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Verification of a quantitative method: complete blood count by flow

cytometry, the HematoFlow (TM) system (Beckman Coulter)

Article in Annales de biologie clinique · September 2016

DOI: 10.1684/abc.2016.1181

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5 authors, including:

Francis Lacombe François-Xavier Mahon

Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux Institut Bergonié
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 Qualité-Accréditation
Ann Biol Clin 2016 ; 74 (5) : 617-31
Vérification de méthode quantitative :
la formule sanguine par cytométrie en flux,
le système HematoFlow® (Beckman Coulter)
Verification of a quantitative method: complete blood count
by flow cytometry, the HematoFlowTM system (Beckman Coulter)
Inès Vergnolle1
Kaoutar Allou1,2
Francis Lacombe1,2
François Xavier Mahon1
Jean-Philippe Vial1,2
1 Laboratoire d’hématologie, CHU
de Bordeaux, Hôpital Haut-Lévêque,
Pessac, France
<inesvergnolle@hotmail.fr>
2 Laboratoire de cytométrie en flux,
CHU de Bordeaux, Hôpital
Haut-Lévêque, Pessac, France
Article reçu le 7 août 2015,
accepté le 30 septembre 2015
Cette vérification de méthode a été initiée dans le cadre
d’une formation pour l’obtention du diplôme universi-
taire « Management de la qualité pour les professionnels
et acteurs de santé », à Bordeaux. Elle s’inscrit dans
la démarche d’accréditation des laboratoires de biologie
médicale dans le cadre de la loi « Hôpital, patients, santé
doi:10.1684/abc.2016.1181
et territoires » (loi n◦ 2009-879 du 21 juillet 2009) et
Tirés à part : I. Vergnolle
Pour citer cet article : Vergnolle I, Allou K, Lacombe F, Mahon FX, Vial JP. Vérification de méthode quantitative : la formule sanguine par cytométrie en flux, le système
HematoFlow® (Beckman Coulter). Ann Biol Clin 2016 ; 74(5) : 617-31 doi:10.1684/abc.2016.1181
Résumé. Le système HematoFlow®, Beckman Coulter, associe un prépa-
rateur d’échantillons (FP1000) et un cytomètre en flux 5 couleurs (FC500)
reliés par un middleware (Remisol®). Il fonctionne en routine au laboratoire
d’hématologie du centre hospitalier universitaire de Bordeaux depuis juillet
2011. HematoFlow® est utilisé en deuxième ligne pour déterminer la formule
sanguine, en cas d’alarmes sur les analyseurs classiques de numération formule
sanguine, ou en systématique, pour les échantillons provenant du service des
maladies du sang. Ce système a permis de nombreuses améliorations concer-
nant le diagnostic précoce et le suivi des maladies hématologiques. Aujourd’hui,
dans le cadre d’une démarche d’accréditation, nous proposons de montrer les
différentes étapes qui ont conduit à la vérification de cette méthode.
Mots clés : qualité, cytométrie en flux, formule sanguine
Abstract. The HematoFlowTM system is used in the hematology laboratory
of the University Hospital of Bordeaux since July, 2011. The HematoFlowTM
solution is the combination of a sample preparator (FP1000) and a 5 color flow
cytometer (FC500) linked by a middleware (RemisolTM ). This system is used
in second line when flags are activated by the hematology instrument and/or
if the sample comes from the OncoHematology Department. Improvements in
hematology disease diagnosis and follow-up were possible using this system.
The laboratory has now entered in an accreditation procedure and needs to check
this method in compliance with the COFRAC requirements.
Key words: quality, flow cytometer, blood count differential
notamment de l’ordonnance d’application du 13 janvier
2010 (ordonnance n◦ 2010-49 relative à la biologie médi-
cale) qui indique qu’un laboratoire de biologie médicale ne
peut réaliser d’examen de biologie médicale sans accrédita-
tion. Cette accréditation est délivrée par le Comité français
d’accréditation (Cofrac) selon la norme NF ISO 15189 [1].
La formule manuelle est à l’heure actuelle la technique de
référence pour l’établissement de la formule sanguine. Elle
présente de nombreux inconvénients ; c’est une technique
chronophage manquant de reproductibilité et de traçabilité ;
ce qui a conduit au développement d’une méthode
617
Qualité-Accréditation
immunologique [2]. Le système HematoFlow® est le pre-
mier système mis au point et évalué pour l’établissement
de la formule sanguine en routine [3]. L’intérêt de sys-
tème réside dans la diminution des vérifications des
formules sanguines par microscopie et la possibilité
d’avoir une reproductibilité et une traçabilité des résul-
tats, peu évidentes à mettre en œuvre dans le domaine
de l’hématologie cellulaire, mais néanmoins indispensables
dans une démarche d’accréditation. Du fait de son utilisa-
tion en routine au laboratoire, il est indispensable de vérifier
les performances de cette méthode, en se conformant à la
démarche utilisée pour les automates de numération for-
mule sanguine (NFS) classiques [4, 5]. Il nous a paru
intéressant de rapporter notre expérience concernant la véri-
fication de la formule sanguine par cytométrie en flux.
Au CHU de Bordeaux, le système HematoFlow® (Société
Beckman Coulter, Brea CA) est utilisé en routine depuis
juillet 2011. Il s’agit d’une solution automatisée qui asso-
cie un préparateur d’échantillons (FP1000) et un cytomètre
en flux 5 couleurs (FC500) pilotés et exploités par un midd-
leware spécifique (Remisol®).
Cette vérification de méthode s’applique à l’établissement
de la formule sanguine par le système HematoFlow®
doté d’un algorithme d’analyse automatisé permettant
d’identifier et de compter 13 sous-populations leucocy-
taires. La vérification de méthode que nous exposons
concerne les sept populations pour lesquelles un résultat
est rendu au clinicien : polynucléaires neutrophiles, éosi-
nophiles, basophiles, lymphocytes, monocytes, myélémie
et blastes.
La portée choisie pour effectuer cette vérification de
méthode est une portée A quantitative puisque le système
HematoFlow® est utilisé selon les recommandations énon-
cées par le fournisseur.
Les vérifications à effectuer ont été définies selon le guide
SH-GTA-04 et en fonction des caractéristiques de l’appareil
[6]. Il est apparu nécessaire d’effectuer les tests de répé-
tabilité, de fidélité intermédiaire, de mesurer la justesse,
d’estimer les incertitudes de mesure, de comparer le sys-
tème HematoFlow® aux automates de numération formule
sanguine. Il nous est apparu en outre intéressant de complé-
ter ce travail, par la réalisation d’une étude de stabilité des
échantillons. En effet, comme suggéré par notre expérience
dans l’immunophénotypage des hémopathies, nous verrons
que cette étude nous permettra de valider le fait avantageux
que certains échantillons arrivés tardivement au laboratoire
pourront tout de même être conservés un certain temps
pour bénéficier ultérieurement d’une vérification de leur
formule par le système HematoFlow®. De plus, une ana-
lyse de risques a été réalisée afin de déterminer les points
critiques lors du traitement des échantillons au laboratoire
et plus particulièrement lors de leur passage sur le cytomètre
en flux.
618
Matériel
Cytométrie en flux
La solution HematoFlow® est constituée d’un prépara-
teur automatisé d’échantillons (FP1000, société Beckman
Coulter, Brea CA), d’un cytomètre en flux 5 couleurs
(FC 500, société Beckman Coulter, Brea CA), d’un algo-
rithme d’analyse automatique, d’un cocktail d’anticorps
monoclonaux CytoDiff® (tableau 1), et d’un système infor-
matique d’exploitation Remisol® (middleware) permettant
la communication entre les différents modules automates
[7]. L’algorithme d’analyse automatique de Beckman Coul-
ter montre 15 histogrammes permettant d’identifier 13
sous-populations leucocytaires (tableau 2).
Enfin, la solution HematoFlow® est, depuis peu, équipée
d’un système d’alarmes mis au point au laboratoire, permet-
tant de détecter les populations cellulaires anormales ou les
mauvais positionnements des fenêtres ou « gates » [8, 9]. Il
comprend 17 histogrammes supplémentaires susceptibles
de générer 27 messages d’alarmes de formule spécifiques.
Le système Hematoflow® est utilisé selon un arbre déci-
sionnel élaboré au laboratoire (figure 1).
Procédures de contrôle qualité
Controles internes de qualite (CIQ)
Lors de ce travail, nous avons réussi à pallier le défaut
de contrôles de qualité standardisés tels que ceux utilisés
pour les automates classiques de NFS (en effet, la tech-
nique d’immunophénotypage ne peut être mise en œuvre
sur les sangs stabilisés habituellement conçus pour servir
de contrôle interne de qualité).
Deux types de procédures de contrôle sont mis en place :
– d’une part, un contrôle quotidien de la stabilité
des réglages du cytomètre en flux est réalisé par
l’intermédiaire de deux types de billes industrielles standar-
disées FlowCheck® (fluorosphères permettant de vérifier
la fluidique et l’alignement des lasers) et FlowSet®
(fluorosphères permettant de vérifier le réglage correct
des compensations de fluorescence). Ces contrôles, qui
s’apparentent à des calibrants, permettent de vérifier quoti-
diennement le bon fonctionnement de l’appareil, et en cas
de dérive des paramètres, de le recalibrer. La calibration
correspond au réglage du laser (effectué uniquement par le
fournisseur lors d’intervention de SAV) ou au réglage du
voltage des photomultiplicateurs (qui peut être réalisé par
le personnel technique de laboratoire habilité, lors d’une
procédure de réglage des compensations de fluorescence) ;
– d’autre part, comme il n’existe pas, aujourd’hui, de
contrôle interne de qualité (CIQ) commercialisé pour
l’établissement de la formule sanguine complète en cyto-
métrie en flux, un échantillon de sang frais (patient ne
Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016
 Vérification de méthode : la formule sanguine par cytométrie en flux

