplasique de I'hemopathie
(verifie par un contr61e cytologique)
Anticoagulant et delai avant analyse - EDTA si analyse dans les 6 heures - Heparine si analyse entre 24 heures - EDTA si analyse apres 6 heures
- Heparine si analyse apres 6 heures et 3 jours
et avant 24 heures
- Milieu de survie heparine si analyse
avant 24 heures (pr61evements
difficiles de moelle osseuse)
- Tube sec pour le LCR
Pour les hemopathies : Realise sur la suspension cellulaire Realise sur tout autre document
contr61e cytologique de typee elle m~me cytologique
I'envahissement tumoral
Melange echantillon / anticoagulant Bonne anticoagulation Prelevement coagul¢
Temperature de transport Temperature ambiante (20-25°C) Entre +4°C et +8°C
et de conservation
Preparation Lyse des globules rouges
ou separation
Conservation Congelation en azote liquide en Culots secs
presence de cryoprotecteur (DMSO)

- la conservation des cellules par la technique dite de ,, culots secs ,, 4, f° " +~ • l ~ t s ~ o

(culots cellulaires obtenus apres centrifugation et decantation du sur-
nageant), si elle est adaptee & la plupart des techniques de biologie
moleculaire, est impropre & la cytometrie en flux.
3.2. R,:2 ; o m m a r ~ d a t i o n s g © n e r ~ es
En I'absence de consensus sur de nombreux points, il est difficile
d'etablir une ,, fiche de conformite ,> pour les prelevements destines
aux analyses de cytometrie en flux. Le but d'une telle fiche etant par
ailleurs de definir des criteres d'acceptabilite et de rejet, elle serait
de toute fa?on peu adaptee dans un domaine ou I'on dolt prendre
en compte de nombreuses contraintes pratiques liees aux patholo-
gies etudiees et au caractere souvent precieux des echantillons bio-
Iogiques. On peut toutefois suggerer une liste de ,, recommandations
generales ,> (tableau II).
a mise en place du G B E A dans un laboratoire d'analyses medicales
L engendre de nombreuses difficult6s. Celle que represente la qua-
lite de la phase pre-analytique n'est pas la moindre. Dans beaucoup de
structures, cette phase est deleguee & un ou plusieurs tiers, creant une
chafne complexe : patient-preleveur-transmission-laboratoire. Ce systeme
comprend comme on I'a vu de multiples variables et sa qualite est donc
difficile & maftriser par la personne qui en est pourtant responsable
d'apres la Ioi, le biologiste. Le probleme est sans doute plus aigu encore
dans le domaine particuNer de I'hematologie cellulaire qui ne beneficie
pas, par habitude, d'une attention tres soutenue en ce qui concerne les
prelevements, contrairement & d'autres secteurs de la biologie comme
I'hemostase par exemple. II est donc du devoir du biologiste de sensi-
biliser et de renforcer la vigilance de son laboratoire et de ses corres-
pondants sur cette phase essentielle du processus analytique.

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