Extraction, séparation et identification des différents pigments présents dans des

feuilles d’épinards
Introduction :
Chlorophylle a (R=CH3):
Un pigment est une substance colorante qui a la couleur bleu-vert
capacité d’absorber les rayonnements lumineux
dans le visible.
Chlorophylle b (R=CHO):
Dans la nature, la couleur des aliments est très couleur vert-jaune
riche et variée en fonction des pigments présents
naturellement en eux. Dans le monde végétal, les
principaux pigments proviennent de trois
familles : les chlorophylles, les caroténoïdes
et les flavonoïdes.

Quels pigments trouve-t-on dans les épinards

?

Les principaux pigments des feuilles

d'épinards en bonne santé sont la
chlorophylle a, la chlorophylle b(ces deux
types de chlorophylle des épinards sont ce qui leur
donne une couleur vert foncé)et le bêta-
carotène (un antioxydant), mieux connu sous le
nom de vitamine A. Les épinards contiennent
également une petite quantité de xanthophylles.
On trouve plus particulièrement la
violaxanthine, la lutéine et la néoxanthine
qui sont de couleurs jaunes.

Objectifs :
On cherche à séparer et à identifier les bêta-carotène (couleur jaune)
différents pigments contenus dans les feuilles
d’épinards. Pour cela, on va réaliser :

•Extraction: on va utiliser la technique

d’extraction solide-liquide : le solide contenant
les espèces chimiques colorées à extraire est les
feuilles d’épinards ; le solvant d’extraction est
l’acétone. on va ensuite utiliser la technique de
filtration par gravité (ou filtration simple) pour
séparer le liquide du solide. On récupérera le
filtrat : il contient l’acétone et les différents
pigments contenus dans les épinards.

•Séparation : on va réaliser une

chromatographie sur colonne pour isoler les
différents pigments.

•Identification : on va utiliser la technique de

CCM. Le nombre de tâches indiquera le nombre
de piments contenus dans les feuilles d’épinards.
Ne disposant pas des références, les différentes
espèces chimiques colorées seront identifiées
grâce à leur couleur.

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Mode opératoire :

Les pigments sont extraits de la

façon suivante:

Etape 1 : Extraction d’une

solution totale de pigments de

1. Coupez les feuilles d’épinard de façon

grossière avec une paire de ciseaux.
2. Peser 4 g d’épinards hachés dans un 1- 2- 3-
bécher de 50 mL.

2. Placez les feuilles coupées dans un

mortier avec un peu de sable (2 g) (qui
facilite le broyage) et rajouter 6 g de
sulfate de magnésiums anhydre.

3. Broyer le mélange en fine poudre

jusqu’à ce qu’il ne soit plus collant et le 4- 5- 6-
transférer dans l‘erlenmeyer à l’aide de
l’entonnoir.

4. Ajouter 15 mL d’acétone, agiter

jusqu’à ce que le solvant prenne une
teinte verte marquée (2 minutes) et
récupérez le filtrat dans un bécher.

5. Evaporer à sec à l'étuve à 50°C.

6. Redissoudre les pigments dans un 7- 8- 9-

minimum d’hexane (0.5 mL).

Etape 2 : -Séparation des pigments par chromatographie sur colonne

La chromatographie d’adsorption est une chromatographie liquide –solide basée sur la

répartition des solutés entre l’adsorbant (phase stationnaire solide) et l’éluant (phase mobile
liquide).
Chaque soluté est soumis à une force de rétention par adsorption et à une force
d’entraînement par élution.
L’équilibre entre ces forces détermine la migration différentielle des solutés du
mélange et donc leur séparation.
2-1-Préparation de la colonne
1. Fixer verticalement 3. Introduire la silice 5.Placer un bécher sous 7. Ajouter une
la colonne à l’aide d’une dans la colonne. la colonne. quantité d’hexane
pince. suffisante pour
4.Tapoter la colonne 6.Introduire être environ à 0.5
2.Déposer un petit doucement de l’hexane cm au-dessus de la
afin d’obtenir une
morceau de coton dans (à l’aide d’une pipette surface plane de la
surface plane de
le bas de la colonne. par écoulement de long silice.
silice.
de la paroi de la
colonne).

2

2.2. Dépôt de l'échantillon :2.3.Séparation :
1. Déposer 1. Effectuer la 2.Lorsque le b- 3. Lorsque tout le b-
délicatement 0,5 mL séparation des carotène arrive en carotène a été
d’extrait d’épinards en pigments d’épinards en bas de la colonne le récupéré, la polarité de
haut de colonne à la choisissant comme récupérer dans un l’éluant est augmentée
éluant un mélange premier afin de faire migrer les
pipette Pasteur afin de
Hexane: acétone tube(fraction I). pigments de chloro-
ne pas perturber la (9:1). l’éluant entraîne phylle. On choisit alors
surface de silice. une migration rapide comme éluant
du b-carotène (anneau l’acétone.Les
jaune) vers le bas de la pigments verts sont
colonne alors que les alors récupérés en bas
pigments de de colonne (fraction
chlorophylle (anneau II).
vert) restent en haut de
la colonne.

Etape 2 : Séparation et identification des pigments par chromatographie sur

couche mince

3
La CCM (chromatographie sur couche mince) permet
de séparer les constituants d’un mélange et
éventuellement de les identifier.
L’identification est basée sur la comparaison du Rf
(rapport frontal) du colorant examiné avec ceux des
colorants de référence.
Les différentes étapes effectuées pour réaliser une
CCM en mode normale est inverse sont les
suivantes :
1. Préparation de la cuve :
Mode normale : Mode inverse :
Eluant : hexane : acétone (70 :30) Eluant : acétone : eau (90 :10).
Mettre l’éluant dans une cuve à chromatographie sur environ 8 mm de haut.
Refermer la cuve et attendre 30 minutes, pour que l'atmosphère de la cuve soit
saturée(ceci a pour but de limiter l'évaporation de la phase mobile depuis la
plaque).
2. Préparation de la plaque :
Mode inverse : Mode normale :
Immerger la plaque dans une solution contenant Réactiver le gel de silice à
un mélange d’huile d’olive-huile de tournesol : hexane l’étuve à 105 °C.
(0.5 : 0.5 :16).
Sécher la plaque au four pendant au moins 15min.
Tracer d’un trait léger de crayon de papier sur une ligne de dépôt à 1 cm du bord
inférieur de la plaque.
Marquer l’emplacement de 4 dépôts régulièrement espacés et les identifier.
Dépôt A : fraction I.
Dépôt B : fraction II.
Dépôt C : solution témoin de β-carotène
Dépôt D : extrait d’épinard.
Déposer les 4 solutions, en utilisant des capillaires fins et différents pour chaque
solution.
Les dépôts doivent être aussi petits et concentrés que possible.
3. Migration
introduire la plaque verticalement dans la cuve, dépôt
en bas en veillant à ce que le niveau de départ de
l’élution soit inférieur à la ligne de dépôt.

Mettre en place le couvercle.

Laisser migrer l’éluant le plus haut possible (au-moins

jusqu’à trois quart de plaque.

4. Révélation
Sortir le chromatogramme de la plaque.
Tracer immédiatement la ligne correspondant au front de l’éluant avec la pointe
du crayon.

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