Tableau 1. Panel CytoDiff®. Tableau récapitulatif du cocktail d’anticorps de la solution HematoFlow® permettant l’identification de treize
sous-populations leucocytaires.

Antigène-fluorochrome Cellules marquées

CD36-FITC Plaquettes, lignage monocytaire (du monoblaste au monocyte mature)
CD2-PE Lymphoblastes T, lymphocytes T et NK
CRTH2-PE Polynucléaires éosinophiles, polynucléaires basophiles
CD19-ECD Lignage B (du lymphoblaste au lymphocyte B)
CD16-PC5 Polynucléaires neutrophiles, monocytes non classiques et lymphocytes Tc- NK
CD45-PC7 Marqueur pan leucocytaire

Tableau 2. Les treize sous-populations leucocytaires identifiées par l’algorithme d’analyse automatique Beckman Coulter et leurs mar-
queurs associés. Liste des treize sous-populations identifiées en fonction de l’intensité de l’expression du CD 45 et d’autres marqueurs
associés à la population considérée.

Populations identifiées CD45 Autres marqueurs

1 Polynucléaires neutrophiles ++ CD16 +++
2 Myélémie ++ CD16 +/-
3 Polynucléaires éosinophiles +++ CRTH2 +, CD16 -
4 Polynucléaires basophiles ++ CRTH2 +, CD16 -
5 Monocytes classiques +++ CD36+, CD16-
6 Monocytes non classiques +++ CD36+, CD16+
7 Lymphocytes T non cytotoxiques ++++ CD2+, CD16-
8 Lymphocytes T cytotoxiques et NK ++++ CD2+, CD16+
9 Lymphocytes B ++++ CD19 +
10 Blastes T +/- CD2+, CD16+
11 Blastes B +/- CD19 +
12 Monoblastes +/- CD36+, CD16-
13 Blastes myéloïdes +/- CRTH2 -, CD16 -

présentant aucune anomalie de numération et de formule
sanguine et n’ayant déclenché aucune alarme sur l’automate
de NFS) est utilisé pour effectuer une comparaison quo-
tidienne avec l’automate de NFS présent au laboratoire
(automate ayant lui-même fait l’objet d’une vérification
de méthode telle que recommandée par le SH-GTA-04).
Ce contrôle permet la vérification du bon fonctionnement
de la globalité de la solution Hematoflow® c’est-à-
dire du préparateur, du cytomètre ainsi que l’absence
d’anomalies concernant les réactifs (CytoDiff® et réactifs
annexes).
Au préalable, il nous fallait déterminer les valeurs limites
permettant l’interprétation de nos résultats. Nous avons
donc, dans un premier temps, calculé une moyenne des
différences observées entre les résultats de l’automate de
NFS et ceux obtenus avec la solution HematoFlow® : 15
échantillons de sang ont été utilisés et analysés par les deux
appareils. Pour chaque échantillon et chaque population (les
5 sous-populations leucocytaires normales), la différence
entre les deux résultats a été calculée puis la moyenne de
ces différences. Des graphiques ont été établis représentant
la moyenne et deux limites : la moyenne ± 2 écarts-types
et ± 3 écarts-types.
L’échantillon de sang frais témoin est analysé dans un pre-
mier temps par l’automate de NFS, puis par le cytomètre
en flux. Les valeurs obtenues, avec chaque modalité ana-
lytique et pour chaque population, sont ensuite reportées
dans un tableur, et la différence entre les deux valeurs est
représentée graphiquement. Ce contrôle est validé par le
biologiste lorsque la valeur se situe entre +/- 3 écarts-types
pour chaque population (figure 2).
Évaluation externe de la qualité (EEQ)
Comme signalé précédemment, le sang stabilisé habituelle-
ment proposé par la plupart des fournisseurs de programme
d’évaluation externe de qualité ne peut être utilisé pour
l’immunophénotypage par cytométrie en flux. Il est donc
indispensable de faire le choix d’un programme proposant
l’utilisation de sang frais. Après deux essais sur les EEQ
biologie prospective destinés aux automates classiques de
numération formule sanguine conventionnelle, les résultats
ont été jugés satisfaisants et il a été convenu avec le four-
nisseur d’inscrire la solution Hematoflow® au programme
de biologie prospective pour l’établissement de la formule
sanguine.

Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016 619

Qualité-Accréditation

Échantillon

Automate de NFS

Non
Alarmes formule Cas particuliers

Oui
Oui

Cytomètre en flux Non

Alarmes Non
Libération du résultat
Hematoflow®
54,1 %

Oui

Libération du résultat
Vérification du « listmode » après vérification du
« listmode »
33,3 %

12,6 %

Vérification frottis sanguin Libération du résultat

Cas particuliers : services onco-hématologie

Figure 1. Logigramme de libération des résultats de la formule sanguine au laboratoire d’hématologie du CHU de Bordeaux. Arbre
décisionnel présentant les différentes étapes de réalisation et de libération des résultats de la formule sanguine en fonction des différents
cas rencontrés. Les pourcentages représentent la proportion de chaque cas rencontré, à titre indicatif.

Pour l’année 2014, quatre résultats de campagnes d’EEQ diaire respectivement, pour le niveau normal. Le volume de
ont pu être exploités pour les calculs de justesse et sang nécessaire ne permettait pas l’utilisation du sang d’un
d’incertitudes de mesure : deux EEQ n◦ 5A, 5B, 6A, 6B. patient.

Patients sans anomalies de la numération-formule

Nature des échantillons de sang pour l’étude
Sujets sains
Deux échantillons de sang frais de volontaires sains ont été
utilisés pour les études de répétabilité et de fidélité intermé-
sanguine
Trente échantillons de sang frais de patients ne présentant
aucune alarme sur l’automate de NFS (LH 785) ont été
utilisés pour la comparaison de méthode.

620 Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016

 Vérification de méthode : la formule sanguine par cytométrie en flux

Cinq autres échantillons de sang de patients ne présen- Justesse-exactitude

tant aucune alarme ont été utilisés pour les études de
stabilité.
Patient avec myélémie
Un échantillon de sang frais d’un patient présentant de
la myélémie a été utilisé pour l’étude de la fidélité inter-
médiaire, pour le niveau pathologique 1. La myélémie est
définie par la présence de promyélocytes, myélocytes et
métamyélocytes dans le sang, la distinction n’étant pas
faite lors du décompte, comme lors de la lecture du frottis.
L’échantillon de sang a été sélectionné après un premier
passage sur le système HematoFlow®, sans alarme.
Patient avec blastes
Un échantillon de sang frais d’un patient présentant une
blastose a été utilisé pour l’étude de la fidélité intermé-
diaire, pour le niveau pathologique 2. L’échantillon de sang
a été sélectionné après un premier passage sur le système
HematoFlow®, en l’absence d’anomalie de fenêtrage ou
« gating ».
Méthodes
La méthode vérifiée correspond à l’établissement de la for-
mule sanguine par la solution HematoFlow® en utilisant
l’algorithme d’analyse automatisé fourni par le fabriquant.
Étude de la répétabilité et de la fidélité
intermédiaire
Les essais de répétabilité ont été réalisés avec un sang nor-
mal. Dix mesures ont été réalisées sur dix tubes différents
prélevés chez le même volontaire sain, le préparateur FP
1 000 ne pouvant prélever 10 fois dans le même tube. Ce
nombre de mesures correspond à un nombre de tubes stan-
dardisés pouvant être raisonnablement prélevés chez un
volontaire. Les essais de répétabilité n’ont pu être réalisés
En l’absence de CIQ externalisés, une approche de la jus-
tesse a été réalisée par le calcul des inexactitudes de mesure
à partir des résultats des EEQ.
x−v
Inexactitude (%) = ×100
v
x : valeur trouvée de l’EEQ
v : valeur cible (groupe de pairs ou moyenne générale)
La conformité des résultats a été établie selon les recom-
mandations Ricos et al. (2014).
Calculs des incertitudes de mesure
Selon le guide SH-GTA-14, la méthode « CIQ/EEQ » a
été utilisée pour calculer les incertitudes de mesure pour
chaque population. En l’absence de CIQ, les écarts-types
calculés pour chaque population lors des mesures de fidélité
intermédiaire ont été utilisés pour calculer l’incertitude liée
à la fidélité intermédiaire [11].
L’incertitude de mesure a été calculée selon la formule
suivante :

u (C) = u2 (CIQ) + u2 (EEQ)
u(C) : incertitude de mesure
u2 (CIQ) : variance des mesures de fidélité intermédiaire
u2 (EEQ) : variance liée à la justesse
Comparaison des résultats avec les automates
de NFS et la méthode de référence
Des études préliminaires de comparaison des différentes
méthodes utilisées au laboratoire (microscopie, LH 785,
solution HematoFlow®) ont été réalisées sur d’importantes
séries d’échantillons [8, 9] ; 2 730 échantillons de sang
Monocytes, juin 2014
5
Différences LH 785-HF

3 sd
sur du sang pathologique en raison de quantité insuffisante
2 sd
de sang disponible à cet effet.
Les essais de fidélité intermédiaire ont été réalisés avec un 0
Moyenne
échantillon de sang normal et deux échantillons de patients
présentant des résultats pathologiques (myélémie, blastes).
-2 sd
Six mesures différentes ont été réalisées à partir du tube
-5 -3 sd
primaire pour chaque niveau, dans la limite du temps de
conservation du sang frais (< 24 h). 0 10 20 30
La conformité des résultats a été établie selon les recom- Jours
mandations Ricos et al. (2014) [10]. Les CV « souhaitable »
et « minimal » ont été calculés en suivant les formules sui- Figure 2. Suivi du contrôle interne de qualité, effectué quotidienne-
vantes : CV(%) répétabilité « souhaitable » = (1/1,33) x 0,5 ment sur sang frais, du compte des monocytes par HematoFlow®
x CVI ; CV (%) répétabilité « minimal » = (1/1,33) x 0,75 x au mois de juin 2014. Représentation de la différence entre les
résultats obtenus sur l’automate d’hématologie LH 785 et ceux
CVI ; CV(%) reproductibilité « souhaitable » = 0,5 x CVI ; obtenus avec la formule HematoFlow® et des limites acceptables
CV (%) reproductibilité « minimal » = 0,75 x CVI . (+/- 3 écarts-types).

Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016 621

Qualité-Accréditation
n’ayant déclenché aucune alarme ni sur l’automate de NFS
LH 785 ni sur HematoFlow® ont été utilisés pour compa-
rer ces deux méthodes. Pour les populations anormales,
une comparaison entre HematoFlow® et les résultats du
frottis a été réalisée sur 208 échantillons présentant des
cellules blastiques et 190 échantillons présentant de la myé-
lémie. Pour notre travail, 30 nouveaux échantillons de sang
(un échantillon sélectionné par jour) ont été analysés par
l’automate de NFS LH 785 puis le système HematoFlow®,
en conditions réelles afin de confirmer les études précédem-
ment publiées.
Étude de stabilité
Cinq échantillons de sang de patients ne présentant aucune
alarme sur le LH 785 ont été analysés par le cytomètre à t0
(dans les 30 minutes suivant le prélèvement) puis à t+6h,
t+20h, t+24h.
Les biais (%) ont été calculés pour chaque échantillon en
utilisant comme valeur vraie la valeur obtenue à t0. Une
moyenne des biais pour chaque population a ensuite été cal-
culée à partir des résultats des cinq échantillons et comparée
aux biais limites définis par Ricos et al. pour chaque popu-
lation.
Archivage des données
Pour une traçabilité des résultats, toutes les données sont
archivées informatiquement (format .lmd) quotidienne-
ment dans le dossier d’archivage des résultats du cytomètre
en flux. Ces données sont régulièrement transférées sur un
disque dur externe de stockage.
L’ensemble des données relatives à la vérification de
méthode ont également été archivées informatiquement
(formats pdf) dans un dossier dédié à la vérification de
méthode. Ces données sont aussi disponibles en format
papier.
Analyse
L’ensemble des données ont été exportées au format .csv
et analysées à l’aide d’un tableur Excel ®. Les représenta-
tions graphiques ont été réalisées avec le logiciel GraphPad
Prism 6.
Résultats
Description de la méthode et maîtrise des risques
Le récapitulatif de la méthode, établi selon le SH FORM
43, reprend la méthode de mesure, les échantillons compa-
tibles, les références des réactifs, des étalons, les valeurs
de référence de la formule sanguine en fonction de l’âge
et la maîtrise des risques liées à l’utilisation de la solution
HematoFlow® [12] (tableaux 3 et 4).
622
Performances de l’automate HematoFlow®
Répétabilité
Dix mesures de répétabilité ont été effectuées sur dix tubes
prélevés chez un volontaire sain (tableau 5). Les résultats
obtenus sont conformes à la norme 15 189 pour les cinq
populations leucocytaires.
Fidélité intermédiaire
Six mesures de fidélité intermédiaire ont été réalisées
au cours de la journée avec un niveau normal (patient
sain) et deux niveaux pathologiques (myélémie et blastes)
(tableau 6). Les résultats sont conformes à la norme
15189 pour les cinq populations leucocytaires normales.
La conformité des résultats concernant la myélémie et la
blastose n’a pu être évaluée en raison de l’absence de réfé-
rentiel.
Évaluation de la justesse - Inexactitude
La justesse a été évaluée à partir des résultats d’EEQ de
biologie prospective (tableau 7). Les résultats obtenus sont
conformes à la norme 15 189 pour les cinq populations
leucocytaires normales.
Incertitudes de mesure
Les incertitudes de mesure ont été calculées pour les popu-
lations leucocytaires normales selon la méthode « CIQ +
EEQ » (tableau 8).
Intervalle de mesure
Selon les données bibliographiques, les plages analytiques
s’étendent de 0 à 100 %.
Les limites de quantification pour les sous-populations
anormales sont respectivement 1 % pour les blastes et 2 %
pour la myélémie [8].
Comparaison des automates
Études préliminaires
Les études préliminaires réalisées antérieurement au labo-
ratoire ont montré une corrélation de l’automate de NFS
et de la solution HematoFlow® pour les cinq populations
normales et une corrélation de la solution HematoFlow®
et de la microscopie optique pour les populations anor-
males (blastes, myélémie). Le coefficient de corrélation r
est supérieur à 0,95 pour toutes les populations excepté les
basophiles (r = 0,56).
Comparaison de 30 échantillons LH 785/cytomètre
en flux au cours de la vérification de méthode
Lors de la vérification de méthode, les résultats entre
l’automate de NFS et le cytomètre en flux ont de nouveau été
comparés sur 30 mesures pour confirmer les résultats obte-
nus précédemment. Ces comparaisons ont été effectuées
Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016
 Vérification de méthode : la formule sanguine par cytométrie en flux

Polynucléaires neutrophiles Lymphocytes

Différence valeurs LH-HF

Différence valeurs LH-HF

0 20
2 sd
2 sd
Moyenne
Moyenne 0
-2 sd
-5
-2 sd

-20

-10
30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50

Monocytes Polynucléaires éosinophiles

Différence valeurs LH-HF

Différence valeurs LH-HF

40
10

2 sd
2 sd
20
Moyenne 0 Moyenne
0

-2 sd -2 sd
-10
-20

5 10 15 20 0 2 4 6 8 10

Polynucléaires basophiles
Différence valeurs LH-HF

400

200 2 sd

Moyenne

0
-2 sd

0.0 0.5 1.0 1.5

Figure 3. Bland Altman Plot LH/HF pour les cinq populations leucocytaires normales. Représentation graphique des différences (en
pourcentage) obtenues entre les résultats du LH 785 et de la solution HematoFlow® en fonction de la moyenne des résultats obtenus avec
les deux automates pour les 5 populations leucocytaires normales.

par la représentation des données sous forme de graphique polynucléaires basophiles. Le résultat obtenu pour les poly-
et la réalisation d’une droite de corrélation. L’équation de nucléaires basophiles n’est, comme dans la plupart des cas,
la droite ainsi que le coefficient de corrélation ont ainsi été pas satisfaisant en raison d’un pourcentage très faible de
calculés (tableau 9). Un coefficient de corrélation supérieur basophiles dans le sang.
à 0,95 est jugé satisfaisant.
D’autre part, la dispersion des résultats a été observée à
l’aide des graphiques Bland Altman Plot, permettant ainsi Contamination
d’apprécier l’homogénéité des résultats (figure 3). L’analyse par le cytomètre en flux n’est pas exposée à
L’ensemble des coefficients de corrélation r sont supérieurs la contamination d’un prélèvement par un autre en rai-
à 0,95 pour les différentes populations excepté pour les son d’une importante dilution des échantillons. En effet,

Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016 623

Qualité-Accréditation

Tableau 3. Tableau descriptif des caractéristiques générales de la méthode.

Analyte/mesurande Formule sanguine par cytométrie en flux

Méthode de mesure Cytométrie en flux
Type d’échantillon primaire Sang total
Type de récipient, additifs Tube EDTA K2, 4 mL
Micro-méthode
Prétraitement Transport à température ambiante. Aucun pré-traitement. Préparation des échantillons par le
de l’échantillon préparateur FP1000 du système HematoFlow® (lyse des GR, incubation avec le panel
CytoDiff®, lavages)
Unités Pourcentage (%), calcul secondaire de valeur absolue (G/L) à l’aide du taux de leucocytes
mesuré par l’automate à NFS

Homme Min-max Femmes Min-max

(années) (années)
Intervalles de Polynucléaires 16-49 1,780-6,946 16-44 1,750-7,500
référence [14] neutrophiles 50-59 1,915-6,634 45-49 1,812-7,154
(G/L) 60-69 1,847-6,138 50-54 1,720-6,299
55-69 1,692-5,839
Polynucléaires 16-19 0,046-0,630 16-19 0,040-0,576
éosinophiles 20-29 0,048-0,593 20-49 0,041-0,549
(G/L) 30-59 0,046-0,547 50-69 0,044-0,474
60-69 0,052-0,576
Polynucléaires 16-39 0,000-0,097 16-19 0,000-0,081
basophiles (G/L) 40-69 0,000-0,091 20-69 0,000-0,085
Lymphocytes 16-39 1,340-3,919 16-29 1,370-3,966
(G/L) 40-69 1,241-3,617 30-69 1,240-3,561
Monocytes (G/L) 16-39 0,228-0,773 16-29 0,201-0,714
40-69 0,233-0,725 30-49 0,205-0,663
50-69 0,192-0,608
Plaquettes (G/L) 16-59 172-398 16-54 185-445
40-69 161-393 55-69 187-420

Marquage CE Oui
Instruments [15] Préparateur d’échantillons (FP 1000)
Cytomètre en flux (FC500)

Dénominations Références Commentaires

Références des IsoFlow ® 8546859 Liquide de gainage
réactifs [16] Clenz 8448222 Liquide de
rinçage
Tubes de 2523749 Tubes en plastique
cytométrie
QuickComp 4 kt 177017 Compensation
de fluorescence
CD45-PC7 IM3548 Idem
CytoDiff panel ® A65119 Cf tableau 1
Versalyse ® A09777 Lyse des globules rouges
IOTest3 Fixative A07800 Conservation des cellules
Solution après préparation du mélange
à passer
PBS / Dilutions éventuelles (1/5 si
GB > 30 G/L, 1/10 si GB
> 100 G/L)

il existe une dilution systématique de tous les échantillons
au 1/10e par la versalyse®. De plus, pour les échantillons
hyperleucocytaires, une dilution supplémentaire est réali-
sée au 1/5e pour les échantillons > 30 G/L, au 1/10e pour
les échantillons > 100 G/L.
Stabilité des échantillons
Une étude de stabilité a été réalisée afin de valider le fait que
certains échantillons arrivés en dehors des horaires de fonc-
tionnement du cytomètre en flux peuvent être conservés,
pour bénéficier ultérieurement d’une vérification de leur

624 Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016

 Vérification de méthode : la formule sanguine par cytométrie en flux

Tableau 3. (Suite)

Dénominations Références Commentaires

Matériaux Flow-check ® 6605359 Contrôle fluidique/alignement laser
d’étalonnage Lot : 9434569
Flow-set ® 6607007 Compensation
Lot : 7524029
Flow-check 770, Flow-set 770 737664 Idem (à 770 nm)
Lot : 997239, 997847

Valeurs cibles
Valeurs Half peak FS FL1 (FITC) FL2 (PE) FL3 (ECD) FL4 (PC5)
étalonnage Flow-check ® coefficient
of variation
(HPCV)
Limites 3 2 2 2 2
inférieures
(%)
Limites 0 0 0 0 0
supérieures
(%)
Mean fluo- FS SS FL1 (FITC) FL2 (PE) FL3 (ECD) FL4 (PC5)
Flow-set ® rescence
intensity
(MFI)
Limites inférieures 113 460 21,2 28,3 23,2 7,08
Limites supérieures 144 490 25,9 37,4 28,0 9,36
Half peak FS 770 FL5 (PC7)
Flow-check 770 ® coefficient
of variation
(HPCV)
Limites inférieures (%) 3 4
Limites supérieures (%) 0 0
Mean FS 770 FL5 (PC7)
Flow-set 770 ® fluorescence
intensity (MFI)
Limites inférieures 175,6 49,7
Limites supérieures 205,6 69,9

formule par le système HematoFlow®. Cinq échantillons
ont été analysés (tableau 10 et figure 4).
On observe que le sang peut être conservé jusqu’à 24 heures
après le prélèvement sans qu’il y ait d’impact significatif
sur le résultat pour l’ensemble des populations.
Discussion
Dans le cadre de la démarche d’accréditation, il a été décidé
de vérifier les performances de la détermination de la for-
mule sanguine réalisée par la solution HematoFlow®. Les
tests à réaliser pour une portée A quantitative ont été définis
à l’aide du guide SH-GTA-04. Nous avons utilisé un niveau
normal pour les études de répétabilité ainsi qu’un niveau
normal et deux niveaux pathologiques pour les études de
fidélité intermédiaire. D’autre part, nous avons utilisé les
échantillons de sang frais proposés par biologie prospec-
tive dans le cadre des campagnes d’EEQ, pour l’estimation
de la justesse et le calcul des incertitudes de mesure. Nous
avons également comparé les résultats de notre automate
de NFS (LH 785) et du système HematoFlow®, afin de
s’assurer que les résultats sont comparables. Enfin, nous
avons réalisé une étude de stabilité des échantillons afin
de valider la possibilité de différer l’analyse d’échantillons
arrivés en dehors des horaires de fonctionnement du cyto-
mètre en flux. Lors de ce travail, une analyse de risque a
également été réalisée.
Les résultats ont été comparés aux recommandations du
fournisseur et/ou aux recommandations données par Ricos
et al., seule société savante proposant des informations pour
les paramètres de la formule sanguine.
L’ensemble des tests réalisés pour vérifier les perfor-
mances de la méthode se sont avérés conformes à la norme
15 189. Les coefficients de variation de répétabilité et de
fidélité intermédiaire ont montré des résultats très satis-
faisants, notamment en comparaison à ceux obtenus par
microscopie optique. Les résultats obtenus par l’équipe du

Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016 625

 Tableau 4. Maîtrise des risques. Liste des points critiques à maîtriser lors de l’utilisation de la solution HematoFlow® et modalités de maîtrise de ces différents éléments.

626
Erreurs possibles Causes Effets Fréquence Détectabilité Gravité Indice de criticité Modalités de maîtrise
du risque
Prélèvement
Défaut de remplissage Conditions de Refus d’échantillon 4 2 2 16 Vérifications pré-analytiques
prélèvement difficiles non conforme Catalogue des analyses de
Non-respect des biologie médicale (guide de
modalités de prélèvement)
prélèvement
Coagulation ou caillot Conditions de Refus d’échantillon 4 3 5 60 Vérifications pré-analytiques
prélèvement difficiles non conforme Catalogue des analyses de
Non-respect des Résultat erroné biologie médicale (guide de
modalités de prélèvement)
prélèvement
Prétraitement
Qualité-Accréditation

échantillon
Durée de conservation Délai d’acheminement Résultat erroné 3 2 5 30 Catalogue des analyses de
> 24h trop long Refus d’échantillon biologie médicale (guide de
Conservation d’un non conforme prélèvement)
échantillon dans Formation du personnel
les horaires de non Étude de stabilité
fonctionnement HF des échantillons
Main d’œuvre
Erreur analytique ou Défaut de formation Absence de résultat 2 2 5 20 Guides d’utilisation du FC 500
de validation technique Résultat erroné et du FP1000 (Beckman) [17]
Validation technique Manuel de formation
erronée Certificats de formation initiale
Formation continue
EEQ
Réactifs, tampons,
milieux de culture
Altération des réactifs, Anomalie de lot Résultat erroné 1 2 5 10 CIQ :
anomalies de réglages Anomalie de Passage quotidien d’un
des lasers conservation échantillon de sang normal
Billes de contrôle
Conditions
d’utilisation
Température ambiante Panne de climatisation Résultat erroné des 2 2 1 4 Contrôle de température
inadaptée ambiante valeurs cibles des billes ambiante (thermostat)
de contrôle (aligne-
ment/compensation)
Équipement,
exigences
métrologiques
Exigence informatique Défaut de paramétrage Défaut de résultat 2 2 5 20 Paramétrage et qualification
spécifique (middleware de connexion/flux Résultat erroné initiale (CBI du CHU)
Remisol)

Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016

 Vérification de méthode : la formule sanguine par cytométrie en flux

Tableau 5. Résultats des mesures de répétabilité. Résultats du coefficient de variation (CV) des dix mesures réalisées sur un échantillon
de sang non pathologique pour les cinq populations cellulaires et comparaison aux limites fournisseur et Ricos et al.

Paramètre Niveau de Nombre Moyenne Écart-type CV Limites CV (%) limite Conclusion

Unités contrôle (%) (%) fournisseur (souhaitable)
Ricos
PNN Normal 10 56,6 0,6 1,1 2 ET ≤ 3 6,4 Conforme
%
Lymphocytes Normal 10 36,1 0,5 1,5 2 ET ≤ 3 3,8 Conforme
%
Monocytes Normal 10 6,1 0,2 3,3 2 ET ≤ 2 6,7 Conforme
%
PNEo Normal 10 0,9 0,1 9,8 2 ET ≤ 1 11,8* Conforme
%
PNb Normal 10 0,3 0,1 19,9 2 ET ≤ 1 15,8* Conforme/
% fournisseur

(*) Limite minimale Ricos.

Tableau 6. Résultats des mesures de fidélité intermédiaire. Résultats du coefficient de variation (CV) des six mesures réalisées sur un
échantillon non pathologique et deux échantillons pathologiques pour les cinq populations normales, sur deux échantillons pathologiques
pour la myélémie et un échantillon pathologique pour les blastes et comparaison aux limites fournisseur et Ricos et al.

Paramètre Niveau de Nombre Moyenne Écart-type CV Limites CV (%) limite Conclusion

Unités contrôle (%) (%) fournisseur (souhaitable)
Ricos
PNN Normal 6 58,3 0,3 0,6 2 ET ≤ 3 8,55 Conforme
%
Patho 1 6 61,5 1,0 1,7 8,55 Conforme
Patho 2 6 25,1 0,4 1,6 8,55 Conforme
Lymphocytes Normal 6 33,6 0,6 1,7 2 ET ≤ 3 5,10 Conforme
%
Patho 1 6 3,1 0,2 5,2 7,65* Conforme
Patho 2 6 59,0 0,3 0,5 5,10 Conforme
Monocytes Normal 6 5,0 0,2 4,3 2 ET ≤ 2 8,90 Conforme
%
Patho 1 6 18,7 0,5 2,8 8,90 Conforme
Patho 2 6 5,5 0,2 3,0 8,90 Conforme
PNEo Normal 6 2,9 0,2 8,0 2 ET ≤ 1 10,50 Conforme
%
Patho 1 6 0,1 0,1 64,5 15,75* Conforme/fournisseur
Patho 2 6 0,7 0,1 18,7 15,75* Conforme/fournisseur
PNb Normal 6 0,3 0,0 14,4 2 ET ≤ 1 21,00* Conforme
%
Patho 1 6 0,8 0,1 14,9 21,00* Conforme
Patho 2 6 0,3 0,2 48,6 21,00* Conforme/fournisseur
Myélémie Patho 1 6 15,8 0,7 4,6 / /
Patho 2 6 3,0 0,1 4,5 / /
Blastes Patho 2 6 6,3 0,2 3,3 / /

* Limite minimale Ricos.

docteur Trimoreau montrent par exemple un CV de 10,04 % HematoFlow® [13]. Malgré le travail exhaustif réalisé par
pour des études de fidélité intermédiaire de la numération cette équipe experte en cytologie, la cytométrie en flux,
des polynucléaires neutrophiles (niveau haut) en micro- parce qu’elle permet l’analyse de 20 000 évènements en
scopie optique contre un CV de 0,6 % avec le système un temps restreint, s’avère plus précise que la cytologie

Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016 627

Qualité-Accréditation

Tableau 7. Résultats des évaluations externes de la qualité du programme de biologie prospective. Résultats de deux campagnes
d’évaluation avec quatre EEQ pour les cinq populations cellulaires normales. Comparaison au groupe de pairs et à la moyenne générale
des participants au programme de biologie prospective, ainsi qu’aux recommandations Ricos et al.

Paramètres Échantillons Nombre Valeur Cible Moyenne Biais (%)/ Biais (%)/ Biais Conclusion
Unités laboratoire (groupe de générale groupe moyenne (%)
(%) pairs) (%) (toutes de pairs générale limite
techniques) Ricos
(%)
PNN EEQ n◦ 5A, 778 58,2 58,29 58,7 0,15 0,85 9,25 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 5B, 770 64 63,93 64,9 0,11 1,39 9,25 Conforme
2014
PNN EEQ n◦ 6A, 773 58,6 58,33 59 0,46 0,68 9,25 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 6B, 768 61,4 60,4 60,7 1,66 1,15 9,25 Conforme
2014
Lymphocytes EEQ n◦ 5A, 779 30 30,012 30 0,04 0,00 9,19 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 5B, 771 28,2 28,19 27,1 0,04 4,06 9,19 Conforme
2014
Lymphocytes EEQ n◦ 6A, 776 30,8 31,37 30,6 1,82 0,65 9,19 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 6B, 771 28,2 29,1 28,5 3,09 1,05 9,19 Conforme
2014
Monocytes EEQ n◦ 5A, 779 7,71 7,14 7,48 7,98 3,07 13,2 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 5B, 771 5,84 5,5 6,08 6,18 3,95 13,2 Conforme
2014
Monocytes EEQ n◦ 6A, 776 7,3 7,03 7,2 3,84 1,39 13,2 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 6B, 771 7,1 7,2 7,6 1,39 6,58 13,2 Conforme
2014
PNEo EEQ n◦ 5A, 774 3,35 3,18 3,21 5,35 4,36 19,8 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 5B, 765 1,48 1,65 1,43 10,30 3,50 19,8 Conforme
2014
PNEo EEQ n◦ 6A, 767 2,6 2,4 2,32 8,33 12,07 19,8 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 6B, 761 2,4 2,4 2,35 0,00 2,13 19,8 Conforme
2014
PNB EEQ n◦ 5A, 773 0,82 0,91 0,66 9,89 24,24 23,1* Conforme/
% 2014 pairs
EEQ n◦ 5B, 765 0,57 0,612 0,46 6,86 23,91 23,1* Conforme/
2014 pairs
PNB EEQ n◦ 6A, 767 0,7 0,8 0,77 12,50 9,09 15,4 Conforme
% 2014
EEQ n◦ 6B, 761 0,9 0,85 0,77 5,88 16,88 23,1* Conforme
2014

* Limite minimale Ricos.

sanguine. La table de Rümke montre que statistiquement,
plus le nombre de cellules comptées est important, plus
les résultats obtenus sont précis. Des difficultés persistent
toutefois dans la répétabilité et la fidélité intermédiaire du
comptage des polynucléaires basophiles, malgré une aug-
mentation de la précision par rapport aux autres techniques.
Ces difficultés s’expliquent par la faible proportion de cette
population dans les échantillons étudiés (moyenne = 0,6 %,
min = 0,1 %, max = 2,5 %). S’il avait été possible (ces échan-
tillons sont trop rares) de réaliser les différents tests sur des

628 Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016

 Vérification de méthode : la formule sanguine par cytométrie en flux

Tableau 8. Calculs des incertitudes de mesure de la solution HematoFlow® pour les cinq populations cellulaires normales selon la méthode
« CIQ + EEQ ».

Paramètre Variance liée fidélité Variance liée à la Incertitudes Incertitudes de mesure

Unités intermédiaire U(CIQ)2 justesse U(EEQ)2 de mesure (%) élargie U (k = 2) (%)
PNN 0,111 0,561 ± 0,819 ± 0,9
%
Lymphocytes 0,327 12,201 ± 3,539 ± 3,6
%
Monocytes 0,046 19,148 ± 4,381 ± 4,4
%
PNEo 0,054 0,125 ± 0,422 ± 0,5
%
PNb 0,002 0,018 ± 0,140 ± 0,2
%

Tableau 9. Résultats de l’étude de corrélation du LH 785 et de la solution HematoFlow®. Équations et coefficients de régression des
droites de régression (LH/HF).

n Équation de la droite de régression r

PNN 30 y = 0,9867x + 2,8679 0,99
Lymphocytes 30 y = 0,8384x + 1,2511 0,98
Monocytes 30 y = 0,9789x + 0,0554 0,95
PNEo 30 y = 0,9682x + 0,1805 0,99
PNB 30 y = 0,0455x + 0,4173 0,15

Tableau 10. Résultats de l’étude de stabilité des échantillons. Tableau récapitulatif du biais moyen observé par rapport à la valeur obtenue
à t0 pour les mesures réalisées sur cinq échantillons de sang à t+6h, t+20h et t+24h pour les cinq populations leucocytaires normales.
Comparaison aux limites de reproductibilité définies par Ricos et al.

Moyenne biais Moyenne biais Moyenne biais Biais (%) limite Conclusion
t+6h (%) t+20h (%) t+24h (%) Ricos
PNN -0,5 0,3 0,1 9,25 Conforme
Lymphocytes 2,6 -0,1 0,1 9,19 Conforme
Monocytes 1,4 1,6 0,7 13,2 Conforme
PNEo 0,4 -0,3 1,4 19,8 Conforme
PNB 1,2 -6,7 -18,0 23,1* Conforme

* Limite minimale Ricos.

patients présentant une basocytose, nous aurions probable-
ment obtenu les mêmes CV que ceux des autres populations
cellulaires étudiées.
D’autre part, on peut évoquer à l’heure actuelle, le défaut
de contrôle de qualité standard puisque la technique n’est
pas encore répandue. Cependant, les exigences des contrô-
les qualité sont aujourd’hui satisfaites par l’utilisation des
billes fluorescentes FlowCheck® et FlowSet® permettant
respectivement la vérification de l’alignement des lasers
et de la fluidique ainsi que celle des compensations de
fluorescence. Les résultats, représentés sous la forme de
courbes de Levey-Jennings, sont analysés quotidiennement.
L’analyse, chaque jour, d’un sang frais permet de vérifier
le fonctionnement du préparateur et la validité des réactifs.
Enfin des maintenances préventives sont réalisées de façons
journalière, hebdomadaire et mensuelle.
De plus, des EEQ ont pu être mis en place grâce au
programme de biologie prospective, unique programme
proposant l’utilisation de sang frais. En effet, les sangs sta-
bilisés ne peuvent être utilisés pour établir l’intégralité de
la formule sanguine par cytométrie en flux, en raison de
l’altération probable des sites antigéniques à la surface des
leucocytes lors des processus de stabilisation. Les résul-
tats seront d’autant plus exploitables lorsque la méthode
sera davantage répandue et que le nombre de participants
augmentera.

Ann Biol Clin, vol. 74, n◦ 5, septembre-octobre 2016 629

Qualité-Accréditation
90
80
% PNN
70
60
50
0h 6h 20 h 24 h
Echantillon 1 Echantillon 3 Echantillon 5
Echantillon 2 Echantillon 4
Figure 4. Étude de stabilité dans le temps des polynucléaires neu-
trophiles réalisée sur cinq échantillons. Représentation graphique
des différentes mesures réalisées par le système HematoFlow®
du % de PNN à t0, t+6h, t+20h, t+24h pour 5 échantillons.
Enfin, de larges études de comparaison de méthodes entre
les différentes techniques du laboratoire ont montré que
celles-ci sont corrélées, ce qui permet d’assurer le bon fonc-
tionnement du système HematoFlow® dans son ensemble.
Conclusion
L’établissement de la formule sanguine est un examen de
biologie essentiel, cependant les techniques utilisées cou-
ramment et notamment la technique de référence (lecture
du frottis sanguin au microscope) présentent un certain
nombre de limitations. L’examen microscopique est long,
peu reproductible, peu sensible et manque de traçabilité
(ce dernier point étant résolu par la microscopie automa-
tisée). L’arrivée d’un cytomètre en flux en routine permet
de pallier ces inconvénients en alliant reproductibilité, rapi-
dité, précision, capacité d’identifier les cellules anormales
même en faible quantité, capacité à effectuer une formule
chez des patients leucopéniques et traçabilité. De plus, le
système HematoFlow® est équipé d’un système d’alarmes
performant permettant à la fois d’alerter sur les erreurs de
fenêtrage « gating » et de donner une orientation diag-
nostique dans certains cas. La vérification des lames reste
nécessaire dans un nombre limité de cas (12 % dans notre
centre avec un recrutement très axé sur l’oncohématologie)
et est devenue plus pertinente dans le cadre du système
HematoFlow® [8, 9]. La microscopie n’est plus utilisée à
des fins de « screening ». Elle est devenue une technique
spécialisée, nécessitant du personnel entraîné pour affiner
630
un diagnostic. Aujourd’hui, les performances de la tech-
nique HematoFlow® ont été vérifiées, ce qui nous a permis
de confirmer la fiabilité, la reproductibilité et la robustesse
de la méthode (en comparaison aux automates classiques
de NFS).
La configuration du système a été modifiée depuis, les LH
785 (Société Beckman Coulter, Brea CA) ont été rempla-
cés par des Dx800 (Société Beckman Coulter, Brea CA)
en miroir. Cependant, des études suivant cette modification
ont montré que les deux types d’automates étaient corré-
lés. Nous nous attendons donc à des résultats équivalents
concernant la comparaison du cytomètre en flux avec les
DxH800.
Enfin, les résultats présentés feront partie du dossier qui
sera présenté pour l’accréditation par le Comité français
d’accréditation (Cofrac) prochainement.
Liens d’intérêts : Les auteurs déclarent ne pas avoir de
lien d’intérêt en rapport avec cet article.
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